We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

Este protocolo e vídeo são destinados a servir como um companheiro para o artigo original que descreve o pacote de software mais detalhadamente 4, bem como o Relatório Técnico que acompanha o download do software no site da Danuser Lab. Os leitores são encorajados a rever estes documentos cuidadosamente se há mais perguntas sobre a utilização do software. 1 Antes de Análise de Imagem <ol><li> Converta cada filme de lapso de tempo em uma seqüência de TIFF (Tagged Image File Format) arquivos de imagem. Se houver vários cones de crescimento / células em um determinado filme, a primeira colheita de cada cone de crescimento / célula para criar a sua própria sequência de imagens. Nota: Isso não é necessário, como regiões de interesse individuais (ROI) pode ser selecionado dentro plusTipTracker. No entanto, utilizando-se as dimensões da imagem menores aumenta a velocidade de processamento computacional, de modo que este passo é recomendável, se houver espaço vazio significativo na imagem. </li><li> Salve cada série TIFF em seu própriopasta chamada &quot;imagens&quot; dentro de um caminho que MATLAB é definido para o acesso (note que &quot;imagens&quot; é sensível a maiúsculas). Para adicionar um novo caminho, navegue até o diretório do arquivo relevante na janela &quot;pasta atual&quot;, clique com o botão direito sobre o ícone do diretório, e selecione &quot;Adicionar ao trajeto - pastas selecionadas e Sub-pastas&quot;. É importante que a pasta do software plusTipTracker ser adicionado ao caminho, como bem. </li></ol> 2. plusTipGetTracks Nota: O primeiro passo na análise de imagens é detectar os cometas EB1-GFP, vincular os cometas em faixas, e determinar os parâmetros da dinâmica dos microtúbulos. Isto é obtido com o comando &quot;plusTipGetTracks&quot; 4. <ol><li> Para começar a análise, aplicação MATLAB aberta e digite &quot;plusTipGetTracks&quot; na janela de comando. Isso fará com que uma nova caixa de diálogo aparecer. </li><li> Clique em &quot;Definir novos projetos&quot; e selecione um (ou more) do TIFF imagem série anterior, selecionando as &quot;imagens&quot; apropriadas pasta (ou pastas que contenham &quot;imagens&quot; pastas). Após a conclusão desta etapa, um diretório de arquivos (roi_1) será criada (na mesma pasta que contém &quot;imagens&quot;) que irá conter os arquivos de dados futuros. Nota: o passo &quot;Configurar Novos Projetos&quot; pode ser concluída antes do tempo, durante uma sessão separada. </li><li> Uma nova janela será exibida: &quot;Selecione um polígono, clique com o botão direito no último ponto, e clique em&quot; Criar máscara &#39;&quot;. Clique em &quot;OK&quot;. A primeira imagem da série imagem selecionada será exibida. Use o mouse para clicar e criar um polígono que abrange a totalidade do cone de crescimento. Dê um duplo clique com o mouse para fechar o polígono. </li><li> Uma vez que o polígono foi fechado, uma caixa de diálogo será exibida: &quot;Você quer selecionar outro ROI?&quot; Se a imagem tem um outro cone de crescimento para analisar, selecione &quot;Sim&quot;; caso contrário, éeleitos &quot;Não&quot;. </li><li> Selecione os projetos que serão imediatamente analisados. Clique em &quot;Selecionar Projetos&quot; e selecione a pasta (roi_X) analisar. </li><li> Uma tela listSelectGUI aparecerá. Selecione o projeto (s) a partir do lado esquerdo da tela e movê-los para o lado direito da tela. Clique em &quot;OK&quot;. Escolha um local para salvar a lista de projeto e clique em &quot;Salvar&quot;. </li><li> Selecione &quot;Detection&quot;, &quot;Rastreio&quot;, e &quot;Pós-Processamento&quot;. Uma vez que essas seleções foram feitas, o lado direito da caixa de diálogo vai se tornar configurável. Configure cada opção. <ol><li> Estes parâmetros são usados ​​para ligar os cometas detectados em faixas MT. Detalhes para a escolha desses parâmetros de controle para monitoramento são incluídos em páginas 9-10 do Relatório Técnico PDF que acompanha o download do pacote de software; Leia o relatório cuidadosamente se forem encontrados problemas. Para efeitos de acompanhamento de cometas EB1-GFP em Xenoplaevis nos cones de crescimento, use as seguintes configurações de Rastreamento: Pesquisar Raio Gama (pixels) 5-12, mínima Sub-Track Comprimento (frames) 3; Max Gap Comprimento (quadros) 8; Max Fator Encolhimento 0,8, ângulo de Max Atacante 50, ângulo de Max para trás 10, Flutuação Radius 2.5. Estas configurações são mostradas na Figura 1. </li></ol> Nota: Max Fator Encolhimento é ajustado para reduzir o número de &quot;atrasados&quot; lacunas detectadas, como &quot;lacunas para trás&quot; não são úteis para analisar no contexto dos cones de crescimento, dadas as condições de superlotação e erros prováveis ​​em ligações de pista. Além disso, tanto ângulo Max Atacante, bem como Flutuação Radius são definidas relativamente alto, como MTs cone de crescimento apresentam pequenas translocações freqüentes, além de crescimentos e retrações, e aumentando a essas configurações de controle permite a este aumento de movimento durante a etapa de ligação. <ol><li> Preencha os pós-processamento configurações, dependendo das configurações específicas de aquisição de imagem desejados. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Uma vez que as configurações tenham sido configuradas, clique em &quot;Iniciar&quot;. O software será executado conforme as configurações foram selecionados. Isso pode levar minutos ou horas, dependendo do número de projetos selecionados e seus tamanhos. A janela de comando exibe o tempo restante estimado para cada função. Quando a etapa plusTipGetTracks estiver concluída, a janela de comando exibirá &quot;Concluído!&quot; Nota: Uma longa lista de parâmetros específicos da dinâmica MT agora foram calculados por este software (ver referência 4 para mais detalhes), mas para a análise da dinâmica de MT em cones de crescimento, os parâmetros mais úteis a serem examinados são MT velocidade pista crescimento (em microns / minuto), tempo de vida pista crescimento (em segundos) e duração da faixa de crescimento (em microns). </li></ol> 3. plusTipSeeTracks Nota: Agora que as faixas de microtúbulos têm sido definidos, a função &quot;plustipSeeTracks&quot; é utilizado para o controle de visualização 4. Esta funçãopode fornecer várias saídas para visualização, incluindo a dinâmica MT espaciais mapas e filmes de velocidade, mas aqui, o foco é apenas sobre o uso de &quot;Filmes faixa&quot; para exibir faixas MT sobrepostas nas imagens cone de crescimento. Enquanto plusTipGetTracks pode analisar vários filmes de uma vez, plusTipSeeTracks só pode analisar um filme de cada vez. <ol><li> Digite &quot;plusTipSeeTracks&quot; na janela de comando. </li><li> Após o carregamento da caixa de diálogo, clique em &quot;Select Project&quot;. Selecione o diretório pai que contém o projeto de visualizar e clique em &quot;Selecionar Pasta&quot;. Uma nova janela será exibida: &quot;Selecione o projeto que deseja visualizar&quot;. Escolha o arquivo para visualizar e clique em &quot;OK&quot;. </li><li> Em seguida, clique em &quot;Select ROI Saved&quot;. Navegue para a mesma pasta roi_X que o selecionado na etapa anterior e selecione o arquivo com o nome &quot;roiYX&quot;. </li><li> Clique em &quot;Selecionar Output Directory&quot; para designar waqui MATLAB irá salvar os arquivos de visualização de pista. Nota: Recomenda-se utilizar a mesma pasta que contém o resto dos dados. </li><li> Selecione &quot;Make Movie Track&quot; e aparecerá uma tela mostrando todas as faixas plusTipGetTracks calculadas a partir dos cometas PONTA +. Esta etapa salva a série temporal rastreado em um formato de filme, no arquivo &quot;allTracks_X_X_X&quot;. Há uma opção para salvar o filme como um AVI, caso contrário, o formato padrão é como um arquivo Quicktime.mov. </li></ol> 4. plusTipGroupAnalysis Nota: Esta última função é usada para criar grupos de filmes para análise e comparação dos seus parâmetros de trilha MT. <ol><li> Digite &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; na janela de comando. Para selecionar manualmente os grupos de comparar, primeiro de-selecionar &quot;grupo Auto de hierarquia&quot;. Em seguida, clique em &quot;Selecionar projetos&quot;. Navegue até o diretório pai contendo todas as pastas roi_Xanalisar. </li><li> Uma tela listSelectGUI aparecerá. Selecione todos os projectos a incluir nos grupos a partir do lado esquerdo da tela e movê-los para o lado direito da tela. Clique em &quot;OK&quot;. Escolha um local para salvar a lista de projeto e clique em &quot;Salvar&quot;. </li><li> Uma janela irá aparecer: &quot;Por favor, selecione primeiro grupo da lista&quot;. Clique em &quot;OK&quot;. A janela listSelectGUI irá exibir novamente. Desta vez, selecione apenas os arquivos que correspondem ao primeiro grupo que devem ser reunidos. Clique em &quot;OK&quot;. </li><li> Em seguida, digite o nome do grupo e clique em &quot;OK&quot;. Uma janela irá aparecer: &quot;Selecione um outro grupo?&quot; Resposta de acordo e continuar selecionando grupos. Uma janela irá aparecer: &quot;Selecione um local para salvar a sua lista de grupos&quot;. Navegue até o local e clique em &quot;Salvar&quot;. </li><li> Clique em &quot;Escolher saída&quot; para escolher o local onde as pastas de saída seráarmazenado. </li><li> Selecione o tipo de análise de grupo para conduzir - se as faixas de MT devem ser combinadas para cada grupo ou por análise de células deve ser realizada. Os testes estatísticos recomendados já são designados. Para incluir todas as faixas na análise, de-selecione &quot;Remover faixas no início / fim do filme&quot;. Caso contrário, ter esta caixa selecionada remove quaisquer faixas de crescimento MT que estão em processo de como o filme começa ou termina. </li><li> Após a seleção Grupo de Análise é feita, selecione &quot;Compare grupos&quot;. </li></ol>

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	<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li><li>Purro, S. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

PlusTipTracker fornece uma interface gráfica de usuário simples para detectar de forma rápida e automaticamente cometas EB1-GFP praticamente todos visíveis em um cone ou crescimento celular, ligar os cometas em faixas, e calcular os parâmetros MT. Outras publicações relataram o desenho de tipos similares de software (por exemplo, Marx et al. Análise quantitativa utilizou também da dinâmica EB1 marcados em cones de crescimento 18). Mas, este software parece ser único em sua facilidade de acesso, uma vez que pode ser baixado gratuitamente a partir do site do Laboratório de Danuser, que é especializada na concepção de código aberto, turn-key software útil para a comunidade biológica celular. Embora o acesso ao MATLAB é necessária, a pessoa não precisa estar totalmente familiarizados com o programa de computador para utilizar o software. No entanto, existem alguns pontos que precisam ser abordadas para facilidade de uso. Primeiro de tudo, um dos problemas mais comuns que surgem quando se usa o software e aplicação informática para o primeiro tempo é relacionada com o caminho de arquivo. Se este erro ocorrer (com o aviso de &quot;Erro usando cd -. Argumento deve conter uma seqüência de erros em formatPath ...&quot;), então a solução mais fácil é para garantir que o software plusTipTracker, bem como o diretório com todas as &quot;imagens&quot; subdiretórios, são ambos da mesma &quot;MATLAB&quot; caminho do arquivo. É melhor se estes não estão no diretório &quot;Arquivos de Programas&quot;, como tem sido sugerido que o espaço no nome &quot;Arquivos de Programas&quot; pode ser um problema. Relacionado a isso, é importante notar que plusTipTracker salva o caminho do arquivo que foi utilizado quando o primeiro calcular a análise plusTipGetTracks e, como tal, este caminho do arquivo deve ser mantida quando esses dados são acessados ​​e utilizados por outro componente do software. As funções plusTipGetTracks, plusTipSeeTracks e plusTipGroupAnalysis todos usam o caminho do arquivo salvo original e, portanto, tentando ctodas essas funções para um determinado filme, depois de mover os arquivos para outro caminho, irá resultar em um erro. Outro erro comum que ocorra durante a análise é quando Rastreamento falhar durante a etapa plusTipGetTracks. Isso ocorrerá se um quadro na série de imagens não contém cometas detectáveis. Isto irá parar completamente a análise e não de pós-processamento irá ocorrer. Uma solução simples para contornar este problema e permitir a análise a seguir, é a criação de um cometa simulada na imagem em uma área onde ele não será incorretamente ligada a quaisquer pistas reais. Isto não terá impacto sobre os parâmetros da faixa finais, como qualquer cometa que não existe em uma quantidade mínima de estruturas consecutivas irá ser filtrados da análise final. Um outro problema que pode surgir é a detecção de cometa com defeito. Isso geralmente pode ser corrigido através da melhoria da selecção região de interesse na etapa 2.3. É importante chamar a região de interesse de perto ao redor da célula e não chamar a awregião IDER do que o necessário. O software usa essa área para determinar o plano de fundo usado durante a detecção de cometa. Se a detecção de cometa ainda é sub-óptima com as configurações padrão, as configurações podem ser ajustadas na janela plusTipGetTracks (durante o passo 2.7). Depois de uma análise, é fundamental para validar as ligações trilha automatizadas por olho, usando plusTipSeeTracks. Configurações de rastreamento podem precisar ser modificados para reduzir o número de falsos vínculos positivos ou falsos negativos cometa. Consulte a documentação plusTipTracker 4 original, bem como o Relatório Técnico PDF que acompanha o download do software para obter mais informações sobre como otimizar as configurações. O desempenho deste software em relação a mão-de monitoramento foi previamente testado em células não-neuronais 4. Os cones de crescimento constitui um desafio ligeiramente diferente, no entanto, como o crescimento de cone MT exibem translocações frequentes em todas as direcções 17, em adição ao crescimento MT e encolhimento. Uma issue que não foi encontrado para ser uma grande preocupação é se as MTs hermeticamente embalados em cones de crescimento apresentam dificuldades de rastreamento 17. Como apenas um subconjunto de MTs estão em fase de crescimento, com EB1-GFP nas extremidades, resolver e acompanhar cometas EB1-GFP individuais não era problemático. No entanto, deve notar-se que estes estudos anteriores utilizados Xenopus laevis cones de crescimento, os quais foram especificamente escolhidas devido ao seu tamanho relativamente grande do cone de crescimento (cerca de 10 micrómetros), em comparação com outros cones de crescimento de vertebrados. Usando esses cones de crescimento maiores permite a análise cometa EB1-GFP mais precisa. Para avaliar a utilidade e precisão deste software para a análise de faixas EB1-GFP em Xenopus laevis cones de crescimento, comparou a experiência de usar plusTipTracker com mão-de rastreamento de uma série de dados idênticos (dados não mostrados). O tempo que levou para a mão-de pista cometas EB1-GFP em um cone de crescimento médio de 39 faixas de cometas (em 1 minuto seri time-lapsees, com 2 segundos entre cada quadro) foi mais de duas horas, em relação a dois minutos, com o software. Os parâmetros obtidos com os dois métodos foram semelhantes para velocidade de crescimento MT (7.4 microns por minuto para automático de controle contra 7,0 microns por minuto para mão-tracking). No entanto, para a vida de crescimento e comprimento, análise de software leva às pistas significativamente mais curtos (por cerca de metade do tempo e distância). Isto é devido ao crescimento faixas sendo dividido pelo software se um cometa entra e sai de foco ao longo do tempo. Enquanto o olho humano pode identificar facilmente que é o mesmo cometa, o software não faz. Esta questão não é problemática, porém, se a pessoa está usando o software, a fim de comparar várias condições. Uma vez que os parâmetros de rastreamento idênticos são usados ​​para todas as condições (e partindo do princípio de que os cometas entrar e sair do foco com a mesma taxa em várias condições), então os tempos de vida relativos e comprimentos são ainda bastante úteis para medições de comparação. Como para análise automatizada de erro de ratoes, estes dependem muito da qualidade das imagens. Em altas filmes sinal-ruído, o percentual de faixas misjoined ou incorretas é de um dígito. Mesmo em filmes de baixa qualidade (onde cometas individuais ainda são claramente visíveis a olho nu, mas o ruído de fundo for maior), as taxas de erro ainda são baixos o suficiente (5-15%) que o tempo significativo salvo usando o software vale a pena o custos em erro. Este é especialmente o caso quando da análise de centenas de cones de crescimento (60-8 cones de crescimento por estado foram analisadas em um estudo anterior 17). É importante notar que este programa foi concebido para detectar + cometas TIP que apenas se ligam ao crescimento extremidades MT, tal como EB1-GFP. Tendo em conta que a articulação e acompanhamento algoritmos esperar que os cometas só existem em polimerização de MTs, usando este software para analisar a dinâmica de um + TIP marcadas com fluorescência que se liga ao encolhimento MT termina além de extremidades em crescimento levará a informações incorretassobre as velocidades de crescimento MT calculados. Uma das características únicas deste software em relação a outros softwares de partícula-tracking único, é que ele leva em conta conhecido comportamentos MT para calcular não apenas parâmetros de polimerização, mas também parâmetros de contração. Ele faz isso através da ligação de um cometa EB1-GFP que desapareceu com um que tenha recém-formado logo atrás na mesma trajetória (isso é chamado de backgap ou faixa bgap). Embora este algoritmo funciona bem para alguns tipos de células, tais como células HeLa 4, que é uma característica menos eficaz quando se analisa dinâmica MT em cones de crescimento. Isto porque MT faixas freqüentemente seguem um ao outro ao longo das mesmas localizações exactas em cones de crescimento (muitas vezes seguintes, juntamente feixes F-actina), e por isso geralmente é impossível dizer se bgap ligações estão corretas. Por esta razão, não é recomendado utilizar as saídas de dados bgap em cones de crescimento. Apesar dessas ressalvas menores e questõesque deve ser levado em consideração quando se utiliza plusTipTracker (e mais qualquer programa de tratamento automático de imagens), este software pode ser uma ferramenta muito útil para a análise de milhares de cometas EB1-GFP em um período relativamente curto de tempo.

O objetivo deste método é a obtenção de informações quantitativas sobre microtúbulos (MT) mais-final rastreamento dinâmica em cones de crescimento vivendo proteína (+ TIP). MT + dicas são um grupo de proteínas que localizam as mais-ends de MTs 9,10. Eles executam uma série de funções para regular os parâmetros de MT instabilidade dinâmica 11, incluindo taxa de polimerização, catástrofe, e de resgate. Um método bem utilizado para analisar dinâmica MT é para controlar o comportamento da EB1 PONTA +, que se liga especificamente a crescimento mais MT-termina 1,12. EB1 é conhecido por recrutar várias outras proteínas para o crescimento de MT plus-termina 13,14, e, recentemente, foi estabelecida como um fator de maturação MT 15, promovendo o crescimento MT e frequência catástrofe 15,16. Muitos estudos de dinâmica de MT em cones de crescimento têm utilizado métodos de mão-de monitoramento para medir as mudanças na dinâmica EB1-GFP ao longo do tempo 1-3, como EB1 localizatipara além de MT-extremidades pode ser utilizado como um marcador para a polimerização de MT. Um dos principais benefícios para a análise cometas EB1-GFP como um proxy para o crescimento MT é que a dinâmica de MT pode ser medida, mesmo em regiões de sobreposição MT significativo. Enquanto o método de cometas EB1-GFP-tracking mão contribuiu positivamente em MT comportamentos 1-3, é demorado e pode ser tendenciosa. Além disso, como o crescimento anormal comportamentos cone são provavelmente o resultado de mudanças de hora em dinâmica do citoesqueleto, analisando apenas um pequeno subconjunto de MTs (geralmente necessário quando a mão-tracking) pode perder informações importantes. Assim, podemos medir parâmetros de dinâmica MT globais usando o pacote de software, plusTipTracker 4, após a aquisição de alta resolução, imagens ao vivo de EB1 com etiquetas em cultura cones de crescimento embrionárias 5. Este software, desenvolvido no Laboratório de Danuser, tem sido usado em vários estudos que caracterizam a dinâmica MT em vários tipos de células 6-8. É um open-source, noser-friendly, pacote baseado em MATLAB, que inclui detecção automática, rastreamento, visualização e análise de filmes de + TIPs fluorescente marcado. Uma longa lista de parâmetros específicos da dinâmica de MT são calculados por este software (ver referência 4 para mais detalhes), mas para a análise da dinâmica de MT em cones de crescimento, os parâmetros mais úteis são MT velocidade pista crescimento (em microns / minuto), a trilha de crescimento vida (em segundos) e duração da faixa de crescimento (em microns). O software pode ser baixado diretamente do site da Danuser Lab (em &quot;Software&quot;). Enquanto o Lab Danuser atualmente suporta uma interface mais recente para + análise de rastreamento TIP, que está incorporado em um pacote de software chamado u-track 2.0, o software original, autônomo continuará disponível. Os algoritmos subjacentes entre os dois programas são os mesmos (pelo menos a partir de 2014), com apenas uma diferença de interface e análise de resultados. Para o usuário iniciante com pouca MATLAB e / ou computacional experi análisecia, plusTipTracker tem características mais user-friendly, incluindo saídas automatizadas de parâmetros estatísticos. Aqui, descrevemos os passos para a análise de imagens da dinâmica EB1-GFP em cultura cones de crescimento Xenopus laevis. Este protocolo foi utilizado em um artigo recente que examina MT dinâmica 17. Veja também Lowery et al. 2.012 5 para instruções detalhadas sobre cones de crescimento cultura expressando EB1-GFP. Embora este artigo focado principalmente na análise dinâmica EB1-GFP em cones de crescimento, o mesmo protocolo pode ser utilizado para outros tipos de células 17. Para todos os tipos de células, o intervalo de tempo entre os quadros deverão ser entre 0,5-2 seg para o rastreamento + TIP óptima. Um intervalo de tempo de até 4 segundos entre os quadros é possível, mas este aumento do tempo de intervalo resulta em erros de rastreio adicionais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">plusTipTracker software</td>
			<td style="width:116px;">Danuser Lab</td>
			<td style="width:345px;"><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td>
			<td style="width:172px;">This software may be hosted by another website in the future.&#160; If the listed site does not exist, search &#34;Danuser Lab Software&#34; on a web search engine to find the site.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Matlab software</td>
			<td style="width:116px;">Mathworks</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Microtúbulos (MT), além de rastreamento de-finais proteínas (+ TIPs) localizar às crescentes mais-extremidades de MTs e regular MT dinâmica 1,2. Uma das dicas mais conhecidos e amplamente utilizados + para analisar a dinâmica de MT é a de Ligação End proteína, EB1, que vincula todos os crescentes MT plus-fins, e, portanto, é um marcador de MT polimerização 1. Muitos estudos de comportamento EB1 dentro cones de crescimento usaram demorado e assistidas por computador, métodos de mão-de rastreamento tendenciosas para analisar indivíduo MTs 1-3. Nossa abordagem é quantificar os parâmetros globais da dinâmica MT utilizando o pacote de software, plusTipTracker 4, após a aquisição de alta resolução, imagens ao vivo de EB1 com etiquetas em cultura cones de crescimento embrionárias 5. Este software é um open-source, o pacote user-friendly baseada em MATLAB que combina detecção automática, rastreamento, visualização e análise de filmes de + TIPs fluorescente marcado. Aqui, apresentamos o protocolo para o uso plusTipTracker para a análise dos cometas PONTA + fluorescente marcado na cultura cones de crescimento Xenopus laevis. No entanto, este software também pode ser utilizado para caracterizar a dinâmica MT em vários tipos de células 6-8.

Usando este software, conforme descrito aqui irá fornecer vários arquivos de informações que quantificam + dinâmica TIP em células vivas. Os plusTipGetTracks função identifica as faixas (usando as configurações de exemplo mostrado na Figura 1) e, em seguida, fornece parâmetros para as faixas PONTA +. Para visualizar a informação de que o software tenha obtido, vá para o diretório roi_X que foi criado no passo 2.2. A pasta &quot;façanha&quot; contém &quot;overlayImages&quot;, que é uma série de imagens que mostram os cometas detectados. Examinando essas imagens utilizando o software de análise pode demonstrar a precisão da detecção de cometa. A pasta &quot;meta&quot; também contém informações detalhadas sobre as estatísticas de cometas + TIP, inclusive o arquivo &quot;projData&quot;, bem como o arquivo &quot;Estatísticas&quot;. Para visualizar o arquivo &quot;Estatísticas&quot;, arrastá-lo para uma planilha aberta de um aplicativo de planilha. Este arquivo contém a calculard parâmetros microtúbulos para cada filme (Figura 2). Como mencionado acima, uma longa lista de parâmetros específicos da dinâmica de MT são calculados por este software (ver referência 4 para mais detalhes), incluindo a velocidade de pista crescimento MT (em microns / minuto), tempo de vida pista crescimento (em segundos), eo crescimento duração da faixa (em microns). Os plusTipSeeTracks função salva um filme dos cometas controladas, que podem ser revistas, abrindo o arquivo &quot;allTracks_X_X_X&quot; (Figura 3). O plusTipGroupAnalysis função combina múltiplos conjuntos de dados individuais em grupos e cria pastas (chamado Percell ou pooledData, dependendo da análise é selecionado) que contêm dados de parâmetro do grupo, incluindo histogramas, gráficos e planilhas para comparar grupos e parâmetros individuais dentro de cada grupo (Figura 4). <img alt="Figura 1" fo:content-width = src &quot;6in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 52138 / 52138fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figura configurações 1. PlusTipGetTracks utilizados para cometas EB1-GFP em Xenopus laevis cones de crescimento. Esta figura mostra as configurações específicas para &quot;detecção&quot;, &quot;Rastreio&quot;, e &quot;Pós-Processamento&quot; passos que podem ser utilizados para a análise da EB1-GFP cometas em Xenopus laevis cones de crescimento. A ferramenta plusTipParamSweepGUI, disponível no pacote plusTipTracker, podem ser utilizados para otimizar as configurações de rastreamento de outros organismos modelo e / ou tipos de células 7. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52138/52138fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 tela de parâmetros MT obtidos através da análise plusTipGetTracks. A pasta &quot;meta&quot;, criado por plusTipGetTracks execução, contém informações relativas ao TIP + cEstatísticas Omet. Ao arrastar o arquivo &quot;Estatísticas&quot; em um aplicativo de planilha, os parâmetros de dinâmica dos microtúbulos podem ser examinados. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52138/52138fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3 tela de MT filme pista obtida a partir da análise plusTipSeeTracks. PlusTipSeeTracks não só permite a visualização de microtúbulos pista, mas também serve como uma ferramenta de verificação, permitindo que o usuário visualize a validade dos dados obtidos a partir de plusTipGetTracks. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52138/52138fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 tela de parâmetros obtidos a partir MT plusTipGroupAnalysis. PlusTipGroupAnalysis oferece ao usuário um método simples para a comparação de grupos e parâmetros individuais between dentro de cada grupo, combinando vários conjuntos de dados individual e gerando uma estatística, que pode ser examinado em um aplicativo de planilha.

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Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

A, pacote de código aberto baseado em software MATLAB, plusTipTracker, pode ser usado para análise de séries de imagem + TIPs marcados com fluorescência para quantificar dinâmica dos microtúbulos.

Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cones de Crescimento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

using-plustiptracker-software-to-measure-microtubule-dynamics-xenopus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

10.3K visualizações.  Boston College.  A, pacote de código aberto baseado em software MATLAB, plusTipTracker, pode ser usado para análise de séries de imagem + TIPs marcados com fluorescência para quantificar dinâmica dos microtúbulos. 

Vídeo: Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Incorporação de plástico e secção de embriões Xenopus laevis

Biologia

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Obtenção de ovos de Xenopus laevis fêmeas

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparação e fracionamento de Xenopus laevis Egg Extractos

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinação tecido Usando o Transplante Cap Animal (ACT) em Ensaio Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Produção de<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrai identificar RNAs associada aos microtúbulos

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Transplantes faciais em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Os embriões

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissecção<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crista neural para<em&gt; In vitro</em&gt; Cultura Explant ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplante

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis como um modelo para identificar Tradução Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...