עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק NIDDK (K01DK092320) ומימון אתחול מתוך מחלקת ילדים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת טקסס מקגוורן.

<ol>
	<li>Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+the+study+of+kidney+development:+Use+of+the+pronephros+in+the+analysis+of+organ+induction+and+patterning.">Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning.</a> Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).</li><li>Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+anatomy+of+the+Xenopus+pronephric+kidney.">Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).</li><li>Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+pronephros+as+a+model+system+for+the+study+of+kidney+development+and+pathophysiology.">The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 17, 73-74 (2002).</li><li>Carroll, T., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development.">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li><li>Zhou, X., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+tubules.">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules.</a> Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).</li><li>Raciti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+pronephric+kidney+revealed+by+large-scale+gene+expression+mapping.">Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping.</a> Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).</li><li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+(Xenopus+laevis)+blastomeres.">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+of+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li><li>Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+stage+origin+of+Spemann's+Organizer:+Analysis+of+the+movements+of+blastomere+clones+before+and+during+gastrulation+in+Xenopus.">The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus.</a> Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).</li><li>Karpinka, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenbase,+the+Xenopus+model+organism+database;+new+virtualized+system,+data+types+and+genomes.">Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).</li><li>Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha5beta1+and+fibronectin+regulate+polarized+cell+protrusions+required+for+Xenopus+convergence+and+extension.">Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension.</a> Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).</li><li>Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precocious+expression+of+the+Wilms'+tumor+gene+xWT1+inhibits+embryonic+kidney+development+in+Xenopus+laevis.">Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis.</a> Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+pronephros:+A+kidney+model+making+leaps+toward+understanding+tubule+development.">The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development.</a> Xenopus Development. , 215-238 (2014).</li><li>Lienkamp, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+kidney+tubules+elongate+using+a+planar+cell+polarity-dependent+rosette-based+mechanism+of+convergent+extension.">Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension.</a> Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).</li><li>Lyons, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+Wnt/&#946;-catenin+signaling+in+pronephric+kidney+development.">Requirement of Wnt/&#946;-catenin signaling in pronephric kidney development.</a> Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).</li><li>Miller, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pronephric+tubulogenesis+requires+Daam1-mediated+planar+cell+polarity+signaling.">Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).</li><li>Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Xenopus+pronephric+system.">Development of the Xenopus pronephric system.</a> Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).</li><li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+12:+The+Xenopus+Pronephros:+A+Kidney+Model+Making+Leaps+toward+Understanding+Tubule+Development.">Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development.</a> Xenopus Development. , (2014).</li><li>Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+LIM+class+homeobox+gene+Xlim-1+in+pronephros+and+CNS+cell+lineages+of+Xenopus+embryos+is+affected+by+retinoic+acid+and+exogastrulation.">Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation.</a> Development. 120, 1525-1536 (1994).</li><li>Weber, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+the+tissue-specific+transcription+factor+HNF1+alpha+(LFB1)+during+Xenopus+development.">Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development.</a> Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).</li><li>Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development.">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li><li>Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+injected+DNA+templates+in+Xenopus+embryos.">Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos.</a> Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).</li><li>Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloride+conductance+channel+ClC-K+is+a+specific+marker+for+the+Xenopus+pronephric+distal+tubule+and+duct.">The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct.</a> Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).</li><li>Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Na+,+K+-ATPase+alpha+subunit+requires+gastrulation+in+the+Xenopus+embryo.">The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo.</a> Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical &amp; chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs.">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li><li>Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastomeres+show+differential+fate+changes+in+8-cell+Xenopus+laevis+embryos+that+are+rotated+90+degrees+before+the+first+cleavage.">Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage.</a> Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).</li><li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos.">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

מיקוד כִּליַת רֵאשִׁית לפתח עוברי Xenopus מסתמכת על זיהוי הזרקת blastomere הנכון. הזרקה של blastomere V2 של עוברים 8 תאים מטרות כִּליַת רֵאשִׁית שמאל 18. זה משאיר את כִּליַת רֵאשִׁית התקינה הנגדית כמו שליטה פנימית. אם morpholino מציאה או ביטוי יתר RNA משמש המשנה את ההתפתחות בכליה, כִּליַת רֵאשִׁית התקינה הנגדית יכולה לשמש כדי להשוות את ההשפעות של מציאת גן או ביטוי יתר על כִּליַת רֵאשִׁית השמאל. במקרה זה, בקרות נאותות כגון morpholino שליטה תואמת או מבנה RNA שלילי דומיננטי אמורות לשמש בנוסף הבקרה הפנימית הנגדית כדי לנתח את התוצאות של שינויים בביטוי גנים. בשל השקיפות היחסית של העובר Xenopus, פגמים בכליות ניתן לכמת באמצעות טכניקות מרובות. לדוגמא, מציאת גן או ביטוי יתר ניתן לכמת פשוט על ידי חישוב מדד pronephric של עוברתimmunostained עם נוגדן 3G8 13, אשר משווה את הפיתוח של tubules הפרוקסימלי בצדדים המוזרקים ובקרה של העובר. בנוסף ללימוד פיתוח pronephric, טכניקה זו ניתן להתאים בקלות למקד ברקמות אחרות על ידי בחירת blastomere הנכונה להזרים באמצעות גורל הוקם מפות 7-10. בנוסף למיקוד סוגי רקמות אחרים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי ללמוד פיתוח כליות בשלבים שונים. פרוטוקול זה נראה בשלב 40 עוברים מוכתמים נוגדני 3G8 ו 4A6, אשר לזהות רקמות כליה מובחנות. עוברים צעירים יכול להיות immunostained עם נוגדנים כליות שונות, או נתון הכלאה באתרו 5, 6, 20. לדוגמה, הנוגדן Lim1 יכול לזהות את כִּליַת רֵאשִׁית בפיתוח 21, 22. כמו כן, lim1, pax8, תעתיקי β hnf1- יכול להיות זוהה עם ב מוצא כלאה באתרו בשלב 12.5 22-24 </sup&gt;. אחרים בהמשך סמנים הכלאה באתרו יכול לשמש כדי לזהות אזורים שונים של הכליה בשלבים התפתחותיים מאוחר יותר. לדוגמה, בדיקות שנועדו לזהות ביטוי nphs1, clckb, slc5a1, ו atp1a1 ב glomus, מבנים צינוריים וחיבור, tubules הפרוקסימלי, ואת כליות כולו, בהתאמה, תוארו 25, 5, 26, 27. הערכת הכליה מעבר בין שלבים מרובים באמצעות נוגדנים שונים או בניתוח באתרו יאפשר הבנה טובה יותר של איך משנה טיפול פיתוח כליות. היבט קריטי אחד פרוטוקול זה הוא הבחירה זיהוי נכון של blastomere להיות מוזרק. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד למקד כִּליַת רֵאשִׁית ידי הזרקת blastomere V2 השמאלי של עובר 8 תאים או blastomere הגחון השמאלי של עובר 4 תאים. אם blastomere השגוי מוזרק, את כִּליַת רֵאשִׁית לא להיות ממוקדת כראוי. לכן,הוא קריטי כדי להתוודע מטוסי פיתוח תא מחשוף של עוברי Xenopus מוקדם לפני microinjection 28, 29. מחשוף עובר לא תמיד פועל לפי תרשימי שלב ההתפתחותי הוקמו, כך כדאי להזריק עובר יחיד שבה שסעי התא מוקדם להסתכל &quot;נורמלי&quot; ואת blastomere הנכונה ניתן לזהות בקלות. זה יקטין את מספר העוברים, כי כבר ממוקדים כראוי. בנוסף, חשוב גם עבור בלסטומרים של העובר להיות מחולק לחלוטין בזמן ההזרקה. לדוגמא, אם המחשוף בין בלסטומרים V1 ו- V2 של עובר 8 תאים אינו שלם לפני microinjection, נותב עלולים להתפשט לתוך V1 וכן V2. זה היה מפחית את יעילות המיקוד של microinjection, ואת העובר וכתוצאה מכך עשוי להראות הפצה נותב שנראה דומה יותר לזה של עובר מוזרק בשלב 4 תאים ולא בשלב 8 תאים. חלק קריטי אחר של פרוטוקול זה הוא אימות כי כִּליַת רֵאשִׁית היה ממוקדת כראוי על ידי microinjection. זה חייב להיעשות לפני ניתוח התפתחות pronephric, כי עוברי כי לא היה לי כִּליַת רֵאשִׁית ממוקד כראוי עלול להטות את הנתונים המתקבלים. כדי לוודא מיקוד הולם, לנתח את ההתפלגות נותב בכל עובר מוזרק. המוזרק (משמאל) לצד העובר צריך להציג את הרוב המכריע של נותב הניאון. במידה ושלט (מימין) לצד העובר מראה כמות הקרינה משמעותית, אז עובר זה אמור להיות מושלך. אם זה מתרחש, blastomere השגוי הוזרק, או blastomere מוזרק טרם סיים בקע לפני הזריקה. שנית, קרינה בצד (משמאל) המוזרק של העובר חייבת למקד כִּליַת רֵאשִׁית כראוי. אם העובר היה מוזרק בשלב 8 תאים, את somites הגב ועל הגחון, צלחת לרוחב, במעי האחורי, proctodeum, העור של תא המטען הרכס העצבי בתא המטען צפויים להראות שפעתorescence בנוסף כִּליַת רֵאשִׁית 6, 29. בנוסף לרקמות רשומות הזריקה 8 תאים, עוברים מוזרק בשלב 4 תאים צריך פריסה רחבה של נותב ניאון בעור somites וכן למיקוד של בלוטת מלט, otocyst, העדשה placode חוש הריח. אם העובר אינו מציג את מיקוד רקמות הנכון, זה אמור להיות מושלך לפני הניתוח (איור 5). הזריקות הממוקדות המתואר בפרוטוקול זה לספק אמצעי מניפולצית ביטוי גנים ברקמות רצויות. הגבלה של טכניקה זו היא כי למרות זריקות אלה ממוקדות, הם אינם משפיעים על כליות פיתוח בלבד. 4 ו-תאים 8 הזריקות המתוארים בטכניקה זו ממוקדות יותר זריקות נעשו בשלב התא הבודד, שבו ביטוי גנים ישתנה בעובר כולו, וזריקות נעשו בשלב שני תאים, שבו מחצית מציג עובר מפורש גן שינהיוֹן. הם אינם, עם זאת, למקד רק ברקמה אחת. למרות זריקות ב בלסטומרים הגחון של העוברים 4 תאים ואת בלסטומרים V2 של 8 תאים העוברים לשנות ביטוי גנים כִּליַת רֵאשִׁית, הם גם לשנות ביטוי גנים ברקמות אחרות. רקמות שנפגעו אחרות כוללות את העור, somites, מעיים, ואת רכס עצבי. לכן, חשוב להבין שלמרות 4- וזריקות 8 תאים ממוקדות יותר אחת או שני תא זריקות, הם ימשיכו לשנות ביטוי גנים ברקמות מרובות. בנוסף הזרקה עוברת בשלבי 4 ו 8 תאים, זריקות יכולות להתבצע גם בבית 2, 16, ושלבי 32 התאים. עוברים מוזרק בשלב 2 תאים יהיה מגוון רחב יותר של רקמות שנפגעו שאינם עוברים מוזרק בשלבים מאוחרים יותר. אמנם יותר מאתגר מבחינה טכנית, עובר מוזרקים בשלבי 16 ו -32 תאים יהיה בטווח צר של רקמות המושפעות מ עובר מוזרקים בשלבי 4 ו 8 התאים. עקב השושלת MEM-RFPr משמש פרוטוקול זה כדי לאמת מיקוד הולם לאחר microinjection. MEM-RFP mRNA תוויות קרום תא לאחר שהתאים תרגם חלבון מן RNA המוזרק. ריכוז נותב השושלת MEM-RFP להשתמש בפרוטוקול זה (0.1 ננוגרם של MEM-RFP mRNA הזרקת 10 nl) צריך להיות שונה לפי הצורך לתת דין וחשבון על מוות העובר הרצוי עוצמת הקרינה נותב. בנוסף שינוי כמות נותב השושלת מוזרק, נותב באים ממשפחות שונות, כגון-dextran rhodamine, נקודות קוונטיות, או β-galactosidase לגילוי histochemically, ניתן להשתמש במקום-RFP MEM. קליעים נותבים השושלת להיות יותר לדלל את התאים מתחלקים, גרימת רמות הקרינה פוחתת ככל העובר מתפתח. יישום נוסף של שיטה זו הוא לשתף להזריק RNA אקסוגניים או morpholino עם נותב השושלת כדי overexpress או להפיל את הביטוי של הגן של עניין. נותב השושלת משמש לאימות מיקוד נכון של כִּליַת רֵאשִׁית, אבל לאכדי לציין היכן RNA או morpholino אקסוגניים מוזרק שיתוף לוקליזציה בעובר. רנ&quot;א morpholinos אקסוגניים לא יכול להתפשט דרך blastomere מוזרק באותו קצב כמו נותב שיתוף מוזרק, וכתוצאה מכך לגרום לתאי הבת שיש נותב אבל לא את הרנ&quot;א אקסוגניים או morpholino הנוכחי 30. למעשה, יש לנו ציינו כי שני מבני RNA שונים מוזרקים לתוך תא בודד לא תמיד שיתוף בתרגום (נתונים שלא פורסמו). לכן, הנוכחות של נותב בתא אינו מצביע בהכרח כי RNA או morpholino אקסוגניים מוזרק שיתוף תמיד נוכח בתא זה. פרוטוקול זה מפרט נוהל מיקוד microinjection אל בלסטומרים כי להצמיח כִּליַת רֵאשִׁית לפתח עוברי Xenopus. התבטאות גנים היא מניפולציה לעתים קרובות בעוברים Xenopus באמצעות הזרקת morpholinos או RNA אקסוגניים, אשר שניהם יכולים למנוע חריגות התפתחותי מוקדם כי אם מוזרק אחת אושני תאי עוברים. עובר מוזרק על מציאת התערוכה הבמה תא הבודדה או ביטוי יתר בכל התאים של העובר המתפתח. אם הגן הוא הכרחי עבור תהליכים התפתחותיים מוקדם נכונים, עובר לא יכול לפתח כִּליַת רֵאשִׁית. זריקות ביצע בשלבים מאוחרים יותר, כגון זריקות 8 תאים המפורטים כאן, יכול לגרום עוברים שעוברים gastrulation ופיתוח pronephric הסופי 18. לכן, הזריקות הממוקדות דנו כאן יכולות להתגבר על פגמי gastrulation נגרמים על ידי שינוי של הביטוי של גנים מסוימים, המאפשרים את העובר להתקדם דרך פיתוח pronephric. בעתיד, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי למקד בונת CRISPR כדי בלסטומרים רצויים.

הכליה העוברית Xenopus, את כִּליַת רֵאשִׁית, הוא מודל טוב ללימוד פיתוח כליות ומחלות. עובר לפתח חיצוני, הם גדולים, יכולים להיות מיוצרים בכמויות גדולות, והם מניפולציות בקלות באמצעות microinjection או הליכים כירורגיים. בנוסף, הגנים לפיקוח על בניית כליות אצל יונקים ודו-חיים הם משומר. כליות יונקות להתקדם דרך שלושה שלבים: כִּליַת רֵאשִׁית, הכליה, ו metanephros 1, בעוד דו חיים עובריים כִּליַת רֵאשִׁית ודו-חי בוגרים יש metanephros. יחידת הסינון הבסיסית של צורות כליות אלה היא נפרון, ושניהם יונקים ודו-חיים דורשים את אותה מפלי איתות ואירועים אינדוקטיביים לעבור nephrogenesis 2, 3. כִּליַת רֵאשִׁית Xenopus מכילה נפרון בודד מורכב הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי וחיבור tubules, וכן glomus (מקביל ל glomerulus היונק) 1, 4-6 (איור 1 </strאונג&gt;). הווה נפרון הבודד, הגדול Xenopus כִּליַת רֵאשִׁית הופך אותו מתאים כמודל פשוט לחקר הגנים המעורבים בתהליכי פיתוח כליות ומחלות. מפות גורל התא הוקמו עבור עוברי Xenopus מוקדם, והם זמינים באופן חופשי באינטרנט ב Xenbase 7-11. כאן אנו מתארים טכניקה microinjection של קליעים נותבים השושלת למקד את כִּליַת רֵאשִׁית Xenopus פיתוח, אם כי באותה טכניקה ניתן להתאים למקד ברקמות אחרות כגון הלב או העיניים. קליעים נותבים השושלת הם תוויות (כולל צבעים חיוניים, dextrans שכותרתו fluorescently, אנזימים לגילוי histochemically, ו mRNA קידוד חלבוני ניאון) כי ניתן להזריק לתוך blastomere מוקדם, המאפשר הדמיה של הצאצאים של התא במהלך ההתפתחות. פרוטוקול זה מנצל mRNA MEM-RFP, קרום קידוד ממוקד חלבון פלואורסצנטי אדום 12, כמו נותב השושלת. טק microinjection הממוקדniques עבור בלסטומרים בודדים עוברים 4 ו 8 תאים המתואר כאן יכול להיות מנוצל להזרקה עם morpholinos להפיל ביטוי גנים, או עם RNA אקסוגני overexpress הגן של עניין. באמצעות הזרקה לתוך blastomere הגחון, הצמחי, בעיקר כִּליַת רֵאשִׁית של העובר תהיה ממוקדת, עוזבת את כִּליַת רֵאשִׁית הנגדית כביקורת התפתחותית. שיתוף ההזרקה נותב מוודאת כי blastomere הנכון הוזרק, ומופעים אשר רקמות בעובר נבעו blastomere המוזרק, אימות מיקוד של כִּליַת רֵאשִׁית. Immunostaining של כִּליַת רֵאשִׁית מאפשר הדמיה של מידת הצלחה של tubules pronephric היה ממוקד. תופעות התבטאות יתר ו מציאה אז יכול להיות הבקיע נגד הצד הנגדי של העובר, אשר משמש כביקורת התפתחותי, והוא יכול לשמש כדי לחשב את מדד pronephric 13. הזמינות של מפות גורל התא מאפשרת טכניקת microinjection ממוקדת זה כדי לשמש יעד רקמות othאה מאשר כִּליַת רֵאשִׁית, ואת שיתוף ההזרקה נותב ניאון מאפשר microinjection המתמקדת בכל רקמות להיות מאומתת לפני הניתוח. במהלך microinjection העובר, טמפרטורה התפתחותי צריכה להיות מוסדרת בחוזקה, בהתחשב בכך את קצב התפתחות Xenopus תלוי מאוד עליו 14. עובר צריך להיות מודגרות בטמפרטורות קרירות (14 - 16 מעלות צלזיוס) במשך 4 ו זריקות 8 תאים כי זמן הפיתוח הוא האטה. בגיל 22 ° C, זמן הפיתוח מ -1 הבמה (תא 1) לביים 3 (4 תאים) הוא כ 2 שעות, תוך 16 ° C זמן הפיתוח לשלב 3 הוא כ 4 שעות. זה לוקח בערך 15 דקות לסיום מעובר 4 תאים לעובר 8 תאים (שלב 4) על 22 מעלות צלזיוס, אבל לוקח בערך 30 דקות על 16 מעלות צלזיוס. באופן דומה, על 22 מעלות צלזיוס, זה לוקח רק 30 דקות עבור עובר 8 תאים כדי להתקדם עובר 16 תאים (שלב 5). הפעם הוא עלה ל 45 דקות ב 16 מעלות צלזיוס. הrefore, כדאי להאט את קצב הפיתוח של עוברים כדי לאפשר מספיק זמן עבור זריקות בשלב 8 תאים לפני העוברים להתקדם לשלב 16 תאים. בנוסף, בטמפרטורות צמיחה יכולות להיות מווסתות כדי להאיץ או להאט התפתחות עוברית עד הכליות פתחו באופן מלא. האפידרמיס של עובר ראשן שלבית Xenopus הוא יחסית שקוף, המאפשר הדמיה קלה של כִּליַת רֵאשִׁית בפיתוח בלי דיסקציה או סליקה של הרקמה 15. בשל השקיפות היחסית של עוברי Xenopus, הדמיה תא חי הוא גם אפשרי 16,17. כל הר immunostaining לדמיין את כִּליַת רֵאשִׁית אפשרי עם נוגדנים נקבע כי התווית הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי ו tubules חיבור של שלב 38 - 40 עוברים המאפשרים הערכת התפתחות pronephric ממוקד לאחר מניפולציה של ביטוי גנים העוברים Xenopus 18-20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin solution, 50 mg/mL</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E737-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine, 99%+</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>52-90-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP525-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Fridge II</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>260009</td>
			<td>Benchtop incubator for embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gap43-RFP plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine dextran, 10,000 M.W.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1817</td>
			<td>Tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade, USP sterile purified water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7&#34; Drummond replacement tubes</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/XL</td>
			<td>Microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>For breaking microinjection needle tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td>Microinjector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, heavy</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CAS 8042-47-5</td>
			<td>Oil for needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G monoject hypodermic needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881200508</td>
			<td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-Lok syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 micron polyester mesh</td>
			<td>Small Parts</td>
			<td>CMY-0800-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td>For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm x 45 mm screw thread vial</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-339-25B</td>
			<td>For fixing, staining, and storing embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzocaine</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>BE130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP661-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumen</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D mini rocker, model 135</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>57281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, New Zealand origin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S227I-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 3G8 antibody</td>
			<td>European Xenopus Resource Centre</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody to label proximal tubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 4A6 antibody</td>
			<td>European Xenopus Resource Centre</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody to label distal tubule and duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td>Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Secondary antibody to label distal tubule and duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21428</td>
			<td>Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 cavity spot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>105862500</td>
			<td>Optional - for clearing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A396-500</td>
			<td>Optional - for clearing embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique to target microinjection to the developing xenopus kidney

הכליה העוברית של Xenopus laevis (צפרדע), את כִּליַת רֵאשִׁית, מורכב נפרון יחיד, והוא יכול לשמש כמודל למחלת כליות. עוברי Xenopus הם גדולים, לפתח חיצונית, ניתן להשפיע בקלות על ידי microinjection או הליכים כירורגיים. בנוסף, מפות גורל הוקמו עבור עוברי Xenopus מוקדם. microinjection ממוקד לתוך blastomere הפרט כי בסופו של דבר יהיה להצמיח איבר או רקמה של עניין ניתן להשתמש כדי overexpress או להפיל ביטוי גנים באופן סלקטיבי בתוך האזור המוגבל הזאת, הפחתת השפעות משניות בשאר העובר המתפתח. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לנצל מפות גורל Xenopus הוקמה כדי למקד את הכליה Xenopus פיתוח (להלן כִּליַת רֵאשִׁית), באמצעות microinjection לתוך blastomere ספציפיים של עוברים תאים 8 4 ו. הזרקה של קליעי נותבים שושלת מאפשרת אימות של המיקוד הספציפי של הזריקה.לאחר עוברים פתחו לשלב 38 - 40, כל הר immunostaining משמש כדי לחזות התפתחות pronephric, והתרומה ידי תאים ממוקדים אל כִּליַת רֵאשִׁית ניתן להעריך. באותה טכניקה ניתן להתאים למקד סוגי רקמות אחרות בנוסף כִּליַת רֵאשִׁית.

Microinjections של 4 ו-תאים 8 עוברי Xenopus עם mRNA MEM-RFP להראות רמות שונות של מיקוד אל כִּליַת רֵאשִׁית. איור 4 מראה הבמה 40 עוברים עם דפוסי ביטוי mRNA MEM-RFP הנכון. עובר הוזרקו ב blastomere הגחון השמאלי (איור 4 א), מיון עבור דפוס הביטוי ההולם של mRNA MEM-RFP. בנוסף להביע MEM-RFP ב הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי וחיבור tubules של הכליה, עוברים מוזרק כראוי צפויים להראות הקרינה באפידרמיס של הראש, חדק, והזנב. הם צריכים גם להראות הקרינה otocyst, בלוטת מלט, proctodeum, ו somites (איור 4C). התפלגות הקרינה MEM-RFP בכליות של 8 עוברים מוזרק כראוי נקבע עם סטראו ניאון (איור 4 ב). עוברים עם רמות גבוהות של ביטוי MEM-RFP באפידרמיס כיזיהוי חסומים של אזורי כליות דורג כמו &quot;האפיל&quot;. ביטוי MEM-RFP זוהה הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי וחיבור tubules של כל העוברים שלא דורגו כמו האפילו. Stereoscope (איור 4D-F) ומיקרוסקופים confocal (איור 4G-I) שימשו כדי לאמת את רקמת שיתוף לוקליזציה של MEM-RFP וכליות immunostained עם 3G8 ו 4A6. הדמית Confocal אומתה לוקליזציה השיתוף של RFP MEM עם הפרוקסימלי, ביניים, מבנים צינוריים וחיבור של הכליה, המציין כי microinjection של RFP MEM לתוך blastomere גחון השמאל כראוי מטרות הכליה. עוברים מוזרק עם MEM-RFP mRNA בשלב 8 תאים (איור 5 א) להראות בטווח צר של הרקמות מוצגות הקרינה, המציין כי זריקות 8 תאים לצמצם את פוטנציאל השפעות משניות לכליה. כמו עובר מוזרקים בשלב 4 תאים, embryos מוזרק קרינת צג 8 תאי השלב הפרוקסימלי, ביניים, מבנים צינוריים וחיבור של הכליה, כמו גם את somites ו proctodeum (איור 5 ג-ו). בניגוד עוברים מוזרק בשלב 4 תאים, בלוטת מלט otocyst לא מסומנים עם-RFP MEM. מתוך 10 עוברים ממוקד כראוי, עובר אחד הראה MEM-RFP כמעט כל tubules הפרוקסימלי, ו -3 הראה MEM-RFP כמעט כל tubules ביניים הדיסטלי של הכליה (איור 5). צינוריות חיבור של 7 עוברים תויגו חלקית עם-RFP MEM. בנוסף, הכליות של עוברים מוזרקים בשלב 8 התאים היו יותר קלות לדמיין, ורק אחד נכבש על כמו האפיל. שיתוף לוקליזציה של MEM-RFP ונוגדני תיוג הכליה (3G8 ו 4A6) נקבעה באמצעות סטראו (איור 5D-F), ואומתה באמצעות מיקרוסקופ confocal (איור 5G-I). הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי וחיבור tubules של הכליה תויג עם-RFP MEM בעוברים מוזרקים בשלב 8 תאים, הוכחה כי ממוקד הזרקת blastomere V2 תוויות הכליה תוך הפגנת קרינה ברקמות פחות מ עוברי מוזרק blastomere גחון השמאל על-התא 4 שלב. assay זה עושה שימוש מתויג fluorescently mRNA כמו נותב כדי לציין אילו רקמות הותקפו על ידי microinjection. חשוב להקרין עוברים לוקליזציה נותב עקבית לפני הניתוח, וכל העוברים כי לא להציג את דפוס והפצה נותב הצפוי אמור להיות מושלך. איור 6 מציג דוגמה של העובר בשלב 40 כי היה ממוקד באופן שגוי עם MEM-RFP mRNA ב בשלב 4 תאים. ביטוי mRNA MEM-RFP ממוקם בצד ימין של העובר במקום בצד שמאל (איור 6 א). בנוסף, רוב ביטוי mRNA הוא בעור של המטען התחתון והזנב, עםביטוי קטן somites. אין ביטוי mRNA נתפס הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי ו tubules חיבור (איור 6), המאשר מיקוד לא תקין של הכליות. לכן, העובר הזה לא אמור לשמש לניתוח. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53799/53799fig1.jpg" /> איור 1:. כליה העוברית Xenopus תרשים של הכליה של עובר Xenopus שלב 35, מראה את הפרוקסימלי, ביניים, דיסטלי, וחיבור tubules. בהתבסס על Raciti et al. (2008) 6. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53799/53799fig2.jpg" /> איור 2: Xenopuהים עוברי גורל מפות. מפות גורל זיהוי ולתת שם בלסטומרים שתורמים כִּליַת רֵאשִׁית מתפתחת. א) מפת הגורל של עובר 4 תאים. B) גורל המפה של עובר 8 תאים. C) מפת הגורל של עובר 16 תאים. D) מפת הגורל של עובר 32 תאים. בלסטומרים של עובר 32 תאים מסומנים גם באמצעות מערכת שמות blastomere חלופית. מפות גורל מבוססות על מודים (1987) 8, 9 ו מודי קליין (1990) 7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53799/53799fig3.jpg" /> איור 3:. Scheme הזרקת למיקוד Xenopus כִּליַת רֵאשִׁית החיצים האדומים מציינים את התא להזריק. א) בעלי חיים ונופי גחון של עובר 4 תאים מראים זריקה של b גחון השמאלlastomere למקד את כִּליַת רֵאשִׁית עזב. החיצים האדומים מציינים את blastomere הגחון עזב. B) בעלי חיים ונופים הגחון של העובר 8 תאים מראה זריקה של blastomere V2 עזב למקד את כִּליַת רֵאשִׁית שמאל. החיצים האדומים מציינים את blastomere V2 עזב. א.ב.) תמונות של עוברים לקחו על סטריאוסקופ בהגדלת 4X. הזריקות מבוססות על גורל Xenopus מפות שפותחו על ידי מודים (1987) 8, 9 ו מודי קליין (1990) 7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53799/53799fig4.jpg" /> איור 4:. דוגמאות של עוברים הממוקדים בשלב 4 תאים בשלב immunostained 40 עוברי Xenopus מראים הזרקה ממוקדת כִּליַת רֵאשִׁית השמאל בשלב 4 תאים באמצעות MEM-RFP mRNA כמו נותב. תוויות MEM-RFPקרום תא אדום. א) הזרקת מראה סכמטי של mRNA MEM-RFP לתוך blastomere הגחון השמאלי של עובר 4 תאים. לוקליזציה B) רקמות של קרינת MEM-RFP בכליות של עוברים מוזרקים כראוי. ג) שלב 40 עובר מוזרק עם-RFP MEM ב blastomere גחון השמאל בשלב 4 תאים. לוקליזציה MEM-RFP מוצגת באדום, ואילו הכליות מסומנות ירוקות. הגדלת 1X. כליות D) מוכתמות 3G8 לתייג לומן של tubules הפרוקסימלי, ו 4A6 לתייג את ממברנות תאי tubules ביניים, דיסטלי וחיבור. הגדלת 5X. E) גדלה של האזור על הכליות מראות לוקליזציה MEM-RFP. הגדלת 5X. F) מוזג תמונה המציגה שיתוף לוקליזציה של נותב MEM-RFP עם הכליות. הגדלת 5X. CF) תמונות של עוברים שצולמו במצלמת DP71 אולימפוס על סטריאוסקופ. G) תמונת Confocal של הכליה של עובר שני מוכתם 3G8 ו 4A6. H) לוקליזציה של RFP MEM בכליות הרקמה שמסביב. I) מוזג תמונת shoשיתוף לוקליזציה כנף של MEM-RFP, 3G8, ו 4A6 בכליות. GI) תמונות Confocal באמצעות הקרנה מקסימלית 20X הגדלה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53799/53799fig5.jpg" /> איור 5:. דוגמאות של עוברים הממוקדים בשלב 8 תאים בשלב immunostained 40 עוברי Xenopus מראים הזרקה ממוקדת כִּליַת רֵאשִׁית השמאל בשלב 8 תאים באמצעות MEM-RFP mRNA כמו נותב. MEM-RFP תוויות קרום התא אדום. א) הזרקת מראה סכמטי של MEM-RFP mRNA לתוך blastomere V2 שנשאר עובר 8 תאים. לוקליזציה B) רקמות של קרינת MEM-RFP בכליות של עוברים מוזרקים כראוי. ג) שלב 40 העובר מוזרק עם-RFP MEM ב blastomere V2 שמאל בשלב 8 תאים. לוקליזציה MEM-RFP מוצגת<html> באדום, ואילו הכליות מסומנות ירוקות. הגדלת 1X. כליות D) מוכתמות 3G8 לתייג לומן של tubules הפרוקסימלי, ו 4A6 לתייג את ממברנות תאי tubules ביניים, דיסטלי וחיבור. הגדלת 5X. E) גדלה של האזור על הכליות מראות לוקליזציה MEM-RFP. הגדלת 5X. F) מוזג תמונה המציגה שיתוף לוקליזציה של נותב MEM-RFP עם הכליות. הגדלת 5X. CF) תמונות של עוברים שצולמו במצלמת DP71 אולימפוס על סטריאוסקופ. G) תמונת Confocal של הכליה של עובר שני מוכתם 3G8 ו 4A6. H) לוקליזציה של RFP MEM בכליות הרקמה שמסביב. I) מוזגה תמונה המציגה שיתוף לוקליזציה של MEM-RFP, 3G8, ו 4A6 בכליות. GI) תמונות Confocal צולמו באמצעות הקרנה מקסימלית 20X הגדלה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ב-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53799/53799fig6.jpg" /> איור 6: דוגמה של העובר ממוקד שגוי בשלב 4 תאים העובר immunostained שלב 40 Xenopus מראה מיקוד שגוי של כִּליַת רֵאשִׁית שמאל בשלב 4 תאים באמצעות MEM-RFP mRNA כמו נותב.. MEM-RFP תוויות קרום התא אדום. א) שלב 40 עובר מראה הפצה תקינה של-RFP MEM מעיד על הזריקה לתוך blastomere השגוי. בנוסף לזה שיש להם הפצה נותב שגויה המציין זריקה לתוך blastomere השגוי, עובר זה הוזרק בצד ימין. הגדלת 1X. B) התמונה הממוזגת של הכליה מראה חוסר שיתוף לוקליזציה של MEM-RFP עם נוגדנים תיוג הכליה (3G8, 4A6). הגדלת 5X. א.ב.) תמונות של עובר לקח על סטריאוסקופ. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney at JoVE.com

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

technique-to-target-microinjection-to-the-developing-xenopus-kidney

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

11.1K Views.  University of Texas McGovern Medical School. Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos. 

Video: Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

5-mc נקודה כתם Assay לכמת את מתילציה DNA רמת Chondrocyte Dedifiationiation<em&gt; במבחנה</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

גישה אבולרית מדויק עבור דוגמנות פגיעה בכליות חריפה בפיתוח דג הזברה

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...