עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקי HL-085,887, HL-092,992, S10RR027535, וMOP-93676.

1. Dissection כלי והדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת קציר מחזירים לנוער מקומיים, כמתואר במרטנס et 27 אל. הנח חדרים תקין חזירים שנקטפו לpolydimethylsiloxane צלחת לנתיחה תחתונה המכילה HEPES נאגרו פתרון פיסיולוגי מלוח (PSS) (PDMS). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת סטראו, לנתח ולהסיר את קטע של קדמי עורק הכלל השמאלי יורדת (אורך ~ 8 מ&quot;מ, קוטר 0.5 מ&quot;מ) מרקמות באמצעות מלקחיים ומספריים באביב על ידי הסרת קטע הכלי משכבות רקמת לב שמסביב. הערה: שים לב שלא לנקב את דפנות כלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בלוק PDMS (1 x 0.5 x 0.5 סנטימטר) לתוך הצלחת לנתיחה, ולהשתמש במחט להצמיד אותו לתחתית. חותכים כ 40 מיקרומטר תיל טונגסטן בקוטר לשנתי עשרה מקטעים באורך 0.3 סנטימטר ~, ויצר micropins, ולמקם את אלה בצלחת. בעזרת מלקחיים, לאבטח את הקצה אחד של מגזר הכלי לבלוק עם micropin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להכניס מספריים באביב קטנים לתוך לומן הכלי, וחתך אורכים בצד אחד של הכלי כדי לפתוח אותו לחלוטין. לכוון את מגזר הכלי נפתח עם האנדותל למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש micropins שנותר כדי לאבטח את הגבולות של מגזר הכלי נפתח כדי לחסום באופן שהכלי יוצר מלבן שטוח. הערה: צריכה להיות כפופות צמרות Micropin 90 ° ונוסף עד מיושר עם משטח הבלוק. יש להקפיד למתוח את הכנת הכלי ללא מתיחת יתר; רוחב סופי צריך להיות ~ 1.5x רוחב unstretched מתחיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הנפח קטן (~ 1 מיליליטר) של Fluo-4 פתרון טעינת PM על ידי ערבוב Fluo-4 בבוקר (10 מיקרומטר) מומסים DMSO עם (0.03%) pluronic בHEPES נאגר PSS (המכיל במ&quot;מ: 134 NaCl, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 גלוקוז), והכנס את כל הגוש לפתרון הטעינה כ 40 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טעינה, לשטוף את הבלוק בHEPES נאגרוPSS ל5-10 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר האבן על 50-100 מפרידי עבים מיקרומטר בתא תחתון coverglass מכיל HEPES נאגרו PSS. הערה: פינים ממתכת יכולים לשמש כמפרידים ולהבטיח מגזר הכלי פונה כלפי מטה ולא נוגע במפרידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדר על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה מצוידת להדמית confocal, ומתמקד בשכבת תאי האנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצפי הזמן לשגות תמונת לכידה של הקרינה היחסית הבסיסית ל~ 3 דקות בהגדלה 20X וקצב פריימים של ~ 8 פריימים לשנייה באמצעות תוכנת aquisition רצף תמונת confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ~ 3 דקות של הקלטת הקרינה הבזליים, להחליף HEPES נאגרו פתרון PSS עם אותו הנפח (~ 1 מיליליטר) של החומר P (100 PM) מומס בHEPES נאגרו PSS, ולהקליט עבור 3 דקות addtional. </li></ol></li></ol> 2. ניתוח אוטומטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדקלם רצף תמונה (ים) של פעילות סיד ניאון מתוכנה רכישת confocal כ8 סיביות, גרם&#39;. Tif&#39; קבצי rayscale תבנית עם מידע לא בקנה מידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ImageJ הפתוח, לחץ על &quot;פתוח&quot; בתפריט הקובץ, ובחר את התמונה ברצף המתאים בחלון הסייר כדי להציג את התמונה ברצף (ים) בImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את ההחזר על ההשקעה בקוטר מתאים על ידי שימוש בכלי ROI המלבני להעריך את הגבולות העליונים ותחתונים של הפריסה המרחבית של פעילות בתוך רצף התמונה (ים). הערה: הקוטר המלבני הממוצע הוא בחירה מתאימה לקוטר החזר על השקעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור תיקייה חדשה בכונן הקשיח של המחשב, ולהוסיף את התמונה ברצף (ים) לתוך ספריית התיקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בImageJ, לחץ על החלון &#39;התוספים&#39;, ולאחר מכן לחץ על &#39;LC_Pro&#39; כדי להתחיל את הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את ערך קוטר החזר על ההשקעה ובחר את ערך סף מסנן (או 0.05 או 0.01). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על תיבת הסימון &#39;הטיפול תרופתי&#39; והזן את ערכי נקודת הזמן מייד לפני ואחרי התרופה נוספת (בשניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;אישור&#39;, והזן את ספריית רצף התמונה לתוך חלון סייר קבצים. </li></ol> 3. פלט גרפי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד גרסת R 3.0.2 <a href="http://www.r-project.org/">מhttp://www.r-project.org/.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את גרסת 32 ביט של ר &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;קובץ&quot;, ואז &quot;תסריט פתוח &#39;ובחר תסריט R&#39; traceplot.R &#39;להפקת דוחות ניסיוניים גרפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את הכיול, וחבילות gplots על ידי בחירה &quot;חבילות&quot;, &quot;התקנת חבילות&quot;, ובחירה בחבילות appropirate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;קובץ &quot;, ואז&quot; מדריך שינוי &quot;הפקודה, ולהשתמש בחלון הסייר כדי לבחור את הספרייה המתאימה לפלט ניתוח LC_Pro. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על חלון סקריפט ולאחר מכן &quot;להפעיל את כל&quot; הפקודה כדי להריץ את הסקריפט. </li></ol>

<ol>
	<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling.">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li><li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Delisle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four+dimensions+of+calcium+signalling+in+Xenopus+oocytes.">The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes.</a> Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).</li><li>Dupont, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics:+spatio-temporal+organization+from+the+subcellular+to+the+organ+level.">Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level.</a> Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).</li><li>Hayashi, H., Miyata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+intracellular+Ca2.">Fluorescence imaging of intracellular Ca2.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, (2009).</li><li>Hong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+spikes+in+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons+induced+by+BAPTA-based+calcium+dyes.">Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes.</a> PloS One. 5 (3), (2010).</li><li>Kuga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+calcium+waves+traveling+through+astrocytic+networks+in+vivo.">Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo.</a> J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).</li><li>Mumtaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+agonist+induced+Ca2++signalling+in+intact+endothelial+cells+studied+confocally+in+in+situ+arteries.">The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries.</a> Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).</li><li>Paredes, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li><li>Silei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+calcium+levels+by+the+fluorescent+Ca2++indicator+Calcium-Green.">Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).</li><li>Simpson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+measurement+of+[Ca2+]c:+basic+practical+considerations.">Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations.</a> Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).</li><li>Gaspers, L. D., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+liver.">Calcium signaling in liver.</a> Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).</li><li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Ca2++oscillations+in+pancreatic+&#223;-cells.">Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic &#223;-cells.</a> Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).</li><li>Kansui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+spontaneous+Ca2++events+in+endothelial+cells+reflect+signalling+through+myoendothelial+gap+junctions+in+pressurized+mesenteric+arteries.">Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries.</a> Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).</li><li>Tatsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+intracellular+calcium+concentration+in+guinea-pig+myenteric+neurons+by+using+fura-2.">Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2.</a> Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).</li><li>Lorenz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pixel-based+criteria-oriented+analysis+of+time-lapse+Ca2+-fluorescence+images.">Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images.</a> J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).</li><li>Mukamel, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data.">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li><li>Reidl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+component+analysis+of+high-resolution+imaging+data+identifies+distinct+functional+domains.">Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains.</a> Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).</li><li>Wegner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+elementary+calcium+release+events+using+the+&#225;+trous+wavelet+transform.">Automated detection of elementary calcium release events using the &#225; trous wavelet transform.</a> Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).</li><li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplitude+distribution+of+calcium+sparks+in+confocal+images:+theory+and+studies+with+an+automatic+detection+method.">Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method.</a> Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).</li><li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SparkMaster:+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ.">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).</li><li>Abramoff, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li><li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2++signals+in+image+sequences.">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2++signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries.">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li><li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Ca2++signal+modalities+in+the+vascular+endothelium.">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li><li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways:+studies+with+normal+pig,+cystic+fibrosis+human,+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi.">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פענוח Ca 2 + אותות מורכבים ברמה התאית ורבה תאית ידרוש גישות ניסוייות ואנליטיות קפדניים. כאן, גישה מתוארת שבזמן רצפי תמונת confocal נפתרו של Ca 2 + הקרינה תלויה נתונים לניתוח אוטומטי שמזהה ומכמת Ca 2 + אותות רלוונטיים מבחינה סטטיסטית בתוך שדות סלולריים ללא פגע במקרה הספציפי שהוצגו, קטע עורק היה מבודד מלב של חזיר, הצמיד נפתח כדי לחשוף את האנדותל, עמוס Ca 2 + מחוון Fluo-4 בבוקר, נתון להדמית confocal, ומוערך עם האלגוריתם המותאם אישית LC_Pro. אלגוריתם זה נועד 1) לזהות ואתרי מסלול של Ca הדינמי 2 + לשנות מעל סטטיסטי (p &lt;0.01) רעש, 2) מגדירים את האזורים של עניין (ROI) באופן אוטומטי במרכזי אתר פעילים, ו -3) לנתח את עוצמות הקרינה ממוצעת בROIs כדי לקבוע פרמטרים אירוע ספציפיים. הגישהמתגבר על מגבלות עיקריות של מחקר איתות ביולוגית על ידי הקטנת שגיאת משתמש ומשוא פנים, צמצום זמן ניתוח מנותק במידה רבה, ומספק אינדקס של אותות מלא על פני שדה להבחין פרופילים או דפוסי נציג. פלט מLC_Pro מעובד נוסף באמצעות תסריטי R, מתן דוחות מלאים פרמטר לניסויים נפרדים, כוללים פלט גרפי באיכות גבוהה. כמה צעדים חשובים לביצוע נכון של הטכניקה שתוארה. הליך נתיחת הרקמות (השלב ​​1.1.1) חייב להתבצע בזהירות כדי להימנע מdenudation או נזק של שכבת תאי האנדותל. בנוסף, רצפי תמונה חייבים להיות בפורמט הנכון (שלב 2.1) לאזור האוטומטי של אלגוריתם העניין לעבוד בצורה נכונה. לדוגמא, אם יש מידע בקנה מידה המשויך לקובץ, אזורים של עניין יוצבו באופן שגוי על פי מיקומי פיקסל, ולא המקומות היחידה בקנה המידה. כמו כן, בחירה מחדש מתאיםגיון בקוטר של עניין הוא קריטי לביצוע נכון ניתוח אוטומטי של פעילות הניאון בתוך תמונה ברצף. ערך בקוטר קטן מדי עלול לגרום למדידות מיותרות, ואילו גדול יותר בקוטר יגרום להדרה של אותות עדינים. החסרונות פוטנציאליים של טכניקה זו בעיקר מתייחסים לרגישות של הניתוח האוטומטי לXY משמרות ברצפי תמונה רשמו ולאותת הרוויה ו / או הלבנה, אשר עלול לגרום לתוצאות שליליות חיוביות או שקר שקר. מרחף או משמרות ממדיים ניתן לפנות ישירות דרך שימוש בתוכנות רישום ערימה וייעוד מדויק של מרווחים שבו הפרעות הם הציגו. רמות אפורות ופרמטרי קוטר החזר על השקעה יכולות גם להיות מותאמות להכנה תינתן מראש של איסוף נתונים על מנת לתקנן ערכות נתונים גולמיות. משום שהוא משמש כגישה סטנדרטית לכל אות הקרינה דינמית, הניתוח שתואר שעותפה הוא מתאים לגוף מגוון של יישומים. בכלי הדם, בשיטה זו היא להיות מועסק להגדיר פיזיולוגית אופיינית ושיטות אות pathophysiological במיטות כלי דם מרובות תחת בסיסי ומגורה תנאי 25,26. כמו כן הוא מיושם במעקב האוטומטי של Ca 2 + גלים. סופו של דבר, ניתוח אוטומטי הגלובלי כזה יהיה ציר מרכזי מכריע בפענוח מרחב ובזמן ביו אותות מורכבים ובהקמת תא חדש ודגמים רב של תאים.

Ca 2 + הוא שליח שני בכל מקום איתות מולקולה וCa 2 + רמות cytosolic קבועות בתקנות. תאיים Ca 2 + אותות הם מורכבים וכוללים ארעיים מבודדים, תנודות ומתפשטים גלים 4 - 1. שליטה במרחב ובזמן של Ca 2 + הוא חשב לבסיס סגוליות אות פיזיולוגית, ולכן הניתוח של 2 + דפוסי אות Ca הוא עניין רב לחוקרים בתחומים מרובים 5. צבעי Ca 2 + מחוון כגון Fluo-4 ופורע-2 הם בדרך כלל מועסקים על מנת למדוד 2 + אותות תאיים Ca עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי 5-12. בדרך כלל, Ca 2 + אותות זמן מוערכים כשינויים תלויי זמן בקרינה ממוצעת בתוך אזור המוגדר על ידי משתמש, או באזור של עניין (ROI) 5,6,13 - 16. נכון לעכשיו, ניתוח ROI במדריך הוא גם זמן רב ועבודה בtensive מכיוון שהיא דורשת למשתמשים לזהות ROIs רבות ולבצע חישובים החוזרים על עצמן 17-19. טכניקות אלו עשויות להיות כפופות גם למשתמש שגיאה ניכרת, כוללים הקדמה של מצבי אות מלאכותיים והדרה של משרעת נמוכה או אותות מפוזר 18,20. אלגוריתמים לזיהוי אוטומטיים את ההחזר על ההשקעה בעבר יושמו באמצעות מגוון של גישות סטטיסטיות כדי לקבוע מיקום ROI אופטימלי, אבל הם בדרך כלל היו מוגבלים לניתוח של קו סריקה או פסאודו אונליין תמונות סריקה, אשר מגבילה את הניתוח לממד מרחבי יחיד בזמן 17, 19-22. בנוסף, קיימים אלגוריתמים רבים אינם מספיקים כדי להקיף את המגוון של Ca 2 + אירועי שחרור אשר נעו בין ארעיים תקופתי, מקומי לגלים מתפשט 23,24. הערכה מקיפה של 2 + אותות Ca הפיסיולוגיים לעתים קרובות מסתבכת עוד יותר על ידי הנוכחות של artif תמונה המשמעותיתלפעול שמקעקעת אות לרעש באפליה רבות מערכות ניסיוניות. בעבר, פתרון אוטומטי זיהוי ROI אלגוריתם לCa 2 + אות זיהוי חולף, מיושם כתוסף לתוכנת NIH ImageJ (המכונים הלאומיים לבריאות, Bethesda, MD), פותח ומאומתים 25,26. אלגוריתם זה, הנקרא LC_Pro, תוכנן כדי לזהות ולנתח ROIs המקיפה ארעיים 2 + אות Ca ברצפי הזמן לשגות תמונה דו ממדיים. הנה פרוטוקול ניסוי מעשי והפגנת נציג יישום של האלגוריתם בהאנדותל של עורקים הכליליים חזירי מסופק, עם postprocessing נוסף באמצעות R תוכנת עיבוד הסטטיסטי בקוד הפתוח ליצירת פלט גרפי שמיש.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dissection dish</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:119px;">#08-772-70</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:119px;">#NC9644388</td>
			<td>elastomer kit, must be molded into dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES-buffered PSS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#H3375-250G</td>
			<td>HEPES acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon Inst.</td>
			<td style="width:119px;">#MNA42000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">#11223-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">spring scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">tungsten wire</td>
			<td style="width:71px;">Scientific Inst Svcs</td>
			<td style="width:119px;">#406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4 AM</td>
			<td style="width:71px;">Life Tech.</td>
			<td style="width:119px;">#F-14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pluronic F-127</td>
			<td style="width:71px;">Life Tech.</td>
			<td style="width:119px;">#P3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">metal pins</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">#26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cover-glass bottom chamber</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom designed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">spinning disc confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">RS-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">imageJ software</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LC_Pro plugin for imageJ</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html">download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">R software</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.r-project.org/">download at: http://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">R traceplot script</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing">download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated analysis of dynamic ca2+ signals in image sequences

תאיים Ca 2 + אותות נלמדים בדרך כלל עם צבעי Ca 2 + חיווי ניאון ושיטות מיקרוסקופיה. עם זאת, ניתוח כמותי של Ca 2 + נתוני הדמיה הוא זמן רב ובכפוף למשוא פנים. אלגוריתמי ניתוח אותות אוטומטיים המבוססים על האזור של עניין גילוי (ROI) יושמו למדידות קו סריקה חד ממדי, אבל אין שום אלגוריתם הנוכחי המשלב זיהוי מותאם וניתוח של ROIs ברצפי תמונה דו ממדיים. הנה אלגוריתם לרכישה מהירה וניתוח של ROIs ברצפי תמונה מתואר. הוא מנצל אליפסות שיתאימו לאותות מסוננים רעש על מנת לקבוע את המיקום אופטימלי את ההחזר על ההשקעה, ומחשב את פרמטרי אות 2 + Ca של משרעת, משך והתפשטות במרחב. אלגוריתם זה מיושם כתוסף זמין באופן חופשי לתוכנת ImageJ (NIH). יחד עם סקריפטים ניתוח נכתבו עבור R תוכנת עיבוד הסטטיסטי הקוד הפתוח,גישה זו מספקת צינור קיבולת גבוהה לביצוע ניתוחים סטטיסטיים מהירים של תפוקה ניסיונית. המחברים מראים כי שימוש בפרוטוקול ניתוח זה יוביל לאפיון של Ca 2 + איתות פיזיולוגית שלם יותר ובלתי משוחד.

אלגוריתם מותאם אישית, LC_Pro, פותח ומיושם על מנת לבצע ניתוח אוטומטי של Ca 2 + דינמיקה ברצפי תמונת confocal. כמתואר באיור 1, האלגוריתם מנצל מודולים עיבוד רציפים ש) לזהות ואתרי מסלול של Ca הדינמי 2 + לשנות מעל סטטיסטי (p &lt;0.01) רעש, B) להגדיר אזורים של עניין (ROI) באופן אוטומטי במרכזי אתר פעילים, ו ג) לחשב את עוצמות הקרינה ממוצעת בROIs לקבוע פרמטרים אירוע ספציפיים. סקירה גרפית של האלגוריתם מוצגת באמצעות פולסים גאוס ממוחשבים של עוצמת ומיקום ידועים (איור 2). פולסים אות (2A דמויות ו-B) הוסבו לינארי באמצעות Z-הציון להתפלגות נורמלית סטנדרטית, ואליפסות מיטבית חולקו ללוקוסי פיקסל מעל סף אות (איור 2 ג). אלגוריתם מיון אליפסה שימש לdetermiמיקום ne האופטימלי את ההחזר על ההשקעה (איור 2 ד). החזר על ההשקעה מתכוונת עוצמת לעומת הזמן נמדדה מכן ופרמטרי אות של משרעת, משך זמן ופריסה המרחבית חושבו (2E איור). גישת ניתוח זה יושמה להעריך Ca הסלולרי 2 + דינמיקה בהאנדותל של כלי דם בשלמותה. באופן ספציפי, confocal הדמיה בוצעה בעורקים הכליליים חזירים נפתחו כמתואר באיור 3, והאלגוריתם הועסק מחובר לכמת Ca 2 + פרמטרים שונים. בניסויים אלה, הקלטות מתמשכים שנעשו לפני ואחרי התוספת של גירוי אנדותל, חומר P (SP; 100 PM), וניתוח LC_Pro בוצע לאחר מכן. עבור קנה מידה אות בתוך כל החזר על השקעה, תוכניות בסיסיות נגזרו כרגרסיות ליניארי של עוצמת החזר על השקעה במשך זמן הניסוי (איור 4). אומר ערכי עוצמת אות חושבו עבור כל החזר על השקעה (איור 4 א), וערכים מעל הממוצע היו TRUNC<html> ated לממוצע ורגרסיה לינארית בוצעה משוערת בסיס אות (איור 4). לבסוף, ערכי עוצמת גלם חולקו על ידי הערך של הקו הרגרסיה להמיר ערכים לקפל שינוי לאורך קו בסיס (איור 4C). איור 5 מראה ניסוי נציג, כוללים תמונות של 2 + הקרינה תלויה Ca ב( איור 5 א) האנדותל, לצבור מסכות בינארי של Ca 2 + אות בסך הכל אותרה בתחום נדגמו (איור 5), והקלטות של הקרינה ממוצעת בכל החזר על השקעה (איור 5 ג) לפני ואחרי טיפול SP. ניתוח פרמטר שלאחר מכן בוצע באמצעות תוכנת R. היסטוגרמות וכתוצאה מכך להראות את אפקט ההגברה של SP על משרעת אירוע, משך זמן, ופריסה המרחבית (איור 6). &quot;Width =&quot; 560/51560fig1highres.jpg 500 &quot;/&gt; איור 1. תרשים זרימת אות של תהליכי אלגוריתם (נתון זה הושג באישור פרנסיס ואח&#39;.) 24. האלגוריתם היה מאורגן לשלושה חלקים: עיבוד תמונה, עיבוד אירוע, ואזור של עניין עיבוד (ROI). רצפי תמונה הם קלט לתוך זרימת השרשרת, וסטטיסטיקת אירוע מופקות כתוצר סופי. שגרת עיבוד תמונה () של האלגוריתם ממירה את התמונה ברצף קלט לתוך רשימה של אליפסות מיטבית על ידי קביעת ערכי סף, באמצעות Z-הציון להתפלגות נורמלית סטנדרטית וניתוח חלקיקי ImageJ. עיבוד אירוע (B) הוא שגרת מיון המשמשת לקביעת עמדת החזר על השקעה אופטימלית על ידי ארגון מקומות לאליפסה &quot;אתרים&quot; אירוע בזמן. לאחר אומר מדידות עוצמת נלקחות בכל החזר על השקעה, פרמטרים סטטיסטיים עבור כל אתר אירוע ומחושבים על ידי שגרת עיבוד ROI (C &lt;/ Strong&gt;) כדי להפיק את הפלט הסופי. BKGD, רקע; AVG, ממוצע. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51560/51560fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51560/51560fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. הפגנה של רכישה אוטומטית החזר על השקעה וזיהוי אותות באמצעות דופק גאוס מחשב שנוצר (נתון זה הותאם באישור פרנסיס ואח&#39;.) 24. דופק מחשב שנוצר אחד אות (א &#39;) היה מוטבע ברעש רקע אקראי. התמונה ברצף בקנה מידה אפורה מסונן כדי להסיר ערכים סטטית רקע פיקסל (B) והמיר לינארי באמצעות ערכי עוצמת פיקסל סף של P &lt;0.05 מחושבים על ידי הציון הסטנדרטי (C). algorith ניתוח חלקיקי ImageJms אז הוחלו על רצף התמונה כדי להקצות אליפסות מיטבית ללוקוסי פיקסל בכל מסגרת. אלגוריתם רומן שימש לאליפסות קבוצה אל &quot;אירועים&quot; זמניים בדידים ולקבוע את המיקום האופטימלי לכל החזר השקעה המבוססת על מרכז האליפסה הממוצע (ד &#39;). החזר על השקעה של רדיוס הגדרת משתמש ממוקם אז בכל עמדה (עיגול מקווקו). אומר ערכי עוצמה בתוך החזר על השקעה מחושבים עבור כל מסגרת ולשנותם באמצעות קירוב בסיס ליניארי. המשרעת שיא מזוהה כמקסימום מקומי מעל P &lt;0.05 כהגדרתו על ידי הציון הסטנדרטי למעקב את ההחזר על ההשקעה מקבילה (E). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51560/51560fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51560/51560fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. Porci<html> פרוטוקול נתיחת לב כלילית ne. סניפי אורך מ&quot;מ כ 0.5 קוטר מ&quot;מ x 8 של קדמי עורק הכלל השמאלי יורדת (תמונה 1, עיגול מקווקו) נותחו משריר הלב שמסביב. מגזרי כלי היו גזוז של רקמה הסובבת adventitial וחתכו לאורכו במספריים קטנים (תמונה 2). בשלב הבא, כלי פתחו נתלו שטוחים לבלוק PDMS באמצעות חוטים עדינים טונגסטן (תמונה 3). מגזרי כלי רכובים הועמסו עם Fluo-4 Ca 2 + צבע מחוון, שטף, ולאחר מכן הניחו בחדר הדמיה עם תחתית coverglass. תמונות נאספו בהגדלה 20X (488 לשעבר., 510.) ב8.0 מסגרות לשנייה באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51560/51560fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> &quot;Width =&quot; 0/51560fig4highres.jpg 500 &quot;/&gt; איור 4. ROI אומר קירוב בסיס עוצמה. בעקבות עוצמת ממוצע לעומת מדידות זמן (קווים מלאים) לכל החזר על השקעה, את ערכי עצמת גלם הם מדורגים F/F0 בשיטת קירוב הבסיס הבא. עוצמת האות הממוצעת (קו מקווקו) בתקופת השליטה מחושבת ממשתמש שליטה מוגדרת וערכי טיפול מרווח (). עקומת עוצמת אות תלוית הזמן לאחר מכן נחתך מעל לעוצמת השליטה הממוצעת לעוצמת השליטה מתכוון לסנן פעילות מקירוב תחילת המחקר, ורגרסיה ליניארית מבוצעת על עקומת התוצאה (קווים מקווקווים) (ב). לבסוף, את ערכי עצמת גלם הם מדורגים לבסיס ליניארי ממוחשבים (C). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51560/51560fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> -Together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51560/51560fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. נציג תוצאות מניתוח LC_Pro של בסיס ומגורה Ca 2 + דינמיקה. תמונות זמן לשגות של תמונה ברצף קלט של מרווח בסיס דגימה (פנל משמאל) ואחריו מרווח בחומרים ממכרים מגורה P דגימה (פנל, נכון ) מוצגים בגוונים אפורים. רצפי תמונת זמן לשגות של האליפסות בכושר הטובות ביותר לבסיס ומגורה מרווחים (ב) ניתנו על ידי LC_pro. לבסוף, עקומות עוצמה בקנה מידה תלויה בזמן מכל אזור ממוקם באופן אוטומטי של עניין (ROI) מוצגות (C). <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51560/51560fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6. היסטוגרמותשל הפצות פרמטר מניסוי נציג (איור 4). היסטוגרמות מפרמטרים של משרעת שיא (F/F0), משך ב½ מקסימום (שניות), והתפשטות המרבית מרחבית (מיקרומטר 2) עבור שניהם השליטה (בעמודה שמאלית) ותוכן היו אירועים (בעמודה ימנית) מניסוי נציג מגורה P שניתנו באמצעות R כדי לעבד את הפלט מLC_pro באופן גרפי. יש לציין, גירוי החומר P הרחיב את מספר האירועים, וגרם לשינוי תקין משמעותי במשרעת וחציון המשך ידי מבחן מאן ויטני U (p &lt;0.01).

Watch this Scientific Journal Video about Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences at JoVE.com

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

הנה אזור רומן של פרוטוקול ניתוח ריבית המבוססת על מיון אליפסות מיטבית הוקצו לאזורים של אות חיובית בתוך רצפי זמן לשגות תמונה דו ממדי מודגם. אלגוריתם זה עשוי לאפשר לחוקרים לנתח באופן מקיף אותות פיסיולוגיים + Ca 2 עם קלט משתמש מינימאלי ומשוא פנים.

ניתוח האוטומטי של דינמי Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות ברצפי תמונות

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

automated-analysis-of-dynamic-ca2-signals-in-image-sequences

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

17.0K Views.  University of South Alabama.  הנה אזור רומן של פרוטוקול ניתוח ריבית המבוססת על מיון אליפסות מיטבית הוקצו לאזורים של אות חיובית בתוך רצפי זמן לשגות תמונה דו ממדי מודגם. אלגוריתם זה עשוי לאפשר לחוקרים לנתח באופן מקיף אותות פיסיולוגיים + Ca 2 עם קלט משתמש מינימא?...

Video: Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

יישום של שרף אור נרפא, דבק שיניים אלקטרודות הרכבה או בדיקות Microdialysis בניסויים כרונית

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

חצי אוטומטיות Heartbeat ניתוח אופטי של לבבות קטנים

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

טכניקות הדמיה Ca 2 + איתות זרע אנושי

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells. While fluorescent 
proteins such as green fluorescence protein (GFP) have been extensively used as fusion partners to proteins to track the properties of a protein of interest1, recent 
developments with smaller tags enable new functionalities of proteins to be examined in cells such as conformational change and protein-association 2, 3. One small 
tag system involves a tetracysteine motif (CCXXCC) genetically inserted into a target protein, which binds to biarsenical dyes, ReAsH (red fluorescent) and FlAsH 
(green fluorescent), with high specificity even in live cells 2. The TC/biarsenical dye system offers far less steric constraints to the host protein than 
fluorescent proteins which has enabled several new approaches to measure conformational change and protein-protein interactions 4-7. We recently developed 
a novel application of TC tags as sensors of oligomerization in cells expressing mutant huntingtin, which when mutated aggregates in neurons in Huntington 
disease 7. Huntingtin was tagged with two fluorescent dyes, one a fluorescent protein to track protein location, and the second a TC tag which only 
binds biarsenical dyes in monomers. Hence, changes in colocalization between protein and biarsenical dye reactivity enabled submicroscopic oligomer 
content to be spatially mapped within cells. Here, we describe how to label TC-tagged proteins fused to a fluorescent protein (Cherry, GFP or CFP) 
with FlAsH or ReAsH in live mammalian cells and how to quantify the two color fluorescence (Cherry/FlAsH, CFP/FlAsH or GFP/ReAsH combinations).

The biarsenical dyes FlAsH and ReAsH bind specifically to tetracysteine motifs in proteins and can selectively label proteins in live cells. Recently this labeling strategy has been used to develop sensors for different protein conformations or oligomeric states. We describe the labeling approach and methods to quantitatively analyze binding.

ReAsH / פלאש סימון ניתוח מקדימה של חלבונים בתאים חיישן Tetracysteine

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בצמחים ארבידופסיס

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

ניתוח האוטומטי של דינמי Ca

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video