We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

הפרוטוקול והסרטון הזה נועדו לשמש כבן לוויה למאמר המקורי המתאר את חבילת התוכנה בפירוט רב יותר 4, כמו גם את הדוח הטכני שמגיע עם תוכנות להורדה באתר האינטרנט של המעבדה Danuser. קוראים מוזמנים לעיין במסמכים אלה בזהירות אם יש שאלות נוספות בנוגע לשימוש בתוכנה. .1 לפני ניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר כל סרט הזמן לשגות לתוך רצף של TIFF (פורמט קובץ תמונה שתייגת) קבצי תמונה. אם יש קונוסים צמיחה מרובים / תאים בסרט נתון, יבול ראשון כל חרוט צמיחה / תא כדי ליצור תמונה ברצף משלה. הערה: זה אינו הכרחי, כפי שניתן לבחור אזורים של ריבית בודדים (ROI) בתוך plusTipTracker. עם זאת, שימוש בממדי תמונה קטנים יותר מגדיל את המהירות של העיבוד חישוביים, כך שלב זה מומלץ אם יש שטח ריק משמעותי בתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציל את כל סדרת TIFF משלותיקייה בשם &quot;תמונות&quot; בתוך נתיב שMATLAB מוגדר גישה (שים לב כי &quot;תמונות&quot; היא תלויות רישיות). כדי להוסיף לדרך חדשה, לנווט לספריית קבצים הרלוונטית בחלון &quot;התיקייה הנוכחית&quot;, לחץ לחיצה ימנית, על סמל הספרייה, ובחר באפשרות &quot;הוסף לנתיב - תיקיות נבחרות ותת תיקיות&quot;. חשובה שתיקיית תוכנת plusTipTracker תתווסף לנתיב, כמו גם. </li></ol> .2 PlusTipGetTracks הערה: הצעד הראשון בניתוח תמונה היא לזהות את כוכבי שביט EB1-GFP, לקשר שביטים למסלולים, ולקבוע את הפרמטרים של דינמיקת microtubule. זה שהושג עם &quot;plusTipGetTracks&quot; הפקודה 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל ניתוח, יישום MATLAB פתוח והקלד &quot;plusTipGetTracks&quot; לתוך החלון הפקודה. זה יגרום תיבת הדו שיח חדשה להופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;הגדרת פרויקטים חדשים&quot; ובחר באחת (או מורה) של סדרת תמונת TIFF הקודמת על ידי בחירה &quot;תמונות&quot; המתאימות תיקייה (או ספריות המכילות &quot;דימויים&quot; תיקיות). עם השלמת שלב זה, ספריית קבצים (roi_1) ייווצר (באותה התיקייה שמכילה &quot;תמונות&quot;) שיכילו את קבצי נתונים העתידיים. הערה: ניתן להשלים את הצעד &quot;פרויקטים חדשים שהוקם&quot; לפני הזמן, במהלך נפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלון חדש יופיע: &quot;בחר מצולע, לחץ לחיצה ימנית על הנקודה האחרונה, ולחץ על &#39;צור מסכה&#39;&quot;. לחץ על &quot;אישור&quot;. התמונה הראשונה בסדרת התמונה שנבחרה לאחר מכן ניתן תהיה מוצג. השתמש בעכבר כדי ללחוץ וליצור מצולע המקיף את מכלול חרוט הצמיחה. לחץ לחיצה כפולה על העכבר כדי לסגור את המצולע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמצולע סגור, תיבת הדו שיח תופיע: &quot;האם אתה רוצה לבחור את ההחזר על ההשקעה אחרת?&quot; אם התמונה יש חרוט צמיחה אחר לנתח, בחר &quot;כן&quot;; אחרת זההנבחר &quot;לא&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הפרויקטים שינותחו באופן מיידי. לחץ על &quot;בחרו פרויקטים&quot; ובחר את התיקייה (roi_X) כדי לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך listSelectGUI יופיע. בחר את הפרויקט (ים) מהצד השמאלי של המסך ולהעביר אותן לצד ימין של המסך. לחץ על &quot;אישור&quot;. בחר מיקום לשמירת רשימת הפרויקט ולחץ על &quot;שמור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;איתור&quot;, &quot;מעקב&quot;, ו &quot;לאחר עיבוד&quot;. ברגע שבחירות אלה נעשו, בצד ימין של תיבת הדו שיח יהפוך להגדרה. קביעת תצורה של כל אופציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטרים אלה משמשים כדי לקשר שביטים זוהו במסלולי MT. פרטים עבור בחירת הפרמטרים שליטה אלה למעקב כלולים בדפי 9-10 של טכני דווח PDF המלווה את הורדת חבילת תוכנה; לקרוא דוח זה בזהירות אם בעיות הם נתקלו. לצורך מעקב אחר השביטים EB1-GFP בXenopשלנו laevis קונוסים צמיחה, להשתמש בהגדרות המעקב הבאות: חפש טווח רדיוס (פיקסלים) 5-12, אורך תת מסלול מינימאלי (מסגרות) 3; אורך מקסימאלי גאפ (מסגרות) 8; מקס כיווץ פקטור 0.8, זווית מקס קדימה 50, זווית מקס אחורה 10, תנודות רדיוס 2.5. הגדרות אלה שמוצגים באיור 1. </li></ol> הערה: מקס כיווץ פקטור מוגדר לצמצם את מספר &quot;הפערים לאחור&quot; מזוהים, כמו &quot;פערים אחורה&quot; אינם מועילים לניתוח בהקשר של קונוסים צמיחה, בהתחשב בתנאים הצפופים וצפויות השגיאות בקשרי מסלול. בנוסף, שניהם זווית מקס קדימה, כמו גם שינויי הרדיוס מוגדר גבוהה יחסית, כMTs חרוט צמיחת תערוכת טרנסלוקציות תכופה קטנה בנוסף לגידולים וshrinkages, וחיזוק הגדרות שליטה אמורה, מאפשר תנועה מוגברת במהלך שלב ההצמדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את פוסט עיבוד הגדרות בהתאם להגדרות רכישת תמונה הספציפיות הרצויות. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שההגדרות הוגדרו, לחץ על &quot;התחל&quot;. התוכנה תפעל לפי הגדרות שנבחרו. פעולה זו עשויה להימשך דקות עד שעות, תלוי במספר פרויקטים שנבחרו והגדלים שלהם. Command Window מציג הזמן המשוער שנותר לכל פונקציה. כאשר צעד plusTipGetTracks הושלם, החלון הפקודה יציג את &quot;סיים!&quot; הערה: רשימה של פרמטרים ספציפיים של דינמיקת MT יש עכשיו כבר מחושבים על ידי תוכנה זו ארוכה (ראה 4 קוד לפרטים נוספים), אבל לניתוח של דינמיקת MT בקונוסים צמיחה, הפרמטרים השימושיים ביותר לבחינה הן מהירות מסלול של צמיחת MT (במיקרון / דקה), חיים במסלול צמיחה (בשניות), ואורך מסלול של צמיחה (במיקרון). </li></ol> .3 PlusTipSeeTracks הערה: כעת, לאחר שמסלולי microtubule הוגדרו, &quot;plustipSeeTracks&quot; הפונקציה משמש להדמיה מסלול 4. פונקציה זויכול לספק במספר יציאות להדמיה, כוללים מפות דינמיקת MT במרחב ובסרטים במהירות, אבל כאן, הדגש הוא אך ורק על שימוש ב&quot; סרטי מסלול &quot;כדי להציג מסלולי MT על גבי התמונות חרוטים צמיחה. בעוד plusTipGetTracks יכול לנתח סרטים מרובים בו זמנית, plusTipSeeTracks יכול רק לנתח סרט אחד בכל פעם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלד &quot;plusTipSeeTracks&quot; לתוך החלון הפקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טעינת תיבת הדו שיח, לחץ על &quot;בחר פרויקט&quot;. בחר את ספריית האב המכילה את הפרויקט לדמיין ולחץ על &quot;בחר תיקייה&quot;. חלון חדש יופיע: &quot;בחר בפרויקט שאתה רוצה לדמיין&quot;. בחר את הקובץ לדמיין ולחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לחץ על &quot;בחר שמורים את ההחזר על ההשקעה&quot;. נווט לאותה התיקייה roi_X כאחד שנבחר בשלב הקודם ובחר את הקובץ בשם &quot;roiYX&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;בחר ספריית פלט&quot; לייעד wכאן MATLAB יחסוך קבצי ההדמיה המסלול. שים לב: אנו ממליצים על שימוש באותה התיקייה שמכילה את שאר הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;הפוך מסלול סרט&quot; ומסך יופיע בו מוצגות כל plusTipGetTracks המסלולים מחושב משביטי עצה +. פעולה זו תשמור את סדרת זמן במעקב בפורמט סרט, בקובץ &quot;allTracks_X_X_X&quot;. יש אפשרות לשמירת הסרט כAVI, אחרת פורמט ברירת המחדל הוא כקובץ Quicktime.mov. </li></ol> .4 PlusTipGroupAnalysis הערה: הפונקציה אחרונה זו משמשת ליצירת קבוצות של סרטים לניתוח והשוואה של הפרמטרים מסלול MT שלהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלד &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; לתוך החלון הפקודה. כדי לבחור באופן ידני את הקבוצות להשוואה, הראשון דה בחר &quot;קבוצה אוטומטית מהיררכיה&quot;. לאחר מכן, לחץ על &quot;פרויקטים בחרו&quot;. נווט אל ספריות אב המכילות את כל תיקיות roi_Xכדי לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך listSelectGUI יופיע. בחר את כל הפרויקטים שייכללו בקבוצות מהצד השמאלי של המסך ולהעביר אותן לצד ימין של המסך. לחץ על &quot;אישור&quot;. בחר מיקום לשמירת רשימת הפרויקט ולחץ על &quot;שמור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יופיע חלון: &quot;אנא בחר קבוצה ראשונה מהרשימה&quot;. לחץ על &quot;אישור&quot;. חלון listSelectGUI יציג שוב. הפעם, בחרו רק את קבצים שמתאימים לקבוצה הראשונה שצריך להיות ויקווה יחד. לחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, הזן את שם הקבוצה, ולחץ על &quot;אישור&quot;. יופיע חלון: &quot;בחר בקבוצה אחרת?&quot; תשובה בהתאם, ולהמשיך בחירת קבוצות. יופיע חלון: &quot;בחר מיקום לשמירת רשימת הקבוצות שלך&quot;. נווט אל המיקום ולחץ על &quot;שמור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;מדריך פלט בחר&quot; לבחור בי תיקיות הפלט תהיהמאוחסן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר איזה סוג של ניתוח קבוצה לנהל - אם מסלולי MT יש ייקוו לכל קבוצה או לניתוח תא צריכה להתבצע. המבחנים הסטטיסטיים המומלצים כבר מיועדים. כדי לכלול את כל המסלולים בניתוח, בטל את הבחירה &quot;הסר מסלולים בתחילת / סיום של סרט&quot;. אחרת, יש תיבה זו נבחרה מסיר את כל מסלולי צמיחת MT שנמצאים בתהליך כסרט מתחיל או מסתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בחירת ניתוח הקבוצה מורכבת, בחר &quot;השוואת קבוצות&quot;. </li></ol>

<ol>
	<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li><li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality:+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli.">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li><li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis.">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).</li><li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics.">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li><li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis.">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li><li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells.">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413 (2012).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+ends:+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips.">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li><li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+'plus-end-tracking+proteins':+The+end+is+just+the+beginning.">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li><li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules.">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1.">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells.">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li><li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics.">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels.">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li><li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

PlusTipTracker מספק ממשק משתמש פשוט, גרפי כדי לזהות במהירות ובאופן אוטומטי שביטים EB1-GFP כמעט כל גלויים בקונוס תא או צמיחה, לקשר שביטים למסלולים, ולחשב פרמטרים MT. פרסומים אחרים דיווחו העיצוב של סוגים דומים של תוכנה (לדוגמא, מרקס et al. ניתוח כמו גם מנוצל של דינמיקת EB1 מתויגת בקונוסים צמיחה 18). אבל, תוכנה זו נראית ייחודית בה להקל על גישה, כפי שהוא להורדה חופשית מאתר האינטרנט של המעבדה Danuser, המתמחה בעיצוב בקוד פתוח, Turn-Key תוכנות שימושיות לקהילת התא הביולוגית. בעוד נדרשת גישה לMATLAB, אף אחד לא צריך להיות מוכר באופן מלא עם יישום מחשב זה כדי לנצל את התוכנה. עם זאת, יש כמה נקודות שצריכות להתייחס לנוחות שימוש. קודם כל, אחד הנושאים הנפוצים ביותר שעולים בעת שימוש בתוכנה עבור מtware ויישום מחשב בפעם הראשונה קשור לנתיב הקובץ. אם שגיאה זו מתרחשת (עם הפקודה &quot;השגיאה באמצעות דיסק -. טיעון חייב לכלול מחרוזת שגיאה בformatPath ...&quot;), ואז הפתרון הקל ביותר הוא להבטיח שתוכנת plusTipTracker, כמו גם הספרייה עם כל &quot;התמונות&quot; תיקיות המשנה, שניהם באותו נתיב הקובץ &quot;MATLAB&quot;. זה הכי טוב אם אלה אינם בספרייה &quot;Program Files&quot;, כפי שהוא כבר הציע שהרווח בשם &quot;Program Files&quot; עשוי להיות בעיה. התייחס לזה, חשוב לשים לב כי plusTipTracker חוסך את נתיב הקובץ שנוצל בעת חישוב ניתוח plusTipGetTracks הראשון, ובתור שכזה, נתיב קובץ זה חייב להישמר כאשר הנתונים אלה הוא לגשת ומועסקים על ידי רכיב אחר בתוכנה. PlusTipGetTracks פונקציות, plusTipSeeTracks, וכל plusTipGroupAnalysis להשתמש בנתיב הקובץ שנשמר המקורי, ובכך, מנסה גכל הפונקציות האלה לסרט נתון, לאחר שעבר את הקבצים לנתיב אחר, תגרום לשגיאה. שגיאה נפוצה נוספת להתרחש במהלך הניתוח היא כאשר המעקב נכשל במהלך שלב plusTipGetTracks. זה יתרחש אם מסגרת בסדרת התמונה לא מכילה שביטים לזיהוי. זה יבלום לחלוטין את הניתוח ולא לאחר עיבוד יתרחש. תיקון קל לעקוף בעיה זו ולאפשר הניתוח כדי להמשיך, הוא ליצור שביט מדומה על התמונה באזור שבו לא יהיה קשור באופן שגוי לכל מסלולים בפועל. הדבר לא ישפיע על הפרמטרים מסלול הסופיים, כמו כל כוכב שביט שאינו קיים במספר מינימאלי של מסגרות רצופות יהיה מסונן מהניתוח הסופי. נושא אחר אחת שעלולה להתעורר הוא גילוי כוכב שביט פגום. זה בדרך כלל ניתן לתקן על ידי שיפור בחירת האזור של הריבית בשלב 2.3. חשוב לצייר את האזור של עניין בשיתוף פעולה הדוק סביב התא ולא לצייר awאזור אידר מנחוץ. התוכנה משתמשת באזור זה על מנת לקבוע את הרקע השתמש במהלך איתור כוכב שביט. אם גילוי כוכב שביט הוא עדיין לא אופטימלי עם הגדרות ברירת המחדל, יכולות להיות מותאמות להגדרות בחלון plusTipGetTracks (במהלך שלב 2.7). לאחר כל ניתוח, זה קריטי כדי לאמת את קשרי מסלול האוטומטיים על ידי העין, באמצעות plusTipSeeTracks. הגדרות מעקב ייתכן שתצטרכנה להיות שונה כדי להפחית את מספרם של קשרי שביט כוזבים חיוביים או שליליים שגויים. עיין בתיעוד המקורי plusTipTracker 4, כמו גם הטכני דווח PDF המלווה את הורדת תוכנה לפרטים על אופטימיזציה של ההגדרות. הביצועים של תוכנה זו בהשוואה ליד המעקב כבר בעבר נבדקו בתאים שאינם עצביים 4. קונוסים צמיחה מהווים אתגר מעט שונה, לעומת זאת, כMTs החרוט צמיחת תערוכת טרנסלוקציות תכופה לכל הכיוונים 17, בנוסף לצמיחת MT והצטמקות. הנפק אחדדואר שלא נמצא להיות דאגה העיקרית הוא האם MTs צפוף בקונוסים צמיחה להקשות מעקב 17. כמו שרק קבוצת משנה של MTS נמצא בשלב הגובר, עם EB1-GFP בקצוות, פתרון ומעקב אחר השביטים EB1-GFP בודדים לא היו בעייתיים. עם זאת, יש לציין כי מחקרים אלה קודמים שימשו קונוסים צמיחת laevis Xenopus, אשר נבחרו במיוחד בגלל גודל חרוט צמיחה הגדול יחסית שלהם (כ 10 מיקרון), בהשוואה לקונוסים צמיחת חוליות אחרות. באמצעות קונוסים צמיחה גדולים אלה מאפשר ניתוח שביט EB1-GFP מדויק יותר. כדי להעריך את השירות ודיוק של תוכנה זו לניתוח מסלולי EB1-GFP בקונוסים צמיחת laevis Xenopus, השווינו את החוויה של שימוש בplusTipTracker עם יד מעקב של סדרת נתונים זהה (מידע לא מוצג). הזמן שנדרש למסור מסלול שביטים EB1-GFP בחרוט צמיחה ממוצע של 39 מסלולי כוכב שביט (בסרי הזמן לשגות דקה 1es, עם 2 שניות בין כל מסגרת) היה יותר משעות, בהשוואה לשתי דקות עם התוכנה. הפרמטרים שהושגו עם שתי השיטות היו דומים למהירות צמיחת MT (7.4 מיקרון לדקה לאוטומטי מעקב לעומת 7.0 מיקרון לדקה עבור יד מעקב). עם זאת, לכל חיים צמיחה ואורך, ניתוח תוכנה מוביל למסלולים קצרים יותר באופן משמעותי (בכמחצית הזמן ומרחק). זאת בשל מסלולי צמיחה מתפצלים על ידי התוכנה אם כוכב שביט נכנס ויוצא מהפוקוס לאורך זמן. בעוד שהעין האנושית יכולה לזהות בקלות שזה אותו השביט, התוכנה לא. אם כי בעיה זו היא לא בעייתית, אם הוא משתמש בתוכנה על מנת להשוות מספר תנאים. מאז פרמטרים מעקב זהים משמשים לכל התנאים (ובהנחה שהשביטים להיכנס ומחוץ לפוקוס באותו השיעור במספר תנאים), ולאחר מכן את החיים ואורכים יחסי עדיין מדידות די שימושיות להשוואה. באשר לחולדת שגיאת ניתוח אוטומטיתes, אלה תלויים במידה רבה באיכות של התמונות. בסרטי אות לרעש גבוהים, אחוזים ממסלולי misjoined או שגויים הוא בחד הספרתי. אפילו בסרטים באיכות נמוכה יותר (שבו כוכבי שביט בודדים עדיין נראים לעין על ידי עין באופן ברור, אך רעשי הרקע הוא גדולים יותר), שיעורי השגיאה עדיין נמוכים מספיק (5-15%) שהזמן המשמעותי שנשמר על ידי שימוש בתוכנה הוא שווה עלויות בטעות. הדבר נכון במיוחד במקרה כאשר מאות ניתוח של קונוסים צמיחה (60-8 צמיחת קונוסים למצב נותחו במחקר קודם 17). חשוב לציין כי תוכנה זו נועדה לגילוי שביטים עצה + שרק נקשרים לקצות MT גובר, כגון EB1-GFP. בהתחשב בכך שאלגוריתמי ההצמדה ומעקב מצפים שכוכבי שביט קיימים רק על polymerizing MTS, באמצעות תוכנה זו כדי לנתח את הדינמיקה של TIP + fluorescently- מתויג שנקשר למתכווץ MT מסתיים בנוסף לסיום גדילה יוביל למידע שגוילגבי מהירויות צמיחת MT מחושבים. אחת התכונות הייחודיות של תוכנה זו בהשוואה לתוכנת חלקיק יחיד מעקב אחר, הוא שזה לוקח בהתנהגויות MT חשבון ידועות לחישוב פרמטרים לא רק פילמור, אלא גם פרמטרים הצטמקות. הוא עושה זאת על ידי קישור שביט EB1-GFP שנעלם עם אחד שהוקם זה עתה ישירות מאחוריה באותו המסלול (זה נקרא backgap, או מסלול bgap). בעוד אלגוריתם זה עובד היטב עבור סוגים מסוימים של תאים, כגון תאי הלה 4, זה הוא תכונה פחות יעילה בעת ניתוח דינמיקת MT בקונוסים צמיחה. סיבה לכך הוא MT עוקב לעתים קרובות בצע אחד את השני לאורך בדיוק את אותו השבילים בקונוסים צמיחה (לעתים קרובות הבא יחד חבילות F-אקטין), וכך הוא בדרך כלל אי ​​אפשר לדעת אם bgap קשרים נכונים. מסיבה זו, לא מומלץ לנצל את תפוקות נתונים bgap בקונוסים צמיחה. למרות אזהרות קטין אלה ונושאיםאשר חייב להילקח בחשבון בעת ​​השימוש בplusTipTracker (ורוב כל תכנית עיבוד תמונה אוטומטית), תוכנה זו יכולה להיות כלי שימושי מאוד לניתוח אלפי שביטים EB1-GFP בסכום זמן קצר יחסית.

מטרתה של שיטה זו היא לקבל מידע כמוני אודות microtubule (MT) בתוספת-מעקב סוף החלבון (+ טיפ) דינמיקה בחיים קונוסים צמיחה. MT + טיפים מועילים בקבוצה של חלבונים הלמקם את התוספת-הקצוות של MTS 9,10. הם מבצעים מגוון רחב של פונקציות להסדיר פרמטרים של חוסר יציבות MT הדינמי 11, כוללים שיעורים של פילמור, קטסטרופה, והצלה. שיטה המשמשת היטב אחד לניתוח דינמיקת MT היא לעקוב אחר ההתנהגות של EB1 עצה +, אשר נקשר באופן ספציפי לMT גדל בתוספת-מסתיים 1,12. EB1 ידוע לגייס כמה חלבונים אחרים לMT גדל בתוספת-מסתיים 13,14, ולאחרונה כבר נקבע כגורם התבגרות MT 15, קידום שניהם צמיחת MT ותדירות אסון 15,16. מחקרים של דינמיקת MT בתוך קונוסים צמיחה רבים מנוצלים שיטות עבודת יד מעקב כדי למדוד שינויים בדינמיקת EB1-GFP לאורך הזמן 1-3, כlocalizati EB1לMT יכול לשמש תוספת מסתיימת כסמן לפילמור MT. יתרון עיקרי לבחינת שביטים EB1-GFP כמדד לצמיחת MT הוא שדינמיקת MT ניתן למדוד גם באזורים של החפיפה MT משמעותית. בעוד השיטה של שביטים EB1-GFP יד מעקב סיפקה תובנות שימושיות לMT התנהגויות 1-3, זה זמן רב ויכול להיות מוטה. בנוסף, כצמיחה חריגה התנהגויות קונוס עשויות התוצאה של משמרות דקות בדינמיקת cytoskeletal, ניתוח תת קבוצה קטנה בלבד של MTS (בדרך כלל נדרשות כאשר יד מעקב) עלול להחמיץ מידע משמעותי. לפיכך, אנו מודדים פרמטרים דינמיקת MT הגלובליים באמצעות חבילת התוכנה, 4 plusTipTracker, לאחר הרכישה של רזולוציה גבוהה, תמונות בשידור חיות של EB1 מתויג בקונוסים צמיחה עובריים בתרבית 5. תוכנה זו, שפותחה במעבדת Danuser, נעשתה שימוש במספר מחקרים המאפיינים את דינמיקת MT בסוגי תאים שונים 6-8. זה קוד פתוח,אה ידידותי, חבילה מבוססת MATLAB הכוללת זיהוי אוטומטי, מעקב, הדמיה, וניתוח לסרטים של + טיפים, שכותרתו fluorescently. רשימה של פרמטרים ספציפיים של דינמיקת MT מחושבים על ידי תוכנה זו ארוכה (ראה 4 קוד לפרטים נוספים), אבל לניתוח של דינמיקת MT בקונוסים צמיחה, הפרמטרים השימושיים ביותר הם מהירות מסלול של צמיחת MT (במיקרון / דקה), מסלול של צמיחה חיים (בשניות), ואורך מסלול של צמיחה (במיקרון). את התוכנה ניתן להוריד מאתר אינטרנט המעבדה Danuser ישירות (תחת &quot;תוכנה&quot;). בעוד המעבדה Danuser תומכת כעת ממשק חדש לניתוח מעקב עצה +, אשר שולב לתוך חבילת תוכנה בשם u-מסלול 2.0, התוכנה המקורית, עצמאית תישאר זמינה. האלגוריתמים הבסיסיים בין שתי התוכניות הם אותם (לפחות כמו של 2014), עם רק הבדל של תפוקות ממשק וניתוח. למשתמש המתחיל עם MATLAB הקטן ו / או התנסות אנליזה חישוביתence, יש plusTipTracker תכונות ידידותי למשתמש יותר, ובכלל זה תפוקות פרמטר סטטיסטיות אוטומטיות. כאן, אנו מתארים את השלבים לניתוח תמונות של דינמיקת EB1-GFP בקונוסים צמיחת laevis תרבותי צפרדעים. פרוטוקול זה נוצל בשנים האחרונה בעיתון בחינת דינמיקת MT 17. ראו גם אל אפלולי ואח. 2012 5 להוראות מפורטות לגבי קונוסים צמיחת culturing להביע EB1-GFP. בעוד מאמר זה התמקד בעיקר בבחינת דינמיקת EB1-GFP בקונוסים צמיחה, באותו הפרוטוקול יכול לשמש לסוגי תאים אחרים 17. לכל סוגי התאים, מרווח הזמן בין מסגרות צריך להיות בין 0.5-2 שניות למעקב עצה + אופטימלי. מרווח זמן של עד 4 שניות בין המסגרות אפשרי, אבל זה עלה תוצאות מרווח זמן בשגיאות מעקב נוספות.

<table><tbody><tr><td>plusTipTracker software</td><td>Danuser Lab</td><td>&lt;a href=&quot;http://lccb.hms.harvard.edu/software.html&quot;&gt;http://lccb.hms.harvard.edu/software.html&lt;/a&gt;</td><td>This software may be hosted by another website in the future.&amp;nbsp; If the listed site does not exist, search &quot;Danuser Lab Software&quot; on a web search engine to find the site.</td></tr><tr><td>MATLAB software</td><td>Mathworks</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mathworks.com/products/matlab/&quot;&gt;http://www.mathworks.com/products/matlab/&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Microtubule (MT) בתוספת-מעקב-end חלבונים (+ טיפים) בתרגום לתוספת-סיום הגדילה של MTS ולהסדיר דינמיקת MT 1,2. אחד הטיפים הידועים ביותר ושימוש נרחב + לניתוח דינמיקת MT הוא כריכה-End החלבון, EB1, הקושר את כל תוספת-קצות MT גדלו, ובכך, מהווה סמן לפילמור MT 1. מחקרים של EB1 התנהגות בתוך קונוסים צמיחה רבים השתמשו זמן רב ו, שיטות עבודת יד מעקב בעזרת מחשב מוטה לנתח פרט MTs 1-3. הגישה שלנו היא לכמת פרמטרים הגלובליים של דינמיקת MT שימוש בחבילת התוכנה, 4 plusTipTracker, בעקבות הרכישה של רזולוציה גבוהה, תמונות בשידור חיות של EB1 מתויג בקונוסים צמיחה עובריים בתרבית 5. תוכנה זו היא חבילה מבוססת MATLAB, קוד פתוח, ידידותי למשתמש, המשלבת איתור אוטומטי, מעקב, הדמיה, וניתוח לסרטים של + טיפים, שכותרתו fluorescently. כאן, אנו מציגים הפרוטוקול לשימוש plusTipTracker לניתוח השביטים עצה + fluorescently שכותרתו בקונוסים צמיחת laevis תרבותיים צפרדעים. עם זאת, תוכנה זו יכולה לשמש גם כדי לאפיין דינמיקת MT בסוגי תאים שונים 6-8.

שימוש בתוכנה זו, כמתואר כאן יספק כמה קבצי מידע שלכמת דינמיקת עצה + בתאים חיים. PlusTipGetTracks הפונקציה מזהה את הרצועות (באמצעות הגדרות דוגמא מוצגות באיור 1), ולאחר מכן מספק פרמטרים לגבי מסלולי עצה +. כדי להציג את המידע שהתוכנה קיבלה, ללכת לספריית roi_X שיצרה בשלב 2.2. התיקייה &quot;ההישג&quot; מכילה &quot;overlayImages&quot;, שהיא סדרה של תמונות המציגות את כוכבי השביט שזוהה. בחינת תמונות אלה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה יכול להוכיח את הדיוק של זיהוי שביט. התיקייה &quot;meta&quot; מכילה גם מידע מפורט לגבי סטטיסטיקת שביט עצה +, כולל את הקובץ &quot;projData&quot;, כמו גם את הקובץ &quot;סטטיסטיקה&quot;. כדי להציג את קובץ &quot;סטטיסטיקה&quot;, לגרור אותה לגיליון עבודה פתוח של יישום גיליון אלקטרוני. קובץ זה מכיל המחשבוןפרמטרים microtubule ד עבור כל סרט (איור 2). כפי שצוין לעיל, רשימה של פרמטרים ספציפיים של דינמיקת MT ארוכה מחושבת על ידי תוכנה זו (ראה 4 קוד לפרטים נוספים), כולל מהירות מסלול של צמיחת MT (במיקרון / דקה), חיים במסלול צמיחה (בשניות), ואורך מסלול של צמיחה (במיקרון). PlusTipSeeTracks הפונקציה חוסך סרט של השביטים במעקב, אשר יכול להיבדק על ידי פתיחת הקובץ &quot;allTracks_X_X_X&quot; (איור 3). PlusTipGroupAnalysis הפונקציה משלב ערכות נתונים בודדות מרובות לקבוצות ויוצרת תיקיות (perCell בשם או pooledData, תלוי באיזה ניתוח נבחר) המכילים נתונים פרמטר קבוצה, כולל היסטוגרמות, מגרשים, וגיליונות אלקטרוניים להשוואת קבוצות ופרמטרים בודדים בתוך כל אחת מקבוצות (איור 4). <img alt="איור 1" fo:content-width = src &quot;6in&quot; = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,138 / 52138fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; הגדרות .1 PlusTipGetTracks איור משמשות לשביטי EB1-GFP בקונוסים צמיחת laevis Xenopus. נתון זה מראה את ההגדרות הספציפיות עבור &quot;זיהוי&quot;, &quot;מעקב&quot;, ו &quot;לאחר עיבוד&quot; צעדים שניתן להשתמש בו לניתוח EB1-GFP שביטים בקונוסים צמיחת laevis Xenopus. כלי plusTipParamSweepGUI, זמין בתוך חבילת plusTipTracker, ניתן להשתמש כדי לייעל את הגדרות מעקב לאורגניזמים מודל אחרים ו / או סוגי תאים 7. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52138/52138fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 מסך של פרמטרים MT המתקבלים מניתוח plusTipGetTracks. התיקייה &quot;meta&quot;, נוצר על ידי plusTipGetTracks פועל, מכיל מידע בנוגע ל+ TIP גסטטיסטיקת omet. על ידי גרירת הקובץ &quot;סטטיסטיקה&quot; ליישום גיליון אלקטרוני, ניתן לבחון פרמטרים דינמיקת microtubule. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52138/52138fig3highres.jpg" width="600" /> מסך איור 3 של סרט מסלול MT המתקבל מניתוח plusTipSeeTracks. PlusTipSeeTracks מאפשר לא רק להדמיה מסלול microtubule, אלא גם משמש ככלי אימות על ידי המאפשר למשתמש להציג את תקפויות הנתונים שנרכשו מplusTipGetTracks. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52138/52138fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4 מסך של פרמטרים MT המתקבלים מplusTipGroupAnalysis. PlusTipGroupAnalysis מציע למשתמש שיטה פשוטה לקבוצות השוואה ופרמטרים בודדים between בתוך כל קבוצה על ידי שילוב של ערכות נתונים בודדים מרובות וייצור תפוקה סטטיסטית, אשר יכול להיבחן ביישום גיליון אלקטרוני.

Watch this Scientific Journal Video about Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones at JoVE.com

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

המבוססת על MATLAB, חבילת תוכנות הקוד הפתוחה, plusTipTracker, ניתן להשתמש בו לסדרת תמונה של + טיפים, שכותרתו fluorescently לנתח לכמת דינמיקת microtubule.

באמצעות plusTipTracker תוכנה כדי למדוד microtubule Dynamics ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; קונוסים צמיחה

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

using-plustiptracker-software-to-measure-microtubule-dynamics-xenopus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

10.3K Views.  Boston College.  המבוססת על MATLAB, חבילת תוכנות הקוד הפתוחה, plusTipTracker, ניתן להשתמש בו לסדרת תמונה של + טיפים, שכותרתו fluorescently לנתח לכמת דינמיקת microtubule. 

Video: Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and networks often contain subsets of microtubule arrays that differ in their dynamic properties. For example, in dividing cells, stable bundles of crosslinked microtubules coexist in close proximity to dynamic non-crosslinked microtubules. TIRF-microscopy-based in vitro reconstitution studies enable the simultaneous visualization of the dynamics of these different microtubule arrays. In this assay, an imaging chamber is assembled with surface-immobilized microtubules, which are either present as single filaments or organized into crosslinked&#160;bundles. Introduction of tubulin, nucleotides, and protein regulators allows direct visualization of associated proteins and of dynamic properties of single and crosslinked microtubules. Furthermore, changes that occur as dynamic single microtubules organize into bundles can be monitored in real-time. The method described here allows for a systematic evaluation of the activity and localization of individual proteins, as well as synergistic effects of protein regulators on two different microtubule subsets under identical experimental conditions, thereby providing mechanistic insights that are inaccessible by other methods.

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Here, a TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay is presented to simultaneously quantify and compare the dynamics of two microtubule populations. A method is described to simultaneously view the collective activity of multiple microtubule-associated proteins on crosslinked microtubule bundles and single microtubules.

הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מיקרוטובולים מקושרים ובודדים במבחנה על ידי מיקרוסקופיה TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Biochemistry

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

השתקפות הפרעה סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה מיקרוטובולים דינמיים וחלבונים נלווים

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the dynamic properties of the cytoskeleton. This protocol offers a technique for human primary fibroblast transfection, which can be difficult because of the specifics of primary cell cultivation conditions. Additionally, cytoskeleton dynamic property maintenance requires a low level of transfection to obtain a good signal-to-noise ratio without causing microtubule stabilization. It is important to take measures to protect the cells from light-induced stress and fluorescent dye fading. In the course of our work, we tested different transfection methods and protocols as well as different vectors to select the best combination of conditions suitable for human primary fibroblast studies. We analyzed the resulting time-lapse videos and calculated microtubule dynamics using ImageJ. The dynamics of microtubules' plus-ends in the different cell parts are not similar, so we divided the analysis into subgroups - the centrosome region, the lamella, and the tail of fibroblasts. Notably, this protocol can be used for in vitro analysis of cytoskeleton dynamics in patient samples, enabling the next step towards understanding the dynamics of the various disease development.

This protocol is dedicated to the microtubule plus-end visualization by EB3 protein transfection to study their dynamic properties in primary cell culture. The protocol was implemented on human primary skin fibroblasts obtained from Huntington's disease patients.

הדמיה של מיקרוטובול פלוס-אנד דיינמיקס במודל מחלת הנטינגטון המבוססת על פיברובלסטים של העור העיקרי האנושי

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Bioengineering

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Neuroscience

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are thought to play a vital role in the microtubule-dependent chromosome motions during cell division, but the relevant proteins and their exact roles are ill-defined. Thus, there is a growing need to develop assays with which to study such motility in vitro using purified components and defined biochemical milieu. Microtubules, however, are inherently unstable polymers; their switching between growth and shortening is stochastic and difficult to control. The protocols we describe here take advantage of the segmented microtubules that are made with the photoablatable stabilizing caps. Depolymerization of such segmented microtubules can be triggered with high temporal and spatial resolution, thereby assisting studies of motility at the disassembling microtubule ends. This technique can be used to carry out a quantitative analysis of the number of molecules in the fluorescently-labeled protein complexes, which move processively with dynamic microtubule ends. To optimize a signal-to-noise ratio in this and other quantitative fluorescent assays, coverslips should be treated to reduce nonspecific absorption of soluble fluorescently-labeled proteins. Detailed protocols are provided to take into account the unevenness of fluorescent illumination, and determine the intensity of a single fluorophore using equidistant Gaussian fit. Finally, we describe the use of segmented microtubules to study microtubule-dependent motions of the protein-coated microbeads, providing insights into the ability of different motor and nonmotor proteins to couple microtubule depolymerization to processive cargo motion.

Microtubules are inherently unstable polymers, and their switching between growth and shortening is stochastic and difficult to control. Here we describe protocols using segmented microtubules with photoablatable stabilizing caps. Depolymerization of segmented microtubules can be triggered with high temporal and spatial resolution, thereby assisting analysis of motions with the disassembling microtubule ends.

הכנת Microtubules מקוטע לחקר תנועות מונעים על ידי מסתיים microtubule הפירוק

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a genetically encoded marker for the positive ends of microtubules (EB3 labelled with tdTomato fluorescent protein) and high-speed, high-resolution, live-cell imaging using spinning disk confocal microscopy. Cell cycle synchronization and increased density of microtubules are achieved by inhibiting centrosomal separation in mitotic cells, and analysis of growth is performed using open-source U-Track software. The use of a bright and red-shifted fluorescent protein, in combination with the lower laser power and reduced exposure time required for spinning disk microscopy reduce phototoxicity and the probability of light-induced artifacts. This allows for imaging a larger number of cells in the same preparation while maintaining the cells in a growth medium under standard culture conditions. Because the analysis is performed in a supervised automatic fashion, the results are statistically robust and reproducible.

Here we present a robust and detailed method of microtubule dynamics analysis in cells synchronized in prometaphase using live-cell spinning disk confocal microscopy and MATLAB-based image processing.

מדידה של מיקרוטוכדורית על ידי ספינינג מיקרוסקופ דיסק ב-מונוסולאר Mitotic צירים

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

באמצעות plusTipTracker תוכנה כדי למדוד microtubule Dynamics ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video