We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.

נהלי כל החיה היו בהתאם לחקיקה מקומית ואיחוד האירופי על ההגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות ניסוי (Directive 86/609 / EEC) ועם המלצות שהועלו על ידי הפדרציה של אגודות מדע בעלי חי מעבדה אירופאיות (FELASA). שניהם C57BL / 6 עכברים ועכברים FPR-RS3-i-ונוס שוכנו בקבוצות של שני המינים בטמפרטורת החדר על מחזור אור 12 שעות / כהה עם מזון כרצונך מים זמין. בניסויים צעירים (6-20 שבועות) של שני מינים היו בשימוש. אין הבדלים ברורים תלויה מגדרים נצפו. 1. פתרון כנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן S 1 פתרון תאי: 4- (2-הידרוקסי-אתיל) piperazine-1-ethanesulfonic חומצה (HEPES) שנאגר פתרון תאי המכיל (מ&quot;מ) 145 NaCl, KCl 5, 1 2 CaCl, 1 2 MgCl, 10 HEPES; pH = 7.3 (מנוכה עם NaOH); osmolarity = 300 mOsm (מנוכה עם גלוקוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן extracelluS 2 פתרון Lar: carbogen-מחומצן (95% O 2, 5% CO 2) פתרון תאיים המכילים (מ&quot;מ) 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 5 KCl, 1 2 CaCl, 1 MgSO 4, 5 BES; pH = 7.3; osmolarity = 300 mOsm (מנוכה עם גלוקוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% פתרון agarose טמפרטורה נמוכה gelling (S 3) להטבעת רקמות: 4% agarose טמפרטורה נמוכה gelling. ממיסים 2 גרם נמוכה gelling agarose ב 50 מ&quot;ל של S 1 בבקבוק מעבדה זכוכית 100 מ&quot;ל יחד עם בוחש מגנטי. כדי להמס את agarose, הנחת את הבקבוק בתוך אמבט מים (עם מכסה לא סגור היטב) על 70 מעלות צלזיוס למשך כ 20 דקות או עד הפתרון הופך שקוף תוך ערבוב. להתקרר ולשמור agarose מומסת באמבט מים שני ב 42 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן S 4 פתרון התאי: פתרון פיפטה המכיל (מ&quot;מ) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0.3 CaCl 2 (Ca חינם 2 + = 110 ננומטר), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7.1 (מנוכה עם KOH); osmolarity = 290 mOsm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות / להתאים רכב S 1, S 2 ו- S 4 פי תכנון ניסוי בודד (למשל, חוסמים תרופתיים לבודד סוגים מסוימים של זרמים מופעלי מתח). </li></ol> 2. סביבת עבודה כנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מחמצני תא אחסון פרוס עם S 2 לפחות 30 דקות לפני לנתיחה, במקום על קרח למשך התאמת טמפרטורה ו- pH פתרון oxygenate ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מאגר עבור הפרוסה superfusion על הקלטת התקנה עם S 2 ו חמצן ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני לנתיחה, למלא vibratome קאמרית עם S 2 ולסדר קרח כתוש סביב החדר. לחלופין, להעביר פתרון מחומצן חילוף קרח קר מחמצנים קאמריים לתוך vibratome קאמרית ולשמור מחמצנים ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרים כלים מתכלים כירורגיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חבילת ג&#39;ל קרח מתחת לנתחמיקרוסקופ, מכסים במגבת נייר כדי למנוע רקמות VNO מן המקפיא אל החלק התחתון של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סכין גילוח נקי על ידי שטיפה קצרה באתנול 70% ומים מזוקקים הר כדי vibratome. חלף עבור כל פגישת חיתוך. </li></ol> 3. VNO Dissection והטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב בעלי חיים על ידי חשיפה קצרה ל- CO 2 לערוף באמצעות מספרי כירורגיות חדים. הערה: ככל שזמן להקריב את החיה לשים את הקפסולה VNO על קרח הוא קריטי, למזער את הזמן פחות מ -2 דקות. כדי לשמור על כדאיות רקמות, להטביע הן VNOs מלא גזור agarose תוך פחות מ -30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הלסת התחתונה עם מספרי כירורגיות גדולים. זן דרך חלל הפה ופצע את העצמות ושרירי לסת התחתונות של כל צד בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את החלק הנותר של הראש הפוך על צלחת פטרי הגדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך כלפי חוץ את העור של הלסת העליונה וסביב קצה האף עם מלקחיים בינוניים כדי לקבל גישה טובה יותרחותכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספרי עצם לחתוך את החלק הגדול ביותר של החותכות בזווית ~ 45 ° בכיוון המקורי (איור 1 א). זה יקל הסרת הקפסולה VNO מחלל האף. הערה: אין לחתוך את שורש השן כדי למנוע נזק קצה הקפסולה VNO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את החיך העליון הנוקשה חלק המקורי שלה עם מלקחיים בינוניים ובזהירות לקלף בחזרה בחתיכה אחת בזווית שטוחה (איור 1 ב). הערה: שוב ושוב לשטוף עם S קר כקרח 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים באביב מיקרו לחתוך את היתוך הגרמי בין קצה העצם vomer והלסת. הכנס את הטיפים מספריים עם החלק המעוגל של קצה מצביע כלפי חוץ מן VNO בזהירות לחתוך את העצם בצעדים קטנים משני שמאל לרוחב בצד ימין הקפסולה VNO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את הקפסולה VNO, להשתמש במספריים באביב מיקרו לחתוך את העצם vomer בחלק הזנב ובזהירות להרים את עצם vomer מתוך nASAL חלל באמצעות מלקחיים בינוניים. מיד להעביר את VNO אל צלחת פטרי קטנה תחת מיקרוסקופ סטריאו על חבילת ג&#39;ל הקרח שבו השלבים הנותרים של הניתוח יבוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את VNO כמות קטנה של קר כקרח S 2 כדי למנוע את רקמות מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את כמוסות סחוסים המכילות רקמות הרכות VNO ידי גרירה האחורית של עצם vomer עם מלקחיים בינוניים. מקם את הקפסולה עבור תצוגה הגבי כך פיצול בין שני VNOs הופך לגלוי (איור 1D i). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקצה מלקחיים בסדר להפריד הסחוס הוא כמוסות VNO מהעצם המרכזית, תוך שמירה על עצם vomer מרותק בחלק האחורי. הערה: שימוש במלקחיים רק בשולי הקפסולה הסחוס להיזהר מאוד שלא לחדור מבעד הסחוס כמו האפיתל החישה העדין נפגע בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שני VNOs מופרדים, להתחיל להסיר את הסחוס encapsulating האשוחיםt VNO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את השולים העליונים של קפסולה עם אחד מלקחיים בסדר התפצל קיר הסחוס שצורף בעבר עד עצם vomer (בצד המדיאלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר הנותרים סחוס להפוך את VNO עם צד לרוחב המעוגל שלה לתחתית המנה ובבטחה להצמיד הסחוס בצד אחד באמצעות מלקחיים. בזהירות להזיז את מלקחיים בסדר השני מהצד האחורי בזווית מאוד שטוח בין סחוס VNO לרופף את הקשר בין רקמות הסחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לקלף את VNO מן הסחוס על ידי מחזיק אותו קצה הזנב שלה, כדי למנוע ניזק האפיתל החושי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר VNO היא דחסה הקפסולה, הקפד להסיר את כל חלקי הסחוס הקטנים הנותרים כמו כל חלקים נותרים של סחוס תנתק את הרקמה שמסביב agarose במהלך תהליך החיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום טיפה קטנה של קר כקרח S 2 על VNO גזור הראשון כדי למנוע נזק לרקמות. כלי דם גדולים על wil צד לרוחבl להיות גלוי המציין כי האיבר עדיין לא נפגע ולא נפגע גס במהלך הניתוח (איור 2 א ii). במקרה כלי דם ניזוק, הוא עדיין יהיה כדאי להמשיך עם חותך את VNO עוד המורפולוגיה הכוללת לא נפגמה בבירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לנתח את VNO השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להטביע את VNOs, למלא שתי צלחות פטרי הקטנות אל שולי עם מומסת S 3 (מאוחסן באמבט מים ב 42 ° C; ראה 1.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את VNO על קצה זנב הרחב עם מלקחיים בסדר, כדי למנוע פגיעת האפיתל החושית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את VNO ב agarose והעבר אותו אופקי הלוך ושוב כמה פעמים כדי להסיר את הסרט של פתרון תאי וכן כל בועות אוויר מפני השטח שלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את VNO אנכית עם קצה הזנב מול התחתון של המנה. במקום צובט את VNO עם המלקחיים ישירות, לשנות את הכיוון על ידי הזזת קצה מלקחי proximi הקרובty אל VNO. הערה: האורינטציה במהלך ההטבעה היא קריטית שכן היא קובעת מטוס פרוס ונגישות עצב סנסורי במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מנות על חבילת ג&#39;ל הקרח ולהמתין עד agarose יש הקרושה. הערה: אין לשנות את הנטייה VNO לאחר agarose החלה לחיזוק כמו זה יהיה לנתק את הרקמה מן agarose שמסביב. </li></ol> 4. רקמות VNO עטרה פרוסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מרית קטנה כדי להסיר גוש agarose מצלחת קטנה לתוך המכסה של צלחת פטרי גדולה, להעיף את agarose במהופך השארת טיפ הזנב של VNO כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הגוש לתוך צורת פירמידה באמצעות אזמל כירורגי (3-4 מ&quot;מ בקצה, 8-10 מ&quot;מ בתחתית). יש להיזהר שלא לגרום נזק לרקמות מוטבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בדבק סופר לתקן את בלוק בצורת פירמידה למרכז הצלחת הדגימה vibratome ולחכות ~ 1 דק &#39;על הדבק להתייבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את צלחת דגימת ג החיתוךhamber ולהכין את VNO השני, בהתאם. שמור צלחת עם הדגימה השנייה ב 4 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש microtome להב רוטט עם ההגדרות הבאות: עובי: 150-200 מיקרומטר; מהירות: 3.5 au = 0.15 מ&quot;מ / sec; תדירות: 7.5 au = 75 הרץ. עבר פרוסות לתא מחמצנים עד לשימוש לאחר שבדק פרוסת מורפולוגיה לזמן קצר תחת מיקרוסקופ לנתח. פרוסות יכולות להישמר במשך כמה שעות. </li></ol> 5. הקלטות אלקטרו מתא בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הקלטות, משתמש במיקרוסקופ קבועה בשלב זקוף מצוידות מטרות טבילה במים, Dodt או בניגוד הפריע הפרש אינפרא אדום (IR-DIC), ואת קרינת EPI וכן CCD-מצלמה מקוררת. עבור רכישת נתונים, השתמש מגבר תיקון- clamp, לשלב את הראש, AD / לוח הממשק DA לבין מחשב (כולל תוכנת צריבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מלאי של 10-20 טפטפות תיקון (4-7 MΩ). טפטפות משוך מן נימי זכוכית בורוסיליקט (1.50 מ&quot;מ OD / 0.86 מזהה מ&quot;מ) usinחולץ micropipette ga ו-פולנית אש עם microforge. הערה: אש ליטוש הטיפים פיפטה הוא חיוני כאשר תיקום VSNs קטן למדי. זה יעזור למנוע פקיעת קרום התא בעת הפעלת לחץ שלילי על מנת לקבל חותמת עמידות גבוהה. לאחר ליטוש פתיחת פיפטה צריך להיות כ 1 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור טפטפות בצנצנת אחסון פיפטה כדי למנוע נזק הצטברות אבק עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מערכת זלוף ידי מילוי מאגרי פתרון צינורות פי תכנון ניסוי. הערה: הסר בועות אוויר וצינורית לחלוטין כפי שהם יפריעו הקלטות אלקטרו בחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם הלחץ להשיג ~ 3 מ&quot;ל / זרימת דקות. הערה: בלחצים גבוהים יגרמו לתנועה של פרוסת רקמות וכן סיום הקלטות אלקטרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר VNO פרוסה תא הדמיה ולתקן את העמדה פרוסה באמצעות עוגן נירוסטה חוטית עם 0.1 מ&quot;מ עובי syntסיבי hetic (התרשים 2B - C). הערה: אין לכסות את פרוסת רקמה עם אחד הנושאים סיבים סינתטיים אלא agarose סביב פרוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לחדר ההדמיה כדי הקלטה להתקנה פרוסה Superfuse ברציפות עם S מחומצן 2 בטמפרטורת החדר באמצעות יישום אמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את נימי היניקה אל פני השטח של הפתרון ליצור יניקה איטית חליפין קבועים של פתרון אמבטיה. התאם את &quot;עיפרון זלוף&quot; 8-in-1 רב חבית מעל וקרוב החלק הלא-חושית של הפרוסה VNO המכיל את כלי הדם (איור 2 ג, 3 ​​א) 50. זה יהיה מועיל לארגן עיפרון זלוף פיפטה ההקלטה להיות מול הפרוסה מכיוונים מנוגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אלקטרודה השוואתית ופתרון אמבטיה באמצעות גשר אגר בצורת L (מלא 150 KCl מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו פיפטה תיקון עם פיפטה פתרון S 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר פיפטה על האלקטרודה תיקון כסף מצופה כלוריד מחוברת אל במת הראש ללא מקרצף את הציפוי ולצרף בתקיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ חיובי קלה (כ 1 מ&quot;ל על מזרק פלסטיק 10 מ&quot;ל) ל פיפטה את התיקון לפני הכניסה לאמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את פיפטה לתוך האמבט באמצעות מניפולטורים מיקרו רחוק מספיק כדי להיות מסוגל להטביע את המטרה מבלי להכות אותו (2D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התנגדות פיפטה (PIP R, בין 4-7 MΩ) באמצעות תוכנת אלקטרופיזיולוגיה מחובר לשלב את הראש. הערה: אם R פיפ &lt;4 MΩ קצה זכוכית שבורה. אם R פיפ&gt; 10 MΩ, קצה יש סתימה ככל הנראה ואת פיפטה חייב להיות מוחלף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את פרוסת VNO עם המצלמה CCD באמצעות התערבות ההפרש לעומת אינפרא אדום אופטימיזציה (DIC) ולזהות תאים FPR-RS3-i-ונוס לבטא (או נוירונים שכותרתו דומה) באמצעות תאורה פלואורסצנטיו קוביית מסנן מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס פלורסנט היעד או תאים שאינם פלורסנט בהתאם לעיצוב ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתקרב גוף התא, השתמש גלגלי יד רגישות מקסימלית. בשל לחץ חיובי, שקע קטן בקרום סומה תא הופך לגלוי פעם קצה פיפטה נמצא בסמיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר לחץ חיובי להפעיל לחץ שלילי קל למצוץ בקרום התא על מנת להשיג חותם עמידות גבוהה (1-20 GΩ). החל יניקה קצרה ועדינה לשבש את קרום התא ולבסס את תצורת כל התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התנגדות גישה ללא הרף במהלך הניסוי. הערה: רק כולל נוירונים מפגינים התנגדות גישה קטנה ויציבה (≤3% של מכניסה; שינוי &lt;20% במהלך הניסוי) לתוך ניתוח. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

VNO הוא מבנה chemosensory מאתר semiochemicals. נכון להיום, רוב הקולטנים vomeronasal נותר deorphanized כזוגות קולטן ליגנד רק כמה זוהו. בין אלה, V1rb2 תואר להיות מופעל על-ידי יצרן פרומון 2-heptanone שתן זכר 30, V2rp5 להיות מופעל על ידי ESP1 פרומון ספציפי זכר 57 וכן V2r1b ו V2rf2 כדי להיות מופעלים על ידי פפטידים MHC SYFPEITHI 48 ו SEIDLILGY 58, בהתאמה. תנאי מוקדם להבנת יחסים ליגנד לרצפטור אות תמרה הוא ידיעת מאפייני biophysical של אוכלוסיות VSN מוגדרות בסביבת ילידים. תכונות הממברנה פסיביות ואקטיביות, conductances היוני המתח מגודר ודפוסים פריקים פוטנציאל פעולה להגדיר את האמצעים ואת המידה שבה נוירונים קולטן להגיב chemosensory גירויים. קלטות אלקטרו בחתכי רקמה אקוטיות, בפרט, אשרle-תא הקלטות מהדק תיקון לספק שיטה מצוינת כדי לנתח תכונות אלה בפירוט רב. שלב קריטי עבור הקלטות פיסיולוגיות מוצלחות ואמינות בחתכי רקמה הוא ההכנה עצם. כדי למקסם את תוחלת הזמן לבצע ניסויים, הרקמה חייבת להיות פרוסה והועברה פתרון מחומצן קר כקרח מייד לאחר דיסקציה. לאחר מכן, יכולות להישמר פרוסות במשך כמה שעות המאפשרות ניתוח של מספר לא מבוטל של תאים לכל יום ניסיוני. זה לוקח קצת תרגול כדי לקצר את הזמן לנתח ולהטביע הן VNOs של חיה אחת פחות מ -30 דקות. לאחר מכן, שיעור ההצלחה של נסיין מנוסה כדי להשיג כמה פרוסים שלמות רקמות עם תאי קיימא הוא הרבה מעל 75%. ביצוע הקלטות מהדק תיקון הוא גישה ניסויית נמוכה תפוקה בהשוואת הדמית Ca 2 +. עם זאת, היא מאפשרת ניתוח מפורט יותר תכליתי פעילות במישור מתחיל מתא הבודד עם זמני הרבה יותר גבוהרזולוציה. בתצורה כל התא, המדיום התאי הוא dialyzed ידי פתרון פיפטה. בעוד הפתרון פיפטה עלול שלא להציג את רכב cytosolic המדויק, הוא מספק את הנסיין עם שליטה מדויקת על שני תנאים יוניים חוּץ ו תאיים. לפרשנות אמינה של תוצאות, ניטור רציף של התנגדות גישה ועדכן דליפה הוא קריטי. לפעמים, עלייה משמעותית או שינוי חזק התנגדות גישה או לדלוף מוביל נוכחי לתוצאות uninterpretable ובכך דורשת הקלטות אלה אינם שורדים. יתר על כן, חשוב לציין כי כמה תרכובות תרופתיות בלתי הפיכה להיקשר טיוח לנכון להחליף פרוסות אחרי כל הקלטה. הקלטה בתצורה מצורפת התא מונעת דיאליזה של רכיבים תאיים אינו משפיע על פוטנציאל הממברנה של התא. לכן, טכניקה זו מספקת דרך פחות פולשנית ומהירה יחסית של הקרנה. עם זאת, זה approאח מוגבל, בדרך כלל מרישום זרמי קיבולי פעולה סופר-סף מונחה פוטנציאל מהחלק החיצוני של קרום התא. קלטות Loose-תיקון הוכיחו להיות מתאים לניתוח ההתנהגות עם העלייה של מספרים גדולים יותר של עצב סנסורי בפרוסות VNO 38,54. המודל המהונדס מועסק כאן מספק כלי אמין לזהות ולנתח את אוכלוסיית FPR-RS3 להביע VSNs. יתר על כן, הטכניקה המתוארת כאן ניתן להרחיב קווים שניים ללא תלות בגנוטיפ שלהם. למרות היתרון העצום של חוקרת לסוג תא מוגדר, באמצעות עכברים מהונדסים מגביל ניסויים לקווים הזמינים. לאחרונה, עם זאת, עריכת הגנום ממוקדת הפכה מהר יותר נוח עם טכניקת CRISPR / Cas9 59. לסיכום, ממוקד הקלטות תיקון- clamp בחתכי רקמת vomeronasal חריפות לספק גישה צדדית לאפיין תכונות biophysical והפיזיולוגיות של מוגדר populatיון של עצב סנסורי.

רוב בעלי החיים להסתמך בכבדות על החושים הכימיים שלהם לתקשר עם סביבתם. חוש הריח ממלא תפקיד חיוני למציאת והערכת מזון, הימנעות טורפים ואיתור שותפים ההזדווגות מתאים. ברוב היונקים, מערכת חוש הריח מורכב מלפחות ארבעה תת היקפי אנטומית והן מבחינה תפקודית ברורים: אפיתל ההרחה הראשי 1,2, גנגליון Grueneberg 3,4, האיבר במחיצה של Masera 5,6 ואת איבר יעקובסון. VNO כוללת המבנה החושי ההיקפי של מערכת חוש ריח האבזר (AOS), אשר ממלאת תפקיד מרכזי באיתור לאותות כימיים המעבירים מידע על זהות, מגדר, מעמד חברתי ומדינה מינית 7-10. VNO ממוקם בבסיס של מחיצת האף ממש מעל החיך. בעכברים, זה הוא צינור דו צדדי שהסתיים סמיות מגודר בתוך הקפסולה סחוסי 11-13. האורגן מורכב הן של epithe חושית המדיאלי בצורת חצי סהרlium כי מטפח את VSNs ושל חלק הלא-חושי בצד לרוחב. בין שניהם epithelia טמון לומן מלא ריר אשר מחובר אל חלל האף דרך הצינור הצר vomeronasal 14. כלי דם לרוחב גדולים בתוך הרקמה הלא-החושית מספקים מנגנון שאיבת כלי דם כדי להקל על כניסה של גדולות יחסית, בעיקר מולקולות בלתי נדיף כגון פפטידים או חלבונים קטנים לתוך לומן VNO באמצעות לחץ שלילי 15,16. הרכיבים המבניים של VNO נוכחים בלידה והאיבר מגיע לגודלו זמן קצר לפני גיל ההתבגרות 17. עם זאת, אם AOS מכרסם כבר תפקודי קטינים עדיין נושא לויכוח 18-20. VSNs מאופיין הוא מיקומם אפיתל את סוג הקולט שהם מבטאים. VSNs להראות מורפולוגיה דו קוטבית עם אקסון מחוסר מיאלין לבין דנדריט פסגה יחיד שבולט כלפי הלום ומסתיים ידית הדנדריטים microvillous. גרזן VSNons fasciculate ליצור את עצב vomeronasal שמשאיר הקפסולה סחוסי בסוף dorso-הזנב, עולה לאורך מחצה, מעביר את הצלחת cribriform ופרויקטים הנורה חוש הריח אביזר (AOB) 21,22. האפיתל חושית vomeronasal מורכב משתי שכבות: השכבה הפסגה ממוקם קרוב יותר אל הצד luminal ונמלים הן V1R- וכל אבל סוג אחד של FPR-rs-להביע עצב. נוירונים אלה coexpress G-חלבון α-למקטע G αi2 ופרויקט לחלק הקדמי של AOB 23-25. עצב סנסורי ממוקם V2Rs המפורש שכבת בסיס יותר או FPR-rs1 לצד αo G ולשלוח האקסונים שלהם לאזור האחורי של AOB 26-28. נוירונים vomeronasal מופעלים ככל הנראה על ידי semiochemicals קטן למדי 29-33 (V1Rs) או תרכובות חלבוניים 34-38 (V2Rs) כי מופרשים לתוך נוזלים שונים בגוף כגון שתן, רוק ולקרוע נוזל 37,39-41 </sup&gt;. בניסויים באתרו הראו כי VSNs גם מופעלים על ידי פפטידים formylated שונים תרכובות מיקרוביאלית / צמודי דלקת 25,42. יתר על כן, heterologously הביע חלבונים-rs FPR לשתף ספקטרום אגוניסט עם FPRs לידי ביטוי את המערכת החיסונית, מה שמעיד על תפקיד פוטנציאלי גלאי עבור מחל conspecifics או מקורות מזון מקולקלים 25 (ראה אסמכתא 43). יסוד להבנת יחסים ליגנד רצפטור ומפלה איתות במורד באוכלוסיות ספציפיות VSN הוא הערכה מפורטת של מאפייני biophysical הבסיסיים שלהם בסביבת ילידים. בעבר, ניתוח של איתות הסלולר יש יתרון מאוד מבעלי חיים מהונדסים גנטית המציינים אוכלוסיה מוגדרת של נוירונים ידי coexpressing חלבון בסמן פלורסנטי 30,44-49. בפרוטוקול זה, קו עכבר מהונדס המבטא FPR-RS3 יחד עם סמן פלואורסצנטי (FPR-RS3-i-ונוס) משמש.גישה זו מדגימה איך להעסיק כזה זן עכבר מהונדס גנטי כדי לבצע ניתוח אלקטרו של אוכלוסיית תאים לזיהוי אופטי באמצעות הקלטות תיקון- clamp נוירון הבודד בחתכי רקמת VNO עטרה חריפים. לחץ מונחה אוויר מערכת זלוף רב-קניים עבור גירויים חושיים וסוכנים תרופתיים מאפשר מהיר, הפיך מוקדי גירוי עצבי או עיכוב במהלך הקלטות. הקלטות כל תא בהכנות פרוסות לאפשר ניתוח מפורט של תכונות מהותיות, conductances מופעל במתח, כמו גם דפוסי פריקת פוטנציאל פעולה בסביבה המקורית של התא.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="846">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Chemicals</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Agarose (low-gelling temperature)</td>
			<td style="width:133px;">PeqLab</td>
			<td style="width:116px;">35-2030</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ATP (Mg-ATP)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">A9187</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">B9879</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">C1016</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">E3889</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Glucose</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">G8270</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">GTP (Na-GTP)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">51120</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">H3375</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">M8266</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">P9333</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">03564</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">S7653</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">S5761</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">S8045</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Surgical tools and consumables</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Large petri dish, 90 mm</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">decapitation, dissection of VNO capsule</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Small petri dish, 35 mm</td>
			<td style="width:133px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sharp large surgical scissor</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">decapitation, removal of lower jaw</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Strong bone scissors</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">cutting incisors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Medium forceps, Dumont tweezers #2</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">removing skin and palate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">cutting out VNO&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">dissecting VNO out of cartilaginous capsule</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Small stainless steel spatula</td>
			<td style="width:133px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">handling agarose block and tissue slices</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Surgical scalpel</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;">cutting agarose block into pyramidal shape</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Name</td>
			<td style="width:133px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:275px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Equipment</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Amplifier</td>
			<td style="width:133px;">HEKA Elektronik</td>
			<td style="width:116px;">EPC-10</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID)</td>
			<td style="width:133px;">Science Products</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">CCD-camera</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">DFC360FX</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">I3</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Fluorescence lamp</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">EL6000</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Hot plate magnetic stirrer</td>
			<td style="width:133px;">Snijders</td>
			<td style="width:116px;">34532</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Microforge&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Narishige</td>
			<td style="width:116px;">MF-830</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Micromanipulator Device&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:116px;">SM-5</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Micropipette puller, vertical two-step</td>
			<td style="width:133px;">Narishige</td>
			<td style="width:116px;">PC-10&#160;</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Microscope</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">CSM DM 6000 SP5</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug)</td>
			<td style="width:133px;">Quest Scientific</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Objective&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">HCX APO L20x/1.00 W</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Oscilloscope</td>
			<td style="width:133px;">Tektronik</td>
			<td style="width:116px;">TDS 1001B</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Osmometer&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Gonotec</td>
			<td style="width:116px;">Osmomat 030</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Perfusion system 8-in-1</td>
			<td style="width:133px;">AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">pH Meter five easy</td>
			<td style="width:133px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Pipette storage jar</td>
			<td style="width:133px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:116px;">e212</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Recording chamber&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:116px;">Slice mini chamber</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Razor blades</td>
			<td style="width:133px;">Wilkinson Sword GmbH</td>
			<td style="width:116px;">Wilkinson Sword Classic</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:323px;">Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are e.g. BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments)</td>
			<td style="width:133px;">custom-made</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">S4E</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Trigger interface&#160;</td>
			<td style="width:133px;">HEKA Elektronik</td>
			<td style="width:116px;">TIB-14 S</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Vibratome&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:116px;">VT 1000 S</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Water bath&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Memmert</td>
			<td style="width:116px;">WNB 45</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in-depth physiological analysis of defined cell populations in acute tissue slices of the mouse vomeronasal organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

כדי לקבל תובנות לגבי מאפייני biophysical ופיזיולוגיים של אוכלוסיות תאים מוגדר, אנו מבצעים בחתכי רקמה העטרה חריפה של העכבר VNO (איור 1 - 2). לאחר דיסקציה, פרוסות יכולות להישמר פתרון תאי מחומצן קר כקרח (S 2) במשך כמה שעות. בשעה הגדרת הקלטה, חילופי מתמיד עם פתרון מחומצן טרי (איור 2 ד) מבטיח הכדאיות רקמות לאורך הניסוי. אנחנו כאן להעסיק מודל עכבר מהונדס (FPR-RS3-i-ונוס). VSNs ב coexpress זן זה חלבון סמן פלואורסצנטי עם-RS3 FPR, חבר אבטיפוס של הגנים ממשפחת FPR-RS (איור 3) מה שמאפשר זיהוי אופטי של אוכלוסיה מוגדרת של עצב סנסורי. קלטות אלקטרו לספק את אמצעי ניתוח מעמיק ברמה-התא הבודד. למשל, ניתוח של זרמי מתח מגודר מתבצע מהדק המתח<html> מצב (איור 4 א - ב). כדי לבודד סוגים ספציפיים של זרמים יוניים, פרוסות superfused עם סוכנים תרופתיים כגון TTX לעכב זרמי מתח מגודר Na + (איור 4 א) או nifedipine לחסום מתח מגודר L- סוג Ca 2 + זרמים (איור 4B). יתר על כן, אנו שגרתי לבצע הקלטות כל תא בתצורת המהדק הנוכחית לנתח דפוסי פריקת פוטנציאל פעולה (איור 4C). בנוסף להקלטות כל תא, מצורף תא ההקלטות &#39;משוחרר חותם&#39; לספק שיטה פולשנית פחות שמונעת דיאליזה של רכיבים תאיים (איור 5 א). פעולת הקלטה מונחה פוטנציאל זרמי קיבולים על יישום גירוי קצר מציע דרך רגישה ויעילה למסך הליגנדים חושי (למשל, חלבוני שתן גדולים; MUPs) מפעילים מוגדרים אוכלוסיות של תאים 51 (איור 5 ב). <html> = &quot;Jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54517/54517fig1.jpg" /> איור 1: Dissection של VNO. (א) להציג צד על ראש העכבר כדי להמחיש את המיקום ואת הזווית שבה החותכות נחתכות. (ב) לאור גחון המתארת ​​את הנקודה הטובה ביותר לתפוס לקלף בחיך העליון (UP). (ג) צפה הגחון על הקפסולה סחוס (CC) כי מטפח את VNO ואת עצם vomer (VB) לאחר הסרת הלסת התחתונה, החותכות וטעמים. (ד) הגבה נוף של הקפסולה VNO הגזורה המתאר את הלוקליזציה הבילטרליים של שניהם (i D) VNOs. את התצוגה לרוחב ממחישה את שפת הסחוס בצד הגבה שבו שני VNOs צריכים להיות מופרדים (ד ii). סרגל קנה מידה = 1 מ&quot;מ (A - D).517 / 54517fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54517/54517fig2.jpg" /> איור 2:. הכנה רקמות, הקלטה קאמרית הבמה מיקרוסקופ תצוגה לרוחב סכמטי על VNO כדי להמחיש את הקורס ואת המיקום של כלי דם הגדולים (BV) של החלק הלא-החושי של האפיתל (A i). השורה המקווקות מייצגת את שכבת חיתוך העטרה. נוף צדדי על VNO קלוף מתוך CC מציג את כלי הדם (A ii). (ב) Agarose-מוטבע פרוסת רקמות עטרת VNO הקבועה לחלק התחתון של תא קלטת מלאות פתרון באמצעות עוגן נירוסטה חוטית עם 0.1 מ&quot;מ סיבים סינטטיים עבים אשכולות (SF). האזור התאגרף מתאר את agarose המקיף את פרוסת הרקמה. (Cנוף סכמטי) הממחיש את המיקום וכיוון של agarose (Ag) -embedded פרוס VNO עטרה ממוקמת בין שני סיבים. (ד) סקירה של חדר ההקלטה להציב על הבמה מיקרוסקופ. התא מצויד יישום אמבטיה (BA) עבור superfusion מתמיד עם S 2 מחומצן, עיפרון זלוף (PP) כדי להחיל גירויים חושיים או סוכנים תרופתיים, פיפטה ההקלטה (RP) מחוברת אל במת ראש המגבר, אלקטרודה ההשוואתית (RE ) ואת נימי (SC יניקה) כדי לשמור על חליפין קבוע של הפתרון בתא. סרגל קנה מידה = 1 מ&quot;מ (א ii). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54517/54517fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54517/54517fig3.jpg" /> איור 3: Tiss VNO עטרהue פרוסה. (א) תמונת Confocal (הקרנת מקסימלית) של 150 מיקרומטר פרוס רקמת VNO עטרה חריפה המראה את הפיזור של טאו-ונוס FPR-RS3 ניאון + נוירונים (ירוק) ב האפיתל החושית vomeronasal. כלי דם (BV), לומן (L), האפיתל חושית (SE). (ב) FPR-RS3 טאו-ונוס + נוירונים מפגינים דנדריט פסגה יחיד וכלה במבנה ידית דמוית בגבול לומינל. הקלטות כל תא מהדק תיקון בוצעו מ סומה VSN, פיפטה התיקון (PP). (C) מורפולוגיה של יחיד VSN עם ידית הדנדריטים (K) בקצה של דנדריט ארוך וצר (D), סומה תא (S) ואת האקסון (א) עוזב סומה בצד הבסיסי. ברי סולם, 50 מיקרומטר (א), 10 מיקרומטר (ב), 5 מיקרומטר (C). נתון זה יש הבדל בין 52. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54517/54517fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן</a>כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54517/54517fig4.jpg" /> איור 4: מבודד מתח מגודרת Na + ו- Ca 2 + זרמים וכן הפרשות ספייק (א) עקבות נציג מהקלטות תיקון- clamp כל תא של זרם TTX רגיש מהירה והפעלה Na + ב FPR-RS3 + VSNs.. (A i) מתח הקלטת צעד בתנאים מבוקרים (פתרון תאי S 1; S 4 הפתרון התאי) מגלה חולפת מהר תלוי מתח פנימה נוכחי. (א ב) טיפול TTX (1 מיקרומטר) מפחית את הנוכחי בתוקף. דיגיטלית מופחתים עקבות (שליטה-TTX (א iii)) Reveמחא זרם Na + TTX הרגיש מגודר המתח. יחסים במתח הנוכחי של זרמי TTX רגישים Na + שבודדים נוירונים מלא FPR-RS3 + (א iv). (ב) הנציג Ca 2+ עקבות נוכחיות מבודדות פרמקולוגית (10 nifedipine מיקרומטר). (C) עקבות מהדק נוכחי נציג מראות דה / hyperpolarization ורכבות של (ריבאונד) פוטנציאל פעולה שנוצר על חיובי בשלבים (i C) והשלילי (C iii) הזרקה נוכחית. הערת הפעילות הספונטנית הנמדדת 0 זריקה הנוכחית PA (C ii). (Iv C) ירי תדירות מלא FPR-RS3 + נוירונים כפונקציה של הזרם המוזרק (אני מזריק). הגידול ההדרגתי ירי שיעור דומה לשליטהו FPR-RS3 + VSNs. שים לב VSNs הם רגיש להפליא זריקות נוכחיות אפילו picoamperes הנמוך נע 53-56. שים לב עקומות -אני f כבר &quot;תקן רקע&quot; באמצעות תדר spiking הספונטני ב 0 הזרקת הרשות נוכחית. נתונים הם אמצעי ± SEM. נתון זה יש הבדל בין 52. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54517/54517fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54517/54517fig5.jpg" /> איור 5: תאי &#39;תיקון רופף &quot;הקלטות מ VSNs הבזליים (א) IR-DIC תמונה של פרוסה רקמת חריפה VNO המתארת ​​את פיפטה הקלטה בשכבת הבסיס של האפיתל חושית.. (ב) הקלטה מקורית נציג של VSN הבזליים בתצורה מצורפת התא (&amp;# 39; רופף חותם &#39;) להגיב עם התפרצויות חולף קצרות קוצי גירויים לתדרך (3 שניות) עם ונקווה recombinantly הביעו חלבונים מרכזיים שתן (rMUPs) וכן ריכוז אשלגן גבוה (50 מ&quot;מימ, 1 sec), בהתאמה (i B) . גדלה גבוהה של הקלטות שמוצגות (i B) ממחישה פרצי קוצים בתגובת גירויים (B ii). ברים אדומים מציינים זמן של גירוי, מרווח בין גירוי = 30 שניות, הקלטה רציפה, הפרעות &lt;1 שניות (סימני חתך //). בר סולם = 5 מיקרומטר (א). לוח (א) יש הבדל בין התייחסות 38. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54517/54517fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ at JoVE.com

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

מעמיק פיסיולוגי ניתוח של אוכלוסיות תאים מוגדרות ב אקוטי רקמות פרוסות של איברי עכבר vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

in-depth-physiological-analysis-defined-cell-populations-acute-tissue

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.5K Views.  RWTH Aachen University. Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings. 

Video: In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

הדמיה פרומון חישה ב תכשיר Vomeronasal עכבר רקמות חריפה Slice

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

ניתוח פונקציונלי של מעגל האכלת הזחל ב דרוזופילה</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

פורסים אותו חם: אקוטי למבוגרים מוח חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...