Name: isolation, cryopreservation and culture of human amnion epithelial cells for clinical applications
Uploaded: 2014-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
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The authors acknowledge financial support from the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

NOTA: placenta dovrebbe essere raccolto da gravidanze sane Singleton, con una preferenza per tagli cesarei elettivi termine. Scritto, consenso informato deve essere dato per la raccolta dei loro placenta. Il tuo comitati etici di ricerca umani dovrebbero approvazione tutta la linea e l&#39;utilizzo di tessuti umani. 1. Isolamento di cellule epiteliali Amnion <ol style="margin-left: 40px;"><li> Posizionare la placenta su una superficie sterile all&#39;interno di una cappa di sicurezza biologica di classe II. </li><li> Utilizzando matasse sterili soluzione salina bilanciata (HBSS), lavare il più sangue possibile dalla superficie della placenta e le membrane. </li><li> Con la placenta disposto con il cordone ombelicale rivolto verso l&#39;alto, separare meccanicamente il bordo esterno delle membrane amnion e corion. </li><li> Una volta separati, striscia manualmente la membrana amniotica dalla membrana corion della placenta, lavorando intorno al bordo della membrana, verso il cordone ombelicale. NOTA: Essere Careful per rimuovere eventuali pezzi di contaminanti membrana chorion dalla membrana amniotica. </li><li> Usando forbici sterili, tagliare la membrana amniotica 2 cm circa dalla base del cordone ombelicale e posto in un contenitore sigillato 500 ml contenente 250 ml HBSS. </li><li> Lavare accuratamente agitando la bottiglia sigillata contenente la membrana amniotica. </li><li> Rimuovere la membrana amniotica dal contenitore di raccolta con pinza sterile, e posto in una capsula di Petri 15 cm. </li><li> Tagliare la membrana amniotica in pezzi lunghi circa 5 cm (se tenuto in verticale con le pinze), scartando i pezzi sanguinosi o strappati. </li><li> Mettere in un contenitore sigillato da 500 ml e lavare con 250 ml HBSS circa 3-5 volte o fino a quando la membrana amniotica diventa traslucida con niente sangue contaminante. NOTA: Qualsiasi sangue presente può ridurre l&#39;efficienza della enzimatica soluzione di analisi. </li><li> Trasferire tutti i pezzi di membrana amniotica in un recipiente contenente 50 ml della soluzione enzimatica digerire, avendo cura diridurre al minimo riporto di HBSS. </li><li> Incubare i pezzi amnion in enzimatica digeriscono soluzione in un bagno d&#39;acqua o camera calda a 37 ° C per 15 minuti con agitazione per rimuovere il sangue residuo. </li><li> Togliere i pezzi di membrana amnion dalla enzimatica digerire soluzione in un nuovo contenitore sterile. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione enzimatica fresco digerire alla membrana amniotica e incubare a 37 ° C per 60 minuti in un bagno d&#39;acqua o una stanza calda con agitando delicatamente (prima digestione). </li><li> Togliere i pezzi di membrana amnios e inserire in un nuovo contenitore cura presa per consentire alla enzimatica digerire soluzione per drenare da ogni pezzo di membrana. NOTA: Ciò può essere ottenuto trascinando pezzi amnion lungo il bordo interno del contenitore. </li><li> Aggiungere 100 ml di enzimatica fresco digeriscono soluzione ai pezzi di membrana amnios e incubare 60 minuti in un bagno di acqua o camera calda a 37 ° C con un leggero scuotimento (seconda digestione). </li><li> Passare il suspensi cellulareon dal punto 1.14 attraverso un filtro 70 micron e centrifugare a 1000 xg per 10 min. </li><li> Rimuovere e scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 4 ml HBSS contenente 1 mg / inibitore basato soia-ml. Pipettare delicatamente ripetutamente con una pipetta 1 ml per ottenere una sospensione di cellule singole. NOTA: In questa fase le cellule possono essere lasciati in ghiaccio fino cellule dal secondo digest sono nella stessa fase di lavorazione. </li><li> Togliere i pezzi di membrana amnios e inserire in un nuovo contenitore cura presa per consentire alla enzimatica digerire soluzione per drenare da ogni pezzo di membrana. NOTA: Ciò può essere ottenuto trascinando pezzi amnion lungo il bordo interno del contenitore. </li><li> Passare la sospensione cellulare dal punto 1.18 attraverso un filtro 70 micron e centrifugare a 1000 xg per 10 min. </li><li> Rimuovere e scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 4 ml HBSS contenente 1 mg / inibitore basato soia-ml. Pipettare delicatamente ripetutamente con un 1 ml pipette per ottenere una sospensione di cellule singole. </li><li> Cellule piscina dal due digest o in alternativa mantenere digest cellule separate fino a dopo il conteggio delle cellule. NOTA: Questo impedisce la miscelazione di cellule viabilità potenzialmente bassi con cellule di alta redditività. </li><li> Aggiungere HBSS ad un volume finale di 10-20 ml ed eseguire la conta delle cellule utilizzando trypan blu per misurare la vitalità. </li><li> Confermare il fenotipo delle cellule epiteliali mediante citometria a flusso. Make up adeguati cocktail di anticorpi con anti-EpCAM-PE (diluizione 1: 2) anti-CD90-PeCy5 (1: 250) e anti-CD105-APC (1: 100) in HBSS. </li><li> Risospendere un sottoinsieme di cellule da uno o entrambi i digest del cocktail di anticorpi ad una concentrazione di 25 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Per la citometria a flusso, macchia 1 x 10 6 cellule con un cocktail di anticorpi contenenti controlli isotipici (ad es. Controllo-PE IgG 1 isotipo + anti-CD90-PeCy5 + anti-CD105-APC). Mantenere ~ 1 x 10 6 cellule senza macchia per citofluorimetro set-up. </li><li> Incubare cellule anticorpococktail a 4 ° C per 60 min. </li><li> Lavare le cellule 3x in HBSS e risospendere tra i 5 ei 10 milioni di cellule per ml di citometria a flusso. </li><li> Eseguire citometria di flusso e risultati di nota. La purezza del campione isolato cella (la percentuale di EpCAM positive e CD90 / CD105 cellule negative) dovrebbe essere rispettivamente 90-95% e &lt;1%. </li><li> Mettere da parte un adeguato numero di cellule per test di criteri di controllo della qualità o di rilascio appropriate come determinato dall&#39;applicazione finale. NOTA: Questo può includere malattia / di screening virale, o altro di sicurezza o criteri biologici. </li><li> Per le cellule rimanenti, seguire il protocollo di crioconservazione, o in alternativa, inserire direttamente nella cultura (diretta alla cultura passo 3.6). </li></ol> 2. Crioconservazione di hAECs <ol style="margin-left: 40px;"><li> Determinare numero di cellulare e la vitalità con citometria a flusso di dati o di conteggio manuale con trypan esclusione blu. </li><li> Centrifugare a 700 xg per 5 min. </li><li> Cell Risospenderes tra 1-10000000 cellule per ml in animali crioconservazione multimediale gratuito prodotto. </li><li> Pipettare un volume adeguato di cellule in vials crioconservazione O-anelli e posto in un apparato velocità di congelamento controllato dove avviene il raffreddamento a circa 1 ° C / min fino a -80 ° C si ottiene. </li><li> Trasferire fiale in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li></ol> 3. scongelamento e Cultura Cyropreserved hAECs <ol style="margin-left: 40px;"><li> Rimuovere le fiale di crioconservazione di azoto liquido e disporli sul ghiaccio. NOTA: solo per il trasferimento - procedere rapidamente alla fase successiva. </li><li> Scongelare le fiale crioconservazione rapidamente a 37 ° C fino a che solo una piccola parte (~ 5 mm x 5 mm) del ghiaccio rimane. NOTA: È importante che la soluzione cella non riscalda per ridurre gli effetti tossici di DMSO nei media crioconservazione. </li><li> Diluire mezzi crioconservazione 10 volte con il freddo (~ 4 ° C), i media senza siero, goccia a goccia in un formato adatto aggiuntod tubo o contenitore. </li><li> Centrifugare a 700 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere in mezzo privo di siero, ad una concentrazione di circa 1 milione di cellule per ml. Determinare numero di cellulare e la vitalità con conteggio automatico o manuale con trypan esclusione blu. Previsto vitalità post-scongelamento sarà 5-10% in meno rispetto redditività pre-crioconservazione. </li><li> Cellule piastra su standard di coltura cellulare trattati e plastico, o in alternativa utilizzare collagene di tipo I per le superfici di cultura cappotto. </li><li> Per tipo I rivestimento collagene seguire il protocollo di seguito <ol><li> Preparare l&#39;acido tipo solubile I collagene dalla placenta umana (15 mg di collagene con 25 ml di acqua deionizzata e 50 ml di acido acetico glaciale). </li><li> Coprire bicchiere con Parafilm e agitazione moderata a 37 ° C fino a filamenti di collagene sono sciolte. </li><li> Soluzione filtro collagene sterile utilizzando un filtro di 0,22 micron. </li><li> Diluire il collagene magazzino 01:10 filtrata con acqua deionizzata. Questa azione diluito è la conce di lavoroSoluzione ntration per superfici di rivestimento in plastica e membrana. </li><li> Collagene plastica cappotto, superfici di vetro e membrana per 2 ore a temperatura ambiente a 37 ° C, o O / N a 2-8 ° C. </li><li> Rimuovere il liquido in eccesso dalla superficie rivestita, e lasciarlo asciugare O / N. </li><li> Risciacquare con acqua di grado colture di tessuti sterili o HBSS prima di introdurre cellule e mezzo. </li></ol></li><li> HAECs piastra a una densità di 25.000 cellule / cm 2 in terreno privo di siero, e consentono il collegamento a verificarsi per 72-96 ore. </li><li> Dopo allegato, cambiare supporto con attenzione aspirare e sostituirli con un opportuno volume di mezzo privo di siero ogni 2-3 giorni. </li><li> Cellule Passage che utilizzano il protocollo di seguito <ol><li> Mezzi di coltura cellulare Aspirare e lavare con il volume di 1x sterile HBSS </li><li> Aggiungere il volume 1x enzimatica digerire soluzione e incubare per 5-15 minuti, o fino a quando le cellule sono osservati staccano dalla superficie di coltura cellulare. </li><li> Raccogliere enzimatica digerire soluzione contenente le cellule, garantendo cells sono staccati dalla superficie coltura cellulare pipettando ripetutamente il enzimatica digerire soluzione contro la superficie di coltura cellulare </li><li> Centrifugare a 700 xg per 5 min. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in un volume adeguato di HBSS contenente 1 mg / inibitore enzimatico a base di soia-ml. Pipettare delicatamente ripetutamente con una pipetta 1 ml per ottenere una sospensione di cellule singole. </li><li> Aggiungere mezzo privo di siero ad una concentrazione approssimativa di 1 milione di cellule / ml. Determinare numero di cellulare e la vitalità con conteggio automatico o manuale con trypan esclusione blu. </li><li> HAECs piastra a una densità di 25.000 cellule / cm 2 in terreno privo di siero, e continuare con i metodi di coltura standard. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Ci sono diversi parametri critici che possono avere un impatto significativo per il successo di questa metodologia. Conservazione della placenta o amnion fino a 3 ore prima isolamento di hAECs può essere desiderabile per scopi logistici o di programmazione, ma si raccomanda che il tessuto viene elaborata appena possibile. Se il tessuto deve essere memorizzato, si raccomanda di memorizzazione eseguito in seguito dissezione e lavaggio della membrana amnion. Amnion può essere immagazzinato in HBSS sterili contenenti anti...

Le cellule derivate da fonti perinatali, come la placenta, membrane placentari, cordone ombelicale e liquido amniotico hanno attirato l&#39;attenzione dei ricercatori e clinici come potenziale fonte di cellule per la medicina rigenerativa 1,2. La ragione di questo interesse è che questi tipi di cellule tutti possiedono un certo grado di plasticità e immunomodulatorie capacità 3, proprietà che sono fondamentali per loro potenziali applicazioni terapeutiche. hAECs sono una popolazione eterogenea epiteliale che può derivare dal termine o pre-termine membrana amniotica 4, fornendo una abbondante fonte potenziale di materiale cellulare rigenerativa. Le proprietà che rendono hAECs accattivanti come terapia cellulare comprendono la multipotenza, bassa immunogenicità, e le proprietà anti-infiammatorie. hAECs sono stati trovati per essere altamente multipotenti sia in vitro che in vivo, in grado di differenziarsi in linee mesodermici (cardiomyocytes, miociti, osteociti, adipociti), lignaggi endodermici (cellule pancreatiche, cellule epatiche, cellule polmonari) e lignaggi ectodermiche (capelli, pelle, cellule neurali e astrociti) 5-10. Rassicurante, nonostante le loro hAECs multipotenza non sembrano né formare tumori o promuovere lo sviluppo del tumore in vivo. Inoltre, hAECs sono immuni privilegiata, esprimendo bassi livelli di classe II antigeni leucociti umani (HLA) 8. La struttura, probabilmente alla base la capacità di eludere rigetto immunitario dopo il trapianto allogenico e xenogenica, come dimostrato in studi che utilizzano scimmie immunitarie competenti, conigli, cavie, topi e maiali 11-13. hAECs visualizzare potenti immunomodulante proprietà immunosoppressive e quindi offrono notevoli vantaggi pratici per le potenziali applicazioni cliniche nella terapia delle malattie autoimmuni. hAECs si ritiene di esercitare le funzioni di immunomodulatori sia sul sistema immunitario innato e adattativo. Sue dei meccanismi proposti, è attraverso la secrezione di fattori immunomodulante 14. Le attuali applicazioni di hAECs in modelli di malattia degli animali pre-clinici comprendono il trattamento di ictus, sclerosi multipla, malattia del fegato, diabete e malattie polmonari croniche e acute. I ricercatori hanno mostrato interesse ad utilizzare hAECs per il trattamento di post-ictus infiammazione del cervello a causa delle loro proprietà uniche. Ci sono prove che hAECs può attraversare la barriera emato-encefalica, dove possono innestare, sopravvivere fino a 60 giorni, differenziarsi in neuroni, diminuire l&#39;infiammazione e promuovere la rigenerazione del tessuto danneggiato del sistema nervoso centrale in modelli animali di malattie neurologiche 15. hAECs offrono la possibilità di individuare e invertire molteplici percorsi patologici che contribuiscono allo sviluppo e la progressione della sclerosi multipla. Ad esempio, i risultati di studi su animali pre-clinici suggeriscono che hAECs fortemente immunosoppressiva epuò potenzialmente indurre tolleranza immunitaria periferica e invertire risposte infiammatorie in corso. hAECs hanno anche dimostrato di avere la capacità di differenziarsi in cellule neurali in vivo e migliorare neurorigenerazione endogena attraverso la secrezione di una vasta gamma di fattori neurotrofici 16. Cellule epiteliali umane e roditori amniotiche hanno già dimostrato la loro efficacia terapeutica per il trattamento della malattia epatica in modelli animali. In un modello di tetracloruro di carbonio induzione danni delle malattie del fegato, il trapianto haec portare ad attecchimento di hAECs vitali nel fegato, accompagnato con una ridotta epatociti apoptosi, e diminuito l&#39;infiammazione epatica e fibrosi 17. hAECs può essere stimolato da fattori pancreatiche espresse compreso insulina e glucosio trasportatori. Diversi studi hanno indagato la possibilità di hAECs per ripristinare i livelli di glucosio nel sangue in topi diabetici 18. Nei topi che ricevehAECs, sia di peso e di glucosio nel sangue i livelli del corpo animale è sceso a livelli normali dopo l&#39;iniezione di cellule. Questi studi presentano un caso forte per l&#39;uso di hAECs per il trattamento del diabete mellito. hAECs hanno un ruolo provata nella prevenzione e riparazione di sperimentale danno polmonare acuto e cronico in modelli neonatali 19 adulti e. Questi studi hanno trovato che hAECs differenziano in vitro in cellule epiteliali polmonari funzionale che esprimono più proteine ​​polmonari associate, tra cui la fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR), il canale ionico che è mutato in pazienti affetti da fibrosi cistica 20. Inoltre, quando hAECs vengono consegnati l&#39;adulto ferito e polmonare neonatale, che esercitano i loro effetti riparatori tramite la modulazione delle cellule immunitarie dell&#39;ospite, riducendo il reclutamento dei leucociti polmonare, tra cui neutrofili, macrofagi e linfociti 21-23. Data la loro abbondanza,record di sicurezza, e le applicazioni cliniche collaudate per più malattie, studi clinici utilizzando hAECs è inevitabile. Con l&#39;obiettivo di accelerare la traduzione di terapie HAEC in sperimentazioni cliniche, abbiamo sviluppato metodi per isolare, criopreservare e hAECs cultura in un modo adatto per la sperimentazione clinica, utilizzando reagenti senza prodotti di origine animale in conformità alle buone pratiche di fabbricazione (cGMP) le linee guida . Abbiamo basato questo protocollo un protocollo precedentemente pubblicato che stavamo usando con successo per isolare hAECs utilizzando reagenti di origine animale 6. Abbiamo modificato il protocollo originale di sostituire i prodotti di origine animale con reagenti privi di prodotti animali, e la successiva ottimizzazione è stata eseguita per ottimizzare il rendimento delle cellule, la vitalità e purezza. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un protocollo che rispettare le norme regolamentari per la produzione di celle per test clinici sull&#39;uomo.

<table><tbody><tr><td>Collection Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stripping tray</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-361B</td><td></td></tr><tr><td>Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17329&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Scissors - Sharp/Blunt Straight</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0562592&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile latex gloves&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Protective Apparel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protective Apparel (Gown)</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Isolation gowns</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Sterile latex gloves&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>General purpose face mask</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7511</td><td></td></tr><tr><td>Bonnets</td><td>Medline</td><td>CRI1001</td><td></td></tr><tr><td>Shoe covers</td><td>U-line</td><td>S-7873W</td><td></td></tr><tr><td>Media and Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td>without calcium or magnesium</td></tr><tr><td>TrypZean (animal product&amp;ndash;free recombinant trypsin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3449</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor&amp;nbsp; 1g/50mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife Solutions</td><td>205102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EpCam-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130 - 091-253</td><td></td></tr><tr><td>PE-isotype control</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-845</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-PeCy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555597</td><td></td></tr><tr><td>PeCy5-isotype control</td><td>BD Pharmingen</td><td>557224</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD105-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>APC-isotype control</td><td>BD Pharmingen</td><td>340754</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type VI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356550</td><td></td></tr><tr><td>10 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon tubes</td><td>BD/Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml falcon tubes</td><td>BD/Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Petri dishes</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m filters</td><td>BD/Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m filters</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pipette tips</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-401</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l Pipette tips</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-409</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Syringe</td><td>BD/Medical</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>Plastic spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-245-97&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Plastic weighing boat</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-102&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cryo vials</td><td>Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr Frosty</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biohazard Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, cryopreservation and culture of human amnion epithelial cells for clinical applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

Quando questa procedura è seguita correttamente, una resa media di 120 milioni di hAECs dovrebbe essere previsto, con un raggio di 80-160,000,000 cellule. Da queste rese, una redditività media di 83 ± 4% può essere previsto. La maggiore resa media e leggermente inferiore redditività nel metodo clinica possono essere dovuti all&#39;attività tripsina superiore prodotto di origine animale, e forse anche a causa della mancanza di proteine ​​del siero. Isolati hAECs hanno un profilo medio della superficie cellulare...

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Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolamento, Crioconservazione e Cultura umani Cellule epiteliali Amnion per le applicazioni cliniche

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

isolation-cryopreservation-culture-human-amnion-epithelial-cells-for

Research

JoVE Journal

Medicine

13.8K Views.  Wake Forest University Health Sciences. We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines. 

Video: Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

Isolamento di cellule staminali mesenchimali umane e la loro coltivazione in poroso Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

A Novel cultura Modello pluripotenti staminali umane propagazione delle cellule su Gelatina in Media Placenta condizionata

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

Riprogrammazione primario del liquido amniotico e le celle a membrana di pluripotenza in condizioni prive di Xeno

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

Isolamento delle cellule stromali dell'endometrio umane per In Vitro decidualizzazione

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congelamento e scongelamento cellule staminali embrionali umane

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Biologia

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that the amniotic epithelium is a homogeneous layer. The human amnion can be divided into three anatomical regions: reflected, placental, and umbilical. Each region has different physiological roles, such as in pathological conditions. Here, we describe a protocol to dissect human amnion tissue in three sections and maintain it in vitro. In culture, cells derived from the reflected amnion displayed a cuboidal morphology, while cells from both placental and umbilical regions were squamous. Nonetheless, all the cells obtained have an epithelial phenotype, demonstrated by the immunodetection of E-cadherin. Thus, because the placental and reflected regions in situ differ in cellular components and molecular functions, it may be necessary for in vitro studies to consider these differences, because they could have physiological implications for the use of HAEC in biomedical research and the promising application of these cells in regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane to determine their heterogeneity and functional properties for possible application in clinical and physiopathological models.

Cultura in vitro di cellule epiteliali provenienti da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

Cultura di cellule staminali pluripotenti umane il polivinil alcool-Co-itaconico acido idrogel con diverse rigidità nelle circostanze senza Xeno

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Bioingegneria

Avanzamento della crioconservazione delle cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali umane

Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in individuals with retinal degenerative diseases; however, studies on the stable and secure banking of these therapeutic cells are scarce. Highly variable cell viability and functional recovery of&#160;RPE cells after cryopreservation are the most commonly encountered issues. In the present protocol, we aimed to achieve the best cell recovery rate after thawing by selecting the optimal cell phase for freezing based on the original experimental conditions. Cells were frozen in the exponential phase determined by using the 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine labeling assay, which improved cell viability and recovery rate after thawing. Stable and functional cells were obtained shortly after thawing, independent of a long differentiation process. The methods described here allow the simple, efficient, and inexpensive preservation and thawing of hESC-derived RPE cells. Although this protocol focuses on RPE cells, this freezing strategy may be applied to many other types of differentiated cells.

Autore in primo piano: Sviluppo di un metodo efficiente e fattibile per il congelamento delle cellule epiteliali pigmentate retiniche

This study provides a detailed protocol for the efficient cryopreservation of human stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.

Crioconservazione di cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane allo stadio ottimale

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in ...

Isolamento, Crioconservazione e Cultura umani Cellule epiteliali Amnion per le applicazioni cliniche

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Isolamento di cellule staminali mesenchimali umane e la loro coltivazione in poroso Bone Matrix

A Novel cultura Modello pluripotenti staminali umane propagazione delle cellule su Gelatina in Media Placenta condizionata

Riprogrammazione primario del liquido amniotico e le celle a membrana di pluripotenza in condizioni prive di Xeno

Isolamento delle cellule stromali dell'endometrio umane per In Vitro decidualizzazione

Congelamento e scongelamento cellule staminali embrionali umane

Cultura in vitro di cellule epiteliali provenienti da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana

Cultura di cellule staminali pluripotenti umane il polivinil alcool-Co-itaconico acido idrogel con diverse rigidità nelle circostanze senza Xeno

Crioconservazione di cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane allo stadio ottimale

Crioconservazione di cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane allo stadio ottimale

Crioconservazione di cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane allo stadio ottimale