This work was supported by NIH grants R21 HD068949-01 and RO1 GM065303.

<ol>
	<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291, 293-296 (1981).</li><li>Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+manipulation+and+induction+of+alternate+clevage+patterns+through+inhibition+of+centrosome+duplication+in+the+early+zebrafish+embryo.">Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo.</a> Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).</li><li>Zhang, X., Onozato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrostatic+pressure+treatment+during+the+first+mitosis+does+not+suppress+the+first+cleavage+but+the+second+one.">Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one.</a> Aquaculture. 240, 101-113 (2004).</li><li>Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hydrostatic+pressure+on+microtubule+organization+and+cell+cycle+in+gynogenetically+activated+eggs+of+olive+flounder+(Paralichthys+olivaceus).">Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus).</a> Theriogenology. 68, 873-881 (2007).</li><li>Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome-intrinsic+mechanisms+modulate+centrosome+integrity+during+fever.">Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever.</a> Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).</li><li>Walker, C., Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 43-70 (1999).</li><li>Blanco-Vives, B., S&#225;nchez-V&#225;zquez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronisation+to+light+and+feeding+time+of+circadian+rhythms+of+spawning+and+locomotor+activity+in+zebrafish.">Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish.</a> Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).</li><li>Dekens, M. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+regulates+the+cell+cycle+in+zebrafish.">Light regulates the cell cycle in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).</li><li>Pelegri, F., Schulte-Merker, S., Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 1-20 (1999).</li><li>Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sperm+entry+site+during+fertilization+of+the+zebrafish+egg:+localization+of+actin.">The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin.</a> Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).</li><li>Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+a+sperm+meets+an+egg:+block+to+polyspermy.">When a sperm meets an egg: block to polyspermy.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).</li><li>Wong, J. L., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defending+the+zygote:+search+for+the+ancestral+animal+block+to+polyspermy.">Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).</li><li>Rappaport, R., Rappaport, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cleavage+furrows+by+the+mitotic+spindle.">Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle.</a> J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).</li><li>W&#252;hr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+cleavage+plane+determination+in+early+amphibian+and+fish+embryos.">A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos.</a> Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).</li><li>Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+maternal-effect+gene+cellular+atoll+encodes+the+centriolar+component+Sas-6+and+defects+in+its+paternal+function+promote+whole+genome+duplication.">The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication.</a> Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).</li><li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1.">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).</li><li>Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+in+vitro+fertilization+of+zebrafish+eggs+in+Hank's+saline+containing+bovine+serum+albumin.">Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin.</a> Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).</li><li>Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+Y,+W,+and+Z+sex+chromosomes+in+Xenopus+tropicalis.">Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).</li><li>Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+analyses+and+gene-centromere+distances+in+zebrafish.">Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish.</a> Genetics. 112, 311-319 (1986).</li><li>Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -. M., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-effect+gene+futile+cycle.is+essential+for+pronuclear+congression+and+mitotic+spindle+assembly+in+the+zebrafish+zygote.">The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote.</a> Development. 130, 3907-3916 (2003).</li><li>Pelegri, F., Mullins, M., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Met. Cell Biol. Vol. 104. , 83-120 (2011).</li></ol>

The authors do not have competing financial interests.

צעדים קריטיים זה קריטי לעבוד בתנאים של יעיל הפריה חוץ גופית. כדי להבטיח אספקה ​​טובה של ביציות בשלות (שלב 1), נקבות להגדיר עבור הזדווגות לא היה צריך להגדיר ב צלבי הזדווגות במשך 5 ימים לפחות, והיא אמורה להופיע הרה. במהלך ההפרעה של רבייה, משקיף יכול לפקח 15-30 טנקים מספקים ההופעה הראשונה של שחול ביצה טבעי. הפרעה של הזדווגות אמורה להתרחש בהקדם האפשרי כאשר הביצים הראשונות משתחררות דרך הזדווגויות טבעיות, על מנת לאפשר ביותר הביצים להישאר בתוך הנקבות עבור תהליך ההזרעה המלאכותי. נקבות אלו, אשר מוכנות כעת עבור שחול ידני של ביציות בשלות, יכולות להישמר מופרד עד שעה 2 ללא השפעה נראית לעין על שחרור ביצה שלאחר מכן. כדי להכין פתרון זרע יעיל (שלב 2), זכרים אמורים להופיע חזקים באופן אידיאלי עם גוון אדמדם, אופייני רביית זכרי דג זברה. לנתיחה נקיה בדרך כלל כרוכה רמהוינג המסלול מעיים על ידי משיכתו כלפי אל האחורי של הגוף, ואת בשלפוחית ​​השחייה ידי משיכתו קדמית. לאחר הסרת איברים פנימיים מרכזיים, האשכים להישאר המונים מוארכים שקופים כמו זו לצד זו בצד של קיר הגוף הפנימי. הימנע כולל איברים לא רצויים (כגון מעיים) לתוך תמיסת הזרע; במידת הצורך להפריד אלה מן האשכים ע&quot;י עבודה על משטח צלחת פטרי יבש לפני שיוצבו לתוך התמיסה של האנק. כדי להשיג קצבי הפריה גבוהים במהלך ההפריה חוץ הגופייה (שלב 4), זה הכרחי כי ביצים מעוקמות נשמרות המוסמכת עד בנוסף זרע. ביצים מוסמכות נגד תערוכת הפריה בנימה מעט צהובה והם שקופים. הימנע ביצים כל מגע עם מים לפני תוספת זרע, מאז מים יפעילו הפעלת ביצה והפעלה מוקדמת ימנעו הפריה. הפעלה והפרית מים אמורות להתרחש בתוך 90 שניות של שחול מן הנקבה כדי למנוע התייבשות של ביצים, אשר תהיינהלהוביל השפלה שלהם. במידת הצורך, יכולות להישמר ביצים מעוקמות לפרקי זמן ארוכים יותר (עד 1.5 שעות או יותר) ב 100-200 μl של הפתרון של האנק בתוספת 0.5% שור הסרום אלבומין (BSA) 17 (בעת הכנת הפתרון של האנק למטרה ספציפית זו, להכין premix לתקן תכולת המים הוסיף במהלך תוספת BSA). אם נשמרו ביצים מוסמכות בעזרת פתרון BSA של האנק, להסיר BSA של האנק העודף מן הביצים באמצעות micropipette ולדשן בתוך דקות 1. שלב קריטי להצלחת diploidization באמצעות HS2 הוא המיון של עוברים נתקעו (שלב 7). מיון ראשוני של ביקוע 2 תאים עוברים באופן סימטרי בוחר עבור עוברים שהופכים מופרה ולהתחיל חלוקת תא (dispermy מדי פעם במהלך תוצאות IVF בעוברים כי מעבר ישירות 1- 4-תאים ב 35-50 MPF - עובר כזה צריך להיות מושלך). רכיבה על אופני Cell מתרחשות כל 15 דקות במהלך העוברי המוקדם אלה stגילים (35-50 MPF עבור מחזור התא הראשון, 50-65 MPF עבור מחזור התא השני, וכן הלאה), כך המיון של ביקוע עובר במהלך 10 הדקות הראשונות של כל מחזור תא מבטחים היעדר החפיפה בין מחזוריים ומדויק זיהוי של דוכן חלוקת התא. שינויים ופתרון בעיות כוחו של טיפול UV בשלב 3 (למשל זמן החשיפה, מנורת חשמל, מרחק מנורה) יכול להיות מותאם במידת הצורך על ידי בדיקת שיעורי הפריה הראשונית וכן תדירות haploids בהעדר טיפול עוקב HSII: את הסכום הנכון של חשיפת UV אין השפעה ניכרת על שיעורי הפריה תוך וכתוצאה מכך 100% של עוברי הפלואידים (ראה תוצאות נציג להבחין הפלואידים מעובר דיפלואידי). חשיפה UV יותר מדי גורם שיעורי הפריה מופחת ככל הנראה בשל השפעות מזיקות על תפקוד הזרע, תוך חשיפה UV מספיק מייצרת עוברים דיפלואידי בשל to איון שלם של DNA זרע. אם עובר להפגין פגמים התפתחותיים או קטלני לאחר חידוש מחשוף תא (שלב 7), טמפרטורת הלם חום בשלב 6 ניתן להפחית מעט (למשל 41.0 ° C) להגדיל הישרדות עובר; תנאים לגרום שברים שווים של 3 תאים סוטים נתקעו עובר 2 תאים במהלך מחזור התא השני (ולכן הם ליד סף השפעה על שכפול centriolar) לגרום מומים התפתחותיים עוקבים מינימאליים וגדילת הישרדות לאחר חידוש אופני תא . שיטת משלבת HS2 מנגנון נוח מהותי להעריך דוכן חלוקת תא (ולכן שכפול הגנום כולו), מאז תצפית הישירה של עובר כאשר הם מפתחים מאפשרת מעקב מחזור התאים השונים. בחירה ידנית של עוברים שעברו דוכן חלוקת מחזור אחד התאים מאפשרת יצירת אוכלוסייה אחידה של העובר diploidizedים. HS2 יכול להתבצע בכל זן גנטי דג זברה (למשל AB, טובינגן, WIK), כמו מעשי דוכן חלוקת תא אחד כמנגנון פנימי כדי לאשר שכפול ה- DNA. בנוסף, סמנים גנטיים גלוי מוחדר המתח ניתן להשתמש כדי להקל על זיהוי של עוברים diploidized (איור 3). לדוגמה, השימוש ביצים מנקבות כי הם הומוזיגוטים מוטציות רצסיביות בגנים פיגמנטציה, כגון זהב או לבקנים, ניתן לשלב עם הזרע נגזר wild-type זנים נושאת אללים נורמליים עבור גן הפיגמנטציה אותו. במצב זה, כי הזרע UV שטופלו לא יכול לתרום אללים פיגמנט wild-type, עוברים דיפלואידי הפלואידים ו הומוזיגוטים להפגין את המוטציה פיגמנט רצסיבי. בנוסף, diploids הומוזיגוטים להפגין מורפולוגיה wild-type ב 24 hpf, בניגוד חריף המורפולוגיה הפלואידים המורחבת פחות. השילוב של המראה של התכונה האימהית רצסיבי ואת אמברי הכוללתo מורפולוגיה מאשרת שכפול ploidy מוצלח. ניתן להשיג אישור נוסף באמצעות ספירת כרומוזום של עוברי מטופלים ואינם מטופלים. מערכת הסימון הגנטית המתואר לעיל, מבוסס על סמנים גנטיים גלויים רצסיבי, גם מאפשרת המאשרת בהעדר DNA שמקורם זרע הצאצאים, מאז העוברי וכתוצאת תערוכת פיגמנטציה wild-type רק אם הזרע לא כבר מומת באופן מלא על ידי טיפול UV . בהעדר מערכת סימון גנטי, מדגם של עוברים ניתן לאפשר להם להתפתח על בהעדר הלם החום כדי לאשר כל העוברים להפגין את המורפולוגיה הפלואידים ב 24 hpf, ובכך איון DNA זרע, שהיה שלם. יחד עם זרע מומת באופן מלא, מערכת סימון גנטית זהה זה גם מאפשר איתור כישלון גוף קוטב ספונטני פוטנציאלי. אירוע כזה יגרום להופעת עוברים המסומנים recessively עם מורפולוגיה דיפלואידי ללא טיפול diploidization. bo הקוטב ספונטניכישלון dy לא נצפה דג זברה אבל מדווח tropicalis Xenopus 18. אם נוכח מערכת נתונה, אירוע ספונטני זה יצטרך להיות מופחת או נשלט על מנת ליישם מניפולציה ploidy בצורה אופטימלית. מגבלות הטכניקה היכולת להפיק gynogenotes הקיימא מסתמכת על ההיעדר וריאנטים גנטיים רקע כאשר הומוזיגוטים הם מזיקים. לפיכך, ההצלחה של ההליך ישתנה בהתאם לזן הגנטי בשימוש. מבחר זנים גנטיים דרך מספר דורות של gynogenesis הוכח לשפר כדאיות 1. שיטת HS2, הפועל בשיתוף עם זרע מטופל לייצר עובר דיפלואידי, גם מאפשרת ייצור של עבר tetraploid בתדר גבוה. עם זאת, במקרה זה, בשל דיפלואידי לטרנספורמציה tetraploid, סמנים גנטיים אינם מאפשרים בקלות לאישור של כל genomשכפול דואר. במקרה זה, תצפית של דוכן מחזור תא אחד בעוברים מסונכרנים ובחירה עוברת נתקעו צריכה להבטיח מבחר tetraploid, וספירת כרומוזום ניתן להשתמש כדי לאשר עוד ploidy. משמעות ביחס קיים / שיטות חלופיות למרות שתואר על ידי Streisinger למעלה מ -40 שנים לפני 1, שיטת HS הרגילה לא נעשתה שימוש נרחב בשל יבול דל. במקום זאת, מניפולציה ploidy כמעט הסתמכה אך ורק על החלופה ויחסית יותר שיטה יעילה של לחץ מוקדם, שתוצאתה שכפול ploidy באמצעות עיכוב של חלוקת meiotic שנייה. עם זאת, תוצאות לחץ מוקדם בפרופורציות משתנות של הגן homozygosity 9,19, אשר מפחית מערכו ככלי גנטי. מחקרים אחרונים מראים כי HS2, שינוי של פרוטוקול HS רגיל, כלומר היישום של הדופק חום בזמן אחר במהלך מחזור התא הראשון (22-24<html> תקופת MPF ב HS2, לעומת 12-14 MPF ב HS רגיל) התוצאה עד 4 פעמים מגידול בתשואה של הפקות דיפלואידי הומוזיגוטים. הפעולה של דופק החום ניתן להסיק להתרחש מכוח העיכוב של שכפול צנטריול בתקופת הלם חום (22-24 MPF, במהלך מחזור התא הראשון) ועל כן חסרה את המשלים הנכון כדי ליצור ציר לתווך חלוקת התא במהלך מחזור התא הבא (50-65 MPF, התואם את מחזור התא השני). שכפול צנטריול יכול לחדש בהעדר ההלם החום במהלך מחזורי תא עקב, המאפשר פיתוח להמשיך לאחר דוכן מחזור אחד תאים מדויק. בגלל מחזורי שכפול שכפול ה- DNA צנטריול תלויים זה בזה 20, שכפול הדנ&quot;א ממשיך כרגיל גם במהלך חלוקת נתקע במחזור התא השני. התוצאה היא שכפול הגנום כולו מדויק homozygosis המלא. יישומים עתידיים = &quot;Jove_content&quot;&gt; מניפולציה ploidy הוא שיטה נוחה כדי להקל על ניתוח גנטי. בפרט, הצימוד של ייצור עובר הפלואידים (באמצעות הפריית מבחנה עם זרע UV שטופל) ושכפול ploidy (דרך HS2) מאפשר הישיר (בדור אחד) homozygosis בחלק גדול וקבוע (50%) של מוטציות נוכחות נקבה הטרוזיגוטיים. זה בתורו עוזר דורות מעקף נוספים אשר יידרשו להגיע homozygosis באמצעות צלבי טבע, צמצום כמות השטח הדרוש תוכניות גנטיות כזה. שיטה כזו יכולה להקל תוכניות גנטיות כגון מסך גנטי, בפרט אלה שיחייבו מספר דורות המעורבים מבוגרים ו / או גנים הורי ותוצאה, או אלה הקשורים אללים מרובים, כגון מסך מדכא / משפר 21. גישות דומות HS2 ניתן ליישם מינים אחרים בהפריה חיצונית, גם אלה כרגע לא בשימוש כמו מערכות גנטיות. שיטה זובפרט מנצל שמשך הזמן שעוברים הפריה באמצעות הייזום של אופני blastomere שבו דופק חום יכול להשפיע שכפול צנטריול וליצור דוכן חלוקת תא מדויק שכפול הגנום כולו מבלי לייצר תופעות התפתחותיות מזיקות. לפיכך, פרק הזמן מוקדם זה יכול להיחקר על רגישות הלם חום לפתח שיטות גנטיות מבוסס מניפולציה ploidy במערכות חיה אחרות.

פרוטוקול זה מאפשר מניפולציה של ploidy עוברי דג הזברה, כגון בדור של diploids gynogenetic הומוזיגוטים מן haploids gynogenetic (איור 1) או לייצור tetraploids. זו מושגת על ידי גרימת עיכוב cytokinesis המתאים מחזור התא אחת בדיוק (איור 2 א, 2 ב). מהעיכוב של מחזור מפתח cytokinesis מושג על ידי טיפול עם הלם חום. הפרוטוקול הסטנדרטי של הלם תרמי (HS) כמו במקור שתיאר Streisinger ועמיתיו מעורבים דופק הטמפרטורה במהלך MPF תקופת 13-15, וכתוצאה מכך דוכן חלוקת התא חד מחזור במהלך מחזור התא הראשון 1. היעילות של פרוטוקול זה שופרה לאחרונה על ידי סריקת מחזורי התא מוקדם עם חלון זזה זמני של טיפול בהלם חום. סריקה זו מזוהית בשלב מאוחר יותר עבור הלם חום, עדיין בתוך מחזור התא הראשון (22-24 MPF), כי תוצאות שיעור גבוה יותר של embryos עם דוכן חלוקת התא חד מחזור, אשר במקרה זה משפיע על מחזור התא השני 2. התצפית כי מניפולציות ניסיון במהלך מחזור התא הראשון להפריע חלוקת תא במהלך מחזור התא השני ולגרום DNA תוכן שכפול גם דווחה מיני דגים אחרים 3,4. אנו מתייחסים פרוטוקול שונה זה כמו חום 2 הלם (HS2 - המונח &quot;2&quot; משקף כי דופק החום מתרחש בנקודת הזמן יאוחר שיטת HS הרגילה, וכי עיכוב המחזור לתאים הנגרמים HS2 מתרחש במהלך מחזור התא השני ). מחקרים אלה הראו כי בסיס מעצר cytokinesis לאחר הלם חום הוא העיכוב של שכפול צנטריול במהלך הדופק החום, אשר משפיע היווצרות ציר ואינדוקצית תלם מחזור התא הבא. תוצאות HS2 בתשואות של עיכוב מחזור התא מתקרבות 100%, ושיעורים עד שכפול ploidy עד 4 פעמים גבוהות יותר מאשר תקן HS 2. עוברים מטופלים שנינותחה הלם חום במהלך רכיבה על אופני תא blastomere מפגינים רבים השפעות מזיקות, הדבר המצביע על כך הלם החום משפיע מספר רב של תהליכים הנדרשים תא חלוק 2. מצד השני, אם הלם החום מוחל לפני תחילת רכיבת תא (פרק הזמן 0-30 MPF), זה משפיע כנראה עולה בקנה אחד עם הפרעה ספציפית עם שכפול צנטריול ואינו נראה להשפיע תהליכים בתא חיוניים אחרים 2 . מחקרים אלה הראו כי הזמן לפני התחלת חלוקת blastomere שנראה תקופת התפתחותית מקובלת באמצעות הלם חום ככלי לתמרן ploidy במיוחד באמצעות עיכוב צנטריול. הגורם הבסיסי של הסלקטיביות לכאורה הלם חום על שכפול צנטריול אינו ידוע, אך עשוי להיות קשור שפלה סלקטיבית של substructures centrosome נצפה תחת עומס חום בסוגי תאים מסוימים, כגון לויקוציטים 5. סנכרון זמני של דה העובריvelopment מושגת על ידי הפריה חוץ גופית (IVF). השימוש בתרומת זרע מגבר מטופל במהלך תוצאות הפריה בעוברים דיפלואידי שעם HS2 הנגרמת דוכן cytokinesis חד מחזור להפוך tetraploid. השימוש בתרומת זרע מגבר שטופלו UV, אשר נושאת crosslinks כי להשבית DNA, תוצאות בעוברים gynogenetic הפלואידים 6, שעם HSII הנגרמת דוכן cytokinesis חד מחזור להפוך 2 gynogenetic diploids. בגלל שכפול הגנום כולו וכתוצאה מכך, את diploids gynogenetic האחרון הם הומוזיגוטים בכל מוקד יחיד בגנום. לקבלת תמציתיות, אנו מתייחסים gynogenetic עוברים הפלואידים כמו &quot;haploids&quot;, ועוברים דיפלואידי gynogenetic הומוזיגוטים כמו &quot;diploids הומוזיגוטים&quot;. אם קיימא ופורה, ניתן להשתמש diploids הומוזיגוטים ליזום קווי סטרילי וקטלני חינם. homozygosity ישיר המושרה על ידי HS2 צריך גם לשלב בקלות ניתוח גנטי או מסכי גנטי, מאז diploids הומוזיגוטים מן הנקבות כי הם נשאים הטרוזיגוטיים של mutשיעורי תערוכת ations של homozygosity בבית גבוה וקבוע (50%) יחסים 2. הפרוטוקול הבא מתאר צעדים לביצוע HS2 ולגרום שכפול ploidy עם homozygosity מלא. לייצור tetraploid, פתרון הזרע צריך להיות מטופל. לייצור דיפלואידי הומוזיגוטים, הזרע צריך להיות מומת על ידי טיפול UV. בנוסף, כפי שמתואר הדיון, סמני פיגמנט גלויים יכולים לשמש גם כדי להקל על זיהוי של diploids הומוזיגוטים. תאומת דג זברה בעיקר במהלך השעות 3 הראשונות של הייזום של מחזור האור שלהם 7, ושניהם המבוגרים והביצים רגישות מקצבי יממת 8, כך להשגת התוצאות הטובות ביותר את תהליך ההזרעה המלאכותי אמור להתרחש בתוך פרק זמן זה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zebrafish mating boxes</td>
			<td style="width:71px;">Aqua Schwarz</td>
			<td style="width:119px;">SpawningBox1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgSO4-7H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine</td>
			<td style="width:71px;">Western Chemical</td>
			<td style="width:119px;">Tricaine-D (MS 222)</td>
			<td>FDA approved (ANADA 200-226)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">77-86-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">920-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fish net (fine mesh) (4-5 in)</td>
			<td style="width:71px;">PennPlax</td>
			<td style="width:119px;">(ThatFishThatPlace # 212370)</td>
			<td>available in ThatFishThatPlace</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>available in most standard stores</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14091-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissecting forceps</td>
			<td style="width:71px;">Dumont</td>
			<td style="width:119px;">SS</td>
			<td>available from Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting stereoscope (with transmitted light source)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Reflective light source (LED arms)</td>
			<td style="width:71px;">Fostec</td>
			<td style="width:119px;">KL1600 LED</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri plates 10 cm diameter</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipetteman P-1000</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette tips 1000 &#181;l</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Narrow spatula</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Depression glass plate</td>
			<td style="width:71px;">Corning Inc</td>
			<td style="width:119px;">722085 (Fisher cat. No 13-748B)</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">UV lamp</td>
			<td style="width:71px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">Model XX-15 (cat No. UVP18006201)</td>
			<td>available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV glasses</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paper towels</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:71px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">06-666-11</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Timer stop watch</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wash bottle</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24020500</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tea strainer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>available in kitchen stores</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">beakers, 250 ml (2)</td>
			<td style="width:71px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1000250</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">water bath (2)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Hanks&#8217; Solution 1</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 2</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 4</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 5</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>1.23g MgSO4 &#8729; 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Premix</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;&#160; 1.0 ml Solution 2;&#160; 1.0 ml Solution 4;&#160; 86.0 ml ddH2O;&#160; 1.0 ml Solution 5. Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 6</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Solution (final solution)</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>Combine 990ul of Hank&#8217;s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment

מניפולציה של ploidy מאפשר טרנספורמציות שימושי, כגון diploids כדי tetraploids, או haploids כדי diploids. בשנתי ה rerio Danio דג הזברה, במיוחד בדור של diploids gynogenetic הומוזיגוטים שימושי בניתוח גנטי משום שהיא מאפשרת את הייצור הישיר של הומוזיגוטים מאם הטרוזיגוטיים יחידה. מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה לשכפול ploidy מבוסס על הדופק חום במהלך מחזור התא הראשון, 2 הלם תרמי (HS2). באמצעות עיכוב של שכפול צנטריול, שיטה זו גורמת דוכן חלוקת התא מדויק במהלך מחזור התא השני. דוכן החלוקה חד מחזור המדויק, מצמיד את שכפול הדנ&quot;א מעושה, תוצאה הוא שכפול הגנום כולו. פרוטוקולים הקשורים בשיטה זו כוללים ביצת אוסף זרע, UV לטיפול זרע, הפריה חוץ גופייה ודופק חום לגרום לעיכוב חלוקת מחזור אחד תאים ושכפולים ploidy. גרסה שונה של פרוטוקול זה יכול להיות מיושמתploidy כדי לגרום לשינויים בעלי חיים אחרים.

למרות דוכן cytokinesis מחזור חד-תאי, שכפול ה- DNA מתרחש בדרך כלל עובר כאלה, וכתוצאה מכך שכפול של תוכן DNA של העובר (איור 1). פרוטוקול הלם חום Streisinger (HS הרגיל) כרוך דופק חום במהלך הפרית תקופת 13-15 דקות (MPF) ומשרת מעצר cytokinesis בעיקר במהלך חלוקת התא העוברית הראשונה ב 35 1,2 MPF, ואילו השיטה הנגזרת מתוארת כאן, המכונה 2 הלם תרמי (HS2), משתמש הלם חום במהלך MPF התקופה 22-24 ומשרת מעצר cytokinesis במהלך חלוקת התא העוברית שני ב 50 MPF (איור 2; 2,3,4). בגיל 24 hpf, תצפית של העוברים לאפשר לקבוע אם יש להם מאפיין מורפולוגיה תקינה של עוברים דיפלואידי דיפלואידי או הומוזיגוטים, או בגוף קצר ורחב ציר מאפיין מורפולוגיה של עוברים הפלואידים (איור 3) <sup&gt; 6. אם נבחר כראוי בשל איחור במחזור חד-תאי, כל העוברים צריכים להפגין מורפולוגיה דיפלואידי נורמלית. בנוסף, בהעדר מוטציות המזיקות diploids הומוזיגוטים הם קיימא, ואילו עבר הפלואידים תמיד להפגין קטלניים לאחר 2-3 ימים של התפתחות. שימוש זן גנטי רקע AB / טובינגן מעורב שלא נבחר, תשואות של אינדוקצית דיפלואידי הומוזיגוטים ידי HS2, כמו assayed ידי מורפולוגיה ב 24 hpf, לנוע בין 10% ל -50% 2. בחירת הקווים ידי התפשטות באמצעות שיטות gynogenetic הוכחה להגדיל את התשואה של ייצור דיפלואידי הומוזיגוטים 1. אישור של שכפול הגנום כולו מדויק הצפוי לנבוע עיכוב של מחזור mitotic אחד ניתן להשיג על ידי ספירת כרומוזום 2,3,4,15 או לכמת את קוטר הגרעין 3,4. התפתחות תקינה של דג זברה כמו בעלי חיים אחרים היא רגישה מאוד למספר כרומוזום ליקויי 16, ואת התצפית כי diploids הומוזיגוטים להיות נמבוגרים iable ופורה 1,2,9 מספק ראיות נוספות עבור diploidization מוצלח. Ploidy בעובר דג הזברה ניתן לעמוד גם באמצעות שיטות מולקולריות כגון ניאון הכלאה באתרו (FISH) של ספירת הגן גרעיני תא ניאון מיון מופעל (FACS) לכמת תוכן DNA 16. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54492/54492fig1.jpg" /> איור 1: סוגי הפריה. (א) להזדווגות. הגמטות זכר ונקבה הם לא מטופלים, וכתוצאה מכך דיפלואידי טבעי. (ב) הזרע מטופל עם UV, וכתוצאה מכך להרס של DNA האבהי ואת הייצור של zygotes הפלואידים. אם לא מטפלים, haploids כאלה אינם שורדים בעבר יום 2-3 של פיתוח. (C) טיפול zygotes הפלואידים עם 2 הלם תרמי (HS2) מעכב מחזור אחד cytokinesis של מיטוזה בעובר המוקדם. מחזור התא זה דוכן, זוגד כדי שכפול הדנ&quot;א מעושה, מייצר diploids הומוזיגוטים שיכול להיות מבוגרים קיימא ופורה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54492/54492fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54492/54492fig2.jpg" /> איור 2: HS2 מקדם שכפול הגנום כולו על ידי השתהות מחזור התא השני. (א) מחשוף Cell דפוס של עובר מטופל בשלושה מחזורי התא הראשונים, המקביל ל 2, 4, ו -8 תאי עוברים. (ב) תוצאות הטיפול HS2 בתא אחד-מחזור של חלוקת תאים במהלך מחזור התא השני. במהלך הדוכן, תוצאות סינתזת DNA מתמשכות עוברים עובר diploidization, משני הפלואידים כדי דיפלואידי (n -&gt; 2n) או דיפלואידי כדי tetraploid (2n -&gt; 4n) (ראה טקסט). לאחר דוכן זה, העובר יתחדש חלוקת התא, עם newly רכשה ploidy. (C) HS2 שטופל עובר יכול להפגין מגוון של סדרי blastomere בהתאם אם בלסטומרים להפגין עיכוב חלוקת תאים במהלך מחזור התא השני: i) &quot;אין דוכן&quot;: לא מייצג blastomere עיכוב, וכתוצאה מכך 2: מאפיין הסדר -2 4 תאים עוברים שלב, ii) &quot;דוכן חלקי&quot;: רק באחת משני בלסטומרים מפגין עיכוב, ותוצאה הוא 2 סוטה: הסדר 1, ו- III) &quot;נתקע&quot;: הן בלסטומרים להפגין עיכוב, וכתוצאה מכך 1: 1 מאפיין סידור עובר שלב 2 תאים. ב (א - ג), גרעינים מיוצגים עיגולים כחולים, עם האירוע diploidization מיוצג על ידי הרחבה של גודל הגרעין. ראה התייחסות 2 עבור תרשים המתאר התנהגות centriolar כבסיס המוצע עבור דוכן חלוקת התא. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54492/54492fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג versi גדול</a>על של נתון זה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54492/54492fig3.jpg" /> איור 3: מורפולוגיה של diploids טבעי, haploids ו gynogenotes. (א) מורפולוגיה עוברית רגילה של דיפלואידי שהושג באמצעות צלבים טבעיים. (ב) עובר הפלואידים מפגינים ציר גוף קצר ורחב יותר. (C) diploids הומוזיגוטים יש מורפולוגיה גוף תקינה. עובר גם לשאת מוטציה רצסיבית של זהב גן הפיגמנטציה כדי להקל על מעקב ירושת DNA הורית: אמהות הם נישאים הומוזיגוטים מוטצית זהב, ואבות wild-type עבור הגן הזה. לפיכך, diploids הטבעי, הטרוזיגוטיים זהב, תערוכת פיגמנטציה wild-type, ואילו הן haploids (hemizygous עבור זהב) ו diploids הומוזיגוטים (הומוזיגוטים זהב) תערוכת פיגמנטציה מוטציה. סרגל קנה מידה = 0.5 מ&quot;מ. לוחות שונים מן מחדשference 2, מודפס ברשות. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54492/54492fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פִּתָרוֹן </td><td> רכיבי </td><td> תנאי אחסון </td></tr><tr><td> פתרון &#39;הנקס 1 </td><td> 8.0 גרם NaCl, ו 0.4 גרם KCl ב 100 מ&quot;ל DDH 2 O </td><td> חנות ב 4 מעלות צלסיוס </td></tr><tr><td> הפתרון &#39;הנקס 2 </td><td> 0.358 גרם נטול מים Na 2 HPO 4, ו 0.6 גרם KH 2 PO 4 ב 100 מ&quot;ל DDH 2 O </td><td> חנות ב 4 מעלות צלסיוס </td></tr><tr><td> פתרון &#39;הנקס 4 </td><td> 0.72 גרם CaCl 2 ב 50 מ&quot;ל DDH 2 O </td><td> חנות ב 4 מעלות צלסיוס </td></tr><tr><td> הפתרון &#39;הנקס 5 </td><td> 1.23 גרם MgSO 4 ∙ 7H 2 O ב 50 מ&quot;ל DDH 2 O </td><td> חנות ב 4 מעלות צלסיוס </td></tr><tr><td> Premix של האנק </td><td> להוסיף, לפי הסדר הבא: 10.0 מ&quot;ל פתרון 1, 1.0 מיליליטר פתרון 2, 1.0 מיליליטר פתרון 4, 86.0 מ&quot;ל ddH2O ו -1.0 מ&quot;ל פתרון 5 </td><td> חנות ב 4 מעלות צלסיוס </td></tr><tr><td> פתרון &#39;הנקס 6 </td><td> 0.33 גרם NaHCO 3 ב 10 מ&quot;ל DDH 2 O </td><td> הכן טרי בבוקר של הליך ההפריה החוץ-גופית </td></tr></tbody></table> טבלה 1. הכנת פתרונות של האנק.

Watch this Scientific Journal Video about Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment at JoVE.com

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

פרוטוקול שונה עבור מניפולציה ploidy משתמשת הלם החום להשפיע על דוכן אחד-מחזור ב cytokinesis בעובר המוקדם. פרוטוקול זה מודגם דג הזברה אבל עשוי לחול על מינים אחרים.

מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

ploidy-manipulation-of-zebrafish-embryos-with-heat-shock-2-treatment

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K Views.  University of Wisconsin.  פרוטוקול שונה עבור מניפולציה ploidy משתמשת הלם החום להשפיע על דוכן אחד-מחזור ב cytokinesis בעובר המוקדם. פרוטוקול זה מודגם דג הזברה אבל עשוי לחול על מינים אחרים. 

Video: Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

הדור של Parabiotic דג הזברה עוברים ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות<em&gt; במבחנה</em&gt; הבשלת ביצית דג הזברה

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...