Name: isolation, cryopreservation and culture of human amnion epithelial cells for clinical applications
Uploaded: 2014-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications at JoVE.com

The authors acknowledge financial support from the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

NOT: plasenta vadeli elektif sezaryen için bir tercih, tekiz gebeliklerde sağlıklı toplanan edilmelidir. Yazılı bilgilendirilmiş onam kendi plasenta toplanması için verilmelidir. Sizin ilgili insan araştırma etik kurul onayı tüm koleksiyon ve insan dokularının kullanılması gerekir. Amniyon Epitel Hücreleri 1. İzolasyon <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bir sınıf II biyolojik güvenlik kabini içinde steril bir yüzeye yerleştirin plasentayı. </li><li> Steril Hanks ile dengelenmiş tuz çözeltisi (HBSS) kullanarak, plasenta yüzeyi ve zarlardan mümkün olduğu kadar kan yıkayın. </li><li> Göbek kordonu yukarı bakacak şekilde yerleştirilen plasenta ile, mekanik amniyon ve koryon zarlarının dış kenarını ayrı. </li><li> Ayrıldıktan sonra, elle göbek kordonu doğru, membran kenarında çalışan, plasentanın koryon zarından amniyon zarı şerit. NOT: caref Beul amniyon gelen koryon zarı kirlenmesine parçaları varsa kaldırmak için. </li><li> Steril makas kullanılarak, 250 ml HBSS içeren kabı sızdırmaz bir 500 ml&#39;lik, göbek bağı ve yer tabanından yaklaşık 2 cm amniyon membran kesti. </li><li> Amniyon zarı içeren mühürlü şişeyi sallayarak iyice yıkayın. </li><li> 15 cm Petri kabı içine toplanması steril forseps kullanarak konteyner ve yerden amniyon zarı çıkarın. </li><li> Kanlı veya yırtılmış parçaları atarak, (forseps ile dikey tutulduğunda), yaklaşık 5 cm uzunluğunda parçalar halinde amniyon zarı kesin. </li><li> 500 ml&#39;lik bir yer kabı sızdırmaz şekilde kapatıldı ve 250 ml HBSS ile yaklaşık 3-5 kez yıkama veya amniyon membranı kirlenmeye sebep olan hiçbir kan saydam hale gelinceye kadar. NOT: Herhangi bir kan mevcut çözüm sindirmek enzimatik etkinliğini azaltabilir. </li><li> Dikkat ederek, çözelti sindirmek enzimatik 50 ml ihtiva eden bir kap içine amniyon zarın tüm parçaları transferHBSS taşınmasını en aza indirir. </li><li> Kalan kanı çıkarmak için yavaşça sallanarak 15 dakika için 37 ° C&#39;de su banyosunda veya sıcak bir odada çözüm sindirmek enzimatik olarak amniyon parçaları inkübe. </li><li> Yeni bir steril kap içinde çözüm ve yer sindirmek enzimatik gelen amniyon zarı parçalarını çıkarın. </li><li> Taze enzimatik 100 mi amniyon zara çözeltisi sindirimi ve bir su banyosu ya da yumuşak çalkalama (birinci sindirim) ile sıcak bir odada 60 dakika süre ile 37 ° C&#39;de inkübe ekleyin. </li><li> Amniyon zarı parçalarını çıkarın ve enzimatik zarının her parçasından tahliye çözüm sindirmek izin vermek için yeni konteyner alarak bakım içine yerleştirin. Not: Bu, kabın iç kenarı boyunca amniyon parçaları sürükleyerek elde edilebilir. </li><li> Taze enzimatik 100 mi amniyon membran parçaları çözeltisi sindirimi ve hafif çalkalama (ikinci sindirim) ile 37 ° C&#39;de bir su banyosu ya da sıcak bir odada 60 dakika inkübe ilave edin. </li><li> Hücre asıltı geçmek10 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de 70 mikron filtre ve santrifüj yoluyla Adım 1.14 itibaren. </li><li> Çıkarın ve supernatant ve 1 mg / ml soya fasülyesi bazlı bir enzim inhibitörü içeren 4 ml HBSS hücre pelletini. Yavaşça tek bir hücre süspansiyonu elde etmek üzere, 1 ml pipet ile tekrar tekrar pipetle. Not: ikinci sindirilmiş hücre işlem aynı seviyede olana kadar bu aşamada hücreler, buz üzerinde bırakılabilir. </li><li> Amniyon zarı parçalarını çıkarın ve enzimatik zarının her parçasından tahliye çözüm sindirmek izin vermek için yeni konteyner alarak bakım içine yerleştirin. Not: Bu, kabın iç kenarı boyunca amniyon parçaları sürükleyerek elde edilebilir. </li><li> 10 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de 70 mikron filtre ve santrifüj yoluyla Adım 1.18 hücre süspansiyonu geçirin. </li><li> Çıkarın ve supernatant ve 1 mg / ml soya fasülyesi bazlı bir enzim inhibitörü içeren 4 ml HBSS hücre pelletini. Yavaşça 1 ml p art arda pipettek bir hücre süspansiyonu elde etmek için ipette. </li><li> İki digests veya alternatif Havuz hücreleri hücre sayımları sonrasına kadar ayrılmış hücre digests tutun. NOT: Bu yüksek canlılık hücreleri ile potansiyel olarak düşük canlılığı hücrelerinin karıştırılması önler. </li><li> 10-20 ml&#39;lik bir son hacme HBSS ekleyin ve canlılığını ölçmek için tripan mavisi kullanarak hücreleri sayısını gerçekleştirmek. </li><li> Flow sitometri ile epitel hücre fenotipi onaylayın. Anti-EpCAM-PE kullanılarak uygun antikor kokteyli Makyaj (1: 2 seyreltme), anti-CD90-PeCy5 (1: 250) ve anti-CD105 APC (1: 100), HBSS. </li><li> 25 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda bir hücreler ya da antikor kokteyli içinde iki digests bir alt yeniden süspanse edin. </li><li> Flow sitometri, leke izotip kontrolleri içeren antikor kokteylleri ile 1 x 10 6 hücre için (örn., IgG 1 izotop kontrol-PE + Anti-CD90-PeCy5 + Anti-CD105-APC). Set-up akış sitometresi için lekesiz ~ 1 x 10 6 hücre tutun. </li><li> Antikorda hücreleri inkübe60 dakika boyunca 4 ° C&#39;de kokteyller. </li><li> Yıkama akış sitometresi için hücreler, ml başına 5-10.000.000 hücreler HBSS ve tekrar süspansiyon 3x. </li><li> Akış sitometrik ve not sonuçlarını gerçekleştirin. Hücre izolatı (EpCAM pozitif ve CD90 / CD105 negatif hücrelerin yüzdesi) saflığı sırasıyla% 90-95 ve &lt;% 1 olacağı tahmin edilmektedir. </li><li> Nihai uygulama tarafından tespit edildiği üzere, uygun kalite kontrol ve serbest bırakma kriterleri için test edilmesi için bir kenara hücrelerin uygun bir sayısı ayarlayın. NOT: Bu hastalık / viral tarama veya diğer güvenlik veya biyolojik kriterlerini içerebilir. </li><li> Kalan hücreler için, Kriyoprezervasyonun protokolünü takip veya alternatif (kültür adım 3.6 doğrudan) kültür doğrudan yerleştirin. </li></ol> HAECs 2. Kryoprezervasyon <ol style="margin-left: 40px;"><li> Veri veya tripan mavi dışlama manuel sayım flow sitometri kullanılarak hücre sayısı ve canlılığı belirleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 700 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süspanse hücrehayvansal ürün içermeyen kriyoprezervasyon medya ml başına 1-10 milyon hücreleri arasındaki s. </li><li> O-halkalı dondurarak saklama şişeleri içine hücrelerin uygun bir hacim pipet ve soğutma yaklaşık olarak meydana geldiği hızı kontrollü dondurma cihazının içine koyun 1 ° C / dakika kadar -80 ° C elde edilir °. </li><li> Uzun süreli depolama için sıvı azot içine şişeleri aktarın. </li></ol> Cyropreserved hAECs 3. erimesi ve Kültür <ol style="margin-left: 40px;"><li> Sıvı azottan dondurarak saklama şişeleri çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. NOT: Yalnızca transferi için - bir sonraki adıma geçin hızla. </li><li> Buz kalır, sadece küçük bir parça (~ 5 mm x 5 mm) kadar 37 ° C de hızlı bir şekilde dondurarak saklama şişeleri çözülme. NOT: Bu hücre çözümü dondurulması medyada DMSO toksik etkilerini azaltmak için sıcak olmadığı önemlidir. </li><li> Soğuk (~ 4 ° C), serum içermeyen ortam ile dondurarak saklama Ortam 10 kat seyreltilir, damla damla uygun bir boyut halinde ilaved tüp veya kap. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 700 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Ml başına 1.000.000 hücre bir konsantrasyonda için, serum barındırmayan ortam içinde yeniden süspanse edin. Tripan mavi dışlama ile otomatik veya manuel sayım kullanarak hücre sayısı ve canlılığı belirleyin. Beklenen canlılık sonrası çözülme öncesi kriyokoruma canlılığı% 5-10 daha az olacaktır. </li><li> Plaka standart hücre kültürü-işlenmiş plastik eşya üzerine hücreler, veya alternatif kullanmak Tip I kat kültür yüzeylere kollajen. </li><li> Tip I Kollajen kaplama için aşağıdaki protokolü takip <ol><li> İnsan plasentasından (25 ml deiyonize su ve 50 ul asetik asit, 15 mg, kolajen) &#39;ye ait asit çözünebilir Tip I Kolajen hazırlayın. </li><li> Parafilm ile beher Kapak ve kolajen iplikler eriyene kadar 37 ° C&#39;de orta karıştırın. </li><li> 0.22 um filtre kullanılarak steril filtre kolajen çözeltisi. </li><li> Deiyonize su ile filtrelenmiş kollajen stok 01:10 sulandırmak. Bu seyreltilmiş hisse çalışma conce olduğunuKaplama, plastik ve zar yüzeylerin ntration çözeltisi. </li><li> Kollajen kat plastik, 37 ° C&#39;de, oda sıcaklığında 2 saat için cam ve zar yüzeylerin ya da O / N, 2-8 ° C&#39;de ilave edildi. </li><li> Kaplanmış yüzey aşırı sıvı kaldırmak, ve O / N kurumasını bekleyin. </li><li> Hücreleri ve orta tanıtan önce steril doku kültürü dereceli su veya HBSS ile durulayın. </li></ol></li><li> Levha serumsuz ortam içinde 25,000 hücre / cm2 yoğunluğunda hAECs ve ek 72-96 saat boyunca oluşmasına izin verir. </li><li> Ek sonra, dikkatli bir şekilde aspire edilmesiyle ve serumsuz ortamda uygun bir hacim, her 2-3 günde bir ile değiştirerek ortamı değiştirmek. </li><li> Aşağıdaki protokolü kullanarak Passage hücreleri <ol><li> Aspire hücre kültürü ortamı ve steril HBSS 1x hacmi ile yıkayın </li><li> Hücreler, hücre kültürü yüzeyinden ayırma gözlenen kadar enzimatik 1x hacmi ekleyin çözüm sindirmek ve 5-15 dakika inkübe, ya da. </li><li> Çözelti, hücreleri ihtiva eden sindirimi ce sağlanması enzimatik toplamakrf defalarca hücre kültürü yüzeyine karşı çözüm sindirmek enzimatik pipetleme hücre kültürü yüzeyinden ayrılır </li><li> 5 dakika boyunca 700 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 1 mg / ml soya fasülyesi bazlı bir enzim inhibitörü ihtiva eden HBSS uygun bir hacimde hücre pelletini. Yavaşça tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için bir 1ml pipet ile art arda pipetle. </li><li> 1.000.000 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda serum içermeyen ortam ekleyin. Tripan mavi dışlama ile otomatik veya manuel sayım kullanarak hücre sayısı ve canlılığı belirleyin. </li><li> Levha serumsuz ortam içinde 25,000 hücre / cm2 yoğunluğunda hAECs, standart kültür yöntemleri ile devam eder. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G., Appasani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stem Cells and Regenerative Medicine. 1, 243-264 (2011).</li><li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+fluid+and+placental+membranes:+unexpected+sources+of+highly+multipotent+cells.">Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells.</a> Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).</li><li>Parolini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+isolation+and+characterization+of+cells+from+human+term+placenta:+outcome+of+the+first+international+Workshop+on+Placenta+Derived+Stem+Cells.">Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells.</a> Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).</li><li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preterm+human+amnion+epithelial+cells+have+limited+reparative+potential.">Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential.</a> Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).</li><li>Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+pluripotent+stem+cell+line+derived+from+human+amniotic+membranes+and+initiation+of+germ+layers+in+vitro.">Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro.</a> Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).</li><li>Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+amniotic+epithelial+stem+cells.">Isolation of amniotic epithelial stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use.">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).</li><li>Ilancheran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+derived+from+human+fetal+membranes+display+multilineage+differentiation+potential.">Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential.</a> Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).</li><li>Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+amnion+epithelium+into+skin+and+hair+follicles.">Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles.</a> Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).</li><li>Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+characteristics+of+amniotic+epithelial+cells.">Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells.</a> Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).</li><li>Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+ocular+surface+with+heterologous+limbal+epithelium+and+amniotic+membrane+in+a+rabbit+model.">Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model.</a> Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).</li><li>Sankar, V., Muthusamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+in+spinal+cord+injury+repair+research.">Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research.</a> Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).</li><li>Yuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+human+amniotic+epithelial+cells+express+connexin+26+and+Na-K-adenosine+triphosphatase+in+the+inner+ear.">Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear.</a> Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppressive+factors+secreted+by+human+amniotic+epithelial+cells.">Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).</li><li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cells+ameliorate+behavioral+dysfunction+and+reduce+infarct+size+in+the+rat+middle+cerebral+artery+occlusion+model.">Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model.</a> Shock. 29 (5), 603-611 (2008).</li><li>Venkatachalam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+neurotrophic+factor+secreted+by+amniotic+epithelial+cells.">Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells.</a> Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).</li><li>Manuelpillai, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+induces+markers+of+alternative+macrophage+activation+and+reduces+established+hepatic+fibrosis.">Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis.</a> PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).</li><li>Wei, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion-isolated+cells+normalize+blood+glucose+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice.">Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+prevent+bleomycin-induced+lung+injury+and+preserve+lung+function.">Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function.</a> Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).</li><li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+induced+to+express+functional+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).</li><li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+do+not+abrogate+pulmonary+fibrosis+in+mice+with+impaired+macrophage+function.">Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function.</a> Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).</li><li>Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cells+as+a+candidate+therapy+for+acute+and+chronic+lung+injury.">Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury.</a> Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).</li><li>Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+mediate+lung+repair+by+directly+modulating+macrophage+recruitment+and+polarization.">Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization.</a> , (2013).</li><li>Litvinov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+adhesion+molecule+(Ep-CAM)+modulates+cell-cell+interactions+mediated+by+classic+cadherins.">Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).</li><li>Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+cell+adhesion+molecule+(Ep-CAM)+as+a+morphoregulatory+molecule+is+a+tool+in+surgical+pathology.">The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology.</a> The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).</li><li>Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+obtained+from+different+human+tissues.">Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues.</a> Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).</li><li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , 119-137 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu metodolojinin başarısında önemli bir etkiye sahip birkaç kritik parametreler vardır. HAECs izolasyonundan önce 3 saat süre ile plasenta veya amniyon depolanması ancak doku mümkün olan en kısa zamanda işlem önerilmektedir, lojistik ve programlama amacıyla arzu edilebilir. Doku saklanacaksa, bu depolama amniyon membran diseksiyon ve yıkama sonrası yapılması tavsiye edilir. Amniyon sıvısı 4 ° C&#39;de steril HBSS içeren antibiyotik saklanabilir ancak hücre canlılığı, uzun depolama süresi ile azalabilir. Biz, ve diğerleri hücre verimi ve canlılığı değişkenlik bulduk, ve tercihen Sezaryen ile doğum sağlıklı term doğum, toplanan olduğu plasenta önerilir bu değişkenliği en aza indirmek için. Bu kan hücreleri ile amniyon membran kirlenme enzim etkinliğinin inhibisyonu ve hücre veriminde bir düşüşe neden olur bulundu. Bu nedenleprotokolünde önemli bir adım plasentanın kapsamlı yıkama ve amniyon zarı tavsiye edilir. O mansap enzim inhibisyonunu önlemek için / beyaz berrak görünene kadar amniyon dokusu yıkanmış olması tavsiye edilir. Epitel hücreleri, nispeten homojen bir popülasyonundan izole edilmesi karakterizasyonu ve kalite kontrol testleri için önemlidir. Mezenkimal hücreler ile hücre verimi düşük verimleri, canlılık veya kirlenme olursa sorun giderme için yapılabilir çeşitli değişiklikler vardır. Hücre verimleri düşüktür, bu enzimatik aktivitesi, kan ya da serum kirlenmeye inhibe olması mümkündür. Bu daha kapsamlı ve ek yıkama adımları ve / veya atma kanlı veya kontamine amniyon parçaları ile çözülebilir. Enzim Kuluçka süresi arttırılmış olur, ancak bu hücre canlılığı için zararlı olabilir. Mezenkimal hücrelerle canlılığı ya da kirlenme özeti zamanı azaltarak önlenebilir azalmış. Bununla birlikte, thilarındaki ayrıca hücrelerin toplam verim düşebilir. 30 dakika ila 2 saat arasında değişen sürelerle bu protokol için kullanılabilir. Bu kez istenilen hücre saflık ve toplam verim / canlılığı için optimize edilmesi gerekir. Bu tekniğin bir sınırlama artan hücre verimi ya da canlılığı birbirine pahasına gelebilir olduğunu. Buna ek olarak, serumsuz bileşenler şu enzimatik aktivite maruz kaldıktan sonra, hücre viyabilitesini muhafaza olarak etkili değildir. Hücreler, bir sıcaklığı kontrol edilen bir sıvı azot depolama sistemi içinde hücre canlılığı veya metabolizma kaybına herhangi bir önemli azalma olmadan dondurularak saklanmış olabilir. Bu basit izopropanol dolu kriyokoruma cihazdan bir state-of-the-art kontrollü hız donma sistemine değişebilir. Bizim bilgilerimize göre, bu sistemde hAECs için en uygun dondurma oranı, hücre canlılığı ve post-çözülme metabolizması uygun bakım 1 ° C / dak sonuçlarının ancak standart oranı, tespit edilmemiştir. Çözdürme o sırasındaf dondurulan hücreler, DMSO hücre maruziyeti azaltmak için minimumda eritme zaman tutmak için önemlidir. Hücreler takmak ve taze izole hücreleri kültür kıyasla dondurarak saklama ve eritme sonrasında daha düşük oranda çoğalırlar olabilir. Kültür hücreleri, hücre sayısı ya da ve / veya in vitro manipülasyonu alt baş karakterizasyon için artırmak için klinik uygulama için, arzu edilebilir. Okuyucular in vitro manipülasyon kendi özel bu hücrelerin klinik uygulamada yer alan düzenleyici yollarını değiştirmek nasıl anlamak gerekir. Böyle EpiLife gibi bir hayvan ürünü içermeyen kültür ortamı, hAECs bakım ve genişlemesi için uygun olduğunu araştırdık. Bununla birlikte, bu tür bir hücre tipi için artan büyüme sonuçları elde etmek amacıyla büyüme faktörü konsantrasyonları optimize etmek için gereklidir. Bir insan kollajen-kaplama matrisi kullanarak kültür sırasında hücre yapışması sorunu, kaplama verimliliğini arttırır. Bununla birlikte, uzun süreli e, aşağıdakienzimatik sindirme ile Xposure plaka oluşturma verimliliği alt uygun olacaktır. Özetle, bu protokol mevcut iyi imalat uygulamaları (cGMP) kurallarına uygun olarak hayvansal ürün içermeyen reaktifler kullanılarak insan amniyon epitel hücreleri (hAECs) izolasyonunu ve kültürünü kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. Alternatif izolasyon yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntemin bir avantajı, uygun hücre verimi, canlılığı ve potansiyelini muhafaza ederken, bu hücreler, insanlar için zararlı hayvan patojenleri teslim riski olmaksızın dondurulmuş ve kültürlendi, karakterize edici özelliği, izole edilebilir olmasıdır. Klinik araştırmalarla klinik öncesi hayvan çalışmalarından hareket eden araştırmacılar için, bu metodolojiler büyük ölçüde, düzenleyici onayı hızlandırmak riskleri azaltmak ve onların tedavi edici hücre popülasyonunun kalitesini artıracaktır.

Plasenta gibi perinatal kaynaklardan, plasental membranlar, göbek kordonu ve amniyotik sıvıdan elde edilen hücreler rejeneratif tıp 1,2 için hücrelerin bir potansiyel kaynağı olarak araştırmacılar ve klinisyenler dikkatini çekmiştir. Bu ilginin nedeni, bu hücre tipleri, tüm plastisite ve bağışıklık yeteneği 3, potansiyel terapötik uygulamalar için temel olan bazı özellikleri derecesine sahip olmasıdır. hAECs rejeneratif hücre malzemeden bir miktarda potansiyel kaynağı temin terimi ya da önceden dönem amniyon zar 4 elde edilebilir heterojen epitel nüfus bulunmaktadır. hücresel bir tedavi olarak çekici hAECs yapmak özellikleri kendi multipotency, düşük imünojenite ve anti-inflamatuar özelliklerini içerir. hAECs (yüksek ölçüde, in vitro ve in vivo olarak multipotent mezodermal soy içine türetme yeteneğinde olduğu kardiyomiyopati bulunmuşturyocytes, myocytes, osteositler, adiposit), Endodermal soy (pankreas hücreleri, karaciğer hücreleri, akciğer hücreleri) ve ektodermal soyları (saç, cilt, sinir hücreleri ve astrositler) 5-10. Reassuringly kendi multipotency hAECs ya bir şekilde tümörlere görünür ya da in vivo olarak tümör gelişimini teşvik etmemesine karşın. Ayrıca, hAECs de sınıf II insan lökosit antijenleri (HLA&#39;lar) 8 düşük seviyelerde ifade, ayrıcalıklı bağışıklık bulunmaktadır. Bu özellik muhtemelen bağışıklık yetkili maymunlar, tavşan, kobay, sıçan, ve domuzlar 11-13 kullanıldığı çalışmalarda gösterildiği gibi, allojenik ve ksenojenik transplantasyon sonrası immün ret kaçınmak için kendi yeteneğini temelini oluşturmaktadır. hAECs güçlü immünomodülatör ve immünosüpresif özellikler gösterir ve böylece otoimmün hastalığın tedavisinde potansiyel klinik uygulamalar için önemli bir pratik avantaj sağlar. hAECs hem doğal ve adaptif bağışıklık sistemi üzerinde bağışıklık fonksiyonlarını uygulamak inanılmaktadır. Üzerindeimmunomodülator salgılanması 14 faktörleri ile öne mekanizmaların e. Klinik öncesi hayvan hastalık modellerinde hAECs Mevcut uygulamalar felç, multipl skleroz, karaciğer hastalığı, şeker hastalığı ve kronik ve akut akciğer hastalıkların tedavisi bulunmaktadır. Araştırmacılar nedeniyle benzersiz özellikleri inme sonrası beyin iltihabı tedavi etmek hAECs kullanarak ilgi gösterdi. HAECs, onlar aşılamak olabilir kan beyin bariyerini kadar 60 gün boyunca hayatta, nöronlar içine ayırt, inflamasyonu azaltmak ve nörolojik hastalıkların 15 hayvan modellerinde hasarlı santral sinir sistemi dokusunun yenilenmesini teşvik edebilir dair kanıtlar vardır. hAECs hedef ve multipl skleroz gelişmesi ve ilerlemesine katkıda birden patolojik yollar ters yeteneği sunuyoruz. Örneğin, klinik öncesi hayvan çalışmalarında kaynaklanan hAECs kuvvetle bağışıklık olduğunu göstermektedir vepotansiyel çevresel immün tolerans neden ve devam eden inflamatuar yanıtları tersine çevirebilirsiniz. hAECs in vivo sinir hücrelerine dönüştürmek ve nörotropik geniş bir dizi 16 faktörleri salgılayarak endojen sinir sistemini geliştirmek için kapasitesine sahip olduğu gösterilmiştir. İnsan ve kemirgen amniyon epitel hücreleri, hayvan modellerinde karaciğer hastalığının tedavisi için terapötik etkinliğini göstermiştir. Düşük hepatosit apoptoz eşliğinde karaciğer hastalığı, karaciğer canlı hAECs nakledilmesiyle için haec nakli kurşun, karbon tetraklorür hasar indüksiyon modelinde ve hepatik inflamasyon ve fibrozis 17 azalmıştır. hAECs insülin ve glükoz taşıyıcıları içeren ifade pankreas faktörlere stimüle edilebilir. Çeşitli çalışmalar, diyabetik farelerde 18 kan şekeri seviyelerinin normale dönmesi için hAECs potansiyelini araştırdık. Farelerde almahAECs, her iki hayvan vücut ağırlığı ve kan glukoz seviyeleri, hücre enjeksiyonunun ardından, normal seviyelere düşmüştür. Bu çalışmalar, diyabet tedavisi için hAECs kullanımı için güçlü bir sunulmaktadır. hAECs yetişkin ve yenidoğan modelleri 19 hem de önlenmesi ve deneysel akut ve kronik akciğer hasarı tamir kanıtlanmış rolü vardır. Bu çalışmalar, hAECs Kistik fibroz membran geçirgenliğinin düzenleyicisi (CFTR), kistik fibroz 20 hastalarda mutasyona uğramış, ve iyon kanalının de dahil olmak üzere birden fazla akciğer ilişkili proteinler ifade eden fonksiyonel akciğer epitel hücrelerine in vitro olarak ayırt bulundu. HAECs yaralı yetişkin ve yeni doğan akciğer teslim edilir, ayrıca, bunların nötrofil, makrofajlar ve lenfositler 21-23 dahil olmak üzere akciğer lökosit işe, azaltılması, konak bağışıklık hücrelerinin modülasyonu yoluyla onarım etkilerini uygularlar. Onların bolluğu göz önüne alındığında,Emniyet kaydı ve birden hastalıklar için kanıtlanmış klinik uygulamalar, hAECs kullanarak klinik çalışmalarda kaçınılmazdır. Klinik denemeler içine haec tedavilerin çeviri hızlandırılması amacı ile, biz mevcut iyi üretim uygulamaları (cGMP) kurallarına uygun olarak hayvansal ürün içermeyen reaktifler kullanılarak, klinik çalışmalar için uygun bir şekilde kültür hAECs, izole cryopreserve ve yöntemler geliştirdi . Biz bu protokolünü biz hayvansal kaynaklı reaktifler 6 kullanarak hAECs izole başarıyla kullandığınız bir önceden yayınlanmış bir protokol tabanlı. Biz hayvansal ürün içermeyen reaktif ile hayvansal kaynaklı ürünler yerine orijinal protokol değişmiş ve sonraki optimizasyon hücre verimi, canlılığı ve saflık optimize etmek yapıldı. Amacımız, insan klinik denemeler için hücre üretimi için düzenleyici standartlara uygun bir protokol geliştirmekti.

<table><tbody><tr><td>Collection Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stripping tray</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-361B</td><td></td></tr><tr><td>Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17329&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Scissors - Sharp/Blunt Straight</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0562592&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile latex gloves&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Protective Apparel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protective Apparel (Gown)</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Isolation gowns</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Sterile latex gloves&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>General purpose face mask</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7511</td><td></td></tr><tr><td>Bonnets</td><td>Medline</td><td>CRI1001</td><td></td></tr><tr><td>Shoe covers</td><td>U-line</td><td>S-7873W</td><td></td></tr><tr><td>Media and Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td>without calcium or magnesium</td></tr><tr><td>TrypZean (animal product&amp;ndash;free recombinant trypsin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3449</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor&amp;nbsp; 1g/50mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife Solutions</td><td>205102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EpCam-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130 - 091-253</td><td></td></tr><tr><td>PE-isotype control</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-845</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-PeCy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555597</td><td></td></tr><tr><td>PeCy5-isotype control</td><td>BD Pharmingen</td><td>557224</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD105-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>APC-isotype control</td><td>BD Pharmingen</td><td>340754</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type VI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356550</td><td></td></tr><tr><td>10 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon tubes</td><td>BD/Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml falcon tubes</td><td>BD/Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Petri dishes</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m filters</td><td>BD/Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m filters</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pipette tips</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-401</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l Pipette tips</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-409</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Syringe</td><td>BD/Medical</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>Plastic spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-245-97&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Plastic weighing boat</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-102&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cryo vials</td><td>Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr Frosty</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biohazard Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, cryopreservation and culture of human amnion epithelial cells for clinical applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

Bu prosedür doğru devam edildiğinde, 120,000,000 hAECs bir ortalama verim 80-160,000,000 hücre tipik aralık, beklenmelidir. Bu verimi kaynaktan, 83 ±% 4 arasında bir ortalama canlılığı beklenebilir. Klinik yöntemde artan ortalama verimi ve biraz daha düşük bir canlılık bağlı olarak serum proteinleri olmaması belki de, hayvan türevi ürün daha yüksek bir tripsin aktivitesi nedeniyle olabilir ve. İzole hAECs &lt;% 1, CD90, CD105, mezenkimal geni taşıyan hücreler ile% 92 EpCAM pozitif hücreleri arasında bir ortalama hücre yüzey profiline sahiptir. Bu belirteçler, sırasıyla epitel 24,25 ve mezenkimal 26 soy için özgüllükleri nedeniyle seçilmiştir. Bu süreç (Şekil 1) tamamlamak için yaklaşık 4-5 saat sürebilir. Krioprezervasyon şişeleri ve nihai hücre verimi sayısına bağlı olarak 20-60 dk gerektirir. Biz daha önce dondurarak saklama ortamı bir dizi test ve buldukbirçok hayvansal ürün içermeyen ortam, ancak optimum DMSO konsantrasyonu yaklaşık% 5-10, uygun gerçekleştirin. Tipik bir canlılık sonrası çözülme öncesi kriyokoruma canlılığı% 5-10 daha az olmasını bekleyebilirsiniz, ve bu kayıp deneyimsiz kullanıcı (Şekil 2) için önemli ölçüde daha büyük olabilir. Hücre kültürü karakterizasyonu, farklılaşma, ya da in vitro prosedürler diğer spesifik sağlamak için hAECs ile yapılabilir. Bu hücreler başlangıçta% 50-80 bir verimlilik (kişisel gözlem) ile hücre yüzeylerinde eklemek. Bu, sonraki geçişleri ile% 70-90 artar. Bağlanma örneğin kolajen tip I veya benzer ürünler gibi yüzey kaplama malzemelerinin kullanımı ile artırılabilir. hAECs serum içermeyen kültür ortamı içindeki epitel fenotipi (Şekil 3) korur. Biz tekrarlanan geçit aşağıdaki hücre yüzey işaretleyici profillerinde önemli değişiklikler bulduk. Buna ek olarak, daha sonra yaklaşık olarak 5 pasaj hAECs eith olabilirer yaşlanmayı ulaşmak, ya da mezenkimal geçiş epitel ile tutarlı morfolojik değişikliklere gitmek. Tekrarlanan geçişten sonra, hAECs normal karyotip, uzun telomer uzunluklarını ve hücre döngüsü dağılımı korumak. Bu özellikler dönüşüm veya tümörgenezine düşük riski göstermektedir. Bağışıklık düzenleyici ve anti-inflamatuar özelliklere sahip ek olarak, hAECs üç ana germ hücre soyları temsilcisi (Şekil 4), ayrıştırıcı, in vitro ve in vivo yüksek multipotent olduğu gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52085/52085fig1highres.jpg" /> Şekil 1:. Beklenen hücre verimi, canlılık ve saflık klinik izolasyonu protokolü için benzer hücre verimi ve canlılığı standart hayvan Ürünü içeren yöntemlere göre hayvan ürünün serbest reaktif kullanılarak elde edilebilir. Tipik bir izolasyon&gt;% 90 EpCAM ve &lt;% 1 CD90 / CD105 pozitif olmalıHücreler. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52085/52085fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52085/52085fig2highres.jpg" /> Şekil 2:.. Serum içeren ve serum serbest kriyoprezervasyon medya için Sonrası çözülme canlılığı ve metabolizma% 10 DMSO içeren FBS ile karşılaştırıldığında, piyasada mevcut hayvansal ürün içermeyen dondurarak saklama ortamı benzer ya da artmış sonrası çözülme canlılığı ve metabolizma gösterdi <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52085/52085fig2large.jpg" target="_blank">için tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52085/52085fig3highres.jpg" /> Şekil 3: serumsuz ve serum içeren hücre kültürleriyle içinde hAECs tipik bağlanma ve büyüme profiliTure ortamı. Hayvan ürünü içermeyen kültür ortamı, uygun hücre eki, proliferasyon ve epitel fenotip bakım göstermiştir. Bununla birlikte, serum içermeyen ortam daha da geliştirilmesi, serum içeren ortamda eşit sonuçlar elde etmek için gereklidir. Ölçek çubukları 500 um temsil eder. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52085/52085fig4highres.jpg" /> Şekil 4:. HAECs arasında Multipotent farklılaşma erken geçiş içinde hAECs üç ana germ birden fazla hücre soyları temsil içine ayırt etmek için gösterilmiştir. Bu soylar şunlardır, ancak bunlarla sınırlı değildir; nöronlar, saç ve cilt hücreleri, akciğer epiteli, kardiyomiyositler, hepatositler, pankreas hücreleri, osteositler ve adipozitler. (Şekil 27 uyarlanmıştır)

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications at JoVE.com

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

isolation-cryopreservation-culture-human-amnion-epithelial-cells-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

13.8K Görüntüleme.  Wake Forest University Health Sciences. We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines. 

Video: Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

İnsan Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu ve Gözenekli Kemik Matrix kendi Yetiştirme

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Gelişim Biyolojisi

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

A Novel Kültür Modeli İnsan Pluripotent için Plasenta klimalı Medyada Jelatin üzerinde hücre çoğalma Kök

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

Vitro Decidualization için insan endometrium Stromal hücre izolasyon

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

İnsan Embriyonik Kök Hücreler Donma ve Çözülme

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Biyoloji

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that the amniotic epithelium is a homogeneous layer. The human amnion can be divided into three anatomical regions: reflected, placental, and umbilical. Each region has different physiological roles, such as in pathological conditions. Here, we describe a protocol to dissect human amnion tissue in three sections and maintain it in vitro. In culture, cells derived from the reflected amnion displayed a cuboidal morphology, while cells from both placental and umbilical regions were squamous. Nonetheless, all the cells obtained have an epithelial phenotype, demonstrated by the immunodetection of E-cadherin. Thus, because the placental and reflected regions in situ differ in cellular components and molecular functions, it may be necessary for in vitro studies to consider these differences, because they could have physiological implications for the use of HAEC in biomedical research and the promising application of these cells in regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane to determine their heterogeneity and functional properties for possible application in clinical and physiopathological models.

İnsan Amniyotik Membranının Farklı Anatomik Bölgelerinden Epitel Hücrelerin In Vitro Kültürü

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

İnsan Pluripotent kök hücre kültürü ile Xeno-Alerjik koşullar altında değişik sertlik polivinil alkol-Co-İtakonik asit Hydrogels

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Biyomühendislik

İnsan Kök Hücre Kaynaklı Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Kriyo Depolamasının İlerletilmesi

Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in individuals with retinal degenerative diseases; however, studies on the stable and secure banking of these therapeutic cells are scarce. Highly variable cell viability and functional recovery of&#160;RPE cells after cryopreservation are the most commonly encountered issues. In the present protocol, we aimed to achieve the best cell recovery rate after thawing by selecting the optimal cell phase for freezing based on the original experimental conditions. Cells were frozen in the exponential phase determined by using the 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine labeling assay, which improved cell viability and recovery rate after thawing. Stable and functional cells were obtained shortly after thawing, independent of a long differentiation process. The methods described here allow the simple, efficient, and inexpensive preservation and thawing of hESC-derived RPE cells. Although this protocol focuses on RPE cells, this freezing strategy may be applied to many other types of differentiated cells.

Yazar Spotlight: Retina Pigment Epitel Hücre Dondurma için Verimli ve Uygulanabilir Bir Yöntemin Geliştirilmesi

This study provides a detailed protocol for the efficient cryopreservation of human stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Optimal Aşamada Dondurularak Saklanması

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in ...

İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İnsan Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu ve Gözenekli Kemik Matrix kendi Yetiştirme

A Novel Kültür Modeli İnsan Pluripotent için Plasenta klimalı Medyada Jelatin üzerinde hücre çoğalma Kök

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Vitro Decidualization için insan endometrium Stromal hücre izolasyon

İnsan Embriyonik Kök Hücreler Donma ve Çözülme

İnsan Amniyotik Membranının Farklı Anatomik Bölgelerinden Epitel Hücrelerin In Vitro Kültürü

İnsan Pluripotent kök hücre kültürü ile Xeno-Alerjik koşullar altında değişik sertlik polivinil alkol-Co-İtakonik asit Hydrogels

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Optimal Aşamada Dondurularak Saklanması

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Optimal Aşamada Dondurularak Saklanması

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Optimal Aşamada Dondurularak Saklanması