בתרבות מבחנה של תאים אפיתל מאזורים אנטומיים שונים של קרום הפיר האנושי

פרוטוקול זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח על הטרוגניות ומאפיינים פונקציונליים של תאי אפיתל מי המפיר האנושיים מבודדים ממברנת מי המפירה. בעוד שפרוטוקולים קודמים בודדו תאים מממברנה מימר שותף מבלי להבחין בין אזורים, הפרוטוקול שלנו מאפשר את תרבות אוכלוסיית התאים המבודדת משלושה אזורים אנטומיים נפרדים. כדי להפריד את קרום מי השפיר לפי אזור, בקבינט biosafety בתנאים סטריליים, לזהות את amnion הטבור עוטף את חבל הטבור, אמניון שליה המכסה את הבסליס decidua, ואת האזור משתקף, אשר נחשב שאר amnion כי אינו מחובר שליה.

כדי לנתח את אזור אמניון הטבור, השתמש במטסות ניתוח כדי להחזיק את החלק של קרום אמניון המכסה את צומת שליה ואת חבל הטבור, ולהשתמש אזמל לנתח את האזור המקיף את חבל הטבור, תוך מתיחה כדי להפריד את האזור מן chorion. לאחר מכן, להפקיד את הרקמה המופרדת בסקילר שכותרתו עם 100 מיליליטר של תמיסת מלח. כדי לנתח את אזור אמניון שליה, להשתמש גזה כותנה סטרילית כדי להסיר את קרישי הדם מפני השטח של chorion / אמניון המכסה את שליה.

ולהשתמש במטסים לנתח כדי לתפוס את הממברנה על הגבול בין שליה לאזור משתקף. השתמש אזמל לחתוך לאורך היקף שליה ולהפריד את אמניון שליה מן chorion, נזהר לא לחתוך כל כלי מן שליה. מניחים את הרקמה המופרדת בסקלר אחר שכותרתו עם 300 מיליליטר של תמיסת מלח.

ולהפריד את שאר קרום מי שפיר כי אינו מחובר שליה מן chorion. לאחר מכן, למקם את האזור משתקף אחר שכותרתו beaker עם 300 מיליליטר של תמיסת מלח. כדי לשטוף את הממברנות, השתמש פינצטה כדי למקם אותם על משטח סטרילי כדי להיות מסוגל להשליך את הפתרון מלוחים מכל מיכל של רקמה.

מניחים את הממברנות בחזרה במיכל ומוסיפים 100 מיליליטר של תמיסת מלח טרייה לאזור הטבור ו -300 מיליליטר של תמיסת מלח טרייה לאזורי שליה ומשתקפים. השתמש מטחנים לנתח כדי לערבב את הממברנות כדי להסיר את כל שאריות הדם ולהציב את הממברנות על פני השטח סטרילי כדי להיות מסוגל להשליך את הפתרונות מלוחים. לאחר מכן, לשטוף את הממברנות לפחות עוד פעמיים, כפי שהוכח רק, עד הרקמות שקופות.

לעיכול אנזימטי של אזורי הממברנה מי השפיר השונים, חותכים את האזורים המשתקפים ואת אזורי שליה לשניים או שלושה שברים. ומ מניחים את השברים ואת אזור הטבור בצינורות צנטריפוגה בודדים של 50 מיליליטר. הוסף 20 מיליליטר של 0.5% טריפסין-EDTA לכל צינור של שברי רקמת אזור משתקפים שליה וחמישה מיליליטר של 0.5% טריפסין-EDTA לצינור המכיל את רקמת אזור הטבור.

לנער את הצינורות בעדינות במשך 30 שניות. לאחר מכן מניחים את הממברנות על משטח סטרילי, משליכים את פתרון טריפסין-EDTA ומחליפים אותו ב-30 מיליליטר של טריים 0.5%trypsin-EDTA עבור שברי רקמת האזור המשתקפים והשליה ו-15 מיליליטר של 0.5%טריפסין-EDTA טריים עבור רקמת האזור הטבור. ואז למקם את הצינורות בסובב בתוך אינקובטור לסיבוב של 40 דקות ב 20 סיבובים לדקה ב 37 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, להעביר את כל נפח של פתרון התא לתוך צינורות חרוט חדשים. ולהוסיף פעמיים את הנפח של 37 מעלות צלזיוס תאים אנושיים AE בינוני לכל צינור על קרח. לעכל את כל שברי רקמת שאריות בצינורות המקוריים עם טרי 0.5% trypsin-EDTA, כפי שהודגם רק.

בסוף העיכול השני, השתמש בזוג מדפים מנותח כדי להחזיק קצה אחד של חלק amnion וזוג שני של מעצורי ניתוח לסחוט לאורך הרקמה הנותרת כדי להסיר את כל השורות של תאי אפיתל שלא לגמרי לקלף במהלך תקופות הדגירה הקודמות. לאחר מכן, להסיר את הממברנות כדי להיות מסוגל להעביר את פתרון העיכול השני לקבוצה שנייה של צינורות צנטריפוגה. ולהשבית את אנזימי העיכול עם נפח גדול פי שניים של מדיום AE אנושי טרי של 37 מעלות צלזיוס על קרח.

לבידוד תאי AE אנושיים, מסיסים את התאים על ידי צנטריפוגה. ולתלות מחדש את גלולה בכל צינור עם 10 מיליליטר של טרי 37 מעלות צלזיוס אנושי AE תא בינוני. משוך כל זוג של עיכול לתוך צינור אחד ולסנן את המתלים דרך מסנני 100 מיקרומטר כדי להסיר את כל פסולת מטריצה חוץ תאית.

לאחר הספירה, זרע את תאי AE האנושיים מכל אחד משלושת האזורים לתוך לוחות בודדים של 100 מילימטרים בשלוש פעמים 10 לתאים הרביעיים אחוזים בריבוע ריכוז ב 37 מעלות צלזיוס אנושי AE תא בינוני, בתוספת 10 ננוגרם למיליליטר של גורם הגדילה האפידרמלי האנושי. לאחר מכן, להדגים את התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים נורמוקסיים באינקובטור לח עד ניתוח במורד הזרם של עניין. לאחר 48 שעות של תרבות, תאי AE אנושיים עם פנוטיפ אפיתל לדבוק על פני השטח של הלוח, בעוד supernatant מכיל פסולת תאים ותאים צפים שניתן להסיר לאחר המדיום משתנה.

מומלץ להשליך את התרבות ולעבד קרום נוסף בעת זיהוי נוכחות של זיהום חיידקי, אריתרוציטים מוגזמים עקב שטיפה לא מספקת של הממברנות, תאים לקויים או לא עקביים, או תאים עם מורפולוגיה פיברובלסט. מורפולוגיה של תאי AE אנושיים תלויה במקור התאים, בכך שתאים מהאזור המשתקף מדגימים מורפולוגיה קובואידית וגדלים במונולייה מרוצפת, ותאים מאזורי שליה וטיבור הם מחמיאים ומוזקלים. Immunofluorescence נגד E-cadherin מגלה כי התרבויות העיקריות ותת התרבות לשמור על פנוטיפ האפיתל שלהם, מה שמרמז כי אין זיהום של סוג תא אחר.

בנוסף, התאים הם קיימא, כפי שמוצג על ידי הביטוי שלהם של סמן התפשטות Ki-67. למרות שהתת-תפקודים מהעימה שונים במורפולוגיה ובתפקוד שלהם, הביטוי והנוכחות של ליבת גורמי הפלוריפוטנטיות אינם משתנים בתאי AE אנושיים הנגזרים מאזורי שליה ומשתקפים. מכיוון שתאי אפיתל מי מיון אנושיים הם מקור אפשרי לתאי גזע פלוריפוטנטיים, אנו יכולים לאתגר אותם באמצעות שורה של פרוטוקולי הגדרה ספציפיים כדי להבהר אם לתאים אלה מכל אזור יש פוטנציאל שונה.

לפני פרוטוקול התחיל, לסקור את ההיסטוריה הרפואית של המטופל כדי להיות בטוח כי הרקמה מציגה שום מאפיינים מיקרוביולוגיים של זיהום.