עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט המוח קוריאה 21 פלוס למדעי הרפואה, אוניברסיטת Yonsei. בנוסף, עבודה זו נתמכה על ידי מענק נבחרת מחקר קרן של קוריאה (ה-NRF-2017R1D1A1B03030315).

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה מחקר מתאים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת Yonsei. כל החיות ניסיוני מוקרבים בהתאם לקווים המנחים של הוועדה טיפול בבעלי חיים מעבדה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת Yonsei.
1. הכנת נוגדנים
התראה: Paraformaldehyde (PFA), אקרילאמיד ו נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות) הם רעילים המגרים, וכך צריך להיות מטופל בשכונה fume עם ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי; חלוק, כפפות, מגן eyewear).
<ol><li>4% אקרילאמיד (א. א) פתרון (A4P0): להוסיף 20 מ של 40% אקרילאמיד פתרון עד 180 מ"ל תמיסת 0.1 M באגירה פוספט (PBS).</li>
	<li>0.25% VA-044 פתרון: להוסיף 0.5 גר' 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] אבקת dihydrochloride (VA-044) עד 200 מ"ל תמיסת 0.1 M באגירה פוספט (PBS). אמנם ניתן לאחסן את האבקה VA-044 בטמפרטורת החדר, זה להיות מאוחסן ב 4 ° C על solubilization ב- PBS. לקבלת תוצאות מיטביות, להכין רק את כמות פתרון לצורך הניסוי.</li>
	<li>פתרון קוקטייל ברית: להוסיף 10 גרם של אקרילאמיד 225 מ של 4% paraformaldehyde (PFA) פתרון ולכוונן את העוצמה עד 200 מ"ל עם 4% מחברים. לפני השימוש, להוסיף 100 מ ג של אבקת VA-044 40 מ"ל של תערובת צינור חרוטי 50 מ.</li>
	<li>הסכם סליקה מאגר פתרון: להוסיף 40 גר' נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות) 350 מ של 0.1 M PBS ולכוונן את העוצמה עד 500 מ"ל עם PBS 0.1 M. עבור mPACT ניקוי פתרון, להוסיף 0.5% α-thioglycerol ההסכם ניקוי מאגר פתרון.</li>
	<li>העכברים השתמשו במחקר זה היו עכברים זכרים BALB בת שבוע-2; החולדות השתמשו במחקר זה היו עכברי-SD זכר 2 בן שבועיים.</li>
</ol>2. הרדמה וניתוח זלוף
התראה: PFA אקרילאמיד הם רעילים המגרים, וכך צריך להיות מטופל בשכונה fume עם עיקרון השוויון הפוליטי המתאים.
<ol><li>עזים ומתנגד החיה בחדר נטול הפתוגן עם 30 מ"ג/ק"ג של zoletil באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 26-מד. לפקח על החיה עבור 5-10 דקות.</li>
	<li>ברגע החיה הגיעה מטוס כירורגי של הרדמה, השתמש בשיטה הבוהן-קמצוץ תגובה כדי לקבוע את העומק של הרדמה. לאשר בעיית חוסר. הערה: השלבים הבאים לערב עכבר ועכברוש, ניתוח בצע דומה פרוטוקול המשמש במחקר הקודם11.</li>
	<li>עושים חתך 5-6 ס מ מתחת לצלעות, דרך דופן הבטן בעור.</li>
	<li>להשתמש במספריים מעוגלים, בוטה לבצע חתך הסרעפת, palpating את אזור בית החזה כדי לאתר את האתר של החתך מראש.</li>
	<li>להרחיב את החתך מעבר לכל אורכה של קשת הצלעות לחשוף את חלל הצדר.</li>
	<li>תחסיר בקפידה את הריאות. לעשות חתך דרך. קשת הצלעות עד לעצם הבריח. באמצעות מספריים איריס, לבצע חתך קטן בקצה האחורי של החדר השמאלי. הכנס של המחט אל תדאגי בלאנט או זית-שקצהו זלוף אבי העורקים, עובר דרך החדר חתוכה.</li>
	<li>לאבטח את המחט ולמנוע זליגת מאת מחבר חובק למעקה הלב עם עוצר דימום. לחלופין, השתמש עוצר דימום ששונה כדי לצבוט העורקים סביב קצה המחט.</li>
	<li>עושים חתך גדול באטריום ימין, מטפל על מנת להבטיח מינימום נזק העורקים. העכברוש מוכן כעת זלוף.</li>
</ol>3. כל זלוף, דיסקציה של עכברוש
התראה: PFA אקרילאמיד הם רעילים המגרים, וכך צריך להיות מטופל בשכונה fume עם עיקרון השוויון הפוליטי המתאים.
הערה: השלבים הבאים זלוף כל דומים פרוטוקול המשמש במחקר הקודם מאת Woo ואח. (2016) 10 , 11.
<ol><li>לצרף את העלייה הימנית של הלב מחט בקוטר 18, מקפיד לא להציג את כל בועות האוויר.</li>
	<li>באמצעות מזרק 50 מ ל, במהירות ובצורה שווה לשאוב 50 מ של קר 0.1 M PBS לאודנום הפארין (היחידות 10/mL).</li>
	<li>לחבר את המחט אל תדאגי הצינור של המשאבה ממברנות.</li>
	<li>לשטוף עם 200 מ של 0.1 M קר PBS פתרון המכיל הפארין (היחידות 10/mL) במהירות זרימת הדם של 10 מ"ל לדקה.</li>
	<li>לתקן עם 250 מ של 4% קר PFA פתרון במהירות זרימת הדם של 10 מ"ל לדקה. העכברוש צריך להיות נוקשה בשלב זה.</li>
	<li>לאסוף ולאחסן את הפתרון PFA הנותרים עבור סילוק.</li>
	<li>עבור ברית, perfuse רקמות עם פתרון קוקטייל צונן ברית של 4% מחברים, אקרילאמיד 4% ו- 0.25% VA-044 אבקה עם מחט בקוטר 18 ולאחר מכן הסר את הראש ועמוד השדרה. לחשוף את הגולגולת על ידי ביצוע חתך קו האמצע של הצוואר האף. שלב נוסף זלוף זה מיותר עבור השיטות psPACT ו- mPACT; לאחר קיבוע, מיד לבודד את הראש ועמוד השדרה ולחשוף את הגולגולת.</li>
	<li>לחשוף את בסיס הגולגולת על-ידי הסרת כל שריר עמוד השדרה והצוואר שיורית.</li>
	<li>השתמש rongeurs ומספריים כדי לקלף את הגולגולת. הסר את המוח ואת חוט השדרה.</li>
	<li>לאחסן את הרקמה 4% מחברים ב 4 ° C; רקמות ניתן לאחסן עד 1 לשבוע.</li>
</ol>4. הידרוג מונומר אינפוזיה, פלמור של מערכת העצבים עכבר ועכבר
התראה: אקרילאמיד, למען חברה דמוקרטית, α-thioglycerol ו- PFA המגרים, וכך צריך להיות מטופל ברדס fume ועם שתן המתאים.
<ol><li>
ברית (פסיב פינוי טכניקה)
	<ol>
<li>לבודד, תרבות של כל מערכת העצבים המרכזית (המוח ועמוד השדרה) מ קבוע עכברים וחולדות לרכבת התחתית 50 מ ל המכיל פתרון קוקטייל צונן ברית של 4% מחברים, אקרילאמיד 4%, ו- 0.25% VA-044 אבקה, חנות ב 4 ° C עבור ה 24 ודא כי הרקמה הוא שקוע לחלוטין ה-s olution.</li>
		<li>להטביע את הדגימה גז חנקן במשך 10 דקות בעזרת טישו ג'ל מערכת הכלאה מחובר למיכל חנקן: הגדר את המערכת 37 מעלות צלזיוס. להעביר לרקמות שפופרת 50 מ ל המכיל טרי קר (4 ° C) ברית פתרון קוקטייל, להתחבר עם הצינורית, לאחר מכן את הריב.</li>
		<li>כדי פולימריזציה של הידרוג, במקום הצינור המכיל את מדגם חממה חזק (150 סל ד, 37 ° C) במשך 3 שעות, או עד הפילמור הושלם.</li>
		<li>באמצעות נייר סופג (ראה טבלה של חומרים), הסר הידרוג polymerized הנותרים של הרקמות הסובבות.</li>
		<li>להעביר את רקמת צינור 50 מ ל המכיל פתרון סליקה (8% מרחביות ב 0.1 M PBS, pH 8.0).</li>
		<li>מקם את הדגימה חממה חזק מוגדר 37 ° C ו 150 סל ד עד הרקמה נוקתה. בממוצע, זה לוקח בערך 20 ימים עבור העכבר CNS להשגת בהירות מלאה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
psPACT (תהליך נפרד טכניקת ניקוי פסיבי)
	<ol>
<li>לבודד את כל מערכת העצבים המרכזית (המוח ועמוד השדרה) עם עצם קאטר ומספריים של כדורגלן-קבוע עכברים וחולדות על ספסל נקי.</li>
		<li>העברת רקמות לרכבת התחתית 50 מ ל המכיל 4% מחברים, וחנות ב 4 ° C עבור 24h. להבטיח כי הרקמה הוא שקוע לחלוטין מקבע.</li>
		<li>לשטוף את הרקמה קבוע עבור 1 h ב- PBS 0.1 M, ולאחר מכן להעביר A4P0 פתרון (4% אקרילאמיד ב- PBS 0.1 M). חנות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.</li>
		<li>לשטוף את הרקמה במשך 5 דקות ב- PBS 0.1 M.</li>
		<li>לטבול את הרקמה ב- 0.25% VA-044 ב- PBS 0.1 M. לאחסן ב 37 מעלות צלזיוס במשך 6-24 שעות, ולאחר מכן להעביר לפתרון VA-044/PBS טריים של 0.25%.</li>
		<li>להטביע את הדגימה גז חנקן במשך 10 דקות בעזרת טישו ג'ל הכלאה המערכת (ראה טבלה של חומרים) מחובר למיכל חנקן: להעביר לרקמות שפופרת 50 מ ל המכיל טרי קר (4 ° C) פתרון VA-044/PBS 0.25%, ולהתחבר עם הצינורית. הפעל את שואב האבק.</li>
		<li>העבר את הרקמה ניקוי פתרון (8% מרחביות ב 0.1 M PBS, pH 8.0).</li>
		<li>דגירה על מדגם חממה חזק מוגדר 37 ° C ו 150 סל ד עד הרקמה נוקתה. בממוצע, זה לוקח כ- 17 ימים עבור העכבר CNS להשגת בהירות מלאה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
mPACT (ששונה פסיבי פינוי טכניקה)
	<ol>
<li>לבודד את כל מערכת העצבים המרכזית (המוח ועמוד השדרה) עם עצם קאטר ומספריים של כדורגלן-קבוע עכברים וחולדות על ספסל נקי.</li>
		<li>בצע את שלבים 4.2.2 - 4.2.8 של הפרוטוקול psPACT.</li>
		<li>העבר את הרקמה ניקוי פתרון. שים לב כי בניגוד הפרוטוקולים ברית ו- psPACT, mPACT מחייב פתרון סליקה בהיקף של 0.5% α-thioglycerol בנוסף מרחביות 8% ב- 0.1 M PBS, pH 8.0. Α-thioglycerol הוא סוכן האו ם browning המסייעת לנקות רקמות יותר במהירות וביעילות. ודא כי הרקמה הוא שקוע לחלוטין הפתרון.</li>
		<li>מקם את הדגימה חממה חזק מוגדר 37 ° C ו 150 סל ד עד הרקמה נוקתה. בממוצע, זה לוקח כשבועיים עבור העכבר CNS להשגת בהירות מלאה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. מקדם שבירה התאמה ו Immunostaining של CNS שנוקה
הערה: nחישוקים (מבוסס-Nycodenz השבירה התאמת פתרון) מורכב אבקת Nycodenz 0.8 g/mL מומס מאגר הבסיס 30 מ ל (אזיד הנתרן 0.01% ו- Tween-20 ב 0.1 M PBS, pH 8.0). מומלץ כי הפתרון נמצא במחלקה של 37 ° C רועד חממה כדי לאפשר יוצרות נאותה של האבקה.
<ol><li>דגירה רקמות ב- 0.1% טריטון X-100 ב 0.1 M PBS כבר שעתיים, ואז לחסום עם 2% שור אלבומין (BSA) ב- PBS 0.1 M עבור 6-אייץ '.</li>
	<li>לשטוף את סעיפים 3 פעמים ב- PBST (0.1% Tween-20 ב- PBS 0.1 M) עבור ה 2 כתם מקטעים עם נוגדנים הראשי (במקרה זה, נוגדן אנטי-ארנב PECAM-CD31, אשר את כתמי הדם) במשך יומיים.</li>
	<li>כתם מקטעים עם נוגדנים משניים (בבמקרה זה, עז ארנב אנטי Cy3 אג פלורסנט המספר המשלים) ב- 2% BSA במשך יומיים.</li>
	<li>שטיפת בתווית רקמות שלוש פעמים ב- PBST עבור 2 h, חנות 15 מ"ל חישוקים n2-10 ימים.</li>
	<li>לפני הדמיה, להעביר רקמות שכותרתו כמות קטנה של nחישוקים על מנות תרביות רקמה 35 או 60-מ מ. לתקן עם סיליקון סביב הקצה התחתון של המנה.</li>
	<li>להוסיף 1.5-2 מ"ל של המכון טריים n.</li>
</ol>6. עיבוד תמונה
<ol><li>לרכוש תמונות של רקמות שנוקה עם אריח סריקה באמצעות של קונפוקלי סורק לייזר microscopewith 10 x הגדלה (ראה טבלה של חומרים). עבור התווית על-ידי Cy3 רקמות, השתמש אורכי הגל של 550-600 ננומטר.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+brain+imaging:+A+powerful+tool+for+neuroscience.">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions.">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810 (2017).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).</li><li>Jensen, K. H. R., Berg, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+tissue+clearing+using+CLARITY.">Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY.</a> J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY.">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+A+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Choi, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products+in+neurons+and+astrocytes+in+a+triple+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Exp Mol Med. 46, 75 (2014).</li><li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+(ENStem-A)+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats.">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53 (2013).</li><li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe/PS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease.">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li><li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis.">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בעוד בשיטות חילוץ פאסיביים, שאינם electrophoretic המועסקים ברית לשפר באופן משמעותי את עקביות מושגת עם רקמת הקודם ניקוי שיטות כגון בהירות2,3,4,7 , 8, הטכניקה עדיין נושאת מספר חסרונות, הקשה ביותר של אשר הוא משך הזמן הדרוש להשגת בהירות רקמות מקסימלי12. במחקר הנוכחי, אנו מציגים ששונה פרוטוקולים ברית להפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש בשביל לרקמות ניקוי תוך עדיין שמירה על רקמות תקינות ומבנה6,10. יתר על כן, בפעם הראשונה, נדגים את היישום של רקמות ניקוי פרוטוקולים ברקמות CNS שלם, במודל של מיומנויות מכרסמים, עכברים10.
באופן ספציפי, psPACT כרוך בעיבוד מדגם אקרילאמיד 4% ו- 0.25% VA-044 בשני שלבים נפרדים במהלך היווצרות הידרוג, בעוד mPACT עוד יותר מתבססת על psPACT, תוספי תזונה זמנים תוססים 8% ניקוי פתרון עם 0.5% α-thioglycerol10. הפרדת את אקרילאמיד ואת העוקבות וירג'יניה-044 צעד מונע את הצורך הסרת שנותרו מונומרים הידרוג unpolymerized המקיפים את הרקמה, אשר יכולים להתפשר רקמת הסופי לאחר השגת שקיפות עם ההסכם; בנוסף, זה מפחית באופן משמעותי את הזמן הדרוש להפקת אישור אופטי מקסימלי. התוספת של α-thioglycerol בשיטה mPACT נוספות מאיצה קרחת היער לעבד13, כמו α-thioglycerol הוא סוכן האו ם browning המסייעת לנקות אזורים של הרקמה שהם פחות נגישים באמצעות רק את ריאגנטים בשיטה ההסכם המקורי 7 , 8 , 9.
השוואה של ברית, psPACT ו- mPACT על רקמת מכרסמים הדגימו כי בעוד psPACT משפר את שקיפות אופטית ביחס פרוטוקול ההסכם המקורי, mPACT באופן היעיל ביותר מאפשר עבור סליקה ודימות ברזולוציה עוקבות של שני שלם בתרבית של איברים, פרוסות המחולקת למקטעים, כפי שהוכח איור 2, איור 3, באיור 4. Α-thioglycerol מבוססי השומנים הכשלון של איברים מעובד המפתח השיטה הוכיחה mPACT ההבדלים יציבות שקיפות, יעילות, רקמות בהשוואה סליקה שתי השיטות האחרות. פעולה זו מותרת לניתוח 3D מהיר של איברים מעובד, ספציפית לגבי דם להערכת המורפולוגיה, דרך immunofluorescence ומיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 5DE).
בעוד התוספת של α-thioglycerol לפתרון סליקה מבוססי מרחביות הוא קריטי עבור האצת שקיפות אופטית, זה גם מעט מגבירה את השבריריות רקמות והופכת אותו יותר רגישים לנזק שלאחר עיבוד. עליונות ברורה mPACT לגבי היעילות שלה עולה מגבלה זו; עם זאת, כיום מבוצעת עבודה כדי להבטיח כי ניקוי מקסימלי תושג עם מינימלי כדי בהוצאות של רקמות תקינות.
לכן, התוצאות שלנו להקים mPACT כמו כלי חקירה רב עוצמה עבור מתן ניתוח תלת-ממד מתכונות אנטומי פונקציונלי או בתרבית של איברים, כולל אך לא מוגבל רשתות עצביים, דם להערכת ואדריכלות מטריקס רקמות. . להתקדם, אנו מאמינים mPACT יכול להיות שימושי במיוחד בחקירת מנגנונים ביולוגיים מיומנויות שתורמים הפתופיזיולוגיה של המחלה, כגון פגיעה ברקמות, מומים התפתחותיים, סרטן, ניווניות מחלת14,15,16,17. בשילוב עם מחקר של עדין המנגנונים הסלולר מעורב במחלה, mPACT יש פוטנציאל לספק מידה מרובה יותר מלאה, הבנה של מחלה שונים איך שונים מנגנוני אינטראקציה כדי להצמיח פנוטיפ שנצפו.

המטרה הבסיסית חקירה מדעית וקלינית כרוכה השגת הבנה מלאה של איבר מבנה ותפקוד; עם זאת, האופי המורכב ביותר של איברים יונקים לעתים קרובות מגישה כמחסום להשגת המטרה הזו1באופן מלא. בהירות (החלפת השומנים ברור hybridized אקרילאמיד נוקשה הדמיה תואמי Tisssue-הידרוג)2,3,4, הכוללת בנייה של היברידית הידרוג מבוססי אקרילאמיד רקמות ללא פגע, משיגה סיווג אופטי מגוון רחב של איברים, כולל את המוח, הכבד, הטחול, תוך שמירה על שלמות המבנה שלהם5. בהירות אפשרה ובכך לא רק ויזואליזציה, אלא גם הזדמנות דק לנתח רשתות הסלולר מורכבות מורפולוגיות רקמות ללא צורך חלוקתה.
כדי להשיג את סיווג רקמות, בהירות מעסיקה electrophoretic שיטות להסרת התוכן השומנים המדגם בהישג יד. בעוד בהירות נרשמה לייצור רקמות במצב יציב-הידרוג כלאיים, מחקרים הראו כי בזכות השימוש בשיטות ניקוי (וכו ') רקמת electrophoretic מפיקה את התוצאות משתנה מבחינת איכות לרקמות, לרבות, בראונינג, נזק epitope, ו איבוד חלבון5,6. כדי לטפל בבעיות אלה, ששונה פרוטוקולים כגון ברית (טכניקה פסיבי של בהירות), אשר מחליף את הטיפול וכד' עם טכניקה הפסיבי, חומרי יוניים delipidation מבוסס, כבר מפותחת7,8,9. למרות השגת עקביות יותר תוצאות, עם זאת, ההסכם דורש יותר זמן כדי לקבל אישור מקסימלי. יתר על כן, אף אחת משיטות אלה טרם הוחלו את כל הטופס CNS או לפי דגמים גדולים מכרסמים כגון עכברים, שרקנים.
המחקר הנוכחי מבקשת להתייחס הגבלות אלה על-ידי מציע מתודולוגיות הרומן, psPACT (ברית נפרדת תהליך) ו mPACT (שהשתנה ההסכם), להקלה על פינוי מהיר של כל מערכת העצבים המרכזית ואיברים פנימיים מודלים גם העכבר וגם עכברוש10. באופן ספציפי, psPACT מעבד רקמות אקרילאמיד 4% ו- 0.25% VA-044 בשני שלבים נפרדים במהלך היווצרות הידרוג; mPACT בעיקרו של דבר כרוך אותם שלבים, אבל תוספי תזונה פתרון סליקה מבוססי מרחביות עם 0.5% α-thioglycerol כמו מפתח תגובה כימית. בשתי הטכניקות לרתום את אנדוגני מערכתית cerebrospinal הדם ומערכות תפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי לייצר סיווג אופטי. מהווה הוכחה של עיקרון, נדגים את השימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית לנתח כלי דם דפוסים רקמות שנוקה10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix, Inc.</td>
			<td>75819</td>
			<td>Clearing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz</td>
			<td>Axia-Shield</td>
			<td>1002424</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td>161-0140</td>
			<td>Polymerization (A4P0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#180;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>017-19362</td>
			<td>Polymerization (VA-044)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1753-100ML</td>
			<td>Clearing solution (mPACT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Georgiachem</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>BSA100</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>375095</td>
			<td>Perfusion (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-CD31 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-28188</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPP-9004</td>
			<td>Perfusion, Polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4)</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPB-9121</td>
			<td>Perfusion, Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL stripette</td>
			<td>Coatar</td>
			<td>4488</td>
			<td>Solution transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Clearing tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Cell culture dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>20035</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>211350</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Korea vaccine Co., Ltd</td>
			<td>26G 1/2</td>
			<td>Anesthetize&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>Korea vaccine Co., Ltd</td>
			<td>21G1 1/4</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>Polymerization (A4P0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 3MM paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z270849</td>
			<td>Blotting paper for gel removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM780</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN lite Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN 2012</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longerpump</td>
			<td>BT100-1F</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyGel</td>
			<td>Lifecanvas Technologies</td>
			<td>EasyGel</td>
			<td>Tissue gel hybridization system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel passive clearing methods for the rapid production of optical transparency in whole cns tissue

מאז הפיתוח של בהירות, bioelectrochemical פינוי טכניקה המאפשרת למיפוי פנוטיפ תלת מימדי בתוך רקמות שקוף, שפע של מתודולוגיות סליקה הרומן כולל מעוקב (הדמיה מוחית ברור, בלא הפרעה קוקטיילים וניתוח חישובית), מתג (פקד-מערכתיות של אינטראקציה עם הזמן) וקינטיקה של כימיקלים, מפה (מוגדל ניתוח של פרוטאום) ו ברית (טכניקה בהירות פסיבי), הוקמו להרחיב את ערכת הכלים הקיימים עבור ניתוח מיקרוסקופי של רקמות ביולוגיות. מטרות המחקר הנוכחי כדי לשפר ולמטב את הנוהל ההסכם המקורי עבור מערך של רקמות מכרסמים שלם, כולל את כל מערכת העצבים המרכזית (CNS), הכליות, הטחול העכבר כל העוברים. כינה psPACT (ברית נפרדת תהליך) ו mPACT (שהשתנה ההסכם), טכניקות הרומן אלה מספקים אמצעי מניעה תכופה מיפוי תא המעגלים והצגה של מבנים subcellular ברקמות נורמליים ופתולוגיים ללא פגע. בפרוטוקול הבא, אנו מספקים מתווה מפורט, צעד אחר צעד כיצד להשיג סיווג רקמות מקסימלי עם הפלישה מינימלי של המבנית שלהם דרך psPACT ו- mPACT.

הדור של דגם שקוף של מערכת העצבים כל באמצעות טכניקות אופטימיזציה סליקה פסיבי
סיווג אופטי של עכבר, חולדה רקמות CNS כל הושג במהירות תוך שימוש בטכניקות שונות סליקה פסיבי (איור 1). תיאור סכמטי של רקמות ניקוי במשך הזמן מוצג באיור 2A. שלא כמו שיטת ההסכם המקורי, psPACT (ברית נפרדת בתהליך) כרוך בטיפול דגימות עם 4% אקרילאמיד (A4P0) והפתרון יוזם VA-044 0.25% בשני שלבים נפרדים כדי ליצור את הידרוג היברידית. mPACT (ששונה הסכם) משפר עוד יותר על psPACT על-ידי שכשהם זמנים תוססים 8% ניקוי פתרון עם 0.5% α-thioglycerol. דוגמאות מעובד דרך ברית, psPACT, mPACT בגיל 14 יום בהשוואה, המוצגים באיור 2B.
במחקר הקודם, דיווחנו כי פרוטוקול ההסכם המקורי נקבע סיווג אופטי בימים 23, psPACT, mPACT פינה והעכבר כולו CNS רק 20 ו-14 ימים, בהתאמה10. במחקר הנוכחי, כאשר נתייחס בעכבר דגימות המוח באמצעות פרוטוקול mPACT, מצאנו כי השיגו שקיפות אופטית לאחר 14 ימים (איור 2B). דגימות CNS כל עכברוש מעובד באמצעות psPACT, mPACT גם הראה שאת mPACT מושגת סיווג מקסימלי עם היעילות ביותר, כמו רקמות נוקתה 30 ו- 20 ימים, בהתאמה (איור 3 א, ב'). עכברים בוגרים את המוח לבדו, לעומת מערכת העצבים כולה, נוקתה עם mPACT בימים 5 גרידא (איור 4A). דפוסי כלי דם של המוח עכברוש שנוקה נותחו באמצעות immunofluorescence לאחר psPACT ועיבוד mPACT כדי להדגים את התועלת של הליכים אלה סליקה עבור ניתוח אנטומי פונקציונלי של המוח (איור 4B, mPACT נתונים מוצג בוו ואח 2016)10.
באמצעות אלה ממוטב רקמות פסיביות ניקוי פרוטוקולים, היינו מסוגל לדמיין ללא פגע, שקוף מודלים של מערכת העצבים כל, למרות הזמנים סליקה שונה בין שלושת הפרוטוקולים. אופטימיזציה פסיבית ניקוי שיטות מושגת בהירות איבר באורך קצר יותר של זמן. יחדיו, תוצאות אלה מראים כי mPACT שיטת ניקוי יכול לייצר יותר stably, מאשר הקודם במהירות פסיבי ניקוי שיטות ברור CNS. לפיכך, mPACT בעל פוטנציאל גדול לשימוש ניתוח אנטומי מבניים עתידיים של איברים יונקים ומספק יתרון משמעותי על פני שיטות הקיימות מבחינת היעילות והבטיחות.
הדור של שטיחות שנוקה איברים פנימיים, העוברים באמצעות mPACT
בנוסף כל רקמות CNS, עכברים בוגרים טחול וכליות נוקתה עם mPACT בימים 19, 23, בהתאמה (איור 5 אב'). העכבר העוברים על E10.5 ועל E13.5 נוקתה גם אחרי 3 ימים של עיבוד באמצעות פרוטוקול mPACT. איור 5C -E מציג את הפריט החזותי של דפוסי כלי דם העובר כולו, כמו גם את microvasculature של האזור הזנב של העובר העכבר, העכברוש תסמונת הרכיבה, הטחול חולדה. תוצאות אלו מראים שאת mPACT הזה יכול לשמש כדי ליצור דגמים שקופים של מגוון רחב של רקמות ואיברים לצורך ניתוח אנטומי תלת-ממד.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig1.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של טכניקות אופטימיזציה סליקה פסיבי (ברית). חלוקה לרמות של מעורב כל אחד מהפרוטוקולים ברית שלושה צעדים בודדים מסופק לצד ריאגנטים הדרושים עבור כל שלב. פרוטוקול ההסכם המקורי הוא רקמה פלמור של הידרוג היווצרות בתערובת קר של 4% מחברים, פתרון אקרילאמיד (א. א) 4% ו- 0.25% VA-044 יוזם פתרון. לאחר רקמות היא polymerized באמצעות גז חנקן, שינוקה פסיבי עם 8% מרחביות ניקוי פתרון. PsPACT (ברית נפרדת תהליך) משתמשת תהליכי טיפול נפרד פתרון שושי מילר-אליוביץ 4% ו- 0.25% VA-044 יוזם פתרון להיווצרות הידרוג הרקמה; תנאים אלו שונים מאלו של פרוטוקול ההסכם המקורי. MPACT (ששונה הסכם) נוספים מוסיפה 0.5% α-thioglycerol 8% זמנים תוססים ניקוי פתרון של הפרוטוקול psPACT. עבור כל שלושת הפרוטוקולים, הרקמות שלמים מודגרת > = 37 מעלות צלזיוס חממה חזק עד iss סיווג מקסימלי הושג. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig2.jpg"> איור 2: שקיפות אופטית של העכבר כל מערכת העצבים המרכזית (CNS) על-ידי ניקוי רקמות פסיבי. (א) Schematization של כל רקמה CNS ניקוי באמצעות שיטות מבוססות-ברית לאורך זמן. השוואה (B) של שלושת הפרוטוקולים סליקה פסיבי (ההסכם המקורי, psPACT, mPACT) ב- CNS כל עכבר-14 ימים לאחר העיבוד. (ג) אישור אופטי של המוח העכבר לאמירה mPACT עיבוד במשך 14 ימים. איור זה השתנה מ וו. ואח 201610. האותיות ג' 2 הם 3 מ מ גבוה. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig3.jpg"> איור 3: שקיפות אופטית של עכברוש שלם CNS רקמות פוסט-psPACT ו- mPACT. (א) רקמות CNS כל עכברוש למבוגרים השיגה אישור אופטי מקסימלי עם psPACT לאחר 30 ימים. (B) רקמות CNS כל עכברוש למבוגרים השיגו אישור אופטי מקסימלי עם mPACT אחרי 20 ימים. לפני ואחרי דיאגרמות לציין את הגודל של מערכת העצבים כל לפני ואחרי טיפול, כפי שנמדד לפי העין. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig4.jpg"> איור 4: ויזואליזציה עיבוד של microvasculature mPACT של מוח משרטוטי עכברוש למבוגרים. (א) השוואה של מוח עכברוש למבוגרים בעובי 4 מ מ. סעיפים לאחר mPACT עיבוד ב- 3 ו- 5 ימים. (B) הקרנה תלת-ממד של דפוסי כלי דם במוח עכברים בוגרים דמיינו נוגדן anti-CD31 לאחר העיבוד psPACT. גודל ברים, 1,500 מיקרומטר, 100 מיקרומטר. איור זה השתנה מ וו. ואח 201610. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig5.jpg"> איור 5: עיבוד mPACT של איברים מכרסמים, העכבר כל העוברים. mPACT להשיג שקיפות אופטית עכברים בוגרים (א) טחול וכליות (B) בימים 19, 23, בהתאמה. (ג) mPACT המיוצר עוברי העכבר שקוף של E10.5 ו- E13.5 אחרי 3 ימים. (ד) ויזואליזציה של microvasculature עם אנטי-CD31 באזור הזנב של העובר העכבר לאחר ניקוי עם mPACT. (ה) 3D השלכה של להערכת העכברוש תסמונת הרכיבה, הטחול עכברוש (נ) עם אנטי-CD31, לאחר עיבוד באמצעות mPACT. איור זה השתנה מ וו. ואח 201610. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue at JoVE.com

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

הרומן פסיבית ניקוי שיטות לייצור מהיר של שקיפות אופטית כל רקמה CNS

כאן, אנו מציגים שתי מתודולוגיות הרומן, psPACT, mPACT, להשגת שקיפות אופטית מקסימלי וניתוח מיקרוסקופיים עוקבות של רקמות להערכת למכרסמים שלם כל מערכת העצבים המרכזית.

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

novel-passive-clearing-methods-for-rapid-production-optical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Views.  Yonsei University College of Medicine. כאן, אנו מציגים שתי מתודולוגיות הרומן, psPACT, mPACT, להשגת שקיפות אופטית מקסימלי וניתוח מיקרוסקופיים עוקבות של רקמות להערכת למכרסמים שלם כל מערכת העצבים המרכזית.

Video: Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

שיטות מניפולציות ניסויית, לאחר חיתוך רוחב עצב הראייה של מערכת העצבים המרכזית היונקים

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the identification of novel molecules active in preclinical assays from an in vitro recombinant receptor to their pharmacological effects at native receptors in rodent brain slices. For compounds binding at the benzodiazepine site of the receptor, the first step is to set up a primary screen that consists of developing radioligand binding assays on cell membranes expressing the major GABAA subtypes. Then, taking advantage of the heterologous expression of rodent and human GABAA receptors in Xenopus oocytes or HEK 293 cells, it is possible to explore, in electrophysiological assays, the physiological properties of the different receptor subtypes and the pharmacological properties of the identified compounds. The Xenopus oocyte system will be presented here, starting with the isolation of the oocytes and their microinjection with different mRNAs, up to the pharmacological characterization using two-electrode voltage clamps. Finally, recordings conducted in rodent brain slices will be described that are used as a secondary physiological test to assess the activity of molecules at their native receptors in a well-defined neuronal circuit. Extracellular recordings using population responses of multiple neurons are demonstrated together with the drug application.

Here, we present protocols to discover compounds active at GABAA receptors, from the binding to the physiology and pharmacology.

שיטות הגילוי של תרכובות הרומן להתכוונן קולטן גאמא אמינו בוטירית הקלד עצבית

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

השרשה כרונית של מערך שלם-קורטיקליים Electrocorticographic ב המרמוסט נפוצות

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

חיסון של רטינות הר שלם עם שיטת ניקוי רקמת בהירות

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...