Name: isolation, cryopreservation and culture of human amnion epithelial cells for clinical applications
Uploaded: 2014-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications at JoVE.com

The authors acknowledge financial support from the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

NOTA: Prematuro da Placenta devem ser coletadas de gravidezes saudáveis ​​Singleton, com uma preferência para cesarianas eletivas prazo. Escrito, o consentimento informado deve ser dada para a coleção de sua placenta. Seu comitê de ética em pesquisa em humanos relevantes devem aprovação totalidade da recolha e utilização de tecidos humanos. 1. Isolamento de Células Epiteliais Amnion <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque a placenta em uma superfície estéril dentro de uma cabine de segurança biológica classe II. </li><li> Usando novelos estéreis solução salina equilibrada (HBSS), lavar o máximo de sangue possível da superfície da placenta e membranas. </li><li> Com a placenta colocada com o cordão umbilical voltada para cima, mecanicamente separar o bordo exterior das membranas de âmnio e cório. </li><li> Uma vez separados, retirar manualmente a membrana âmnio do cório membrana da placenta, trabalhando em torno da borda da membrana, para o cordão umbilical. Nota: Tenha careful para remover quaisquer peças de contaminar membrana cório do âmnio. </li><li> Com uma tesoura estéreis, cortar a membrana âmnio aproximadamente a 2 cm da base do cordão umbilical e introduzir num recipiente selado a 500 ml contendo 250 ml de HBSS. </li><li> Lavar cuidadosamente agitando o frasco lacrado contendo a membrana amnion. </li><li> Retire a membrana amnion do recipiente de coleta usando uma pinça estéril, e coloque em uma placa de Petri de 15 cm. </li><li> Corte a membrana amnion em pedaços de aproximadamente 5 cm de comprimento (quando mantido verticalmente com uma pinça), rejeitando pedaços sangrentos ou rasgadas. </li><li> Coloque em um recipiente de 500 ml selado e lavar com 250 ml HBSS aproximadamente 3-5 vezes ou até que a membrana amnion se torna translúcido com o sangue não contaminante. NOTA: Qualquer presença de sangue pode reduzir a eficiência da solução enzimática digerir. </li><li> Transferir todos os pedaços de membrana âmnio para um recipiente contendo 50 ml de solução enzimática a digerir, tendo o cuidado deminimizar transição de HBSS. </li><li> Incubar as peças em âmnio enzimática solução num banho de água quente ou quarto digerem a 37 ° C durante 15 min com agitação suave para remover todo o sangue restante. </li><li> Retire os pedaços de membrana amnion da solução enzimática e coloque em um novo recipiente estéril digerir. </li><li> Adicionar 100 ml de solução enzimática fresca digerir à membrana âmnio e incubar a 37 ° C durante 60 min num banho de água ou sala quente com agitação suave (primeiro a digestão). </li><li> Retire os pedaços de membrana âmnio e coloque em nova tomada recipiente cuidado para permitir a digestão enzimática solução para drenar a partir de cada pedaço de membrana. NOTA: Este pode ser conseguido arrastando pedaços âmnio ao longo da borda interior do recipiente. </li><li> Adicione 100 ml de enzimática fresco digerir solução para as peças de membrana âmnio e incubar 60 min em banho-maria ou sala quente a 37 ° C com agitação suave (segunda digestão). </li><li> Passe o suspensi celularem Passo de 1,14 por meio de um filtro de 70 ^ m e de centrifugação a 1000 xg durante 10 min. </li><li> Remover e descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 4 ml de HBSS contendo 1 mg / ml de inibidor de enzima à base de soja. Pipeta suavemente várias vezes com uma pipeta de 1 ml para se obter uma suspensão de célula única. NOTA: Nesta fase, as células podem ser deixadas em gelo até que as células da segunda digestão estão na mesma fase de processamento. </li><li> Retire os pedaços de membrana âmnio e coloque em nova tomada recipiente cuidado para permitir a digestão enzimática solução para drenar a partir de cada pedaço de membrana. NOTA: Este pode ser conseguido arrastando pedaços âmnio ao longo da borda interior do recipiente. </li><li> Passar a suspensão de células a partir do Passo 1,18 através de um filtro de 70 ^ m e centrifugar a 1000 xg durante 10 min. </li><li> Remover e descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 4 ml de HBSS contendo 1 mg / ml de inibidor de enzima à base de soja. Pipeta suavemente várias vezes com 1 mL de pipette para obter uma suspensão de célula única. </li><li> Piscina células das duas digestões, alternativamente, manter ou digestões de células separadas após a contagem de células. NOTA: Isso impede que a mistura de células potencialmente baixa viabilidade com células de alta viabilidade. </li><li> Adicionar HBSS para um volume final de 10-20 mL e realizar a contagem de células utilizando azul de tripano para medir a viabilidade. </li><li> Confirmar o fenótipo de células epiteliais por citometria de fluxo. Perfaz-se misturas de anticorpos apropriados utilizando anti-EpCAM-PE (diluição 1: 2) de anti-CD90-PeCy5 (1: 250) e anti-CD105-APC (1: 100) em HBSS. </li><li> Ressuspender um subconjunto de células a partir de uma ou ambas as digestões do coquetel de anticorpo numa concentração de 25 x 10 6 células / ml. </li><li> Por citometria de fluxo, manchas de 1 x 10 6 células com misturas de anticorpos contendo controlos do isotipo de controlo (por exemplo. EP-IgG de isotipo 1 + anti-CD90-PeCy5 + anti-CD105-APC). Mantenha ~ 1 x 10 6 células unstained para citômetro de fluxo set-up. </li><li> Incubar as células em anticorpococktails a 4 ° C durante 60 min. </li><li> Lavar as células 3 vezes em HBSS e ressuspender em 5 a 10 milhões de células por ml para citometria de fluxo. </li><li> Execute citometria de fluxo e os resultados de nota. A pureza do isolado de células (a percentagem de EpCAM positiva e CD90 / CD105 células negativas) deverá ser de 90-95% e &lt;1%, respectivamente. </li><li> Separe um número adequado de células para testes de critérios de controle de qualidade ou de libertação adequadas conforme determinado pela aplicação final. NOTA: Isso pode incluir doença / triagem viral, ou outro segurança ou critérios biológicos. </li><li> Para as restantes células, siga o protocolo de criopreservação, ou, alternativamente, coloque diretamente na cultura (direto à cultura passo 3.6). </li></ol> 2. Criopreservação de hAECs <ol style="margin-left: 40px;"><li> Determinar o número e viabilidade celular utilizando citometria de fluxo de dados ou contagem manual com exclusão do azul de tripan. </li><li> Centrifugar a 700 xg por 5 min. </li><li> Célula Resuspendas entre 1-10 milhões de células por ml em animais media criopreservação livre de produto. </li><li> Pipetar um volume adequado de células para frascos de crioconservação anéis-O e colocar em um aparelho de congelamento controlado arrefecimento onde ocorre a aproximadamente 1 ° C / min até -80 ° C é alcançada. </li><li> Transferir frascos em azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo. </li></ol> 3. O descongelamento e Cultura da Cyropreserved hAECs <ol style="margin-left: 40px;"><li> Retirar os frascos de criopreservação de nitrogênio líquido e colocar no gelo. Nota: Somente Para transferência - proceder rapidamente à próxima etapa. </li><li> Descongelar as ampolas rapidamente criopreservação a 37 ° C até que apenas uma pequena parte (aproximadamente 5 x 5 mm) de gelo mantém-se. NOTA: É importante que a solução de células não aquecer para reduzir os efeitos tóxicos de DMSO no meio de criopreservação. </li><li> Diluir media criopreservação 10 vezes com (~ 4 ° C) meios livres de soro gelado, gota a gota, em um tamanho adequado adicionadod tubo ou recipiente. </li><li> Centrifuga-se a 700 xg durante 5 min à TA. </li><li> Ressuspender em meio isento de soro, a uma concentração aproximada de 1 milhão de células por ml. Determinar o número e viabilidade celular utilizando contagem automatizado ou manual, com exclusão do azul de tripan. Esperado viabilidade pós-descongelamento será 5-10% menos de viabilidade pré-criopreservação. </li><li> Células placa em células tratadas com cultura plásticas padrão, ou, alternativamente, usar colágeno tipo I em superfícies de cultura do casaco. </li><li> Para Tipo I revestimento Collagen seguir o protocolo abaixo <ol><li> Prepare ácido solúvel colágeno tipo I de placenta humana (colágeno 15 mg com 25 ml de água deionizada e 50 ácido acético glacial ul). </li><li> Cubra copo com Parafilm e uma agitação moderada a 37 ° C, até filamentos de colagénio são dissolvidos. </li><li> Solução de colagénio a filtração estéril utilizando um filtro de 0,22 um. </li><li> Diluir o colágeno estoque 01:10 filtrada com água deionizada. Este estoque diluída é o conce trabalhandontration solução para revestimento de superfícies de plástico e de membrana. </li><li> Revestimento de plástico colagénio, vidro e superfícies de membrana durante 2 horas à temperatura ambiente a 37 ° C, ou O / N a 2-8 ° C. </li><li> Retire o excesso de fluido da superfície revestida, e deixe-a secar O / N. </li><li> Enxágüe com água de grau de cultura de tecidos estéreis ou HBSS antes da introdução de células e meio. </li></ol></li><li> HAECs em placas a uma densidade de 25.000 células / cm2 em meio isento de soro, e para permitir a ligação ocorrer durante 72-96 hr. </li><li> Após a ligação, mudar mídia cuidadosamente aspiração e substituindo com um volume adequado de meio isento de soro a cada 2-3 dias. </li><li> Células de passagem utilizando o protocolo abaixo <ol><li> Aspirar os meios de cultura de células e lava-se com o volume de HBSS estéril 1x </li><li> Adicionar o volume 1x de solução enzimática digerir e incubar durante 5-15 minutos, ou até que as células sejam observadas separando-se da superfície da cultura de células. </li><li> Recolhe enzimática digerir solução contendo as células, garantindo cells são destacados da superfície da cultura de células pipetando repetidamente a solução enzimática contra a superfície de cultura de células digerir </li><li> Centrifugar a 700 xg por 5 min. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em um volume apropriado de HBSS contendo 1 mg / ml de inibidor de enzima à base de soja. Pipeta suavemente várias vezes com uma pipeta de 1 ml para se obter uma suspensão de célula única. </li><li> Adicionar meio isento de soro para uma concentração aproximada de 1 milhão de células / ml. Determinar o número e viabilidade celular utilizando contagem automatizado ou manual, com exclusão do azul de tripan. </li><li> HAECs em placas a uma densidade de 25.000 células / cm2 em meio isento de soro, e continuar com métodos de cultura Standard. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G., Appasani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stem Cells and Regenerative Medicine. 1, 243-264 (2011).</li><li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+fluid+and+placental+membranes:+unexpected+sources+of+highly+multipotent+cells.">Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells.</a> Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).</li><li>Parolini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+isolation+and+characterization+of+cells+from+human+term+placenta:+outcome+of+the+first+international+Workshop+on+Placenta+Derived+Stem+Cells.">Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells.</a> Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).</li><li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preterm+human+amnion+epithelial+cells+have+limited+reparative+potential.">Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential.</a> Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).</li><li>Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+pluripotent+stem+cell+line+derived+from+human+amniotic+membranes+and+initiation+of+germ+layers+in+vitro.">Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro.</a> Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).</li><li>Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+amniotic+epithelial+stem+cells.">Isolation of amniotic epithelial stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use.">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).</li><li>Ilancheran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+derived+from+human+fetal+membranes+display+multilineage+differentiation+potential.">Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential.</a> Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).</li><li>Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+amnion+epithelium+into+skin+and+hair+follicles.">Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles.</a> Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).</li><li>Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+characteristics+of+amniotic+epithelial+cells.">Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells.</a> Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).</li><li>Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+ocular+surface+with+heterologous+limbal+epithelium+and+amniotic+membrane+in+a+rabbit+model.">Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model.</a> Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).</li><li>Sankar, V., Muthusamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+in+spinal+cord+injury+repair+research.">Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research.</a> Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).</li><li>Yuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+human+amniotic+epithelial+cells+express+connexin+26+and+Na-K-adenosine+triphosphatase+in+the+inner+ear.">Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear.</a> Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppressive+factors+secreted+by+human+amniotic+epithelial+cells.">Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).</li><li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cells+ameliorate+behavioral+dysfunction+and+reduce+infarct+size+in+the+rat+middle+cerebral+artery+occlusion+model.">Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model.</a> Shock. 29 (5), 603-611 (2008).</li><li>Venkatachalam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+neurotrophic+factor+secreted+by+amniotic+epithelial+cells.">Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells.</a> Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).</li><li>Manuelpillai, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+induces+markers+of+alternative+macrophage+activation+and+reduces+established+hepatic+fibrosis.">Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis.</a> PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).</li><li>Wei, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion-isolated+cells+normalize+blood+glucose+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice.">Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+prevent+bleomycin-induced+lung+injury+and+preserve+lung+function.">Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function.</a> Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).</li><li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+induced+to+express+functional+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).</li><li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+do+not+abrogate+pulmonary+fibrosis+in+mice+with+impaired+macrophage+function.">Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function.</a> Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).</li><li>Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cells+as+a+candidate+therapy+for+acute+and+chronic+lung+injury.">Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury.</a> Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).</li><li>Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+mediate+lung+repair+by+directly+modulating+macrophage+recruitment+and+polarization.">Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization.</a> , (2013).</li><li>Litvinov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+adhesion+molecule+(Ep-CAM)+modulates+cell-cell+interactions+mediated+by+classic+cadherins.">Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).</li><li>Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+cell+adhesion+molecule+(Ep-CAM)+as+a+morphoregulatory+molecule+is+a+tool+in+surgical+pathology.">The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology.</a> The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).</li><li>Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+obtained+from+different+human+tissues.">Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues.</a> Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).</li><li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , 119-137 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Existem vários parâmetros críticos que podem ter um impacto significativo no sucesso desta metodologia. Armazenamento da placenta ou âmnio por até 3 horas antes do isolamento do hAECs pode ser desejável para fins de logística ou programação, no entanto, recomenda-se que o tecido seja processado o mais rapidamente possível. Se o tecido é para ser armazenada, é recomendado que o armazenamento ser realizada seguindo esvaziamento e lavagem da membrana âmnio. Âmnio pode ser armazenado em HBSS estéril contendo antibióticos a 4 ° C, no entanto, a viabilidade celular pode diminuir com o tempo de armazenamento prolongado. Nós, e outros encontraram variabilidade na produtividade e viabilidade celular, e para minimizar essa variabilidade é recomendado que placenta são coletados de nascimentos a termo saudáveis, de preferência, de parto cesáreo. Descobrimos que a contaminação da membrana âmnio com células de sangue irá resultar em inibição da actividade da enzima e uma redução no rendimento das células. Portantoum passo crítico no protocolo é a lavagem completa da placenta e o âmnio membrana é recomendado. Recomenda-se que o tecido amnion ser lavado até que ele apareça branco / clara para evitar inibição da enzima downstream. O isolamento de uma população relativamente homogénea de células epiteliais é importante para testes de caracterização e de controlo de qualidade. Se ocorre rendimentos baixos, a viabilidade ou a contaminação do rendimento celular com células mesenquimais há várias modificações que podem ser realizadas para solucionar problemas. Se os rendimentos são baixos de células, é provável que a actividade enzimática foi inibida devido à contaminação do sangue ou soro. Isso pode ser resolvido com etapas de lavagem mais completas e adicionais e / ou descartar peças amnion sangrentas ou contaminados. Enzima tempo de incubação pode também ser aumentada, mas este pode ser prejudicial para a viabilidade celular. A diminuição da viabilidade ou contaminação com células mesenquimais podem ser evitados através da diminuição do tempo de digest. No entanto, this podem também diminuir o rendimento total de células. Tempos que variam entre 30 minutos e 2 horas pode ser utilizado para este protocolo. Estes tempos precisam ser otimizados para a pureza de célula desejada e rendimento total / viabilidade. Uma limitação desta técnica é que o aumento de rendimento celular ou a viabilidade podem vir em detrimento do outro. Além disso, os componentes isentos de soro não são actualmente tão eficaz para manter a viabilidade das células após exposição a actividade enzimática. As células podem ser criopreservados, sem qualquer diminuição importante na viabilidade ou perda do metabolismo celular por armazenamento em um sistema de nitrogênio líquido a temperatura controlada. Isto pode variar de um dispositivo de criopreservação cheio de isopropanol simples de um sistema de state-of-the-art controlada taxa de congelamento. Para o nosso conhecimento, a taxa de congelamento ideal para hAECs neste sistema ainda não foi determinada, no entanto, a taxa normal de 1 ° C / min resultados na manutenção adequada da viabilidade celular e metabolismo pós-descongelamento. Durante a descongelação of células criopreservadas, é importante para manter o tempo de descongelamento para um mínimo para reduzir a exposição das células a DMSO. As células podem anexar e proliferar a uma taxa inferior após a criopreservação e descongelamento em comparação com a cultura de células recentemente isoladas. Para aplicação clínica, pode ser desejável para células de cultura para aumentar o número de células ou a jusante para a caracterização e / ou manipulação in vitro. Os leitores devem entender como seu específico manipulação in vitro pode alterar as vias regulatórias envolvidas na aplicação clínica destas células. Nós investigamos que um animal livre de produto meio de cultura, como EpiLife era adequado para a manutenção e expansão da hAECs. No entanto, é necessário optimizar as concentrações do factor de crescimento para atingir taxas de crescimento aumentados para tal tipo de célula. O problema de aderência durante a cultura de células, utilizando uma matriz de colagénio humano de revestimento, aumenta a eficiência de plaqueamento. No entanto, após prolongada eXposure a digestão enzimática a eficiência de revestimento será sub-óptima. Em resumo, este protocolo foi desenvolvido para facilitar o isolamento e cultura de células humanas epiteliais (amnion hAECs) utilizando reagentes livre de produtos de origem animal, de acordo com boas práticas de fabricação atuais (cGMP) orientações. A vantagem do presente método em comparação com métodos alternativos de isolamento, é que estas células podem ser isoladas, caracterizado criopreservadas e cultivadas sem o risco de entregar agentes patogénicos de origem animal potencialmente nocivos para os seres humanos, mantendo ao mesmo tempo os rendimentos celulares adequadas, viabilidades e potencial de crescimento. Para os pesquisadores que se deslocam de estudos em animais pré-clínicos para ensaios clínicos, estas metodologias irá acelerar a aprovação regulamentar, diminuir os riscos e melhorar a qualidade de sua população de células terapêutico.

Células derivadas de fontes perinatais, como a placenta, membranas da placenta, do cordão umbilical e líquido amniótico têm atraído a atenção de pesquisadores e clínicos como uma fonte potencial de células para a medicina regenerativa 1,2. A razão para este interesse é que estes tipos de células todos possuem algum grau de plasticidade e imunomodulador capacidade 3, as propriedades que são fundamentais para as suas potenciais aplicações terapêuticas. hAECs são uma população heterogénea epitelial que podem ser derivados de termo ou pré-termo membrana âmnio 4, proporcionando uma fonte potencial abundante de material celular regenerativo. As propriedades que tornam hAECs atraentes como uma terapia celular incluem a sua multipotência, baixa imunogenicidade, e propriedades anti-inflamatórias. hAECs foram encontrados para ser altamente multipotentes in vitro e in vivo, capaz de se diferenciar em linhagens mesodérmica (cardiomyocytes, miócitos, osteócitos, adipócitos), linhagens endoderme (células pancreáticas, células hepáticas, células do pulmão) e linhagens ectodérmica (cabelo, pele, células neurais e astrócitos) 5-10. Reassuringly, apesar de suas hAECs multipotency parecem não quer formar tumores ou promover o desenvolvimento do tumor in vivo. Além disso, hAECs também são imunes privilegiado, expressando baixos níveis de classe II antígenos leucocitários humanos (HLA) 8. Esta propriedade provável subjaz a sua capacidade de fugir rejeição imunológica após o transplante alogênico e xenogênico, como demonstrado em estudos com macacos imunes competentes, coelhos, porquinhos da índia, ratos e porcos 11-13. hAECs exibir imunomodulador potente e propriedades imunossupressoras e, assim, oferecer vantagens práticas significativas para potenciais aplicações clínicas em terapia doença auto-imune. hAECs são acreditados para exercer funções imunomoduladoras em ambos os sistemas imune inata e adaptativa. Eme dos mecanismos sugeridos, é através da secreção de factores de 14 imunomodulador. As aplicações atuais de hAECs em modelos pré-clínicos de doenças animais incluem o tratamento de acidente vascular cerebral, esclerose múltipla, doença hepática, diabetes e doenças pulmonares crônicas e agudas. Pesquisadores demonstraram interesse em utilizar hAECs para tratar pós-AVC inflamação do cérebro, devido às suas propriedades únicas. Há evidências de que hAECs pode atravessar a barreira sanguínea do cérebro, onde eles podem enxertar, para sobreviver até 60 dias, diferenciar-se em neurónios, diminuir a inflamação e promover a regeneração de tecido danificado sistema nervoso central em modelos animais de doenças neurológicas 15. hAECs oferecer a capacidade de segmentar e reverter várias vias patológicas que contribuem para o desenvolvimento e progressão de esclerose múltipla. Por exemplo, os resultados de estudos animais pré-clínicos sugerem que hAECs são fortemente e imunossupressorapodem potencialmente induzir tolerância imunológica periférica e reverter respostas inflamatórias em curso. hAECs também têm mostrado ter a capacidade de se diferenciarem em células neuronais in vivo e aumentar neuroregeneração endógeno através da secreção de uma vasta gama de factores neurotróficos 16. Células epiteliais humanas e de roedores âmnio já demonstraram a sua eficácia terapêutica para o tratamento de doença do fígado em modelos animais. Em um modelo de indução de lesão tetracloreto de carbono de doença hepática, HAEC transplante liderança para enxerto de hAECs viáveis ​​no fígado, acompanhado de uma diminuição da apoptose dos hepatócitos, e diminuição da inflamação hepática e fibrose 17. hAECs podem ser estimulados com factores pancreáticos expressas incluindo insulina e transportadores de glicose. Diversos estudos têm investigado o potencial de hAECs para restaurar os níveis de glicose no sangue em ratos diabéticos 18. Em ratos que receberamhAECs, tanto a nível de peso e de glicose no sangue do corpo de animais diminuiu para níveis normais após a injeção das células. Estes estudos apresentam um caso forte para o uso de hAECs para o tratamento da diabetes mellitus. hAECs têm um papel comprovada na prevenção e reparação da lesão pulmonar aguda e crônica em adultos e modelos neonatais 19. Estes estudos revelaram que hAECs diferenciarem in vitro em células epiteliais do pulmão funcional que expressam múltiplas proteínas associadas à pulmão, incluindo fibrose cística da condutância transmembranar regulador (CFTR), o canal de iões, que é transformado em pacientes com fibrose cística 20. Além disso, quando hAECs são entregues para o adulto lesionado e pulmonar neonatal, que exercem os seus efeitos através da modulação de reparação de células imunitárias do hospedeiro, reduzindo o recrutamento de leucócitos pulmonar, incluindo neutrófilos, macrófagos e linfócitos 21-23. Dada a sua abundância,registro de segurança, e aplicações clínicas comprovadas para várias doenças, os ensaios clínicos utilizando hAECs é inevitável. Com o objetivo de acelerar a tradução de terapias em HAEC de ensaios clínicos, desenvolvemos métodos para isolar, criopreservar e hAECs cultura de uma maneira adequada para os ensaios clínicos, utilizando reagentes sem produtos de origem animal, de acordo com boas práticas de fabricação atuais (cGMP) orientações . Baseamos este protocolo um protocolo publicado anteriormente que estávamos usando com sucesso para isolar hAECs utilizando reagentes de origem animal 6. Nós alteramos o protocolo original para substituir os produtos derivados de animais com reagentes livre de produtos de origem animal, e posterior otimização foi realizada para otimizar o rendimento das células, viabilidade e pureza. Nosso objetivo foi desenvolver um protocolo que iria cumprir com as normas regulamentares de fabricação de células para testes clínicos em humanos.

<table><tbody><tr><td>Collection Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stripping tray</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-361B</td><td></td></tr><tr><td>Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17329&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Scissors - Sharp/Blunt Straight</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0562592&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile latex gloves&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Protective Apparel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protective Apparel (Gown)</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Isolation gowns</td><td>U-line</td><td>S-15374-M</td><td></td></tr><tr><td>Sterile latex gloves&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-643&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>General purpose face mask</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7511</td><td></td></tr><tr><td>Bonnets</td><td>Medline</td><td>CRI1001</td><td></td></tr><tr><td>Shoe covers</td><td>U-line</td><td>S-7873W</td><td></td></tr><tr><td>Media and Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td>without calcium or magnesium</td></tr><tr><td>TrypZean (animal product&amp;ndash;free recombinant trypsin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3449</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor&amp;nbsp; 1g/50mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife Solutions</td><td>205102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EpCam-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130 - 091-253</td><td></td></tr><tr><td>PE-isotype control</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-845</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-PeCy5</td><td>BD Pharmingen</td><td>555597</td><td></td></tr><tr><td>PeCy5-isotype control</td><td>BD Pharmingen</td><td>557224</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD105-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>APC-isotype control</td><td>BD Pharmingen</td><td>340754</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type VI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356550</td><td></td></tr><tr><td>10 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml graduated pipette</td><td>BD/Falcon</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon tubes</td><td>BD/Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 ml falcon tubes</td><td>BD/Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Petri dishes</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m filters</td><td>BD/Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m filters</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pipette tips</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-401</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l Pipette tips</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-409</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Syringe</td><td>BD/Medical</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>Plastic spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-245-97&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Plastic weighing boat</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-102&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cryo vials</td><td>Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr Frosty</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biohazard Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, cryopreservation and culture of human amnion epithelial cells for clinical applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

Quando este procedimento é seguido corretamente, um rendimento médio de 120 milhões de hAECs deve ser esperado, com um alcance típico de 80-160000000 células. A partir destes rendimentos, uma viabilidade média de 83 ± 4% pode ser esperado. O aumento do rendimento e a viabilidade média ligeiramente inferior no método clínico pode ser devido a actividade da tripsina maior do que o produto derivado de animal, e, talvez, também devido à ausência de proteínas do soro. Isolado hAECs ter um perfil de superfície celular média de 92% EpCAM células positivas com &lt;1% CD90, CD105 células positivas marcadores mesenquimais. Estes marcadores foram selecionados devido à sua especificidade para 24,25 epiteliais e mesenquimais 26 linhagens respectivamente. Este processo pode demorar cerca de 4-5 horas para completar (Figura 1). Criopreservação requer 20-60 min, dependendo do número de frascos e rendimento celular final. Nós já testou uma variedade de mídias de criopreservação e encontrouque os meios de comunicação social livre de produtos de origem animal muitos executar adequadamente, no entanto, a concentração de DMSO ideal é de cerca de 5-10%. Tipicamente, pode-se esperar que a viabilidade pós-descongelação para ser 5-10% inferior a viabilidade pré-criopreservação, e esta perda pode ser significativamente maior para o utilizador inexperiente (Figura 2). A cultura celular pode ser realizada com hAECs para permitir a caracterização, a diferenciação, ou outro específico em procedimentos in vitro. Estas células inicialmente se prendem às superfícies de células, com uma eficiência de 50-80% (observação pessoal). Isto aumenta a 70-90% com passagens subsequentes. Ligação pode ser aumentada com a utilização de materiais de revestimento de superfície tais como colagénio de tipo I, ou produtos semelhantes. hAECs manter o seu fenótipo epitelial em meios de cultura isentos de soro (Figura 3). Foram encontradas alterações significativas nos perfis marcador da superfície celular seguintes passagem repetida. Além disso, depois de cerca de 5 passagens hAECs pode Either alcançar a senescência, ou passar por alterações morfológicas compatíveis com epitelial para mesenquimal. Após passagem repetida, hAECs manter um cariótipo normal, comprimentos dos telômeros longos e distribuição do ciclo celular. Estas propriedades indicam um baixo risco de transformação ou tumorigenicity. Além de possuírem propriedades reguladoras e anti-inflamatórias imunes, hAECs têm mostrado ser altamente multipotentes in vitro e in vivo, se diferenciar em linhagens celulares representativas das três camadas germinais primárias (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52085/52085fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Esperado rendimento celular, viabilidade e pureza para protocolo de isolamento clínico rendimentos celulares e similares viabilidade pode ser realizada utilizando reagentes livres-produtos de origem animal em comparação com métodos que continham o produto padrão de animais. Um isolamento típico deve ser&gt; 90% de EpCAM e &lt;1% CD90 / CD105 positivacélulas. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52085/52085fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52085/52085fig2highres.jpg" /> Figura 2:.. Publicar viabilidade degelo e metabolismo para mídia criopreservação contendo soro e sem soro Comparado com FBS contendo 10% de DMSO, animais media criopreservação livre de produtos disponíveis no mercado, é viável pós-descongelamento semelhante ou aumentada e metabolismo <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52085/52085fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52085/52085fig3highres.jpg" /> Figura 3: attachment típica e crescimento perfil de hAECs em cul celular soro-livre e contendo soromeios de cultura ture médio. animal livre de produto mostrou apego adequado celular, proliferação e manutenção do fenótipo epitelial. No entanto ainda mais o desenvolvimento de meios isentos de soro é necessária para alcançar resultados iguais aos meios contendo soro. As barras de escala representam 500 um. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52085/52085fig4highres.jpg" /> Figura 4:. Multipotentes diferenciação de hAECs Na passagem precoce, hAECs foram mostrados para diferenciar em várias linhagens celulares representativas das três camadas germinais primárias. Estas linhagens incluem, mas não estão limitados a; neurónios, células do cabelo e da pele, epitélio pulmonar, cardiomiócitos, hepatócitos, células pancreáticas, osteócitos e adipócitos. (Figura 27 adaptada a partir de)

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications at JoVE.com

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolamento, criopreservação e cultivo de células epiteliais humanas Amnion para aplicações clínicas

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

isolation-cryopreservation-culture-human-amnion-epithelial-cells-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

13.8K visualizações.  Wake Forest University Health Sciences. We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines. 

Vídeo: Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

Isolamento de mesenquimais humanas células-tronco e seu cultivo na matriz óssea Porous

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Biologia do Desenvolvimento

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

A Cultura Modelo Novel para pluripotentes estaminais humanas Propagação celular em gelatina no Media Placenta condicionado

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

Reprogramação de primário líquido amniótico e a membrana de células de pluripotência em condições Xeno-livre

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

Isolamento de células do estroma Endometrial humanas para In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congelamento e descongelamento, células estaminais embrionárias humanas

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Biologia

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that the amniotic epithelium is a homogeneous layer. The human amnion can be divided into three anatomical regions: reflected, placental, and umbilical. Each region has different physiological roles, such as in pathological conditions. Here, we describe a protocol to dissect human amnion tissue in three sections and maintain it in vitro. In culture, cells derived from the reflected amnion displayed a cuboidal morphology, while cells from both placental and umbilical regions were squamous. Nonetheless, all the cells obtained have an epithelial phenotype, demonstrated by the immunodetection of E-cadherin. Thus, because the placental and reflected regions in situ differ in cellular components and molecular functions, it may be necessary for in vitro studies to consider these differences, because they could have physiological implications for the use of HAEC in biomedical research and the promising application of these cells in regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of epithelial cells from different anatomical regions of the human amniotic membrane to determine their heterogeneity and functional properties for possible application in clinical and physiopathological models.

In Vitro Cultura das Células Epitelias de diferentes regiões anatômicas da membrana amniótica humana

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

Cultura de células-tronco pluripotentes humanas em polivinil álcool-Co-itacónico ácido hidrogel com rigidez diferentes condições Xeno-livre

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Bioengenharia

Avanço do crioarmazenamento de células epiteliais pigmentares da retina derivadas de células-tronco humanas

Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in individuals with retinal degenerative diseases; however, studies on the stable and secure banking of these therapeutic cells are scarce. Highly variable cell viability and functional recovery of&#160;RPE cells after cryopreservation are the most commonly encountered issues. In the present protocol, we aimed to achieve the best cell recovery rate after thawing by selecting the optimal cell phase for freezing based on the original experimental conditions. Cells were frozen in the exponential phase determined by using the 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine labeling assay, which improved cell viability and recovery rate after thawing. Stable and functional cells were obtained shortly after thawing, independent of a long differentiation process. The methods described here allow the simple, efficient, and inexpensive preservation and thawing of hESC-derived RPE cells. Although this protocol focuses on RPE cells, this freezing strategy may be applied to many other types of differentiated cells.

Autor em destaque: Desenvolvimento de um método eficiente e viável de congelamento de células epiteliais pigmentares da retina

This study provides a detailed protocol for the efficient cryopreservation of human stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.

Criopreservação de células-tronco embrionárias humanas derivadas de células epiteliais pigmentares da retina no estágio ideal

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in ...

Isolamento, criopreservação e cultivo de células epiteliais humanas Amnion para aplicações clínicas

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Isolamento de mesenquimais humanas células-tronco e seu cultivo na matriz óssea Porous

A Cultura Modelo Novel para pluripotentes estaminais humanas Propagação celular em gelatina no Media Placenta condicionado

Reprogramação de primário líquido amniótico e a membrana de células de pluripotência em condições Xeno-livre

Isolamento de células do estroma Endometrial humanas para In Vitro Decidualization

Congelamento e descongelamento, células estaminais embrionárias humanas

In Vitro Cultura das Células Epitelias de diferentes regiões anatômicas da membrana amniótica humana

Cultura de células-tronco pluripotentes humanas em polivinil álcool-Co-itacónico ácido hidrogel com rigidez diferentes condições Xeno-livre

Criopreservação de células-tronco embrionárias humanas derivadas de células epiteliais pigmentares da retina no estágio ideal

Criopreservação de células-tronco embrionárias humanas derivadas de células epiteliais pigmentares da retina no estágio ideal

Criopreservação de células-tronco embrionárias humanas derivadas de células epiteliais pigmentares da retina no estágio ideal