This work was supported by the University of Innsbruck, Austria, and the Austrian Academy of Sciences (&#214;AW).

<ol>
	<li>Holland, P. W., Garcia-Fernandez, J., Williams, N. A., Sidow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+duplications+and+the+origins+of+vertebrate+development.">Gene duplications and the origins of vertebrate development.</a> Dev Suppl. 120 (1), 125-133 (1994).</li><li>Simmen, M. W., Leitgeb, S., Clark, V. H., Jones, S. J., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+number+in+an+invertebrate+chordate,+Ciona+intestinalis.">Gene number in an invertebrate chordate, Ciona intestinalis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (8), 4437-4440 (1998).</li><li>Dehal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+draft+genome+of+Ciona+intestinalis:+insights+into+chordate+and+vertebrate+origins.">The draft genome of Ciona intestinalis: insights into chordate and vertebrate origins.</a> Science. 298 (5601), 2157-2167 (2002).</li><li>Satoh, N., Satou, Y., Davidson, B., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciona+intestinalis:+an+emerging+model+for+whole-genome+analyses.">Ciona intestinalis: an emerging model for whole-genome analyses.</a> Trends Genet. 19 (7), 376-381 (2003).</li><li>Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunicates+and+not+cephalochordates+are+the+closest+living+relatives+of+vertebrates.">Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates.</a> Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).</li><li>Lemaire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unfolding+a+chordate+developmental+program,+one+cell+at+a+time:+invariant+cell+lineages,+short-range+inductions+and+evolutionary+plasticity+in+ascidians.">Unfolding a chordate developmental program, one cell at a time: invariant cell lineages, short-range inductions and evolutionary plasticity in ascidians.</a> Dev Biol. 332 (1), 48-60 (2009).</li><li>Hikosaka, A., Satoh, N., Makabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+spatial+expression+of+fusion+gene+constructs+with+the+5&#8242;+upstream+region+of+Halocynthia+roretzi+muscle+actin+gene+in+Ciona+savignyi+embryos.">Regulated spatial expression of fusion gene constructs with the 5&#8242; upstream region of Halocynthia roretzi muscle actin gene in Ciona savignyi embryos.</a> Roux's Arch Dev Biol. 203 (1-2), 104-112 (1993).</li><li>Corbo, J. C., Levine, M., Zeller, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+notochord-specific+enhancer+from+the+Brachyury+promoter+region+of+the+ascidian,+Ciona+intestinalis.">Characterization of a notochord-specific enhancer from the Brachyury promoter region of the ascidian, Ciona intestinalis.</a> Development. 124 (3), 589-602 (1997).</li><li>Zeller, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+use+of+transgenic+ascidian+embryos.">Generation and use of transgenic ascidian embryos.</a> Methods Cell Biol. 74 (74), 13-30 (2004).</li><li>Satou, Y., Imai, K. S., Satoh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+morpholinos+in+Ciona+embryos.">Action of morpholinos in Ciona embryos.</a> Genesis. 30 (3), 103-106 (2001).</li><li>Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+blueprint+for+a+chordate+embryo.">Regulatory blueprint for a chordate embryo.</a> Science. 312 (5777), 1183-1187 (2006).</li><li>Tassy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ANISEED+database:+digital+representation,+formalization,+and+elucidation+of+a+chordate+developmental+program.">The ANISEED database: digital representation, formalization, and elucidation of a chordate developmental program.</a> Genome Res. 20 (10), 1459-1468 (2010).</li><li>Brozovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANISEED+2015:+a+digital+framework+for+the+comparative+developmental+biology+of+ascidians.">ANISEED 2015: a digital framework for the comparative developmental biology of ascidians.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Kubo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+cis-regulatory+networks+in+the+early+Ciona+intestinalis+embryo.">Genomic cis-regulatory networks in the early Ciona intestinalis embryo.</a> Development. 137 (10), 1613-1623 (2010).</li><li>Rothb&#228;cher, U., Bertrand, V., Lamy, C., Lemaire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+of+maternal+GATA,+Ets+and+&#946;-catenin-TCF+transcription+factors+specifies+and+patterns+the+early+ascidian+ectoderm.">A combinatorial code of maternal GATA, Ets and &#946;-catenin-TCF transcription factors specifies and patterns the early ascidian ectoderm.</a> Development. 134 (22), 4023-4032 (2007).</li><li>Segal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+code+for+nucleosome+positioning.">A genomic code for nucleosome positioning.</a> Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).</li><li>Khoueiry, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cis-regulatory+signature+in+ascidians+and+flies,+independent+of+transcription+factor+binding+sites.">A cis-regulatory signature in ascidians and flies, independent of transcription factor binding sites.</a> Curr Biol. 20 (9), 792-802 (2010).</li><li>Gilchrist, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pipeline+for+the+systematic+identification+of+non-redundant+full-ORF+cDNAs+for+polymorphic+and+evolutionary+divergent+genomes:+Application+to+the+ascidian+Ciona+intestinalis.">A pipeline for the systematic identification of non-redundant full-ORF cDNAs for polymorphic and evolutionary divergent genomes: Application to the ascidian Ciona intestinalis.</a> Dev Biol. 404 (2), 149-163 (2015).</li><li>Roure, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicassette+Gateway+vector+set+for+high+throughput+and+comparative+analyses+in+ciona+and+vertebrate+embryos.">A multicassette Gateway vector set for high throughput and comparative analyses in ciona and vertebrate embryos.</a> PLoS One. 2 (9), e916 (2007).</li><li>Kumano, G., Takatori, N., Negishi, T., Takada, T., Nishida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+maternal+factor+unique+to+ascidians+silences+the+germline+via+binding+to+P-TEFb+and+RNAP+II+regulation.">A maternal factor unique to ascidians silences the germline via binding to P-TEFb and RNAP II regulation.</a> Curr Biol. 21 (15), 1308-1313 (2011).</li><li>Sasaki, H., Yoshida, K., Hozumi, A., Sasakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+knockout+in+the+ascidian+Ciona+intestinalis.">CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the ascidian Ciona intestinalis.</a> Dev Growth Differ. 56 (7), 499-510 (2014).</li><li>Stolfi, A., Gandhi, S., Salek, F., Christiaen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+genome+editing+in+Ciona+embryos+by+CRISPR/Cas9.">Tissue-specific genome editing in Ciona embryos by CRISPR/Cas9.</a> Development. 141 (21), 4115-4120 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ישנן שתי טכניקות גדולות כדי ליצור עבר Ciona מהונדסים: microinjection של רנ&quot;א או דנ&quot;א electroporation של ה- DNA. טכניקות אלו עבור הפרעות גנים העוברים Ciona שמשו ראשונות בשנת 1990 7,8 ומכאן ואילך שיפור ברציפות, ועכשיו מנוצלות Ciona (וסוגי ascidian אחרים) 20 ברחבי עולם. צעדים קריטיים בפרוטוקול Transgenesis המוצלח לתוך הגמטות Ciona שנאספים בקלות מחיות מבוגרות תלוי בכמה גורמים קריטיים. איכות הגמטות תלויה בעונת ההשרצה (בדרך כלל ממאי עד דצמבר באוקיינוס ​​האטלנטי הצפוני, משתנית עם טמפרטורת מי חמצון), על האיכות מי ים האקווריומים (ב מליחות נכונה, מבוגרים להישאר בריאים במשך 2-4 שבועות) , ולבסוף על טיפול נכון הגמטות על חילוץ מן המבוגרים, כמפורט להלן עבור השלבים השונים שלפרוטוקול. במהלך שלבים כנים, דוגרי טפטפות פסטרו עם מי ברז ימנע עוברים יידבקו מראש דגירה מי ים של בצלחות פטרי מצופה agarose יסיר חומרים רעילים שוחררו מן agarose. באופן כללי, מנות עשויות להיות מוכנים עד 2 שבועות לפני השימוש, לאחסן 4 ° C כדי למנוע התפתחות חיידקים ושטף טרי לפני השימוש. יום אחד זקן, מנות קטנות נראים הכי טובים עבור זריקות. יעילות ואורך dechorionation הוא צעד חיוני בפרוטוקול כטיפול ממושך של ביצים / עובר יפגע בפיתוח. הכנה קפדנית (לא רועד) ואחסון נכון (ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע) לשמור על איכות פתרון dechorionation. פרוטאזות בתמיסה לאבד יעילות אם אחד מעורב באלימות מדי הכנה או לאורך זמן, בעיקר אם כל הזמן בטמפרטורת החדר למשך שעות / ימים ארוכים יותר. יש לנו אופטימיזציה שלב קריטי זה באמצעות פתרון dechorionation טרי נוחשהוכן aliquots הקפוא של פתרון מניות 20x. טיפול נכון / עובר ביצי dechorionated שברירי חיוני גז או דקירה של עוברים תוך pipetting יהיה מזיק. כאשר pipetting, עובר נשמרים ככל האפשר בתרחיף (על ידי בעדינות &#39;נושב&#39; נוזל להתערבל אותם ואחריו pipetting החלקה אך מהירה), תוך כדי לחיצה על פיפטה זכוכית אנכית ולא במצב אופקי. טיפול כאמור חל על כל השלבים pipetting לשטיפה, resuspension והעברת ביצים / עוברים פנימה והחוצה של צינורות, cuvettes או צלחות, לפני ואחרי קיבוע. עם קיבעון, טיפול מיוחד צריך גם לקחת כדי בהתקן פיפטה נפרד חי מול עוברי קבוע כדי למנוע רעילות מ- שרידי fixatives. Microinjection הוא מסובך למדי Ciona ביצים / עוברים בשל גודלם הקטן ואת עמידותו של קרום vitelline ובביקורתיות תלוי בגודל טיפ אופטימיזציה שלמחט הזריקה, זווית מושלמת של הזרקה (תנועת מחט בשורה אחת, לאורך רדיוס הביצה) וכן שבירה, הוראות מכוונות היטב של קרום vitelline (על ידי שאיבה לפני שאיפה להזרקה). זו האחרונה הוא אפשרי רק אם בועות אוויר בוטלו לחלוטין מן צינורות ההזרקה המכיל שמן מינרלים להחלקת לחץ יניקה / הזרקה. בנוסף, את החלקים הקטנים ביותר של פסולת אבק או ביצה יסתמו את המחט, והם להימנע בקלות על ידי תנאי עבודה נקיים צעדי שטיפה לביצים לפני העברה על צלחת ההזרקה. הזרקת הודעה, העברת ביצים על מנות טריות תמנע השפעות רעילות מעובר מת שלא שרדו הליך ההזרקה. פתרון בעיות בעיות פוטנציאליות ההליך עשוי להיות מטופל על ידי הפתרונות הבאים. שיעורי הפריה נמוכים לנבוע הפעלת זרע מספיק, ניקיון ביצה נמוך או כרכי הפריה גדולים. השתמש freshly ונקווה ופחות בדילול הזרע. בדוק את התנועה זרע באקטיבציה. לשטוף את הביצים עם ASWH לפני הפריה כמתואר בשלב 4.2. הקטנת נפח המים ולהפחית את כמות ביצים לכל צלחת הפריה / טוב. עובר לאבד במהלך השלבים בהכנה יכול להימנע על ידי הוספת ירידה של פתרון dechorionation ומייעלים צנטריפוגות במורד הביצים / עובר undechorionated. Dechorionation זמן צריך להיות מותאם כמו ביצי dechorionated חלקית לא משקעים dechorionation הממושך הוא רעילים, בגרימה עובר להתפוצץ. פיתוח אסינכרוני לנבוע זרע שיורית שפורסם במהלך לנתיחה. שמור על יצוות הביצה הופרד בעלי חיים שונים כדי למנוע הפריה הדדית בלתי מבוקרת. התפתחות לא תקינה יכולה להיות סיבות שונות. בתחילה ובסוף העונה, לאחר השמירה על העובר מאנשים שונים המופרדים, הקבוצות הטובות ביותר ניתן לבחור. הימנע מביך את העוברים על10 דק &#39;כי אחרי הפריה כדי למנוע הפרעות הפרדה ooplasmic שלהם. ודא כי עוברי לא להתחיל חלוקת בזמן שהוא מועבר כמו pipetting המפריד בין בלסטומרים אחות ותוצאות בעוברים חלקית. שימוש בזרע פחות ביצים dechorionated להימנע polyspermy. השתמש מוכנים טרי אבל שטפו מנות agarose. ודא שהתקן pipetting הוא מקבע בחינם. שמור עוברת בקרה שלא dechorionated ולא electroporated לזהות בה צעד פיתוח שובש. להשלים את העוברים עם אנטיביוטיקה אם זיהום ופירוק מתרחשים. אם התקן הזריקה &#39;סתום&#39; פתיחת מחט הזריקה עלולה להיות מאומתת על ידי גירוש חלק מתכולת המוכתם שלה. חומר סתימה עלול להימחק מעל ידי גרירת קצה המחט בעיון את agarose. בועות אוויר בצינור ההזרקה ו / או שיש להסירו מחט. שנה את המחט לשליטה טובה יותר את עוצמת הזריקה כמו לביתטיפ DLE עלול לשבור או לסתום יחד ההזרקה. יש לשטוף את הביצים ומניחים אותם בצלחת הזרקה נקיה אם פסולת שהצטברה המנה. צנטריפוגה הפתרון הזריק לפני מילוי מחטים טריות כדי משקעים כל חלקיקים או גבישים קטנים. לעזר גם מתאמן הזרקה רק עם צבע חיוני. בדוק את טכניקת ההזרקה בדישון ביצים מוזרקות ולא מוזרקים. לבסוף, התייעצות עם עמית מנוסה יכול להיות מועיל כדי לשפר את טכניקת ההזרקה. כדי לשלוט על תופעות מחוץ היעד שני שאינם חופף MO והצל עם mRNA שונה שאינו מוכר על ידי MOS יכול לשלול נאמנו את השפעות פנוטיפי נוקב ב Ciona. Microinjection: משמעות ומגבלות Microinjection ב Ciona נוצל כדי ליצור לטיוטה הראשונה עבור רשת גנטית העובר כולו (GRN) בתוך chordate 11. עם זאת, למרות הרמ&quot;א כגוןהישג rkable, microinjection בעוברים Ciona יש מגבלות, בשל גודלו הקטן יחסית (0.14 מ&quot;מ קוטר) של ביצים Ciona. בהשוואה לאל של מיני chordate אחרים שבם דנ&quot;א זר / mRNA הוא הציג ידי microinjections, ביצי Ciona קשות יחסית להתמודד והשיעור העוברים Ciona מוזרק לכל ניסוי נותר נמוך (בממוצע 30 עד 50 עובר לכל ניסוי), פגיעת ניתוחים כמותיים. אף על פי כן, עבור גורמים אימהיים ומטרידים ב Ciona, microinjection של Mos היא השיטה של בחירה גם ללמוד מעורבותם הופעת zygotic התפתחות מן התא 16 עד 32 שלבי 15. בנוסף, זה אפשרי אם כי הרבה יותר קשה microinject בלסטומרים בודדים עד שלב התא 16-32. לבסוף, microinjection נשאר הטכניקה היעילה ביותר להפקת עוברים מהונדסים (על ידי ה- mRNA או הזרקת DNA) במיני ascidian מלבד Ciona, עבורו מלא OptimiZed פרוטוקולים electroporation אינם קיימים. Electroporation: משמעות ומגבלות כדי להתגבר על מספרים נמוכים ואילוצים אחרים של microinjection, רוב הקהילה Ciona השתמשה electroporation של DNA פלסמיד שכן הוא פותח ופורסם כמו פרוטוקול אופטימיזציה וסטנדרטי ידי זלר et al. בשנת 2004 9. ואכן, אלפי עוברים מהונדס Ciona יכול להיווצר בתוך שעה אחת עם עד 500 עוברים electroporated בו זמנית קובט אחד באמצעות הדופק יחיד 50 V של 16 מילי-שניות. הגישה של יצירת מספרים מסיביים של עוברים מהונדסים הוא עדיין ייחודית בין אורגניזמים מודל chordate. הידיעה הביאה Ciona שיכירו במהירות כמערכת מודל עוצמה לביצוע in vivo מנתח של אזורים רגולטורית ציס פוטנציאליים לוקליזציה הסלולר / subcellular, כפי שהודגם כאן. למרות electroporatiעל ב zygotes Ciona חוללה מהפכה באופן מהותי לתחום המחקר chordate GRN, הטכניקה בכל זאת כמה פרצופים גבולות. ראשית, פלסמידים מוצגים זמניות לעוברי Ciona ורוב עוברים בירושה כפי הנראה מערכי extrachromosomal, מה שהופך את היציבות של ה- DNA פלסמיד electroporated ספקולטיבי. יתר על כן, זה מאוד קשה, ואולי אף בלתי אפשרי, לשלוט על עותקים של פלסמידים electroporated כי יילקחו לכל הזיגוטה, ובכך וכתוצאה מכך תנודות פנוטיפי. בעיה נוספת מקשה לפרש תוצאות electroporation היא תופעה שאנו קוראים פסיפס. פלסמיד דנ&quot;א Electroporated ניתן לקחת עד בנקודות שונות של העובר בשלב אחד התא; המכרז קובע אילו וכיצד בחוגים רבים של הזיגוטה יקבלו פלסמיד הנורשים ידי בלסטומרים צאצא. וריאציות כאלה בבירור להפוך את הפרשנות להשפעות כמותיות יותר קשה. עם זאת, רוב הבעיות שמגיעות עם electroporaהשתנות tion נפתרות על ידי כמות מתאימה של דגימות ביולוגיות, עם ספירה וסטטיסטיקות של LacZ (או GFP) תאים חיוביים, אשר הוא בר השגה בקלות תצווה אחת. צדדי ואת הפוטנציאל של electroporation עבור הנדסה גנטית Electroporation בסופו של דבר מאפשר הקרנת אמצע תפוקה של אזורי רגולטורית ציס פוטנציאליים ניתוחים כמותיים של תפקוד גן המשובט פעם לתוך פלסמידים כתב או ביטוי. בשל הגנום Ciona הקומפקטי, זיהוי שיבוט של אזורי רגולטוריים פוטנציאל הוא פשוט למדי 3. אסטרטגיה באמצעות השפע של נתוני קהילה מודגמת באיור 2A. שיבוט של פלסמידים קידוד כתב גן הוא קל עוד יותר על ידי הדור של Ciona מותאם, סוויטות וקטור תואמות GATEWAY 19 ובאורך מלא תואם ספריית ORF 18. שני הכלים הם העומדים לרשות הקהילהלאפשר רקומבינציה אנזים ללא יעיל, הגבלה של נהגי רגולטוריות אזורי קידוד, כמתואר באיור 2B. בשנים האחרונות, electroporation הותאמה בהצלחה להשיג מניפולצית גן במיקוד רקמה עם פלסמידים מבטאי כלי עריכת גן כמו רכיבי CRISPR / Cas9 בשליטה נהגית רקמות ספציפיות 21,22. גישות כאלה תקדמנה ההבנה שלנו במהירות של הדינמיקה של GRNs ואת מנגנוני איתות נשמרים באופן פוטנציאלי, כוללים קודים גורמים שעתוק המעורבים ביצירת רקמות היציאה מתפשטת מן pluripotency. יתר על כן, loss- רקמות ספציפיות או לזכות של פונקציה גישות (על ידי CRISPR / Cas9 או על ידי ביטוי יתר) באמצעות electroporation יהיה אינסטרומנטלי ללמוד orthologs Ciona של גנים של מחלות הקשורות אדם. ואכן, קטלוגים עבור orthologs Ciona של גנים של מחלות האדם באורך מלא שלהם ORF קידוד שיבוטים הם בקלות available לניתוח ב Ciona 1 8. בשל הכפילויות הרחבות הגנום חוליות, רוב הגנים האנושיים להחזיק paralogs מיותר מבחינה תפקודית אשר מקשה על ניתוחים של גן פונקצית 1. Ciona להיות מערכת פשוטה עם הסדר רקמות chordate הטיפוס זחלים צריכים לחשוף תפקידים בסיסיים של כל כך חשובים, לעתים קרובות גנים נשמרים מבחינה תפקודית.

לאחרונה, רצף הגנום רפרטוארי גן עבדו הפכו נגישים מספר אורגניזמים מודל. קביעת קישורים תפקודיים גן, לעומת זאת, וכיצד הקשרים הללו נטועים ב- DNA כדי לבצע פעילות תעתיק לאורך זמן עוברי ומרחב, להישאר אתגר גדול, במיוחד בקרב בעלי חוליות. המורכבות של אינטראקציות רגולציה ואת המורכבות של הגנום 1,2, בעיקר בעלי חוליות, להאט ניתוחים פונקציונליים יעילים, בפרט ברמת ה- DNA in vivo. אכן, אין GRN מנותח כעת מן ההפריה לגמר, המדינה הבדיל סופני של האורגניזם המתפתח. ג ascidian intestinalis מייצג אורגניזם מודל שבו כגון מלאה GRN מנתח עשוי להיות אפשרי. יש לו הגנום ללא כפילות טיפוסית מחסרי עם יתירות גן קטנה. חולייתנים, בניגוד עברו שני סיבובים של כפילויות הגנום כי havאלקטרוני אשר נוצר משפחות גנים וגיוון פונקציונלי גדולות אלא גם יתיר בין paralogs. הרצפים הקומפקטיים ציס רגולטורית (יחידות הבקרה של GRNs) של ג intestinalis, וכן שושלת עוברית בלתי משתנית עם תאים כמה מזכירי ג elegans. יתר על כן, עמדת פילוגנטי הייחודית כקבוצת אחות חסרת חוליות לבעלי חוליות בתוך המיתרנים מאפשרת תצפית התפתחותית, ברזולוציה הסלולר, של תכנית גוף chordate להרכיב 3-6. סוגיית המפתח המבטיחה את ההצלחה העתידית עידן הגנומיקה באורגניזמים מודל היא הדור של מספר רב של עבר הפרעות כמותית in vivo. התפתחות הטכניקה microinjection בביצים Ciona 7, והאפשרות להשיג במהירות הרבה חיות טרנסגניות זמני על ידי electroporation ב vivo במאות Ciona zygotes 8,9 כבר פריצת דרך <em&gt; גנומיקה תפקודית Ciona. הנה, אנחנו ראשונים להציג את טכניקת microinjection המייגעת יותר למיקוד גנים בודדים כי נשארה שיטת הבחירה של morpholino (MO) מציאת גן בתיווך, בעיקר של תמלילים אימהיים. oligos MO בדרך כלל למקד היוזם ATG או אתרי השחבור של RNA ולהפריע תרגום חלבון. לאחר מכן, אנו מראים כיצד electroporation בביצים מופרות של Ciona מאפשר למספר גדול של עוברים כדי להיות מנותח באופן כמותי, ובכך פתח השדרות של ניתוח יעיל של משפרי in vivo ו גישות פונקציה רקמות ספציפיות gain- או הפסד של, עם אפשרות למניפולציות סימולטני וניתוחים. בנוסף, אנו מראים כיצד כלי קהילת Ciona מנוצלים עבור בחיזוי סיליקון של אזורי רגולטוריים שיבוט היעיל של מסגרות קריאה פתוחה מלאה (ORFs) וקטורי ביטוי. לבסוף, אנו מדגימים localizations subcellular ההפרש של fluorescently מתויגאו שכותרתו חלבונים על ביטוי יתר ידי electroporation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="913">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Lab with constant temp. (~ 18&#176;C)&#160;</td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">For embryo work</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:227px;">Ciona intestinalis adults</td>
			<td style="width:348px;">UPMC - Station Biologique, 
			Roscoff, France</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">For collecting gametes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">NaCl</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">3957.1</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">KCl</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">6781.1</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">CaCl2x2H2O</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">A119.1</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">MgCl2x6H2O</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">2189.1</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">MgS04x7H2O</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">P027.2</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">6885.1</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Hepes&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">HN78.3</td>
			<td style="width:255px;">For ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Sodium thioglycolate&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">MZ-6</td>
			<td style="width:255px;">For Dechorionation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Pronase&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">T0632-100G</td>
			<td style="width:255px;">For Dechorionation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">D-Mannitol&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:83px;">M9546-250G</td>
			<td style="width:255px;">For electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Plasmid DNA (prep &#62;1&#181;g/&#181;l)</td>
			<td style="width:348px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:83px;">740410.100</td>
			<td style="width:255px;">For electroporation or microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Agarose</td>
			<td style="width:348px;">any supplier</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">For coating embryo culture dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Plastic petri dishes</td>
			<td style="width:348px;">VWR</td>
			<td style="width:83px;">612-2079</td>
			<td style="width:255px;">Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Small scissors</td>
			<td style="width:348px;">any supplier</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">For dissecting gametes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">NaOH&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">6771.1</td>
			<td style="width:255px;">For activating dechorionation solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">5429.3</td>
			<td style="width:255px;">1M pH9.5, for sperm activation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Pasteur pipettes&#160;</td>
			<td style="width:348px;">VWR</td>
			<td style="width:83px;">612-1701</td>
			<td style="width:255px;">Treated by immersion in tap water for at least 12h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Hand centrifuge</td>
			<td style="width:348px;">Hettich Zentrifugen</td>
			<td style="width:83px;">1011</td>
			<td style="width:255px;">Use glass centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">1.5ml Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">T3406-250EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">2ml Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">T3531-200EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Square electroporator</td>
			<td style="width:348px;">Bio Rad Gene Pulser Xcell</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Electroporation cuvettes 4 mm</td>
			<td style="width:348px;">Eurogentec</td>
			<td style="width:83px;">CE-0004-50</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Coverslips</td>
			<td style="width:348px;">Sto Premium</td>
			<td style="width:83px;">PR248212600</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Glass slides</td>
			<td style="width:348px;">VWR</td>
			<td style="width:83px;">ECN 613-1551</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">G6257-10ML</td>
			<td style="width:255px;">For fixation in LacZ staining</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:348px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:83px;">P6148-500G</td>
			<td style="width:255px;">For fixation of fluorescent samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Vectashield</td>
			<td style="width:348px;">Vector</td>
			<td style="width:83px;">H-1000</td>
			<td style="width:255px;">For mounting of fluorescent samples</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &#223;-D-Galactopyranoside)</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">2315.2</td>
			<td style="width:255px;">LacZ substrate; stock in 40mg/ml DMF (Dimethylformamide)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">K5Fe(CN)6</td>
			<td style="width:348px;">Merck</td>
			<td style="width:83px;">4984</td>
			<td style="width:255px;">For LacZ staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">K3Fe(CN)6</td>
			<td style="width:348px;">Merck</td>
			<td style="width:83px;">4973</td>
			<td style="width:255px;">For LacZ staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">Na22HPO4</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">4984.2</td>
			<td style="width:255px;">For PBT</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:227px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:348px;">Roth</td>
			<td style="width:83px;">3904.2</td>
			<td style="width:255px;">For PBT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Tween&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">SLBJ5103V</td>
			<td style="width:255px;">For PBT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:348px;">Sigma</td>
			<td style="width:83px;">M8410</td>
			<td style="width:255px;">Embryo culture tested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Green Vital Dye</td>
			<td style="width:348px;">Fast Green Sigma&#160;</td>
			<td style="width:83px;">F7251</td>
			<td style="width:255px;">for microinjection; 10&#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Micropipette Puller (Flaming/Brown)</td>
			<td style="width:348px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:83px;">Model P-97</td>
			<td style="width:255px;">For pulling injection needles</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:227px;">Borosilicate glass capillaries GC100TF-10</td>
			<td style="width:348px;">Harvard Apparatus Ltd. UK</td>
			<td style="width:83px;">30-0038</td>
			<td style="width:255px;">1.0mm O.D. x0.78mm I.D., containing filament, for microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:348px;">Narishige</td>
			<td style="width:83px;">MWS-2</td>
			<td style="width:255px;">Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Injection holder</td>
			<td style="width:348px;">Narishige</td>
			<td style="width:83px;">1M-H1</td>
			<td style="width:255px;">For holding injection needles, entire system filled with mineral oil</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">All Glass Syringe</td>
			<td style="width:348px;">Walter Graf &#38; Co GmbH &#38; Co. KG&#160;</td>
			<td style="width:83px;">No. 95199.10427A4</td>
			<td style="width:255px;">10ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Morpholinos&#160;</td>
			<td style="width:348px;">GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">Injection at 0.25-0.5mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Capped mRNA</td>
			<td style="width:348px;">Ambion mMessage mMashine kit</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:255px;">Injection at 0.05-0.5&#181;g/&#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Injection at 20 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombination cloning kit</td>
			<td>Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen</td>
			<td>11789-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombination cloning kit</td>
			<td>Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen</td>
			<td>11791-019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo microinjection and electroporation in the chordate ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis at JoVE.com

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

אנו מציגים transgenesis חולף מציאת גן ב intestinalis Ciona, קבוצת אחות chordate לבעלי חוליות, תוך שימוש בטכניקות microinjection ו electroporation. שיטות כאלה להקל גנומיקה תפקודית חסר חוליות הפשוטות הזה כולל מאפיינים בסיסיים של בעלי חוליות, כולל notochord ו epithelia ראש חושים ועל orthologs הרב של הגנים הקשורים למחלות אנושיות.

העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

embryo-microinjection-electroporation-chordate-ciona

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

15.8K Views.  University Innsbruck.  אנו מציגים transgenesis חולף מציאת גן ב intestinalis Ciona, קבוצת אחות chordate לבעלי חוליות, תוך שימוש בטכניקות microinjection ו electroporation. שיטות כאלה להקל גנומיקה תפקודית חסר חוליות הפשוטות הזה כולל מאפיינים בסיסיים של בעלי חוליות, כולל notochord ו epithelia ראש חושים ?...

Video: Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that the chicken embryo is an effective research model for studying basic biological functions of auditory system development. More recently, the chicken embryo has become particularly valuable in studying gene expression, regulation and function associated with hearing. In ovo electroporation can be used to target auditory brainstem regions responsible for highly specialized auditory functions. These regions include the chicken nucleus magnocellularis (NM) and nucleus laminaris (NL). NM and NL neurons arise from distinct precursors of rhombomeres 5 and 6 (R5/R6). Here, we present in ovo electroporation of plasmid-encoded genes to study gene-related properties in these regions. We show a method for spatial and temporal control of gene expression that promote either gain or loss of functional phenotypes. By targeting auditory neural progenitor regions associated with R5/R6, we show plasmid transfection in NM and NL. Temporal regulation of gene expression can be achieved by adopting a tet-on vector system. This is a drug inducible procedure that expresses the genes of interest in the presence of doxycycline (Dox). The in ovo electroporation technique &#8211; together with either biochemical, pharmacological, and or in vivo functional assays &#8211; provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena.

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditory brainstem neurons of avians and mammals are specialized for fast neural encoding, a fundamental process for normal hearing functions. These neurons arise from distinct precursors of embryonic hindbrain. We present techniques utilizing electroporation to express genes in the hindbrain of chicken embryos to study gene function during auditory development.

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM ו Microrheology בתא חלמון עובר דג זברה

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

האפקטיביות של פירוק אוויר בדגים Salmonid שני, פורל הקשת (Oncorhynchus Mykiss) ופורל חום (Salmo Trutta מורפיום fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

העברת העובר פולשני המינימלי העובר ויטריפיקציה בשלב העובר אופטימלית במודל ארנב

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. This tissue complexity confounds the identification of causal link between extrinsic cues and cellular dynamics. A synthetically reconstituted multicellular system overcomes this problem by enabling researchers to test for a specific cue while eliminating others. Here, we present a method to reconstitute cell contact patterns with isolated Caenorhabditis elegans blastomere and adhesive polystyrene beads. The procedures involve eggshell removal, blastomere isolation by disrupting cell-cell adhesion, preparation of adhesive polystyrene beads, and reconstitution of cell-cell or cell-bead contact. Finally, we present the application of this method to investigate the orientation of cellular division axes that contributes to the regulation of spatial cellular patterning and cell fate specification in developing embryos. This robust, reproducible, and versatile in vitro method enables the study of direct relationships between spatial cell contact patterns and cellular responses.

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Tissue complexities of multicellular systems confound the identification of causal relationship between extracellular cues and individual cellular behaviors. Here, we present a method to study the direct link between contact-dependent cues and division axes using C. elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads.

בחוקת חוץ גופית דפוסי יצירת קשר מרחבי המרחב עם מבודדים העובר בלייסטומרים וחרוזי קלקר

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...