Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención NIDDK (K01DK092320) y la financiación de inicio del Departamento de Pediatría de la Universidad de la Escuela de Medicina de Texas McGovern.

El siguiente protocolo ha sido aprobado por la Universidad de Texas Health Science Center en el Centro de Houston para el Laboratorio de Medicina Animal Comité de Bienestar Animal, que sirve de Atención Institucional y el empleo Comisión (protocolo #: HSC-AWC-13-135). 1. Identificación y Selección de blastómeros para inyección de riñón de orientación <ol><li> Antes de generar embriones, utilice la Tabla normal de Xenopus Desarrollo 21 para entender la orientación de las divisiones celulares tempranos en el embrión. Como alternativa, los diagramas de acceso de las etapas tempranas del desarrollo de Xenopus en Xenbase 11. </li><li> Acceder a los mapas interactivos del destino celular de Xenopus en Xenbase 11 para seleccionar qué blastómeras serán objeto de microinyección. </li><li> Observe que el embrión de una sola célula tiene un polo animal pigmentación oscura y un polo vegetal, que es blanco y Yolky. Tenga en cuenta que una membrana protectora, conocido como el vitelino envelope, cubre el embrión. </li><li> Observe que la primera división se produce típicamente entre los lados izquierdo y derecho del embrión. Estas células contribuyen por igual al linaje pronephric. </li><li> Tenga en cuenta que la segunda escisión divide el dorsal y mitades ventral del embrión, lo que lleva a un embrión de 4 células. Las células dorsales son más pequeños y tienen menos pigmento que las células ventrales (Figura 2A y la Figura 3A). <ol><li> Identificar los blastómeros ventral (V; los grandes, células oscuras) en los lados izquierdo y derecho, que contribuyen más al riñón en desarrollo que el dorsal (D; luz, células pequeñas) blastómeras (Figura 2A). </li><li> Si la inyección en un embrión de 4 celdas, inyectar el blastómeras ventral izquierdo para apuntar el riñón izquierdo (Figura 3A y la Sección 3). </li></ol></li><li> La tercera escisión biseca los lados animales y vegetales, lo que resulta en un embrión de ocho células. En este punto, hay cuatro blastómeras animales [izquierda y derecha ventral(V1) y dorsal (D1)] y cuatro blastómeros vegetales [izquierda y derecha ventral (V2) y dorsal (D2)] (Figura 2B y la Figura 3B). <ol><li> Localizar los vegetales, blastómeras ventral (V2). Estos blastómeras contribuyen más al riñón en desarrollo cualquier otra célula en esta fase (Figura 2B). Para orientar el riñón izquierdo de un embrión de 8 células, inyectar en el blastómeras la izquierda V2 (Figura 3B y la Sección 3). </li></ol></li><li> Observe que las divisiones cuarta y quinta bisecan los blastómeros animales y vegetales. Dos progenie se generó a partir de cada blastómero, resultando en un embrión de 16 células. Las células llevan el nombre de su predecesor. Por ejemplo, el blastómero V2 de la etapa de 8 células da lugar a V2.1 y V2.2 progenie en la fase de 16 células (Figura 2C). La célula V2.2 en la fase de 16 células proporciona la mayoría de las células que contribuyen a la riñón en desarrollo. </li><li> Tenga en cuenta las divisiones sexto y séptimo dan como resultado un embry 32 célulaso. Una vez más, dos progenie se generó a partir de cada blastómero, nombrados después de su predecesor. Por ejemplo, el blastómero V2.2 desde la etapa 16 de células da lugar a V2.2.1 y V2.2.2 en la etapa de 32 células. Hay un sistema de nomenclatura alternativa en la etapa de 32 células en el que se identifican las células en cuatro filas como A, B, C, y D (de animal a vegetal), y en cuatro columnas como 1, 2, 3, y 4 ( de dorsal a ventral). Por lo tanto, la blastómeros V2.2.2, que contribuye en mayor medida a los pronefros en desarrollo, se llama C3 bajo este sistema de denominación alternativa (Figura 2D). </li></ol> 2. Preparación de embriones <ol><li> Preparar 50 ml de Dejelly solución (2% de cisteína, NaOH a pH 8,0). </li><li> Aislar ambos testículos de un solo rana macho de acuerdo con protocolos estándar 14. Coloque los testículos en un plato de 60 mm Petri llena de 10 ml de solución de testículos de almacenamiento (de Marc 1x Modificado Ringers [MMR; 0,1 M NaCl, KCl 2 mM, 1 mM MgSO 4, 2 mMCaCl 2, 5 mM de HEPES pH 8, EDTA 0,1 mM] 12, 1% de albúmina de suero bovino, 50 mg / ml de gentamicina). Almacenar los testículos a 4 ° C. Nota: Los testículos se pueden almacenar durante aproximadamente 7 a 10 días a 4 ° C, pero la eficiencia de fertilización disminuirá cuanto más tiempo los testículos se han almacenado. </li><li> Exprimir una rana hembra para obtener huevos de acuerdo con protocolos estándar 14. Recoge los huevos en una placa de Petri de 100 mm. Verter el exceso de agua. </li><li> Cortar ¼ de un testículo mientras está en solución de almacenamiento Testículos utilizando fórceps y una hoja de afeitar. La transferencia de la pieza de testículo a la placa de Petri que contiene los huevos. Ajustar el tamaño de la porción de testículo utilizado para contabilizar el tamaño de los testículos, el tiempo que el testículo se ha almacenado, y cuántos son los huevos para ser fertilizados. Generalmente utilizar ¼ a 1/3 de un testículo recién disecados para fertilizar un embrague de huevos. </li><li> Cortar la parte de testículo en trozos pequeños con fórceps y una hoja de afeitar. Agregar suficiente MMR 0.3x+ 30 mg / ml de gentamicina a la placa de Petri para cubrir los huevos. Agitar la MMR en el plato para mezclar. </li><li> Espere aproximadamente 30 minutos para la fertilización se lleve a cabo a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que el hemisferio animal (por el lado pigmentada del embrión) se sentará en la parte superior del embrión tras la fecundación efectiva. A continuación, retire el MMR de la placa de Petri con una pipeta de transferencia. Agregar suficiente Solución Dejelly al plato para cubrir los embriones. </li><li> En los próximos minutos, agitar suavemente el plato de forma intermitente. agitación vigorosa del plato en este momento puede causar defectos de eje. &#160; La capa de gelatina en los embriones se disolverá, y los embriones se congregan en el centro del plato durante el revolver. Una vez que los embriones se tocan de cerca el uno al otro en el centro del plato, eliminar la solución Dejelly con una pipeta de transferencia. No deje embriones en la solución Dejelly durante más de 5 minutos, o los embriones pueden ser dañados. </li><li> Lavar los embriones dejellied 3 - 5 veces en 0.3xMMR + 30 mg / ml de gentamicina mediante el vertido de cuidado o de pipeteado de la triple vírica y llenar el plato con el nuevo MMR. No quite toda la MMR del plato, o los embriones pueden ser dañados. </li><li> Retire cualquier huevos no fertilizados o piezas de testículo de la placa de Petri con una pipeta de transferencia. </li><li> Incubar los embriones entre 14 y 22 ° C. Nota: Los embriones se cultivan a temperaturas más bajas se desarrollan más lentamente que los embriones cultivados a temperaturas más altas. El momento de las etapas de desarrollo se puede encontrar en Xenbase 22. <ol><li> Para espaciar su desarrollo, el lugar de la mitad de los embriones de una sola fertilización en una placa de Petri se mantuvo a 14 ° C, y la otra mitad de los embriones en una placa de Petri se mantuvo a 18 ° C. Esto permite utilizar dos conjuntos de inyecciones en 4 u 8 de células de células de embriones de una sola fertilización. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de soluciones de inyección y microinyección de embriones <ol><li> Preparar la solución inyectable que contiene 0,01ng / nl proteína unida a la membrana roja fluorescente (RFP-MEM) ARNm 9, mientras que los embriones se desarrollan para la etapa de 4 células o de 8 celdas. Almacenar la solución de inyección en hielo hasta que esté listo para inyectar. </li><li> Cargar un &quot;tubo capilar de vidrio de repuesto en un extractor de aguja, con la parte superior del tubo de reemplazo alineado con la parte superior de la caja de aguja extractora. Establecer el valor de calor No. 2 a 800, y el valor de extracción a 650. Pulse la tecla&quot; 7 tire &quot;botón para tirar de la aguja. Esto creará 2 agujas de un solo 7&quot; tubo capilar de vidrio. </li><li> Cortar la punta de una aguja desmenuzado con un par de pinzas Dumont. Nota: Después de sacar la aguja, la punta está sellada y debe ser cortada abierta. Cuanto más cerca de la punta de la aguja que se corta, menor es el diámetro será la punta de la aguja. Aunque el diámetro de la punta no afectará el volumen de inyección con el sistema de microinyección se utiliza aquí, una punta con un diámetro más grande es más probable que el daño del embrión. </li><li> Deslizar el mpinza icropipette en la parte posterior de la aguja. A continuación, deslice el anillo O grande agujero en la parte posterior de la aguja detrás de la pinza. </li><li> Llene la aguja con aceite mineral utilizando una aguja hipodérmica de calibre 27, con cuidado de no obtener burbujas de aire en la aguja. </li><li> Slip la aguja en el émbolo de la microinyector, con capacidad para la aguja en el agujero grande del espaciador de plástico blanco instalado en el émbolo. El émbolo debe tener una pequeña junta tórica más cercana al cuerpo del microinyector, seguido por el espaciador blanco, gran junta tórica agujero, y el collar. Asegure la aguja apretando la pinza. Tire suavemente de la aguja para asegurarse de que está bien sujeto. </li><li> Pulse y mantenga pulsado el botón de &quot;vacío&quot; en la caja de control microinyector hasta hay dos pitidos. </li><li> Pipetear 3 l de solución de inyección en un trozo de Parafilm. Inserte la punta de la aguja en el talón de la solución de inyección en el Parafilm. Mantenga pulsado el botón de &quot;relleno&quot; en la microinjector caja de control para dibujar la solución de inyección en la aguja. </li><li> Llenar un plato de 60 mm Petri forrada con 500 micras de poliéster de malla con 5% de Ficoll en 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina. Con cuidado, pipetear 20 - 30 4 células o 8 de células de embriones en el plato. </li><li> El uso de un bucle de pelo 14, manipular los embriones de modo que el blastómero a inyectar se enfrenta a la aguja. Para orientar el riñón izquierdo, alinee los embriones para que los blastómeros ventral izquierda de embriones de 4 células o los blastómeros V2 dejado de embriones de 8 células se enfrentan a la aguja. </li><li> Inyectar 10 nl de solución de inyección en el blastómero seleccionado de cada embrión en el plato. Nota: La malla en la parte inferior de la placa de Petri estabiliza los embriones y les impide laminados, lo que les permite ser inyectados sin el uso de un bucle de pelo para la estabilización. </li><li> Transferencia de embriones inyecta en los pocillos de una placa de cultivo que se han llenado con un 5% de Ficoll en 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina. Incubar el embrión inyectados a 16 ° C durante al menos una hora para permitir que los blastómeros inyectados para sanar. </li><li> La transferencia de los embriones curadas en pocillos de una nueva placa de cultivo que se han llenado con 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina por la etapa 9 (antes de la gastrulación). </li><li> Incubar los embriones a 14-22 ° C hasta que los embriones alcanzan etapa 38 a 40 21. </li></ol> 4. La fijación y la inmunotinción de embriones <ol><li> Preparar 50 ml de sulfato de MOPS / EGTA / magnesio / formaldehído Buffer [MEMFA: MOPS 100 mM (pH 7,4), EGTA 2 mM, MgSO mM 4, 3,7% (v / v) de formaldehído 1]. </li><li> Usando una pipeta de transferencia, puesto 10-20 etapa 38 - 40 embriones en un vial de vidrio. Añadir 10 l 5% benzocaína en 100% de etanol al vial vial y invertido para mezclar. Espere 10 minutos para anestesiar a los embriones. </li><li> Eliminar la MMR del vial usando una pipeta de vidrio. Si el procesamiento de múltiples viales al mismo tiempo, los viales se pueden mantener en posición vertical en una placa de cultivo celular de 24 pocillos. </li><li> Con un tubo de vidrioTTE, llenar el vial con MEMFA. Colocar el vial en una plataforma oscilante en tres dimensiones durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar la MEMFA del vial usando una pipeta de vidrio. Llene el vial con metanol al 100%. Colocar el vial en una plataforma oscilante en tres dimensiones para 10 min a temperatura ambiente. Repita este paso de lavado una vez más, y almacenar los embriones en 100% durante la noche metanol a -20 ° C. </li><li> Preparar 1x Phosphate Buffered Saline-albúmina de suero bovino-Triton (PBT): 1x PBS, 2 mg / ml de albúmina de suero bovino, 0,1% de Triton X-100. </li><li> Preparar la solución de anticuerpo primario: 1x PBT con 10% de suero de cabra con una dilución 1: 5 de ratón monoclonal 4A6 anticuerpo (para etiquetar las membranas de los túbulos intermedios, distales y de conexión 20), una dilución de uno y treinta minutos de anticuerpo monoclonal de ratón 3G8 (a lumen de la etiqueta de los túbulos proximales 20), y una dilución 1: 250 de anticuerpo policlonal de conejo RFP (para etiquetar el trazador MEM-RFP). Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar la secondasolución de anticuerpo ry: 1x PBT con suero de cabra al 10%, 1: 500 Alexa 488 cabra anti-ratón IgG (concentración de solución madre 2 mg / ml; a la etiqueta 4A6 y 3G8) y 1: 500 Alexa 555 IgG de cabra anti-conejo (Stock concentración 2 mg / ml; para etiquetar el trazador MEM-RFP). Almacenar a 4 ° C, que cubre el tubo de papel de aluminio para protegerlo de la luz. </li><li> Alternativamente, recoger los anticuerpos primarios y secundarios después de la tinción, y guardar a 4 ° C para su reutilización en futuros experimentos. Si el anticuerpo se va a guardar para su reutilización, añadir azida de sodio al 0,01%. </li><li> Immunostain los embriones utilizando protocolos establecidos 18. </li></ol> 5. La visualización de los embriones y los análisis del tejido pronephric Targeted <ol><li> Se tamizan los embriones inmunoteñidas para verificar que el blastómero correcta se inyectó mediante la visualización de la fluorescencia del trazador bajo un estereomicroscopio fluorescente a 1X (para ver embrión entero) y 5X (para ver riñón) ampliación. Coloque los embriones en una placa de vidrio de múltiples pocillos con el queLLS llenos de 1x PBT utilizando una pipeta de transferencia con la punta cortada. Manipular los embriones con un bucle de cabello. Usar sólo los embriones que tienen la co-inyección de trazador presente en el pronefros en el lado izquierdo del embrión (Figura 3C, F y la Figura 4C, F) para la sobreexpresión del gen o el análisis de caída. </li><li> Como alternativa, desactive los embriones de Murray en Clear (2 partes de benzoato de bencilo: 1 de alcohol de bencilo parte) mediante la colocación de los embriones en un vial de vidrio y llenar el vial de Murray con Claro. Visualizar los embriones utilizando una placa de vidrio. Nota: Claro de Murray es un disolvente orgánico, y debe ser manejado con cuidado. Use guantes, y sólo utilizar viales de vidrio y pipetas de Murray con Claro. </li><li> embriones se almacena a 4 ° C en 1x PBT durante 2 - 3 semanas. Para el almacenamiento a largo plazo de embriones, los embriones deshidratar por lavado dos veces en 100% de metanol a temperatura ambiente durante 10 min. Almacenar los embriones a -20 ° C en metanol al 100%. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Orientación de los pronefros de desarrollo de embriones de Xenopus se basa en la identificación y la inyección de la blastómeros correcta. La inyección de la V2 de blastómeros de embriones de 8 células se dirige a los pronefros izquierda 18. Esto deja el pronefros derecho contralateral como control interno. Si morfolino desmontables o ARN sobreexpresión se utiliza para modificar el desarrollo del riñón, el pronefros derecho contralateral se pueden utilizar para comparar los efectos del gen desmontables o sobreexpresión de los pronefros izquierda. En este caso, los controles adecuados, tales como un grupo morfolino de control no coinciden o dominante constructo de ARN negativo se deben utilizar, además de la de control interno contralateral para analizar los resultados de las alteraciones en la expresión génica. Debido a la transparencia relativa del embrión Xenopus, defectos renales se pueden cuantificar fácilmente usando múltiples técnicas. Por ejemplo, desmontables gen o la sobreexpresión pueden ser simplemente cuantificaron mediante el cálculo del índice de pronephric de embrionesinmunotinción con anticuerpo 3G8 13, que compara el desarrollo de los túbulos proximales en los lados inyectados y de control del embrión. Además de estudiar el desarrollo pronephric, esta técnica se puede adaptar fácilmente para dirigirse a otros tejidos mediante la selección de la blastómero adecuada para inyectar el uso de destino establecido mapas 7-10. Además de dirigirse a otros tipos de tejidos, este protocolo también podría ser utilizado para estudiar el desarrollo del riñón en diferentes etapas. Este protocolo se veía en la etapa 40 embriones se tiñeron con anticuerpos 3G8 y 4A6, que detectan el tejido renal diferenciada. Embriones más jóvenes podrían inmunotiñeron con diferentes anticuerpos de riñón, o sometidos a hibridación in situ 5, 6, 20. Por ejemplo, el anticuerpo Lim1 puede detectar el pronefros en desarrollo 21, 22. Del mismo modo, LIM1, Pax8, y transcripciones beta hnf1- puede ser detectado con la puesta en marcha de hibridación in situ en la etapa 12.5 22-24 </sup&gt;. Otros más adelante en los marcadores de hibridación in situ se puede utilizar para detectar diferentes regiones del riñón en etapas de desarrollo posteriores. Por ejemplo, las sondas diseñadas para detectar la expresión de NPHS1, clckb, slc5a1, y ATP1A1 en el glomus, distal y la conexión de los túbulos, túbulos proximales, y todo el riñón, respectivamente, se han descrito 25, 5, 26, 27. La evaluación de la riñón a través de múltiples etapas usando diferentes anticuerpos o en análisis in situ permitiría una mejor comprensión de cómo un tratamiento altera el desarrollo del riñón. Un aspecto crítico de este protocolo es la correcta selección y la identificación del blastómero a inyectar. En este protocolo, se describe cómo dirigirse a los pronefros mediante la inyección de la izquierda blastómeras V2 de embriones de 8 células o blastómeros la ventral izquierda de embriones de 4 células. Si se inyecta el blastómeros incorrecta, el pronefros no estarán orientadas correctamente. Por lo tantoes fundamental para familiarizarse con los planos de desarrollo y la escisión de células de embriones tempranos de Xenopus antes de la microinyección 28, 29. La primera división celular no siempre sigue las tablas de la etapa de desarrollo establecidos, por lo que es útil sólo inyectar embriones en el que las divisiones celulares tempranos parecen &quot;normal&quot; y el blastómeras adecuada puede ser fácilmente identificado. Esto disminuirá el número de embriones que han sido dirigidas de manera incorrecta. Además, también es importante para los blastómeros del embrión a ser completamente divididos en el momento de la inyección. Por ejemplo, si la escisión entre blastómeras V1 y V2 de un embrión de 8 células no es completa antes de la microinyección, el trazador puede extenderse en V1, así como V2. Esto disminuiría la eficacia de dirección de la microinyección, y el embrión resultante puede mostrar la distribución del marcador que se parece más similar a la de un embrión inyectado en la etapa de 4 células en lugar de la etapa de 8 células. Unotra parte crítica de este protocolo es la verificación de que pronefros se dirige de manera adecuada mediante microinyección. Esto debe hacerse antes de analizar el desarrollo pronephric, ya que los embriones que no han tenido el pronefros adecuadamente dirigidos pueden sesgar el conjunto de datos resultante. Para verificar la correcta orientación, analizar la distribución del trazador en cada embrión inyectado. El lado inyectado (izquierda) del embrión debe mostrar la gran mayoría del trazador fluorescente. Si el lado de control (derecha) del embrión muestra una cantidad sustancial de la fluorescencia, entonces este embrión debe ser desechada. Si esto ocurre, se inyectó ya sea la blastómeros incorrecta o el blastómeras inyectado no había completado escinde antes de la inyección. En segundo lugar, la fluorescencia en el lado inyectado (izquierda) del embrión debe orientar correctamente el pronefros. Si el embrión se inyectó en el estadio de 8 células, los somitas dorsal y ventral, la placa lateral, intestino grueso, proctodeo, se espera que la piel del tronco y de la cresta neural en el maletero para mostrar la gripeorescence además de los pronefros 6, 29. Además de los tejidos mencionados para la inyección de 8 células, los embriones inyectados en la etapa de 4 células deben tener una distribución más amplia del trazador fluorescente en la piel y somitas, así como la orientación de la glándula de cemento, otocyst, la lente y placoda olfativa. Si el embrión no muestra la orientación adecuada de tejido, debe desecharse antes del análisis (Figura 5). Las inyecciones dirigidas descritos en este protocolo proporcionan un medio de la manipulación de la expresión génica en un tejido deseado. Una limitación de esta técnica es que aunque estas inyecciones se dirigen, no influyen sólo el riñón en desarrollo. Los de 4 y 8 células inyecciones que se describen en esta técnica son más específicas que las inyecciones realizadas en la etapa de célula única, en la que se altera la expresión de genes en todo el embrión, y las inyecciones hechas en el estadio de dos células, donde la mitad de la embrión hace alterado expresas genion. No lo hacen, sin embargo, se dirigen a un solo tejido. Aunque las inyecciones en los blastómeros ventrales de embriones 4-celulares y los blastómeros V2 de embriones de 8 células alteran la expresión génica en el pronefros, también alteran la expresión génica en otros tejidos. Otros tejidos afectados incluyen la piel, somitas, intestino, y la cresta neural. Por lo tanto, es importante entender que aunque las inyecciones de células 8 de 4 y son más específico que una o dos inyecciones de células, todavía se alteran la expresión de genes en múltiples tejidos. Además de la inyección de embriones en las etapas 4 y 8 de células, las inyecciones también se pueden realizar en las etapas de células 32 2-, 16-, y. Los embriones inyectados en la etapa de 2 células tendrán una gama más amplia de tejidos afectados que los embriones inyectados en etapas posteriores. Aunque técnicamente más difícil, embriones inyectados en las etapas 16 y 32 celulares tendrán una gama más reducida de los tejidos afectados que los embriones inyectados en las etapas de células y 8 4-. La traza el linaje MEM-RFPr se utiliza en este protocolo para verificar la correcta orientación después de la microinyección. MEM-RFP ARNm etiquetas de las membranas celulares después de que las células han traducido proteína a partir del ARN inyectado. La concentración de MEM-RFP trazador de linaje utilizado en este protocolo (0,1 ng de MEM-RFP ARNm en una inyección nl 10) debe ser modificado según sea necesario para dar cuenta de la muerte del embrión y la intensidad de la fluorescencia del marcador deseado. Además de modificar la cantidad de trazador de linaje inyectado, un trazador de linaje diferente, tal como rodamina-dextrano, los puntos cuánticos, o la histoquímicamente detectable β-galactosidasa, se puede utilizar en lugar de MEM-RFP. trazadores Lineage vuelven más diluida como las células se dividen, haciendo que los niveles de fluorescencia a disminuir a medida que se desarrolla el embrión. Una aplicación adicional de esta técnica es para co-inyectar un ARN exógeno o morfolino con el trazador de linaje para sobreexpresar o reducir la expresión de un gen de interés. El trazador de linaje se utiliza para verificar la correcta orientación de los pronefros, pero nopara indicar donde co-inyectado ARN exógeno o morfolino localiza en el embrión. ARN exógeno y morfolinos no pueden propagarse a través del blastómero inyectado a la misma velocidad que el trazador co-inyectado, potencialmente resultando en células hijas que tienen el trazador, pero no el ARN exógeno o morfolino presente 30. De hecho, hemos observado que dos construcciones de ARN diferentes inyectados en una sola celda no siempre co-localizar (datos no publicados). Por lo tanto, la presencia del trazador en una célula no indica necesariamente que la co-inyección de ARN exógeno o morfolino está siempre presente en dicha célula. Este protocolo detalla un procedimiento para la orientación de microinyección a los blastómeros que dan lugar a los pronefros de desarrollo de embriones de Xenopus. La expresión de genes a menudo se manipula en embriones de Xenopus a través de la inyección de morfolinos o ARN exógeno, ambos de los cuales pueden prevenir causa principios de anomalías del desarrollo si se inyecta en uno oembriones de dos células. Los embriones inyectados en el knockdown sola exposición etapa de célula o sobreexpresión en todas las células del embrión en desarrollo. Si el gen es necesario para los procesos de desarrollo tempranos adecuados, el embrión no puede desarrollar un pronefros. Las inyecciones se realizan en etapas posteriores, como las inyecciones de 8 células se detallan aquí, pueden dar lugar a embriones que se someten a la gastrulación y el desarrollo eventual pronephric 18. Por lo tanto, las inyecciones selectivas discutidos aquí pueden superar los defectos de gastrulación causadas por la alteración de la expresión de algunos genes, lo que permite que el embrión para el progreso a través del desarrollo pronephric. En el futuro, este protocolo también puede ser utilizada para combatir las construcciones de CRISPR a blastómeras deseados.

El riñón embrionario de Xenopus, el pronefros, es un buen modelo para estudiar el desarrollo del riñón y la enfermedad. Los embriones se desarrollan externamente, son de tamaño grande, se pueden producir en grandes cantidades, y son fácilmente manipulados mediante microinyección o procedimientos quirúrgicos. Además, se conservan los genes que regulan el desarrollo del riñón en mamíferos y anfibios. Riñón de los mamíferos desarrollará en tres etapas: el pronefros, mesonefros y metanefros 1, mientras que los anfibios embrionarias tienen un pronefros y anfibios adultos tienen un metanefros. La unidad de filtrado básico de estas formas de riñón es la nefrona, y ambos mamíferos y anfibios requieren las mismas cascadas de señalización y eventos de inducción para someterse a nefrogénesis 2, 3. Los pronefros Xenopus contiene una sola nefrona compuesto por proximal, intermedia, distal y la conexión de los túbulos, y un glomus (análogo al glomérulo mamífero) 1, 4 a 6 (Figura 1 </strong&gt;). El único, gran nefrona presente en el pronefros de Xenopus lo hace adecuado como un modelo simple para el estudio de genes implicados en los procesos de desarrollo del riñón y enfermedades. Mapas del destino celular se han establecido los primeros embriones de Xenopus, y están libremente disponibles en línea en Xenbase 7-11. A continuación, describimos una técnica de microinyección de marcadores de linaje para orientar el pronefros Xenopus en desarrollo, aunque la misma técnica se puede adaptar a dirigirse a otros tejidos como el corazón o los ojos. trazadores Lineage son etiquetas (incluidos colorantes vitales, dextranos marcados con fluorescencia, enzimas histoquímicamente detectables, y mRNA que codifican proteínas fluorescentes) que se pueden inyectar en un blastómero temprano, lo que permite la visualización de la progenie de esa célula durante el desarrollo. Este protocolo utiliza MEM-RFP ARNm, que codifica la membrana dirigida proteína fluorescente roja 12, como trazador de linaje. La tecnología orientada microinyeccióntécnicas para blastómeros individuales en embriones de 8 celdas de 4 y descritos aquí pueden ser utilizados para la inyección con morfolinos para derribar la expresión de genes, o con ARN exógeno que sobreexpresan un gen de interés. Inyectando en el blastómeras ventral, vegetal, principalmente se dirigirán los pronefros del embrión, dejando el pronefros contralateral como control del desarrollo. Co-inyección de un trazador verifica que se inyectó el blastómero correcta, y muestra que los tejidos en el embrión surgió de la blastómero inyectado, la verificación de la orientación de los pronefros. La inmunotinción de las pronefros permite la visualización de lo bien que han sido blanco de los túbulos pronéfricos. Sobreexpresión y desmontables efectos pueden ser marcados contra el lado contralateral del embrión, que sirve como un control de desarrollo, y se pueden utilizar para calcular el índice pronephric 13. La disponibilidad de mapas destino celular permite que esta técnica de microinyección concretas, que sirva a los tejidos diana OTHer que los pronefros y co-inyección de un trazador fluorescente permite la microinyección dirigida a cada tejido a ser verificada antes del análisis. Durante la microinyección de embriones, la temperatura de desarrollo debe ser regulada fuertemente, dado que la tasa de desarrollo de Xenopus es altamente dependiente de ella 14. Los embriones se incubaron a temperaturas más bajas (14 - 16 ° C) para las inyecciones de células 4- 8 y debido a que el tiempo de desarrollo se hace más lenta. A 22 ° C, el tiempo de desarrollo de la etapa 1 (1 célula) a la etapa 3 (4 celdas) es de aproximadamente 2 horas, mientras que a los 16 años el tiempo de desarrollo ° C a la etapa 3 es de aproximadamente 4 horas. Se tarda aproximadamente 15 minutos para el final de un embrión de 4 células a una de 8 celdas (etapa 4) de embriones a los 22 ° C, pero tarda aproximadamente 30 minutos a 16 ° C. Del mismo modo, a 22 ° C, sólo se tarda 30 minutos para que un embrión de 8 células para pasar a un embrión de 16 células (etapa 5). Este tiempo se aumentó a 45 minutos a 16 ° C. losrefore, es útil para disminuir la tasa de desarrollo de los embriones para permitir tiempo suficiente para que las inyecciones en la etapa de 8 células antes de que los embriones pasar a la fase de 16 células. Además, las temperaturas de crecimiento pueden modularse para acelerar o ralentizar el desarrollo embrionario hasta que el riñón ha desarrollado plenamente. La epidermis de renacuajo etapa embriones de Xenopus es relativamente transparente, permitiendo una fácil obtención de imágenes de los pronefros en desarrollo sin disección o limpieza del tejido 15. Debido a la relativa transparencia de los embriones de Xenopus, imágenes de células vivas es también factible 16,17. Todo el montaje inmunotinción para visualizar el pronefros es posible con anticuerpos establecidos que etiquetan los extremos proximal, intermedio y distal túbulos de conexión de fase de 38 - 40 embriones que permiten la evaluación del desarrollo pronephric después de la manipulación específica de la expresión génica en embriones de Xenopus 18-20.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin solution, 50 mg/ml</td><td>Amresco</td><td>E737-20ML</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine, 99%+</td><td>Acros Organics</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher</td><td>BP525-100</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Mini Fridge II</td><td>Boekel</td><td>260009</td><td>Benchtop incubator for embryos.</td></tr><tr><td>Gap43-RFP plasmid</td><td></td><td></td><td>For making tracer RNA. Ref: Davidson &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2006.</td></tr><tr><td>Rhodamine dextran, 10,000 M.W.</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Tracer.</td></tr><tr><td>Molecular biology grade, USP sterile purified water</td><td>Corning</td><td>46-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>7&quot; Drummond replacement tubes</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/XL</td><td>Microinjection needles.</td></tr><tr><td>Needle puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>For breaking microinjection needle tip.</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>Microinjector.</td></tr><tr><td>Mineral oil, heavy</td><td>Fisher</td><td>CAS 8042-47-5</td><td>Oil for needles.</td></tr><tr><td>27 G Monoject hypodermic needle</td><td>Covidien</td><td>8881200508</td><td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td></tr><tr><td>5 ml Luer-Lok syringe</td><td>BD</td><td>309646</td><td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>800 micron Polyester mesh</td><td>Small Parts</td><td>CMY-0800-C</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipets</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.</td></tr><tr><td>6-well cell culture plate</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 45 mm Screw thread vial</td><td>Fisher</td><td>03-339-25B</td><td>For fixing, staining, and storing embryos.</td></tr><tr><td>24-well cell Culture plate</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Spectrum</td><td>BE130</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder</td><td>Fisher</td><td>BP661-50</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumen</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>3D Mini rocker, model 135</td><td>Denville Scientific</td><td>57281</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum, New Zealand origin</td><td>Invitrogen</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Fisher</td><td>S227I-25</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal 3G8 antibody</td><td>European Xenopus Resource Centre</td><td></td><td>Primary antibody to label proximal tubules.</td></tr><tr><td>Monoclonal 4A6 antibody</td><td>European Xenopus Resource Centre</td><td></td><td>Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules.</td></tr><tr><td>anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td>Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>Secondary antibody to label kidney tubules.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21428</td><td>Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td></tr><tr><td>9 Cavity spot plate</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Fisher</td><td>105862500</td><td>Optional - for clearing embryos</td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Fisher</td><td>A396-500</td><td>Optional - for clearing embryos</td></tr></tbody></table>

technique to target microinjection to the developing xenopus kidney

El riñón embrionario de Xenopus laevis (rana), el pronefros, consta de una sola nefrona, y se puede utilizar como un modelo para la enfermedad renal. Embriones de Xenopus son grandes, desarrollar externamente, y pueden ser manipulados fácilmente por microinyección o procedimientos quirúrgicos. Además, se han establecido mapas de destino para los primeros embriones de Xenopus. microinyección dirigida en el blastómero individuo que finalmente dará lugar a un órgano o tejido de interés se puede utilizar para sobreexpresar selectivamente o derribar a la expresión de genes dentro de esta región restringida, la disminución de los efectos secundarios en el resto del embrión en desarrollo. En este protocolo, se describe la forma de utilizar los mapas de destino de Xenopus establecidos para apuntar el riñón en desarrollo Xenopus (el pronefros), a través de microinyección en blastómeros de embriones específicos de células y 8 4-. La inyección de trazadores linaje permite la verificación de la orientación específica de la inyección.Después de embriones se han desarrollado hasta la etapa 38 - 40, todo el montaje inmunotinción se utiliza para visualizar el desarrollo pronephric, y la contribución de las células diana a las pronefros se puede evaluar. La misma técnica se puede adaptar a dirigirse a otros tipos de tejidos además de las pronefros.

Microinyecciones de 4 y 8 células embriones de Xenopus con MEM-RFP ARNm muestran diferentes niveles de focalización para el pronefros. La figura 4 muestra la etapa 40 embriones con los patrones de expresión de ARNm MEM-RFP correctas. Los embriones fueron inyectados en el blastómero ventral izquierdo (Figura 4A), y clasifican para el patrón de expresión adecuado de MEM-RFP mRNA. Además de expresar MEM-RFP en el proximal, intermedio, distal y la conexión de los túbulos del riñón, se espera que los embriones inyectados correctamente para mostrar fluorescencia en la epidermis de la cabeza, tronco y cola. También deben mostrar fluorescencia en el otocyst, la glándula de cemento, proctodeo, y somitas (Figura 4C). La distribución de la fluorescencia MEM-RFP en los riñones de 8 embriones inyectados correctamente se determinó con un estereomicroscopio fluorescente (Figura 4B). Los embriones con altos niveles de expresión MEM-RFP en la epidermis quebloqueó la detección de regiones renales se calificaron como &quot;oclusión&quot;. expresión MEM-RFP se detectó en el proximal, túbulos intermedios, distales y de conexión de todos los embriones que no se anotó como ocluido. Estereoscopio (Figura 4D-F) y microscopios confocal (Figura 4G-I) se utilizaron para verificar la co-localización de MEM-RFP y tejido renal con inmunotinción 3G8 y 4A6. de formación de imágenes confocal verificó la co-localización de MEM-RFP con la proximal, túbulos distales intermedios, y de conexión de los riñones, lo que indica que la microinyección de MEM-RFP en el blastómero ventral izquierda se dirige correctamente el riñón. Los embriones inyectados con MEM-RFP mRNA en la etapa de 8 células (Figura 5A) muestran una gama más estrecha de los tejidos que exhiben fluorescencia, lo que indica que las inyecciones de células 8 reducen el potencial de efectos secundarios en el riñón. Al igual que los embriones inyectados en la fase de 4 células, embryos inyecta en la etapa de programa de fluorescencia 8-célula en el proximal, túbulos distales intermedios, y de conexión del riñón, así como los somitas y proctodeo (Figura 5C-F). A diferencia de los embriones inyectados en la etapa de 4 células, la glándula de cemento y otocyst no están etiquetados con MEM-RFP. Fuera de 10 embriones correctamente orientados, un embrión mostró MEM-RFP en casi la totalidad de los túbulos proximales, y 3 mostró MEM-RFP en casi todos los túbulos intermedia y distal del riñón (Figura 5B). Los túbulos de conexión de 7 embriones fueron etiquetados en parte con MEM-RFP. Además, los riñones de embriones inyectados en la etapa de 8 células eran más fáciles de visualizar, y sólo uno se puntuó como ocluido. Co-localización de MEM-RFP y marcar anticuerpos del riñón (3G8 y 4A6) se determinó utilizando un microscopio estereoscópico (Figura 5D-F), y verifica por medio de un microscopio confocal (Figura 5G-I). El proximal, intermedio, distal y la conexión de tubules del riñón se marcaron con MEM-RFP en embriones inyectados en la etapa de 8 células, lo que demuestra que tenía como objetivo la inyección del blastómeras V2 etiqueta el riñón mientras se muestra la fluorescencia en un menor número de tejidos de embriones inyectados en el blastómeras ventral izquierda en la de 4 celdas escenario. Este ensayo hace uso de un fluorescentemente etiquetado mRNA como un trazador para indicar que los tejidos fueron blanco de microinyección. Es importante evaluar los embriones para la localización trazador consistente antes del análisis, y los embriones que para no mostrar el patrón de distribución de trazador esperada debe ser desechada. La figura 6 muestra un ejemplo de un embrión de etapa 40 que fue incorrectamente dirigido con MEM-RFP mRNA en la etapa de 4 células. La expresión de ARNm MEM-RFP se encuentra en el lado derecho del embrión en lugar del lado izquierdo (Figura 6A). Además, la mayoría de la expresión de ARNm es en la piel de la parte inferior del tronco y la cola, conpoca expresión en los somitas. No expresión de ARNm se ve en la proximal, intermedio y distal túbulos de conexión (Figura 6B), lo que confirma la orientación inadecuada de los riñones. Por lo tanto, este embrión no debe ser utilizado para el análisis. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53799/53799fig1.jpg" /> Figura 1:. Xenopus embrionaria de riñón Diagrama del riñón de una etapa 35 Xenopus embrión, que muestra el proximal, intermedio, distal, y la conexión de los túbulos. Basado en Raciti et al. (2008) 6. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53799/53799fig2.jpg" /> Figura 2: Xenopus embrionarias Mapas Destino. mapas Fate identificar y nombrar los blastómeros que contribuyen a los pronefros en desarrollo. A) Mapa de destino de un embrión de 4 celdas. B) El destino mapa de un embrión de 8 células. mapa C) El destino de un embrión de 16 células. mapa D) El destino de un embrión de 32 células. Blastómeros del embrión de 32 células también están etiquetados utilizando un sistema de blastómeros de nomenclatura alternativa. Fate mapas basados ​​en Moody (1987) 8, 9 y Moody y Kline (1990) 7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53799/53799fig3.jpg" /> Figura 3:. Esquema de inyección para la segmentación del Xenopus pronefros flechas rojas indican la célula para inyectar. A) Animal y puntos de vista ventral de un embrión de 4 celdas que muestra la inyección de la b ventral izquierdolastomere para apuntar a los pronefros izquierda. Las flechas rojas indican la blastómeros ventral izquierdo. B) Animales y puntos de vista ventral de un embrión de 8 células que muestra la inyección del blastómeras V2 izquierdo para apuntar el pronefros izquierda. Las flechas rojas indican la V2 blastómeras la izquierda. AB) Imágenes de embriones tomadas en un estereoscopio con un aumento de 4X. Las inyecciones en base a la suerte de Xenopus mapas de desarrollados por Moody (1987) 8, 9 y Moody y Kline (1990) 7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53799/53799fig4.jpg" /> Figura 4:. Ejemplos de embriones Dirigido a la Etapa 4 celdas etapa inmunote~nido 40 embriones de Xenopus que muestra la inyección dirigida a los pronefros izquierda en la fase de 4 células usando MEM-RFP ARNm como trazador. etiquetas MEM-RFPmembranas de las células rojas. A) muestra la inyección esquemática de MEM-RFP ARNm en el blastómero ventral izquierdo de un embrión de 4 células. B) de localización de tejido de la fluorescencia MEM-RFP en los riñones de embriones inyectados correctamente. C) Etapa 40 embriones inyectados con MEM-RFP blastómeras en el ventral izquierdo en la fase de 4 células. localización MEM-RFP se muestra en rojo, mientras que el riñón se etiqueta verde. ampliación 1X. D) de riñón teñidas con 3G8 para etiquetar el lumen de los túbulos proximales, y 4A6 para etiquetar las membranas de las células en los túbulos intermedios, distales y de conexión. ampliación 5X. E) La ampliación de la región sobre el riñón que muestra la localización MEM-RFP. ampliación 5X. F) se fusionaron imagen que muestra co-localización del trazador MEM-RFP con el riñón. ampliación 5X. CF) Imágenes de embriones tomadas con una cámara Olympus DP71 en un estereoscopio. G) imagen confocal del riñón de un segundo embrión teñidas con 3G8 y 4A6. H) La localización de MEM-RFP en el riñón y el tejido circundante. I) se fusionó sho imagenala co-localización de MEM-RFP, 3G8, 4A6 y en el riñón. GI) Confocal de imágenes utilizando proyección máxima de 20 aumentos. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53799/53799fig5.jpg" /> Figura 5:. Ejemplos de embriones focalizados en la etapa de 8 células etapa inmunote~nido 40 embriones de Xenopus que muestra la inyección dirigida a los pronefros la izquierda en el estadio de 8 células usando MEM-RFP ARNm como trazador. MEM-RFP etiquetas de las membranas de los glóbulos rojos. A) muestra la inyección esquemática de MEM-RFP ARNm en el blastómeras V2 izquierdo de un embrión de 8 células. B) de localización de tejido de la fluorescencia MEM-RFP en los riñones de embriones inyectados correctamente. C) Etapa 40 embriones inyectados con MEM-RFP en el blastómeras V2 izquierda en el estadio de 8 células. Se muestra la localización MEM-RFPen rojo, mientras que el riñón se etiqueta verde. ampliación 1X. D) de riñón teñidas con 3G8 para etiquetar el lumen de los túbulos proximales, y 4A6 para etiquetar las membranas de las células en los túbulos intermedios, distales y de conexión. ampliación 5X. E) La ampliación de la región sobre el riñón que muestra la localización MEM-RFP. ampliación 5X. F) se fusionaron imagen que muestra co-localización del trazador MEM-RFP con el riñón. ampliación 5X. CF) Imágenes de embriones tomadas con una cámara Olympus DP71 en un estereoscopio. G) imagen confocal del riñón de un segundo embrión teñidas con 3G8 y 4A6. H) La localización de MEM-RFP en el riñón y el tejido circundante. I) se fusionó imagen que muestra co-localización de MEM-RFP, 3G8, 4A6 y en el riñón. GI) Confocal de imágenes tomadas con proyección máxima de 20 aumentos. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 6: Ejemplo de embriones incorrectamente dirigido a la etapa de 4 células inmunote~nido etapa 40 embriones de Xenopus que muestra la orientación incorrecta de los pronefros izquierda en la fase de 4 células usando MEM-RFP ARNm como trazador.. MEM-RFP etiquetas de las membranas de los glóbulos rojos. A) Etapa 40 embriones que muestra la distribución inadecuada de MEM-RFP indicativo de la inyección en el blastómeros incorrecta. Además de tener la distribución del marcador incorrecta que indica la inyección en el blastómero incorrecta, este embrión se inyectó en el lado derecho. ampliación 1X. B) imagen combinada del riñón que muestra una falta de co-localización de MEM-RFP con anticuerpos de etiquetado del riñón (3G8, 4A6). ampliación 5X. AB) Imágenes del embrión tomado un estereoscopio. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53799/53799fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

technique-to-target-microinjection-to-the-developing-xenopus-kidney

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

11.2K vistas.  University of Texas McGovern Medical School. Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos. 

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Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Uso del análisis confocal de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Encargado de investigar moduladores de Wnt y Shh morfógeno Degradados

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Biología

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Los cultivos neuronales de explantes de<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Neurociencias

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Microinyección de ADN en los oculares en embriones de Xenopus laevis e imágenes de gFP que expresan los árboles axonales ópticos en los renacuajos de Xenopus vivos

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Translocación polarizado de proteínas fluorescentes en Xenopus Ectodermo en respuesta a la señalización de Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery (References 2 - 3, and references therein). A characteristic that makes the oocyte attractive for foreign channel expression is the poor abundance of endogenous ion channels4. This expression system has proven useful for the characterization of many proteins, among them ligand-gated ion channels.
The expression of GABAA receptors in Xenopus oocytes and their functional characterization is described here, including the isolation of oocytes, microinjections with cRNA, the removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments. The procedures were optimized in this laboratory5,6 and deviate from the ones routinely used7-9. Traditionally, denuded oocytes are prepared with a prolonged collagenase treatment of ovary lobes at RT, and these denuded oocytes are microinjected with mRNA. Using the optimized methods, diverse membrane proteins have been expressed and studied with this system, such as recombinant GABAA receptors10-12, human recombinant chloride channels13, Trypanosome potassium channels14, and a myo-inositol transporter15, 16.
The methods detailed here may be applied to the expression of any protein of choice in Xenopus oocytes, and the rapid solution change can be used to study other ligand-gated ion channels.

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail vein injection, for example, is a well-established method by which the liver can be transfected. This manuscript describes an application of hydrodynamic principles by injection of the mouse kidney directly with plasmid DNA for kidney-specific gene expression. Mice are anesthetized and the kidney is exposed by a flank incision followed by a fast injection of a plasmid DNA-containing solution directly into the renal pelvis. The needle is kept in place for ten seconds and the incision site is sutured. The following day, live animal imaging, Western blot, or immunohistochemistry may be used to assay gene expression, or other assays suited to the transgene of choice are used for detection of the protein of interest. Published methods to prolong gene expression include transposon-mediated transgene integration and cyclophosphamide treatment to inhibit the immune response to the transgene.

This protocol describes a method to inject plasmid DNA into the mouse kidney via the renal pelvis to produce transgene expression specifically in the kidney.

Inyección hidrodinámica la Pelvis Renal para la no expresión de proteínas en el riñón

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo

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Uso del análisis confocal de

Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria