Name: isolation, cryopreservation and culture of human amnion epithelial cells for clinical applications
Uploaded: 2014-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications at JoVE.com

The authors acknowledge financial support from the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

הערה: Placentae יש לאסוף מהריונות בריאים סינגלטון, עם העדפה לניתוחים קיסריים אלקטיביים טווח. בכתב, הסכמה מדעת יש לתת לאיסוף השליה שלהם. ועדת האתיקה במחקר האנושית הרלוונטית שלך צריך אישור כל האיסוף ושימוש ברקמות אנושיות. 1. בידוד של תאי אפיתל amnion <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השליה על גבי משטח סטרילי בתוך ארון בטיחות ביולוגי ברמה השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הנקס סטרילי תמיסת מלח מאוזן (HBSS), לשטוף כמה שיותר דם ככל האפשר ממשטח השליה והקרומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השליה ממוקמת עם חבל הטבור כלפי מעלה, באופן מכאני להפריד את הקצה החיצוני של קרומי amnion וסיסיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שנפרד, להפשיט ידני קרום amnion מן הקרום סיסית השליה, עובד מסביב לקצה של הקרום, לכיוון חבל הטבור. הערה: careful כדי להסיר כל חתיכות של זיהום קרום סיסית מamnion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת המספריים סטרילי, לחתוך את קרום amnion כ -2 סנטימטרים מהבסיס של חבל הטבור ומניחים במכל אטום 500 מיליליטר המכיל 250 מיליליטר HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ביסודיות על ידי טלטול בקבוק האטומה המכיל קרום amnion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את קרום amnion מהמכלים המיוחד לאיסוף באמצעות מלקחיים סטרילית, והמקום לתוך צלחת פטרי 15 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את קרום amnion לחתיכות כ -5 סנטימטרים (כאשר החזיקו במאונך עם מלקחיים), השלכת חלקים דמו או קרועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום במכל אטום 500 מ&quot;ל ולשטוף עם 250 מיליליטר HBSS כ 3-5 פעמים או עד שקרום amnion הופך שקוף ללא דם מזהם. הערה: כל דם נוכחי עלולים להפחית את היעילות של האנזימטית לעכל פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל החתיכות של קרום amnion לתוך מיכל המכיל 50 מיליליטר של האנזימטית לעכל פתרון, מקפידלמזער שריד של HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חתיכות amnion בהאנזימטית לעכל פתרון באמבט מים או בחדר חם על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עם תסיסה עדינה כדי להסיר כל דם שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חתיכות קרום amnion מהאנזימטית לעכל פתרון ומקום במכל סטרילי חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של האנזימטית טרי 100 מיליליטר לעכל פתרון לקרום amnion ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות באמבט מים או בחדר חם עם (עיכול ראשון) טלטול עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חתיכות קרום amnion ומקום לטיפול לקיחת מיכל חדש כדי לאפשר האנזימטית לעכל פתרון לניקוז מכל פיסת הקרום. הערה: זו יכולה להיות מושגת על ידי גרירת חתיכות amnion לאורך השפה הפנימית של המכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף להאנזימטית טרי 100 מיליליטר לעכל פתרון לחתיכות קרום amnion דגירה 60 דקות באמבט מים או בחדר חם על 37 מעלות צלזיוס עם (עיכול שני) טלטול עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את suspensi התאמהשלב 1.14 דרך מסנן 70 מיקרומטר ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר ולסלק supernatant, וresuspend התא גלולה ב 4 מיליליטר HBSS המכיל 1 מ&quot;ג / מעכב אנזים מבוסס סויה מיליליטר. בעדינות פיפטה שוב ושוב עם פיפטה 1 מיליליטר לקבל השעיה תא בודדת. הערה: בשלב זה ניתן להשאיר תאים על קרח עד תאים מהתקציר השני הם באותו השלב של עיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חתיכות קרום amnion ומקום לטיפול לקיחת מיכל חדש כדי לאפשר האנזימטית לעכל פתרון לניקוז מכל פיסת הקרום. הערה: זו יכולה להיות מושגת על ידי גרירת חתיכות amnion לאורך השפה הפנימית של המכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את ההשעיה התא משלב 1.18 דרך מסנן 70 מיקרומטר ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר ולסלק supernatant, וresuspend התא גלולה ב 4 מיליליטר HBSS המכיל 1 מ&quot;ג / מעכב אנזים מבוסס סויה מיליליטר. בעדינות פיפטה שוב ושוב עם p מיליליטר 1ipette לקבל השעיה תא בודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת תאים משני המעכלים או לחלופין לשמור מעכלים תא מופרד עד לאחר ספירת תאים. הערה: זה מונע ערבוב של תאי כדאיות פוטנציאל נמוכים עם תאי כדאיות גבוהים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת HBSS לנפח סופי של 10-20 מ&quot;ל ולבצע ספירת תאים באמצעות trypan הכחול כדי למדוד את הכדאיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את הפנוטיפ תאי אפיתל על ידי cytometry זרימה. איפור קוקטיילים נוגדן מתאימים באמצעות אנטי EpCAM-PE (1: 2 דילול) אנטי-CD90-PeCy5 (1: 250) ואנטי-CD105-APC (1: 100) בHBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend משנה של תאים מאחד או שניהם מעכלים בקוקטייל של הנוגדנים בריכוז של 25 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לcytometry זרימה, כתם 1 x 10 6 תאים עם קוקטיילים נוגדן המכילים פקדי isotype (למשל. שליטה PE אלוטיפ 1 IgG + אנטי CD90-PeCy5 + אנטי-CD105-APC). שמור ~ 1 x 10 6 תאים בלא כתם לcytometer זרימת הגדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים בנוגדןקוקטיילים על 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאי 3x בHBSS וגלול ב5-10,000,000 תאים לכל מיליליטר לזרימה cytometry. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע cytometry זרימה ותוצאות פתק. טוהר בודד התאים (אחוז EpCAM החיובית וCD90 / CD105 תאים שליליים) צפוי להיות 90-95% ו- &lt;1% בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בצד מספר מתאים של תאים לבדיקת קריטריוני בקרת איכות או שחרור מתאימים כפי שנקבע על ידי יישום סופי. הערה: זה יכול לכלול מחלה / הקרנה נגיפית, או בטיחות אחרת או קריטריונים ביולוגיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאים הנותרים, לעקוב אחר פרוטוקול ההקפאה, או לחלופין להציב ישירות לתוך התרבות (ישירה לצעד תרבות 3.6). </li></ol> 2. Cryopreservation של hAECs <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע מספר תא ואת כדאיות באמצעות זרימת cytometry נתונים או ספירה ידנית עם הדרת trypan כחולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בXG 700 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא גלולשל בין 1-10 מיליון תאים למ&quot;ל בתקשורת הקפאה ללא מוצר מן החי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה נפח מתאים של תאים לתוך צלוחיות הקפאה-טבעתי O ומקום לתוך מנגנון הקפאת קצב מבוקר שבי הקירור מתרחש בכ 1 ° C / min עד -80 ° C מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הבקבוקונים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. </li></ol> 3. הפשרה ותרבות של Cyropreserved hAECs <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוקוני הקפאה מחנקן נוזלי ומניח על קרח. הערה: להעברה בלבד - להמשיך במהירות לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את ההקפאה במהירות הבקבוקונים ב 37 מעלות צלזיוס עד שרק חתיכה קטנה (~ 5 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ) של הקרח נשאר. הערה: חשוב שפתרון התא אינו לחמם כדי להפחית את ההשפעות הרעילות של DMSO בתקשורת ההקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תקשורת הקפאה של פי 10 ב( ~ 4 ° C) סרום ללא מדיה קרה, הוסיף טיפה חכמה בגודל מתאיםצינור ד או מיכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בXG 700 במשך 5 דקות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend במדיום סרום ללא, לריכוז של כ 1 מיליון תאים לכל מיליליטר. לקבוע מספר תא ואת כדאיות באמצעות ספירה אוטומטית או ידנית עם הדרת trypan כחולה. לאחר הפשרה-כדאיות צפויה תהיה 5-10% פחות מכדאיות מראש הקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צלחת על כלי פלסטיק סטנדרטיים תא שטופל תרבות, או לחלופין להשתמש בסוג אני קולגן למשטחי תרבות מעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לציפוי קולגן אני סוג לעקוב אחר הפרוטוקול להלן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חומצת סוג מסיס אני קולגן משליית אדם (קולגן 15 מ&quot;ג עם 25 מיליליטר מים deionized ו 50 חומצה אצטית קרחונית μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות כוס עם Parafilm ומערבבים באופן מתון על 37 מעלות צלזיוס עד גדילי קולגן הם מומסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון קולגן סינון סטרילי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מניות 01:10 קולגן המסוננים במים ללא יונים. המניה מדוללת זה conce עובדפתרון ntration למשטחי פלסטיק ציפוי וקרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסטיק מעיל קולגן, משטחי זכוכית וקרום לשעה 2 ב RT על 37 מעלות צלזיוס, או O / N ב 2-8 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הנוזלים עודפים מהמשטח המצופה, ולאפשר לו להתייבש O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים סטריליים תרבות רקמות כיתה או HBSS לפני החדרת תאים ובינוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hAECs הצלחת בצפיפות של 25,000 תאים / 2 סנטימטר במדיום סרום ללא, ולאפשר התקשרות להתרחש עבור 72-96 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התקשרות, לשנות תקשורת על ידי aspirating בזהירות והחלפה עם נפח מתאים של מדיום סרום ללא כל 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מעבר באמצעות הפרוטוקול להלן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבית תאי תקשורת לשאוב ולשטוף עם נפח 1x של HBSS סטרילי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח 1x של האנזימטית לעכל פתרון דגירה של 5-15 דקות, או עד שתאים הם נצפו ניתוק ממשטח תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף האנזימטית לעכל תמיסה המכילה תאים, הבטחת ceLLS מנותקים ממשטח תרבית תאים על ידי pipetting האנזימטית שוב ושוב לעכל פתרון כנגד משטח תרבית תאים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בXG 700 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה בנפח מתאים של HBSS המכיל 1 מ&quot;ג / מעכב אנזים מבוסס סויה מיליליטר. בעדינות פיפטה שוב ושוב עם פיפטה 1ml לקבל השעיה תא בודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני סרום ללא לריכוז של כ 1 מיליון תאים / מיליליטר. לקבוע מספר תא ואת כדאיות באמצעות ספירה אוטומטית או ידנית עם הדרת trypan כחולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hAECs הצלחת בצפיפות של 25,000 תאים / 2 סנטימטר במדיום סרום ללא, ולהמשיך בשיטות סטנדרטי culturing. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G., Appasani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stem Cells and Regenerative Medicine. 1, 243-264 (2011).</li><li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+fluid+and+placental+membranes:+unexpected+sources+of+highly+multipotent+cells.">Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells.</a> Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).</li><li>Parolini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+isolation+and+characterization+of+cells+from+human+term+placenta:+outcome+of+the+first+international+Workshop+on+Placenta+Derived+Stem+Cells.">Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells.</a> Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).</li><li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preterm+human+amnion+epithelial+cells+have+limited+reparative+potential.">Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential.</a> Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).</li><li>Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+pluripotent+stem+cell+line+derived+from+human+amniotic+membranes+and+initiation+of+germ+layers+in+vitro.">Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro.</a> Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).</li><li>Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+amniotic+epithelial+stem+cells.">Isolation of amniotic epithelial stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use.">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).</li><li>Ilancheran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+derived+from+human+fetal+membranes+display+multilineage+differentiation+potential.">Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential.</a> Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).</li><li>Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+amnion+epithelium+into+skin+and+hair+follicles.">Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles.</a> Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).</li><li>Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+characteristics+of+amniotic+epithelial+cells.">Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells.</a> Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).</li><li>Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+ocular+surface+with+heterologous+limbal+epithelium+and+amniotic+membrane+in+a+rabbit+model.">Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model.</a> Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).</li><li>Sankar, V., Muthusamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+in+spinal+cord+injury+repair+research.">Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research.</a> Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).</li><li>Yuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+human+amniotic+epithelial+cells+express+connexin+26+and+Na-K-adenosine+triphosphatase+in+the+inner+ear.">Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear.</a> Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppressive+factors+secreted+by+human+amniotic+epithelial+cells.">Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).</li><li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cells+ameliorate+behavioral+dysfunction+and+reduce+infarct+size+in+the+rat+middle+cerebral+artery+occlusion+model.">Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model.</a> Shock. 29 (5), 603-611 (2008).</li><li>Venkatachalam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+neurotrophic+factor+secreted+by+amniotic+epithelial+cells.">Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells.</a> Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).</li><li>Manuelpillai, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+induces+markers+of+alternative+macrophage+activation+and+reduces+established+hepatic+fibrosis.">Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis.</a> PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).</li><li>Wei, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion-isolated+cells+normalize+blood+glucose+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice.">Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+prevent+bleomycin-induced+lung+injury+and+preserve+lung+function.">Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function.</a> Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).</li><li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+induced+to+express+functional+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).</li><li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+do+not+abrogate+pulmonary+fibrosis+in+mice+with+impaired+macrophage+function.">Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function.</a> Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).</li><li>Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cells+as+a+candidate+therapy+for+acute+and+chronic+lung+injury.">Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury.</a> Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).</li><li>Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+mediate+lung+repair+by+directly+modulating+macrophage+recruitment+and+polarization.">Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization.</a> , (2013).</li><li>Litvinov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+adhesion+molecule+(Ep-CAM)+modulates+cell-cell+interactions+mediated+by+classic+cadherins.">Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).</li><li>Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+cell+adhesion+molecule+(Ep-CAM)+as+a+morphoregulatory+molecule+is+a+tool+in+surgical+pathology.">The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology.</a> The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).</li><li>Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+obtained+from+different+human+tissues.">Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues.</a> Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).</li><li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , 119-137 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ישנם מספר פרמטרים קריטיים שיכול להשפיע באופן משמעותי בהצלחתה של מתודולוגיה זו. אחסון של השליה או amnion עד 3 שעות לפני הבידוד של hAECs עשוי להיות רצוי למטרות לוגיסטיים או תזמון, אולם מומלץ שרקמת מעובד בהקדם האפשרי. אם רקמה היא להיות מאוחסנת, מומלץ כי אחסון להתבצע הבא לנתיחה ושטיפה של קרום amnion. ניתן לאחסן amnion באנטיביוטיקת HBSS סטרילית המכילה על 4 מעלות צלזיוס, אולם כדאיות תא יכולות יפחתו עם זמן אחסון ממושך. אנחנו, ואחרים מצאנו השתנות בתשואת תא ואת הכדאיות, וכדי למזער את ההשתנות זו מומלץ השליה שנאספות מלידות טווח בריאים, נמסרו רצוי בניתוח קיסרי. מצאנו כי הזיהום של קרום amnion עם תאי דם יגרום לעיכוב של פעילות אנזים וירידה בתשואת תא. לכןשלב קריטי בפרוטוקול הוא שטיפה יסודית של השליה וקרום amnion מומלץ. מומלץ רקמת amnion לשטוף עד להופעתה הלבנה / ברור, כדי למנוע עיכוב אנזים במורד הזרם. בידוד של אוכלוסייה הומוגנית יחסית של תאי האפיתל הוא חשוב לבדיקת שליטת אפיון ואיכות. אם תשואות נמוכות, יכולת קיום או זיהום של תשואת התא עם תאי mesenchymal מתרחש יש כמה שינויים שניתן לבצע לפתרון בעיות. אם תשואות תא נמוכות, סביר להניח כי פעילות האנזימטית הייתה עצורה בשל דם או זיהום בדם. זה יכול להיפתר בצעדים יסודיים יותר ונוספים שטיפה ו / או חתיכות amnion דמו או מזוהמות השלכת. יכול גם להיות מוגבר זמן דגירה אנזים, אבל זה יכול להיות מזיק לכדאיויות תא. בירידה בניתן להימנע כדאיות או זיהום עם תאי mesenchymal ידי הפחתת הזמן לעכל. עם זאת, thiים עשוי גם להקטין את התשואה הכוללת של תאים. פעמים שנעו בין 30 דקות לשעה 2 יכולות לשמש לפרוטוקול זה. בימים אלה צריכים להיות מותאמים לטוהר תא רצוי ותשואה בסך הכל / כדאיות. מגבלה אחת של שיטה זו היא כי תשואת תא הגדלת או כדאיות יכולה לבוא על החשבון שני. בנוסף, רכיבי סרום ללא כרגע לא יעילים כמו של שמירה על כדאיות תא בעקבות חשיפה לפעילות האנזימטית. תאים יכולים להיות cryopreserved ללא כל ירידה משמעותית בכדאיויות תא או הפסד של חילוף חומרים על ידי אחסון במערכת חנקן נוזלי בטמפרטורה מבוקרת. זה יכול לנוע בין מכשיר הקפאה מלא isopropanol פשוטה למערכת ממלכתית-of-the-אמנות הקפאת קצב מבוקרת. למיטב ידיעתנו, שיעור ההקפאה האופטימלי לhAECs במערכת זו עדיין לא נקבע, אך השיעור הסטנדרטי של 1 ° C תוצאות / min בתחזוקה המתאימה של כדאיות תא וחילוף חומרים שלאחר הפשרה. במהלך o ההפשרהf תאי cryopreserved, חשוב לשמור על זמן הפשרה למינימום כדי להפחית את החשיפה לתא DMSO. תאים עשויים לצרף ולהתרבות בקצב נמוך יותר בעקבות הקפאה והפשרה בהשוואה לתאי culturing מבודדים טרי. ליישום קליני זה עשוי להיות רצוי לתאי תרבות כדי להגדיל את המספר הסלולרי שלך או לאפיון במורד הזרם ו / או במניפולציה חוץ גופית. קוראים צריכים להבין כיצד הספציפי שלהם במניפולצית מבחנה עשוי לשנות את המסלולים רגולטוריים מעורבים ביישום הקליני של תאים אלה. חקרנו שמדיום תרבות חיה נטול מוצר כגון EpiLife היה מתאים לתחזוקה והרחבת hAECs. עם זאת, הוא נדרש כדי לייעל את ריכוזי גורם הגדילה להשיג שיעורי צמיחה מוגברות לסוג תא כזה. הנושא של דבקות תא במהלך התרבות באמצעות מטריצת קולגן ציפוי אנושית, מגביר את יעילות הציפוי. עם זאת, בעקבות דואר ממושךxposure לעיכול אנזימטי יעילות הציפוי תהיה תת-אופטימלית. לסיכום, פרוטוקול זה פותח כדי להקל על הבידוד והתרבות של תאים אנושיים amnion אפיתל (hAECs) באמצעות ריאגנטים ללא מוצר מן החי בהתאם לשיטות ייצור טובות הנוכחיות הנחיות (cGMP). יתרונה של שיטה זו בהשוואה לשיטות בידוד חלופיות, הוא שיכולים להיות מבודדים תאים אלה, המתאפיינים, cryopreserved ותרבותי ללא הסיכון של מסירת פתוגנים בעלי חיים מזיקים לבני אדם, תוך שמירה על תשואות מתאימות תא, viabilities ופוטנציאל צמיחה. לחוקרים עוברים ממחקרים בבעלי חיים פרה-קליניים לניסויים קליניים, מתודולוגיות אלה יאיצו מאוד אישור רגולטורים, להפחית סיכונים ולשפר את איכות אוכלוסיית התאים הטיפולית שלהם.

תאים המופקים ממקורות סביב הלידה, כגון השליה, שליה קרומים, חבל טבור ומי שפיר שמשכו את תשומת לב של חוקרים וקלינאים כמקור פוטנציאלי של תאים לרפואת רגנרטיבית 1,2. הסיבה לעניין זה היא כי סוגים אלה תא כל יש מידה מסוימת של גמישות ויכולת המערכת החיסונית 3, תכונות שהן יסוד ליישומים הטיפוליים הפוטנציאל שלהם. hAECs היא אוכלוסייה הטרוגנית אפיתל שניתן להפיק מקרום amnion טווח או מראש טווח 4, מתן מקור פוטנציאלי בשפע של חומר תאי משובי. התכונות שהופכות את hAECs מושך כטיפול תאי כוללות multipotency שלהם, immunogenicity הנמוך, ותכונות אנטי דלקתיות. hAECs כבר מצא להיות multipotent ביותר הן במבחנה in vivo, מסוגלים להבדיל לשושלות mesodermal (cardiomyocytes, myocytes, osteocytes, adipocytes), שושלות endodermal (תאי לבלב, תאים כבד, תאי ריאה) ושושלות ectodermal (שיער, עור, תאים עצביים והאסטרוציטים) 5-10. מרגיע, למרות hAECs multipotency שלהם אינו מופיע לשני גידולי טופס או לקדם התפתחות גידול in vivo. יתר על כן, hAECs גם חיסון חסוי, המבטא רמות נמוכות של II אנטיגנים המעמד אנושיים לויקוציטים (HLAs) 8. נכס זה צפוי עומד בבסיס היכולת שלהם כדי להתחמק מדחייה חיסונית לאחר השתלה אלוגנאית וxenogenic, כפי שהודגם במחקרים בקופים חיסוניים מוסמכים, ארנבות, שרקנים, חולדות, וחזירים 11-13. hAECs להציג המערכת החיסונית חזקה ונכסים לדיכוי המערכת החיסונית ובכך להציע יתרונות מעשיים משמעותיים עבור יישומים קליניים פוטנציאליים בטיפול מחלה אוטואימונית. הם האמינו hAECs להפעיל פונקציות המערכת החיסונית בשתי מערכות החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. בדואר של המנגנונים הציעו, הוא באמצעות ההפרשה של המערכת החיסונית גורמי 14. יישומים הנוכחיים של hAECs במודלים של בעלי החיים מחלה פרה-קליניים כוללים טיפול בשבץ מוחי, טרשת נפוצה, מחלת כבד, סוכרת ומחלות ריאה כרוניות ואקוטיות. חוקרים הראו עניין בשימוש hAECs לטיפול בדלקת מוח שבץ-פוסט בשל המאפיינים הייחודיים שלהם. יש ראיות לכך hAECs יכול לחצות את מחסום דם המוח שבו הם יכולים נקלטים, לשרוד עד 60 יום, להתמיין לתאי עצב, להקטין את הדלקת ולקדם את ההתחדשות של רקמות פגועות של מערכת עצבים מרכזיות במודלים של בעלי חיים של מחלות נוירולוגיות 15. hAECs מציע את היכולת לכוון ולהפוך מסלולי פתולוגי מרובים שתורמים להתפתחות וההתקדמות של טרשת נפוצה. לדוגמא, נובע ממחקרים בבעלי חיים פרה-קליניים מציע כי hAECs הם מאוד מדכא את מערכת חיסון ועלול לגרום לסובלנות חיסונית פריפריה ולהפוך תגובות דלקתיות מתמשכות. hAECs גם הוכח יש את היכולת להתמיין לתאים עצביים in vivo ולשפר neuroregeneration אנדוגני באמצעות ההפרשה של מגוון רחב של גורמי neurotrophic 16. תאי אפיתל אדם וamnion המכרסם כבר הוכיחו היעילות הטיפולית שלהם לטיפול במחלות כבד במודלים של בעלי חיים. במודל פחמן טטרא אינדוקציה נזק של מחלת כבד, השתלה להוביל hAEC לengraftment של hAECs קיימא בכבד, מלווה באפופטוזיס hepatocyte מופחת, וירידה בדלקת ופיברוזיס 17 בכבד. יכול להיות מגורה hAECs לגורמי לבלב הביעו כוללים מובילי אינסולין וגלוקוז. מספר מחקרים בחנו את הפוטנציאל לhAECs לשחזר את רמות הגלוקוז בדם בעכברים סוכרתיים 18. בעכברים שקבלhAECs, שתי רמות הסוכר בדם ומשקל הגוף של בעלי החיים ירד לרמות נורמליות לאחר הזרקה של תאים. מחקרים אלה מציגים טיעון חזק לשימוש בhAECs לטיפול בסוכרת. יש לי hAECs תפקיד מוכח במניעה ובתיקון של פגיעת ריאות חריפה וכרונית ניסיונית בשני מבוגרים ודגמי יילודי 19. מחקרים אלה מצאו כי hAECs להבחין במבחנה לתאי האפיתל ריאות פונקציונליות להביע חלבונים הקשורים ריאה מרובים, כוללים סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות רגולטור (CFTR), ערוץ היון שעובר מוטציה בחולים עם סיסטיק פיברוזיס 20. בנוסף, כאשר hAECs מועברים למבוגר הפצועה וריאות של ילוד, שהם מפעילים השפעות המתקן שלהם באמצעות האפנון של תאים חיסוניים מארח, צמצום גיוס לויקוציטים ריאה, כוללים נויטרופילים, מקרופאגים ולימפוציטים מסוג 21-23. בהתחשב בשפע שלהם,שיא בטיחות, ויישומים קליניים מוכחים למחלות מרובות, ניסויים קליניים באמצעות hAECs הוא בלתי נמנע. במטרה להאיץ את התרגום של טיפולי hAEC לקליניים-ניסויים, שפיתחנו שיטות לבודד, cryopreserve וhAECs התרבות באופן מתאים לניסויים קליניים, באמצעות ריאגנטים ללא מוצר מן החי בהתאם לשיטות ייצור טובות הנוכחיות הנחיות (cGMP) . פרוטוקול זה אנו מבוססים פרוטוקול שפורסם בעבר שאנחנו משתמשים בהצלחה לבודד hAECs באמצעות ריאגנטים מן החי 6. אנחנו שיניתי את הפרוטוקול המקורי כדי להחליף מוצרים המופקים מבעלי חיים עם ריאגנטים ללא מוצר מן החי, ואופטימיזציה שלאחר מכן בוצעה כדי לייעל את תשואת תא, כדאיות וטוהר. המטרה שלנו הייתה לפתח פרוטוקול שעומד בתקנים רגולטוריים לתא ייצור לניסויים קליניים בבני אדם.

<table><tbody><tr><td>Collection Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stripping tray</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-361B</td><td></td></tr><tr><td>Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17329&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Scissors - Sharp/Blunt Straight</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0562592&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile latex gloves&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Protective Apparel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protective Apparel (Gown)</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Isolation gowns</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Sterile latex gloves&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>General purpose face mask</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7511</td><td></td></tr><tr><td>Bonnets</td><td>Medline</td><td>CRI1001</td><td></td></tr><tr><td>Shoe covers</td><td>U-line</td><td>S-7873W</td><td></td></tr><tr><td>Media and Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td>without calcium or magnesium</td></tr><tr><td>TrypZean (animal product&amp;ndash;free recombinant trypsin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3449</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor&amp;nbsp; 1g/50mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife Solutions</td><td>205102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EpCam-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130 - 091-253</td><td></td></tr><tr><td>PE-isotype control</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-845</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-PeCy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555597</td><td></td></tr><tr><td>PeCy5-isotype control</td><td>BD Pharmingen</td><td>557224</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD105-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>APC-isotype control</td><td>BD Pharmingen</td><td>340754</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type VI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356550</td><td></td></tr><tr><td>10 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon tubes</td><td>BD/Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml falcon tubes</td><td>BD/Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Petri dishes</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m filters</td><td>BD/Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m filters</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pipette tips</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-401</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l Pipette tips</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-409</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Syringe</td><td>BD/Medical</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>Plastic spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-245-97&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Plastic weighing boat</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-102&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cryo vials</td><td>Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr Frosty</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biohazard Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, cryopreservation and culture of human amnion epithelial cells for clinical applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

כאשר הליך זה ואחריו בצורה נכונה, תשואה ממוצעת של 120 מ&#39;hAECs צריכה להיות צפויה, עם מגוון טיפוסי של 80-160,000,000 תאים. מתשואות אלה, ניתן לצפות כדאיות ממוצעת של 83 ± 4%. הגידול בתשואה הממוצעת והכדאיות נמוכה במקצת בשיטה הקלינית יכולים להיות בגלל פעילות טריפסין גבוהה מהמוצר המופק מבעלי החיים, ואולי גם בשל היעדרם של חלבונים בסרום. יש לי hAECs המבודד פרופיל פני תא ממוצע של תאים חיוביים EpCAM 92% עם &lt;תאים חיוביים סמן mesenchymal 1% CD90, CD105. סמנים אלה נבחרו בשל ייחודם ל24,25 וmesenchymal 26 שושלות אפיתל בהתאמה. תהליך זה יכול לקחת כ 4-5 שעות כדי להשלים (איור 1). הקפאה דורשת 20-60 דקות בהתאם למספר של בקבוקונים ותשואת תא סופי. יש לנו נבדקו בעבר מגוון של מדיה הקפאה ומצאנוכי ללא מדיה מוצר רב של בעלי חיים לבצע כראוי, אולם ריכוז DMSO האופטימלי הוא כ 5-10%. בדרך כלל אפשר לצפות שלאחר ההפשרה-הכדאיות להיות 5-10% פחות מכדאיות מראש הקפאה, וההפסד הזה יכול להיות גדול יותר באופן משמעותי עבור המשתמשים חסרי ניסיון (איור 2). תרבית תאים ניתן לבצע עם hAECs כדי לאפשר אפיון, בידול, או ספציפי אחרים בהליכי מבחנה. תאים אלה בתחילה לצרף למשטחי תאים עם יעילות של 50-80% (תצפית אישית). זה מגדיל ל70-90% עם קטעים שלאחר מכן. קובץ מצורף עשוי להיות מוגבר עם השימוש בחומרי ציפוי פני השטח כגון אני סוג קולגן, או מוצרים דומים. hAECs לשמור על הפנוטיפ האפיתל שלהם בתקשורת ותרבות חופשי בסרום (איור 3). מצאנו שינויים משמעותיים בפרופילי סמן תא שטח הבאים מעבר חוזר ונשנה. בנוסף, לאחר hAECs כ 5 מעברים יכול eithאה להגיע הזדקנות, או לעבור שינויים מורפולוגיים בקנה אחד עם אפיתל מעבר mesenchymal. לאחר מעבר חוזר ונשנה, hAECs לשמור קריוטיפ נורמלי, אורכי הטלומרים ארוכים והפצת מחזור התא. מאפיינים אלה מצביעים על סיכון נמוך לשינוי או tumorigenicity. בנוסף להחזקת נכסי רגולציה ואנטי דלקתיים חיסוניים, hAECs הוכח להיות multipotent מאוד במבחנת in vivo, הבחנה לנציג שושלות תאים של שלוש שכבות הנבט הראשוניות (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52085/52085fig1highres.jpg" /> איור 1:. תשואה צפויה תא, כדאיות וטהרה לפרוטוקול בידוד קליני תשואות תא דומים וכדאיות יכולים להיות מושגות באמצעות ריאגנטים חופשיים בעלי חי מוצר בהשוואה לשיטות המכיל מוצר סטנדרטיים בבעלי חיים. בידוד אופייני צריך להיות&gt; EpCAM 90% ו- &lt;CD90% 1 / CD105 חיוביתאים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52085/52085fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52085/52085fig2highres.jpg" /> איור 2:.. כדאיות הפשרת הודעה ואת חילוף חומרים לתקשורת הקפאה המכילה סרום והסרום ללא השוואה לFBS המכיל DMSO 10%, תקשורת הקפאה זמינה המסחרית של בעלי חיים ללא מוצר הראו יכולת קיום שלאחר הפשרה-דומה או מוגבר וחילוף חומרים <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52085/52085fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן ל להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52085/52085fig3highres.jpg" /> איור 3: קובץ מצורף אופייני וצמיחת פרופיל של hAECs ברחוב ללא מוצא תא סרום ללא וסרום המכילture בינוני. תקשורת ותרבות ללא מוצר בעלי חיים הראתה קובץ מצורף מתאים תא, התפשטות, ותחזוקה של פנוטיפ אפיתל. עם זאת התפתחות נוספת של סרום ללא מדיה נדרשת על מנת להשיג תוצאות שווים לתקשורת סרום המכיל. ברים סולם מייצגים 500 מיקרומטר. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52085/52085fig4highres.jpg" /> איור 4:. בידול multipotent של hAECs במעבר המוקדם, hAECs הוכח להתמיין לנציג שושלות תאים המרובים של שלוש שכבות הנבט העיקריות. שושלות אלה כוללות, אך אינם מוגבלים ל; נוירונים, תאי שיער ועור, אפיתל ריאות, cardiomyocytes, hepatocytes, תאי לבלב, osteocytes וadipocytes. (איור מותאם מ -27)

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications at JoVE.com

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

isolation-cryopreservation-culture-human-amnion-epithelial-cells-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

13.8K Views.  Wake Forest University Health Sciences. We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines. 

Video: Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Developmental Biology

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

תרבות דגם חדשני לpluripotent אדם תאי גזע רביה בטין במדיה מזגן שליה

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

התכנות ראשי מי שפיר ו ממברנות התאים כדי Pluripotency בתנאים קסנו-חופשית

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

לבידוד של תאי סטרומה רירית הרחם אדם במבחנה Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Biology

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that the amniotic epithelium is a homogeneous layer. The human amnion can be divided into three anatomical regions: reflected, placental, and umbilical. Each region has different physiological roles, such as in pathological conditions. Here, we describe a protocol to dissect human amnion tissue in three sections and maintain it in vitro. In culture, cells derived from the reflected amnion displayed a cuboidal morphology, while cells from both placental and umbilical regions were squamous. Nonetheless, all the cells obtained have an epithelial phenotype, demonstrated by the immunodetection of E-cadherin. Thus, because the placental and reflected regions in situ differ in cellular components and molecular functions, it may be necessary for in vitro studies to consider these differences, because they could have physiological implications for the use of HAEC in biomedical research and the promising application of these cells in regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane to determine their heterogeneity and functional properties for possible application in clinical and physiopathological models.

בתרבות מבחנה של תאים אפיתל מאזורים אנטומיים שונים של קרום הפיר האנושי

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

התרבות תאי גזע Pluripotent אנושי על פוליויניל אלכוהול-Co-Itaconic Hydrogels חומצה עם קשיות שונות בתנאים קסנו-חופשית

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Bioengineering

קידום אחסון קריואחסון של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע אנושיים

Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in individuals with retinal degenerative diseases; however, studies on the stable and secure banking of these therapeutic cells are scarce. Highly variable cell viability and functional recovery of&#160;RPE cells after cryopreservation are the most commonly encountered issues. In the present protocol, we aimed to achieve the best cell recovery rate after thawing by selecting the optimal cell phase for freezing based on the original experimental conditions. Cells were frozen in the exponential phase determined by using the 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine labeling assay, which improved cell viability and recovery rate after thawing. Stable and functional cells were obtained shortly after thawing, independent of a long differentiation process. The methods described here allow the simple, efficient, and inexpensive preservation and thawing of hESC-derived RPE cells. Although this protocol focuses on RPE cells, this freezing strategy may be applied to many other types of differentiated cells.

מחבר זרקור: פיתוח שיטה יעילה וישימה להקפאת תאי אפיתל פיגמנט ברשתית

This study provides a detailed protocol for the efficient cryopreservation of human stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.

שימור בהקפאה של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בשלב האופטימלי

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in ...

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

תרבות דגם חדשני לpluripotent אדם תאי גזע רביה בטין במדיה מזגן שליה

התכנות ראשי מי שפיר ו ממברנות התאים כדי Pluripotency בתנאים קסנו-חופשית

לבידוד של תאי סטרומה רירית הרחם אדם במבחנה Decidualization

מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

בתרבות מבחנה של תאים אפיתל מאזורים אנטומיים שונים של קרום הפיר האנושי

התרבות תאי גזע Pluripotent אנושי על פוליויניל אלכוהול-Co-Itaconic Hydrogels חומצה עם קשיות שונות בתנאים קסנו-חופשית

שימור בהקפאה של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בשלב האופטימלי

שימור בהקפאה של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בשלב האופטימלי

שימור בהקפאה של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בשלב האופטימלי