The work presented here is supported by the Singapore National Research Foundation under CREATE program (NRF-Technion): The Regenerative Medicine Initiative in Cardiac Restoration Therapy Research Program and by the Public Sector Funding (PSF) 2012 from the Science and Engineering Research Council (SERC) under the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR).

הערה: פרוטוקול זה מתאר את השימוש של מערכת מחלק רובוטית בסיוע גב לחץ (איור 1 א) כמו תחריט שטח (איור 1 ב) ו bioprinter מבוסס שחול (תרשים 1C) 10. שינוי 1. משטח קלקר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1 גליונות מ&quot;מ קלקר מאז צלחות תרבות קלקר רקמות נוטים להרכין כלפי מעלה במרכז, הורס את העקביות בגובה שני תחריט ודפוס. הערה: ככל גליונות קלקר אינם משתנים עבור הידבקות התא, טיפול פלזמה מתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמצן טיפול פלזמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, בחר בלחץ של בר 2 על הרגולטור של גליל החמצן המחובר למכונת הפלזמה. ואז לעבור את המכונה פלזמה על קלט התנאים הבאים אל לוח הבקרה של המכשיר: 150 W, 30 sscm של חמצן, 10 דק &#39;(כוח, זרימת הגז וזמן בהתאמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את substrat קלקרדואר לתוך תא פלזמה, לאטום את הדלת ולחץ על כפתור התחל בלוח הבקרה. משרים את המצע קלקר שטופלו פלזמה חמצן בסרום שור העובר לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לפני הכביסה בופר פוספט 1x שלוש פעמים (PBS). </li></ol></li></ol> 2. דפוסי הדפס תכנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתכנית כדי ראשית לחתוך את השטח עם Stylus או אזמל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר באמצעות עט, להכניס מחט טקסטיל 1.5 מ&quot;מ קוטר (מבפנים בזהירות רבה) לתוך הנחיר של מזרק מחלק (או 5 או 10 מ&quot;ל) עד ​​שזה הופך תקוע ומאובטחת. אם באמצעות אזמל, לבחור אזמל עגול טפל כך שהוא עשוי להיות מהודק לתוך מנגנון המהדק של זרוע ההדפסה. הערה: חרט משרטטת דפוסי מעוקל טוב יותר מאשר להב סכין המנתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מנסים ראשון ליצור הסדר bioprinted, לשרטט את התבנית הרצויה על נייר מילימטרים עם גרזנים ממוספרים כדי ליצור את קואורדינטות XY. ואז אניNput את הקואורדינטות של דוגמה חרוטה / bioprinted לתוך תוכנת גיליון אלקטרוני (איור 2). הערה: &quot;התבנית הרצויה&quot; יכול להיות בצורות רבות כגון ליניארי, בצורת האות S, או עגול. הבחירה תלויה בדגם הניסוי הנדרש, כגון קווי קו מקבילים עבור הבידול של MSCs כדי cardiomyocytes כפי שהודגם כאן. פונקצית גרף הפיזור מאפשרת ההדמיה של תבנית החלקה המוצעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת ההדפסה / מחלק. בחר &quot;התוכנית&gt; הוספת תוכנית&quot; ואחריו &quot;ערוך&gt; הוסף נקודה&quot; כדי להגדיר את התוכנית. יצא את x ו- y לתאם הערכים שהתקבלו מגיליון הנתונים לתוך ההדפסה / מחלק התוכנה באמצעות &quot;העתק הדבק&quot; פונקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את הגובה &quot;z&quot; של הרובוט לפני כל סיבוב על מנת למקם את זרבובית חרט / להדפיס על גבי המשטח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת ההדפסה / מהחלק, בחר באפשרות &quot;הרובוט&quot;, לחץ על &quot;מצב שינוי &amp;# 34; ו להפעיל את האפשרות &quot;מצב הוראה&quot;. לאחר שנבחר, התוכנה מאפשרת את הפונקציה &quot;רוץ&quot; של הרובוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרוץ, ראשון לאתחל את הרובוט למצב ברירת המחדל שלו על ידי בחירת הפקודות הבאות משורת התפריטים; &quot;רובוט&gt; מקה אתחול&quot;, ולאחר מכן בחר &quot;רובוט&gt; רוץ&quot;. קלט את הערכים המספריים (במ&quot;מ) ב &quot;חריצי X ו- Y&quot; נדרש להציב את העט בדיוק על מוצאם של הדפוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, קלט ערך מספרים (במ&quot;מ) ב &quot;חריץ Z&quot; כדי למקם את הזרבובית העטה או הדפסה במגע עם פני השטח, אך לא כופף או להגביה את פני השטח. נקודה זו היא יועדה ערך התחלה &quot;Z&quot;. הערה: העומק של כל חריץ יכולה להיות מגוונים בקלות באמצעות Z-הגובה של המערכת. חריצים של 40, 80, ו 170 מיקרומטר מודגמים לחתוך לתוך השטח של 1 מ&quot;מ יריעות קלקר עבה (איור 4 ולוח 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר pהוראה דפס עבור כל אחת מן הנקודות לתאם, כלומר, &quot;התחלה של קו לוותר&quot; על מנת להגדיר את הנקודה הראשונה וייזום ההדפסה, &quot;הקו עובר&quot; לייעד את נקודות ביניים &quot;סוףשורה לוותר&quot; לאותת הרובוט לסיים את מהדורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשר את התכנית אל הרובוט על ידי בחירת פקודות מעקב משורת התפריטים העליונה: &quot;Robot&gt; שלח נתוני C &amp; T&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום בטווח תחריט / הדפסה, על ידי שינוי הרובוט למצב &quot;הפעל&quot;. עושה זאת על ידי הבחירה &quot;רובוט&gt; שינוי מצב&gt; Switch הפעלת מצב&quot; משורת התפריטים העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הליך ההדפסה על ידי לחיצה על ירוק &quot;כפתור התחל&quot; על הקונסולה מנפק רובוט. </li></ol></li></ol> 3. הכנה והדפסה של תא המכיל ג&#39;לטין Bioink <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים ג&#39;לטין 2% מינימום בינוני Essential אלפא בינוני (αMEM) (בתוספת 10% FBS ו 2% אנטיביוטי / antimycotic) ב 60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי להכין את פתרונות bioink. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום תרבות חלבון פלואורסצנטי אדום לבטא בתאי גזע mesenchymal (RFP-MSCs) כדי מפגש 70% במנות בתרבית רקמה 10 ס&quot;מ באמצעות αMEM / 10% FBS. שחרר את התאים המצורפים לתוך השעיה על ידי הסרה הבינונית וציפוי עם פתרון טריפסין-EDTA 1x במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. Resuspend התא גלולה ב 0.5 מ&quot;ל של 1x PBS ולספור את צפיפות התאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המאפשר bioink כדי להתקרר לטמפרטורת החדר, מערבבים בעדינות נפח מספיק כדי השעיית RFP-MSCs ב bioink כדי להשיג ריכוז סופי של 5 x 10 מ&quot;ל 6 תאים -1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק את תא הנושאת bioink לתוך מזרק הדפסה עם הזרבובית האטומה. צ&#39;יל המזרק הטעון עד 4 ° C כדי להשיג צמיגות להדפסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להכניס את המזרק הטעון על אוטומטיותמערכת מחלק רובוטית ולצרף קווים בלחץ האוויר. הסר את חותם מזרק Luer ולצרף נחיר ההדפסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Extrude את bioinks cellularized לתוך קווים דקים באמצעות לחץ 0.05 מגפ&quot;ס בחזרה, ב 5 מ&quot;מ / מהירות כתיבת שניות מתוך מזרק 10 מיליליטר דרך נחיר 27 G מחט / (קונים מומלצים יותר גלילי) על גבי משטח סרט קלקר, בעקבות בתצהיר המתוכנת מראש הדפוס שתואר בשלב 2.1 למקם את bioink cellularized על גבי המסילות מראש חרוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1 דגירת שעה בטמפרטורת חדר, להוסיף 10 מיליליטר צמיחת תקשורת (בתוספת 10% FBS ואנטיביוטיקה) ו דגירת התאים למשך 24 שעות (כדי לאפשר לתאים לחוש ולהגיב לתכונות החרוטות) לפני הצפייה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה 10X. </li></ol>

<ol>
	<li>Ma, Z., Ringeisen , R. B., Spargo, J. B., Wu, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell and Organ Printing. , 137-159 (2010).</li><li>Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+systems+for+the+generation+of+patterned+co-cultures+for+controlling+cell-cell+interactions.">Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions.</a> Biochim Biophys Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).</li><li>Goubko, C. A., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+multiple+cell+types+in+co-cultures:+A+review.">Patterning multiple cell types in co-cultures: A review.</a> Materials Science and Engineering: C. 29 (6), 1855-1868 (2009).</li><li>Pati, F., Jang, J., Lee, J. W., Cho, D. W., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 123-152 (2015).</li><li>Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+and+prototyping+of+tissues+and+scaffolds.">Printing and prototyping of tissues and scaffolds.</a> Science. 338 (6109), 921-926 (2012).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=25th+anniversary+article:+Engineering+hydrogels+for+biofabrication.">25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication.</a> Adv Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).</li><li>Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+trends+and+limitations+in+hydrogel-rapid+prototyping+for+tissue+engineering.">A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering.</a> Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).</li><li>Skardal, A., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 1-17 (2015).</li><li>Irvine, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+cell-laden+gelatin+constructs+by+free-form+fabrication+and+enzymatic+protein+crosslinking.">Printing cell-laden gelatin constructs by free-form fabrication and enzymatic protein crosslinking.</a> Biomed Microdevices. 17 (1), 16 (2015).</li><li>Bhuthalingam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+printing+method+for+cell+alignment+and+differentiation.">A novel 3D printing method for cell alignment and differentiation.</a> International Journal of Bioprinting. 1, 57-65 (2015).</li><li>Curtis, A., Wilkinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+control+of+cells.">Topographical control of cells.</a> Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).</li><li>Tay, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+matrix+directs+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+towards+myocardial+lineage.">Micropatterned matrix directs differentiation of human mesenchymal stem cells towards myocardial lineage.</a> Exp Cell Res. 316 (7), 1159-1168 (2010).</li><li>Tay, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-inspired+micropatterned+platform+to+steer+stem+cell+differentiation.">Bio-inspired micropatterned platform to steer stem cell differentiation.</a> Small. 7 (10), 1416-1421 (2011).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+laser+machining-induced+topographic+pattern+promotes+up-regulation+of+myogenic+markers+in+human+mesenchymal+stem+cells.">Direct laser machining-induced topographic pattern promotes up-regulation of myogenic markers in human mesenchymal stem cells.</a> Acta Biomater. 8 (2), 531-539 (2012).</li><li>Kolind, K., Leong, K. W., Besenbacher, F., Foss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+stem+cell+fate+on+2D+patterned+surfaces.">Guidance of stem cell fate on 2D patterned surfaces.</a> Biomaterials. 33 (28), 6626-6633 (2012).</li><li>Agrawal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+Muscle+Cell+Alignment+and+Phenotype+Control+by+Melt+Spun+Polycaprolactone+Fibers+for+Seeding+of+Tissue+Engineered+Blood+Vessels.">Smooth Muscle Cell Alignment and Phenotype Control by Melt Spun Polycaprolactone Fibers for Seeding of Tissue Engineered Blood Vessels.</a> International Journal of Biomaterials. 2015, (2015).</li><li>Chang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+modulation+of+primary+vascular+smooth+muscle+cells+by+short-term+culture+on+micropatterned+substrate.">Phenotypic modulation of primary vascular smooth muscle cells by short-term culture on micropatterned substrate.</a> PLoS One. 9 (2), e88089 (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cell+alignment+in+vitro.">Engineering cell alignment in vitro.</a> Biotechnol Adv. 32 (2), 347-365 (2014).</li><li>Blaeser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+Shear+Stress+in+3D+Bioprinting+is+a+Key+Factor+to+Balance+Printing+Resolution+and+Stem+Cell+Integrity.">Controlling Shear Stress in 3D Bioprinting is a Key Factor to Balance Printing Resolution and Stem Cell Integrity.</a> Adv Healthc Mater. 5 (3), 326-333 (2016).</li><li>Nery, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells:+From+immunophenotyping+by+flow+cytometry+to+clinical+applications.">Human mesenchymal stem cells: From immunophenotyping by flow cytometry to clinical applications.</a> Cytometry Part A. 83A (1), 48-61 (2013).</li><li>Guvendiren, M., Lu, H. D., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-thinning+hydrogels+for+biomedical+applications.">Shear-thinning hydrogels for biomedical applications.</a> Soft Matter. 8 (2), 260-272 (2012).</li><li>Markstedt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Bioprinting+Human+Chondrocytes+with+Nanocellulose-Alginate+Bioink+for+Cartilage+Tissue+Engineering+Applications.">3D Bioprinting Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage Tissue Engineering Applications.</a> Biomacromolecules. 16 (5), 1489-1496 (2015).</li><li>Kolesky, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+vascularized,+heterogeneous+cell-laden+tissue+constructs.">3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs.</a> Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).</li><li>Merceron, T. K., Murphy, S. V., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 249-270 (2015).</li><li>Carrow, J. K., Kerativitayanan, P., Jaiswal, M. K., Lokhande, G., Gaharwar, A. K., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 229-248 (2015).</li><li>Lee, K. V., Turksen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioprinting in Regenerative Medicine. , 33-66 (2015).</li><li>Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+and+future+perspectives+in+extrusion-based+bioprinting.">Current advances and future perspectives in extrusion-based bioprinting.</a> Biomaterials. 76, 321-343 (2016).</li><li>Li, M., Tian, X., Schreyer, D. J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+needle+geometry+on+flow+rate+and+cell+damage+in+the+dispensing-based+biofabrication+process.">Effect of needle geometry on flow rate and cell damage in the dispensing-based biofabrication process.</a> Biotechnol Prog. 27 (6), 1777-1784 (2011).</li><li>Nikkhah, M., Edalat, F., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+microscale+topographies+to+control+the+cell-substrate+interface.">Engineering microscale topographies to control the cell-substrate interface.</a> Biomaterials. 33 (21), 5230-5246 (2012).</li><li>Khademhosseini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+patterning+for+fabrication+of+contractile+cardiac+organoids.">Microfluidic patterning for fabrication of contractile cardiac organoids.</a> Biomed Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).</li><li>Chelli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+cell+alignment+by+patterning+gradients+of+the+extracellular+matrix+protein+laminin.">Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin.</a> Interface Focus. 4 (1), 20130041 (2014).</li><li>Aubin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+3D+cell+alignment+and+elongation+in+microengineered+hydrogels.">Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels.</a> Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).</li><li>B&#233;duer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+adult+human+neural+stem+cells+differentiation+through+surface+micropatterning.">Engineering of adult human neural stem cells differentiation through surface micropatterning.</a> Biomaterials. 33 (2), 504-514 (2012).</li><li>Bian, W., Jackman, C. P., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+structural+and+functional+anisotropy+of+engineered+cardiac+tissues.">Controlling the structural and functional anisotropy of engineered cardiac tissues.</a> Biofabrication. 6 (2), 024109 (2014).</li><li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+large+perfusable+macroporous+cell-laden+hydrogel+scaffolds+using+microbial+transglutaminase.">Fabrication of large perfusable macroporous cell-laden hydrogel scaffolds using microbial transglutaminase.</a> Acta Biomater. 10 (2), 912-920 (2014).</li><li>Bertassoni, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct-write+bioprinting+of+cell-laden+methacrylated+gelatin+hydrogels.">Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels.</a> Biofabrication. 6 (2), 024105 (2014).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+patterned+substrates+for+bioartificial+blood+vessels+-+The+effect+of+hydrogels+on+aligned+cells+on+a+biomaterial+surface.">3D patterned substrates for bioartificial blood vessels - The effect of hydrogels on aligned cells on a biomaterial surface.</a> Acta Biomater. 26, 159-168 (2015).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interest.

השלב הקריטי של הליך זה הוא משלוח bioprinting בפועל של תאי הגזע כתהליך חייב לאפשר שקיעת תא לתכונות, להדפיס ללא bioink מתפשטת / דימום, לספק תאים בלי מוות של תאי מאמץ גזירה ולא לעורר בידול כלפי שושלת רצויה. אם יישור התא הצפוי נכשל אמורה להתרחש, צמיגות bioink יש לבחון עבור התאמתה להדפסה. חשוב כי bioink מאפשר לתאים משקעים על פני שטח פולימר בדוגמת. ריכוז פולימר bioink ניתן להקטין או הטמפרטורה שלו גדלה (עד למקסימום של 37 מעלות צלזיוס), כדי להפחית את הצמיגות ולקדם שקיעת תא. עם זאת, הפחתות אלה עלולות לגרום bioink להפיץ / לדמם ופוסט הדפסה. כאן אנו ממליצים להשתמש 2% ג&#39;לטין (w / v) מומס 1x PBS. אם את ריכוז תאי הדפסת הפוסט מופיעה מופחתת, אז מאמץ הגזירה מושרה על ידי הדפסה ייתכן שהזיקכדאיות של התאים המודפסים 7. בדקו את תאי bioink לפני ואחרי ההדפסה באמצעות assay כדאית כגון הפעלת resazurin fluoresence 7. בנוסף, אם תאי גזע bioprinted קשר פני השטח, אך לא ליישר, אז זה אפשרי מאמץ הגזירה במהלך הדפסת ירד multipotency שלהם באמצעות הסתת מסלול בידול רצוי. Stemness ופוסט הדפסה ניתן להעריך על ידי מיון תא מופעל קרינה (FACS) ניתוח באמצעות סמני תא גזע כגון CD 29 10,19,20. אם יתברר כי מאמץ הגזירה הוא שיש השפעות מזיקות על התאים, אז צמיגות הדפסת bioink יכולה להיות מופחתת על ידי הוספה או ההחלפה של פולימר bioink עם גזירה הדלילה אחד, כגון אלגינט, Pluronic F127, חומצה היאלורונית, מסטיק gellan, methacrylate או פוליאתילן ג&#39;לטין תחמוצת 19, 21-25. לבסוף, היבטים אחרים שיכולים להיות מותאם כוללים את backpressure הדפסה, צפיפות התאים bioink,בקוטר זרבובית. Backpressure דורש אופטימיזציה על הצמיגות של bioink וניתן לשנות כדי להשיג שמץ רצוף בדיד. ריכוז תא גבוה עלול להגדיל את צמיגות bioink ולסתום את ראש ההדפסה. עם זאת, תהליך שחול זה לאפשר הדפסה של צפיפות תא גבוהה יחסית שיטות bioprinting אחרות 26,27. הבחירה של מד זרבובית ההדפסה צריכה להיחשב מאז חרירים בקוטר קטנים יכולים לייצר עקבות עדינות אבל יהיה נוטה וסותם. חרירי קונים נמצאו לתפקד טוב יותר מאז אותו קצב הזרימה יכול להיות מושג כמו זרבובית גלילית אבל בכל מאמץ גזירה נמוך ומכאן כדאיויות תא השתפר 28. השיטה בתצהיר סייע backpressure, המכונה גם שחול bioprinting, יש פחות מאשר החלטת גישות הדפסת תאים אחרות כגון הזרקת דיו ומתודולוגיה בסיוע הליזר בשל אורך צעד לתכנות מינימום ההתפשטות של emerging bioink. עם זאת, ציוד שחול backpressure הוא שונה ביותר בקלות עבור הכללת חרט תחריט. שיטות אחרות של חריצי ייצור כגון דפוסי מייקרו באמצעות photolithography ואחריו דפוס PDMS יש משמעותי יותר צעדים מאשר תחריט רובוטיות השיטה היא פחות צדדית ב שינוי דפוסים קיימים או ייצור חדש 12,15,29-31. שיטה זו מציעה כלי מחקר במבחנה של אינטראקציות התא שבו המיקום, האורינטציה, והסידור של סוגי תאים אחד או יותר חשובים. סוגי תאים מספר כולל בתאי גזע mesenchymal, פיברובלסטים, ותאי שריר חלק ידועים ליישר על חריצים משטח 1,10,14,18. דפוסי החרוט, המוצגים כאן, יכולים להיות משונים נדפסו מהר מאוד בקלות. זהו עניין כמו דפוסי משטח עם חריצים כבר השתמשו במחקר של הידבקות תא, מורפולוגיה, הגירת גזע התמיינות תאים. יתר על כן, אניt גם יושם עצביים והנדסת רקמות שרירים ושלד 18, 32,33. מאז החריצים לעשות לשחק תפקיד התמיינות תאים או תקנה פנוטיפ עבור מספר סוגים של תאי, שיטה זו יכולה לשמש כדי ליצור חריצים, כדי לסייע בידול להפקיד תאים בשורות בדידות כך מסך יכול להתבצע. נכון לעכשיו, אנו בוחנים בשיטה זו כדי לקדם הסדר תא איזוטרופי של תאים לייצור יריעות תא cardiomyocyte, כמו הנטייה הסלולר היא חשובה לתפקוד של רקמת לב 12-14,34. הגישה הפגינה כאן מעסיקה bioink מסיס כי בסופו של דבר יתפוגג. עם זאת, אם כיסוי הידרוג&#39;ל קבוע יותר נדרש, אז הכללת transglutaminase חיידקים יכולים קשר צולב ולייצב הידרוג חלבון כגון אלו המבוססים ג&#39;לטין ללא השפעות שליליות על תאים 9, 35. Bioinks יכול גם לנצל פולימרים methacrylated עבור UV יזם crosslinkinגרם של הידרוג נושאות התא באופן cytocompatible 36. עם זאת, הניסיון שלנו, נמצא כי crosslinking transglutaminase הנתונות עבור אינטראקציה משופרת בין הידרוג&#39;ל משטח פולימר (פחות בקלות delaminated), וסביבת cytocompatible יותר בהשוואה פולי (אתילן גליקול) diacrylate (PEGDA) הידרוג&#39;ל 37.

הדפוסים המכוונים של מיקום תא מאפשרים ההיווצרות של תרבויות המחקים בארגון הסלולר vivo 1. ואכן, מחקר לתוך האינטראקציה בין סוגי תאים מרובים יכול להסתייע בארגון 2,3 המיקום המרחבי שלהם. רוב מערכות הדפוסים להסתמך על נהלי שינוי פני שטח לקידום או במניעת הידבקות תא עם בתצהיר תא פסיבי שלאחר מכן. Bioprinting מציע שליטה במרחב ובזמן על הפצות תא 1. בנוסף לפונקציות אלה, bioprinting תואר להיות שיטה פשוטה, מהירה טכנית וחסכונית להפקה 4 פיגומים גיאומטריים מורכבים. הוא מנצל תוכנות עיצוב במחשב ומאפשר כניסתה של תאים לתוך תהליך הייצור 4. מערכות Bioprinting סווגו מבוססות על עקרונות העבודה שלהם כמו ליזר המבוסס, דיו מבוסס או שחול מבוסס 4. Bioprinting שחול תוארה המבטיח ביותר שכן היא מאפשרת הייצור של בונה מאורגנת בגדלים רלוונטיים קליני בתוך מסגרת זמן מציאותית 4-6. הדבר מתבצע באמצעות שחול סייע לחץ מכאני או אחורי של bioink הידרוג&#39;ל תא נושא. בשיטה המוצגת כאן, חזרה לחץ הועסק. כאמור, התאים מועברים בתוך bioink cytocompatible. כזה bioink צריך לתמוך המשלוח של תאים מבלי לייצר מאמץ גזירה מזיק, ולהיות של צמיגות מספיק כדי לשמור על השלמות של הקורט המודפס, בלי להתמוטט או להפיץ (המכונה &quot;לדמם דיו&quot;) 7-10. האינטראקציה של תאים עם המשטח החסיד שלהם ידועה להשפיע על התנהגות הסלולר. טופוגרפית המשטח יכולה לשלוט על צורת התא, נטיית 11, ואפילו את הפנוטיפ. בפרט, הייצור של חריצים וערוצים הוכח לגרוםמורפולוגיה נמתחה, מוארכת על סוגי תאים מרובים. אימוץ מורפולוגיה זה כבר נמצא להשפיע על הפנוטיפ של תאי מולטיפוטנטיים ו פלוריפוטנטיים. לדוגמא, כאשר מיושרים על חריצים, בתאי גזע mesenchymal (MSC) מעיד בידול כלפי cardiomyocytes 12,13 ותאי שריר חלק בכלי דם לאמץ את הפנוטיפ ההתכווצות מעל הסינתטי 10,14-17. התא יישור ערוצים או חריצים יכול להיווצר על משטח פולימרי באמצעות מספר שיטות, למשל, תחריט יון תגובתי עמוק, ליתוגרפיה אלומת אלקטרונים, הדפסת לייזר ישירה, לייזר femtosecond, photolithography ופלזמה יבש תחריט 18. גישות אלה הן בדרך כלל זמן רב, דורשות מנגנון מורכב ויכולות להיות הגבלה בצורת התבנית שנוצרה. בנוסף, הם לא לסנכרן דפוסים עם bioprinting ואינם מאפשרים עבור cellularization מיידית. התנועה נשלט בצורה מתואמת של אוטומטיותמערכת מחלק לעקוב אחרי תבניות מורכבות להפקדה של פתרונות. כאן אנו מדגימים כיצד תנועת microscale שבשליטת ניתן לנצל כדי ליצור ערוצים להתמצאות תא. עט או אזמל חדד מצורף ראש ההדפסה במקום של מזרק שהחול והציוד אז יכול לחרוט את פני שטח הפולימר תחת הדרכתו של התוכנה והתוויית. השיטה מציעה צדדית דפוס עיצוב שלכם והיא חלה על חומרים פולימריים נפוצים Bioengineering כגון פוליסטירן, PTFE, ו polycaprolactone. כצעד לאחר התחריט, תאים ניתן bioprinted ישירות החריצים השרוטים. Bioink ג&#39;לטין מנוצל כאן הצליח הוא לשמור על השמץ ולאפשר לתאים שהופקדו לחוש את התכונות החרוטות. תאי גזע mesenchymal bioprinted לחריצי חרוט הודגמו להאריך לאורך אותם קווים ברורים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="448">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Equipment</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:151px;">Robotic Dispensing System</td>
			<td style="width:131px;">Janome</td>
			<td style="width:104px;">2300N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Plasma Machine</td>
			<td style="width:131px;">Femto Science</td>
			<td style="width:104px;">Covance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">USB Microscope</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Optical Microscope</td>
			<td style="width:131px;">Olympus</td>
			<td style="width:104px;">IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Software</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Spreadsheet</td>
			<td style="width:131px;">Excel</td>
			<td style="width:104px;">Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:151px;">Printing Co-ordinate Software</td>
			<td style="width:131px;">Janome</td>
			<td style="width:104px;">JR C-Points</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:151px;">Imaging Software</td>
			<td style="width:131px;">National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td style="width:104px;">ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Equipment</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Stylus (Blade)</td>
			<td style="width:131px;">OLFA</td>
			<td style="width:104px;">AK-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">5ml printing syringe</td>
			<td style="width:131px;">San-ei Tech</td>
			<td style="width:104px;">SH10LL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">30G printing needle</td>
			<td style="width:131px;">San-ei Tech</td>
			<td style="width:104px;">SH30-0.25-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:151px;">1mm polystyrene sheets</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:104px;">Purchased locally</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:104px;">10270-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:151px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:151px;">Gelatin from porcine skin, Gel strength 300, Type A</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">&#945;MEM</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">41061-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:151px;">Antibiotc antimycotic</td>
			<td style="width:131px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:151px;">Red Fluorescent Protein Mesenchymal Stem Cells (RFP-MSCs)</td>
			<td style="width:131px;">Cyagen Biosciences Incorporation</td>
			<td style="width:104px;">RASMX-01201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated robotic dispensing technique for surface guidance and bioprinting of cells

כתב יד זה מתאר את המבוא של תכונות הדרכת תא ואחריו המסירה הישירה של תאים לתכונות הללו bioink הידרוג&#39;ל באמצעות מערכת מחלק רובוטיות אוטומטית. Bioink בפרט נבחר כפי שהוא מאפשר לתאים משקעים כלפי ולחוש את התכונות. המערכת מהחלק bioprints תאי קיימא bioinks הידרוג&#39;ל באמצעות ראש ההדפסה סייע backpressure. עם זאת, על ידי החלפת ראש ההדפסה עם עט או אזמל חדד, המערכת מהחלק יכולה גם להיות מועסקת על מנת ליצור רמזים טופוגרפיים דרך תחריט שטח. תנועת החרט ניתן לתכנת בצעדים של 10 מיקרומטר בכיווני X, Y ו- Z. החריצים בדוגמת הצליחו להתמצא בתאי גזע mesenchymal, תשפיע עליהם לאמץ מורפולוגיה מוארכת ובהלימה &#39;כיוון החריצים. הדפוסים יכולים להיות מתוכננים באמצעות תוכנת זומם בקווים ישרים, מעגלים קונצנטריים, וגלים סינוסי. בעוד הליך נוסף, פיברותקיעות ותאי גזע mesenchymal הושעו בתוך bioink ג&#39;לטין 2%, עבור bioprinting ב ראש הדפסה שחול מונע backpressure. מסב תא bioink שהודפס מכן באמצעות אותן נקודות ציון מתוכנת המשמשות התחריט. תאי bioprinted הצליחו לחוש ולהגיב לתכונות החרוטות כפי שהוכח על ידי האורינטציה המוארכת שלהם יחד לכיוון החריצים החרוטים.

תוצאות הנציג להוכיח כי המערכת מהחלק רובוטית סייע backpressure יכולה לשמש bioprinter שחול מבוסס לביצוע הוא תחריט שטח והדפסת bioink (איור 1 א). ניתן להשתמש בו עבור הדור של חריצים חרוטים לתוך משטחים פולימריים, ולאחר מכן להדפיס bioink תא נושא ישירות לתכונות (B איור 1 ו- C). הן התחריט וההדפסה נקבעים על ידי הקואורדינטות המתוכנות (איור 2) קלט לתוך תוכנת ההדפסה / מחלק המאפשרת הדפסה של ליניארי, מעוקל ודפוסים רדיאלי כנדרש עבור היישום (איור 3 AC). הגדרות ציר Z לאפשר בקרה של עומק החריץ החרוט (איור 4 ולוח 1). לאחר ההחלפההעט עם ראש הדפסה הידרוג&#39;ל, תכנות כי תאם את התחריט, אפשר לחזור כדי לאפשר למערכת מחלק הרובוטית כדי לספק את bioink תא נושא ישירות החריצים החרוטים בעקבות אותו העיצוב (D איור 3 ו- E). כפי שנראה באיור 5 A ו- B, תאי הגזע שנזרעו על ידי bioprinting בתוך bioink בסופו של דבר משקע על פני השטח, ואת לחוש להאריך לאורך הכיוון של התחריט בתוך קווי נבדל. התאים זורעים במדיום תרבות ללא bioprinting מיושר לכיוון של תכונות, לעומת זאת, הם כיסו את כל פני השטח (איור 5 ג), המוכיח כי bioink מגביל את התאים עד הקו מודפס. ללא תכונות חרוטות, תאים שנזרעו בתקשורת התרבות מראים נטייה או יישור (איור 5 ד &#39;). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54604/54604fig1.jpg" /> figuבתשובה לשאלה 1:. המערכת מהחלק רובוטיות האוטומטית (א) את המכשור אישית עם הצטרפותם של חרט חדד (מאובטח מזרק) מרכזי ראש ההדפסה משרטט טבעות קונצנטריות לשקופית פוליסטירן (B). ראש ההדפסה ניתן יהיה להמיר extrude bioink ג&#39;לטין תא נושא, עם לחץ בחזרה סייע שחול, ופיקדונות על הדפוס החקוק בעבר (C). נתון זה יש הבדל בין ואח Bhuthalingam. 2015 10. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54604/54604fig2.jpg" /> איור 2: שרטוט קואורדינטות XY בתוך תוכנת הגיליון האלקטרוני תפוס המסך המוצג כאן מוכיח כי xy לחשב את נקודות הציון יצר תבנית גל סינוסי כפי שמוצג על ידי העלילה הגרף.. נקודות ציון אלה היו קלט לתוך התוכנה זומם באמצעות העתק / הדבקפוּנקצִיָה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54604/54604fig3.jpg" /> איור 3:. חרוט דפוס צדדי הקואורדינטות שתוכנת התוכנה והתוויית הצליחו לחרוט ליניארי (א), סינוסי (ב &#39;) מעגלי קונצנטריים (C). החריצים הצרובים פוליסטירן יכולים להיות מודפסים ישירות על גבי עם bioink הידרוג&#39;ל במהלך השלב הבא (ד) ו- (ה). נתון זה יש הבדל בין Bhuthalingam et al. 2015 10. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54604/54604fig4.jpg" /> איור 4:. עומק חריץ חרוט עומק החריץ החרוט ניתן לווסת באמצעות שלט Z- ציר של המערכת מהחלק. תמונות (א) עד (ג) להציג את התצוגה התקורה(ד) עד (ה) להראות את החתך. הרובוט היה מתוכנת כדי לחרוט את השטח עד לעומק של 40 ((א) ו- (ד)), 90 ((ב) ו- (ה)) ו -180 מיקרומטר ((ג) ו- (ו)). הקרבה של עומק מתוכנת ועומק חרוט בפועל מוצגת בטבלה 1. נתון זה יש הבדל בין Bhuthalingam et al. 2015 10. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54604/54604fig5.jpg" /> איור 5: Bioink נמסר בתאי גזע mesenchymal המכרז-MSCs מודפס bioink על דפוסי חרוט יכול לחוש את התכונות כפי שהוכח על ידי המורפולוגיה ויישור מוארך שלהם עם חריצים (א) ו- (ב) לעומת תאים שנזרעו על. תכונות מבלי bioink (כלומר, במדיום תרבות) (C &lt;/ strong&gt;) ועל משטח שאינו בדוגמת (ד &#39;). נתון זה יש הבדל בין Bhuthalingam et al. 2015 10. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> עומק מתוכן (מיקרומטר) </td><td> עומק חריץ חרוט (מיקרומטר) </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 35 ± 7 </td></tr><tr><td> 90 </td><td> 81 ± 6 </td></tr><tr><td> 180 </td><td> 175 ± 3 </td></tr></tbody></table> טבלה 1:. השוואת מתוכנת לעומת עומק תחריט בפועל על קלקר נתון זה יש הבדל בין Bhuthalingam ואח 2015 10..

Watch this Scientific Journal Video about Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells at JoVE.com

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

טכניקת Dispensing רובוטיות אוטומטית להכוון משטחים Bioprinting של תאים

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

automated-robotic-dispensing-technique-for-surface-guidance

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.3K Views.  Nanyang Technological University. This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Video: Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting Cellularized בונה בעזרת רקמות ספציפיות הידרוג&#39;ל Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is conducted by eliciting an illusion through use of a mirror as if the hemiplegic arm is moving in real-time while moving the healthy arm. It can facilitate brain neuroplasticity through activation of the sensorimotor cortex. However, conventional mirror therapy has a critical limitation in that the hemiplegic arm is not actually moving. Thus, we developed a real-time 2-axis mirror robot system as a simple add-on module for conventional mirror therapy using a closed feedback mechanism, which enables real-time movement of the hemiplegic arm. We used 3 Attitude and Heading Reference System sensors, 2 brushless DC motors for elbow and wrist joints, and exoskeletal frames. In a feasibility study on 6 healthy subjects, robotic mirror therapy was safe and feasible. We further selected tasks useful for activities of daily living training through feedback from rehabilitation doctors. A chronic stroke patient showed improvement in the Fugl-Meyer assessment scale and elbow flexor spasticity after a 2-week application of the mirror robot system. Robotic mirror therapy may enhance proprioceptive input to the sensory cortex, which is considered to be important in neuroplasticity and functional recovery of hemiplegic arms. The mirror robot system presented herein can be easily developed and utilized effectively to advance occupational therapy.

We developed a real-time mirror robot system for functional recovery of hemiplegic arms using automatic control technology, conducted a clinical study on healthy subjects, and determined tasks through feedback from rehabilitation doctors. This simple mirror robot can be applied effectively to occupational therapy in stroke patients with a hemiplegic arm.

תרפיה מערכת Mirror רובוטית עבור התאוששות תפקודית של Arms ומחוסר

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting של הסחוס, תחליפי רקמת העור ניצול פסיבים הרומן ערבוב טכניקה יחידה עבור Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

השימוש תפוקה גבוהה אוטומטית Microbioreactor מערכת לייצור של מודל IgG1 בתאים צ'ו

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

מניפולציה של תאי גזע עצביים יחיד ונוירונים בפרוסות מוח באמצעות Microinjection רובוטי

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also respond to neural injuries and act to protect the tissue from degenerative events. In vitro studies of astrocytes&#39; functionality are important to elucidate the mechanisms involved in such events and contribute to developing therapies to treat neurological disorders. This protocol describes a method to biofabricate a neural-like tissue structure rich in astrocytes by 3D bioprinting astrocytes-laden bioink. An extrusion-based 3D bioprinter was used in this work, and astrocytes were extracted from C57Bl/6 mice pups&#39; brain cortices. The bioink was prepared by mixing cortical astrocytes from up to passage 3 to a biomaterial solution composed of gelatin, gelatin-methacryloyl (GelMA), and fibrinogen, supplemented with laminin, which presented optimal bioprinting conditions. The 3D bioprinting conditions minimized cell stress, contributing to the high viability of the astrocytes during the process, in which 74.08% &#177; 1.33% of cells were viable right after bioprinting. After 1 week of incubation, the viability of astrocytes significantly increased to 83.54% &#177; 3.00%, indicating that the 3D construct represents a suitable microenvironment for cell growth. The biomaterial composition allowed cell attachment and stimulated astrocytic behavior, with cells expressing the specific astrocytes marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and possessing typical astrocytic morphology. This&#160;reproducible protocol provides a valuable method to biofabricate 3D neural-like tissue rich in astrocytes that resembles cells&#39; native microenvironment, useful to researchers that aim to understand astrocytes&#39; functionality and their relation to the mechanisms involved in neurological diseases.

Here we report a method of 3D bioprinting murine cortical astrocytes for biofabricating neural-like tissues to study the functionality of astrocytes in the central nervous system and the mechanisms involving glial cells in neurological diseases and treatments.

הדפסה ביולוגית תלת-ממדית של אסטרוציטים קליפת המוח מורין לרקמה דמוית עצב הנדסית

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.