We are grateful to B. Stevenson for technical assistance and Dr Marc R. Knight for providing Aequorin transgenic line. This work was funded by the National Institutes of Health Grant R01 GM059138.

.1 ההדמיה Aequorin מבוסס Ca 2 + שימוש במערכת FAS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שתילי הדמיה הארה. לעקר זרעים של צמחי ארבידופסיס להביע Aequorin עם פתרון אקונומיקה 10% מכיל 0.01% Triton-100. לזרוע את הזרעים סטריליים על צלחת מרובעת (10 x 10 סנטימטר צלחת פטרי מרובע עם רשת,) המכילים במלוא הכוח MS (Murashige ותערובת Skoog סל מלח), סוכרוז 1%, ואגר 1.2%. צלחות מקום אנכי בתא צמיחה לאחר ריבוד על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את השתילים על גבי סרט. מניחים סרט דבק (איור 1) בחלק העליון של שתילים ישנים 7-10 יום גדלו על הצלחת. דחף בעדינות את הסרט ביד על מנת להבטיח ששתילים לדבוק בסרט (איור 1 ג). לקלף את הסרט בעדינות, כך שהשתילים יישארו דבקו בסרט (1D איור ו1E) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השתילים עם cofactor. הנח אתשתילי dhered לצלחת המרובע (10 x 10 סנטימטר) המכילה 15 מ&quot;ל של 2 מיקרוגרם h-CTZ / מ&quot;ל ​​(coelenterazine) במים. דגירה השתילים בטמפרטורת חדר למשך 4 שעות ללילה (איור 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתכונן להדמית הארה. קח את הסרט של פתרון h-CTZ ולחתוך אותו באמצע, ויצר שתי חתיכות. מניחים כל חתיכת סרט עם שתילים עם הפנים כלפי מעלה בשתי צלחות שונות. השאר את הצלחות בחושך במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות הארה. בחושך, מקם את שתי הצלחות לצד זה על הבמה של מערכת ההדמיה הארה (איור 1G). לרכוש תמונות מייד עם הוספת 20 מ&quot;ל של תמיסת גירויים לצלחות בו זמנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תמונות הארה. בחר את אותו טווח תצוגה לכל תמונות הארה. לחתוך את האזור של העניין (ROI) וליצור תמונות כקבצים (איור 2 א) JPEG. לחלופין, לייצא את התמונות כקבצים בפורמט SPE ולייבא אותם לתוךתוכנת ניתוח תמונת ImageJ. מדידות קבועות לחישוב הערך האפור הממוצע של החזר על השקעה. בחר באותו הגודל של שטח החזר על ההשקעה ולמדוד את הנתונים אפורים ובהווה אומר כגרף עמודות (איור 2). </li></ol> .2 תא חי הדמיה Confocal Ca 2 + <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שתילים להדמית confocal. לעקר זרעים של צמחי ארבידופסיס להביע case12 עם פתרון אקונומיקה 10% מכיל 0.01% טריטון. לזרוע את הזרעים סטריליים על צלחת המכילה מלחי כוח משרה מלא MS, סוכרוז 1%, ואגר 1.2%. צלחות מקום אנכי בתא צמיחה לאחר ריבוד על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יימברס ההדמיה התקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב חדר הדמיה באמצעות שקופיות וcoverslip (קאמרי). מניחים פיסת צמר גפן במים ספוגה על אמצע השקופית. לאחר מכן להעביר ישנים שתילי 5 יום אחד או שתיים מהצלחת על החלק העליון של צמר גפן ספוג מים. היצמד חתיכות קטנות של חימר לכל פינה של coverslip,coverslip מקום ד בחלק העליון של שתילים כדי ליצור פער (קאמרי) בין coverslip ושקופיות (איור 3 א, פנל משמאל). חבר קצה אחד של צינור פוליאתילן (0.58 מ&quot;מ קוטר) למזרק 1 מ&quot;ל ומניח את הקצה השני של צינור מייד בסמוך לתא. החזק את צינורות במקום עם קלטת (איור 3 א, פנל מימין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב חדר הדמיה באמצעות תא פרספקס (הקאמרי B). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים שכבה דקה של גריז סיליקון סביב שני צינורות פוליאתילן (קוטר 0.58 מ&quot;מ) ולחץ על הצינורות מצופים לערוצים בכל צד של חדר פרספקס (איור 3B עזב פנל). מורחים שכבה דקה של גריז סיליקון על פני השטח של התא המכיל את חריצי הצינור ולחץ coverslip לתוך הגריז לאטום צד אחד של פתיחת התא (לגזור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את השתיל בן חמישה ימים מהצלחת לתוך התא ולמקם את פיסת צמר גפן טבול במים בo העליונהf השתיל. מורחים גריז סיליקון על גבי המשטח האחר של החדר, ולחץ coverslip אחר על גבי לאטום. חבר את קצו של אחד מהצינורות למזרק 1 מ&quot;ל. השאר את קצה הצינורית האחר (פנל מימין איור 3 ב) פתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חדר הדמיה באמצעות מכסה זכוכית chambered (הקאמרי C). לעקר את מכסה זכוכית chambered עם אתנול 70% ולהשאיר אותה על מכסה המנוע עד יבש. הוספת 0.6 מ&quot;ל או 0.2 מ&quot;ל של כוח מלא בינוני MS המכיל סוכרוז 1% וphytagel 0.5% לבאר כל תא 2 היטב או קאמרי 8 היטב (פנל מימין איור 3 ג), בהתאמה. לעקר זרעים ולזרוע את הזרעים ישירות בכיסוי זכוכית chambered המכילה שכבה דקה של ג&#39;ל ברור ולתת להם לגדול בצורה אנכית במשך 5 ימים (איור 3 ג). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal. כדי להחיל גירויי מתח, כגון מלח, קר או מי חמצן, להזריק לאט על 200 μl של 150 mM NaCl, קרח colהמים ד או 1 מ&quot;מ H 2 O 2 פתרון לתוך התא (הקאמרי A או B) רק לפני רכישת תמונות, או בעדינות להוסיף 500 μl μl או 100 של פתרון גירוי ולשל תא 2 או 8 היטב, בהתאמה . צלם תמונות באופן מיידי לאחר יישום פתרון הגירוי באמצעות מיקרוסקופ confocal Nikon A1R הפוך לייזר סריקה עם עדשת 20X טבילה במים (צמצם מספרי 0.75). לאסוף סדרת זמן של תמונות ב 4 מרווחי שניות עם אורכי גל עירור ופליטה של ​​488 ננומטר ו500-550 ננומטר, בהתאמה, וברזולוצית פיקסל של 512 x 512. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תמונה השימוש בNikon אלמנטים, ROIs נמשכו מסביב לכל תא (או אזור) של עניין. עוצמת סה&quot;כ בתוך כל החזר על השקעה נמדדה לאורך זמן באמצעות תיבת הדו שיח זמן המדידה (יכול לשמש ImageJ במקום). מדידות עוצמת סה&quot;כ יוצאו ומעובד בDataGraph. משרעת ספייק 2 + Ca הוגדר כעוצמת שיא מינוס עצמת מנוחה, משך כהזמן דואר בין ייזום והשלמת ספייק, ותקופה כפי שמרווח הזמן בין פסגות ספייק הסמוכות של שני קוצים. ט&#39;-test שימש להשוות את האמצעים. </li></ol>

<ol>
	<li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signals:+the+lead+currency+of+plant+information+processing.">Calcium signals: the lead currency of plant information processing.</a> Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li><li>Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+screening+Arabidopsis+mutants+with+disordered+abiotic+stress-induced+calcium+signal.">A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal.</a> J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).</li><li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana.">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li><li>Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aequorin-based+luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2++dynamics+in+Arabidopsis+plants.">Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li><li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium.">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li><li>Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+calcium+signalling+pathways+regulate+calmodulin+gene+expression+in+tobacco.">Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco.</a> Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).</li><li>Johnson, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+oscillations+of+cytosolic+and+chloroplastic+free+calcium+in+plants.">Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants.</a> Science. 269 (5232), 489-503 (1995).</li><li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signature+after+acclimation.">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation.</a> Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).</li><li>Logan, D. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+and+cytosolic+calcium+dynamics+are+differentially+regulated+in+plants.">Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants.</a> Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).</li><li>Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana.">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li><li>Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+calcium+responses+to+drought,+salt+and+cold+in+the+Arabidopsis+root.">Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root.</a> Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li><li>Souslova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+fluorescent+protein-based+Ca2++sensors+with+increased+dynamic+range.">Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range.</a> BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).</li><li>Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nucleotides+elicit+cytosolic+free+calcium+oscillations+in+Arabidopsis.">Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).</li><li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-tuning+of+the+cytoplasmic+Ca2++concentration+is+essential+for+pollen+tube+growth.">Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).</li><li>Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear-targeted+Cameleon+demonstrates+intranuclear+Ca2++spiking+in+Medicago+truncatula+root+hairs+in+response+to+rhizobial+nodulation+factors.">A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).</li><li>Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+Cameleons+to+different+subcellular+compartments+reveals+a+strict+cytoplasmic/mitochondrial+Ca2++handling+relationship+in+plant+cells.">Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells.</a> Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).</li><li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca2++dynamics.">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics.</a> Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).</li><li>Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+Ca2++accumulation+and+dynamics+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Arabidopsis+root+cells+using+a+genetically+encoded+Cameleon+sensor.">Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor.</a> Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).</li><li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2O2+in+plant+peroxisomes:+An+in+vivo+analysis+uncovers+a+Ca2++dependent+scavenging+system.">H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system.</a> Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).</li><li>Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+in+innate+immunity-mediated+programmed+cell+death.">Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death.</a> EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).</li><li>Roszik, J., Lisboa, D., Sz&#246;llosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution.">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אנחנו הוכחנו מערכת FAS להקלטת Ca 2 + תגובת מרחב וזמן של שתילי ארבידופסיס. מערכת הקלטה זו FAS Ca 2 + מספקת גישה פשוטה, רגישה וחזקה שיכול להיות מותאמת למדידת Ca 2 + דינמיקה מופעלת על ידי גירויים שונים, בנוסף לגירויים אביוטי המתח שמוצגים כאן. באמצעות מערכת זו, אנו יכולים בקלות להשוות ברקמה או גירויים ספציפיים 2 + דינמיקת Ca מרחב וזמן ברמת הצמח כולו. הרגישות הגבוהה של FAS מאפשרת השימוש בגירויים בעוצמה נמוכים לבחינת תגובות Ca 2 +, וזה חשוב עבור הימנעות חפצים הנגרמים על ידי נזקים פיזיים לתאים כאשר נעשה שימוש מתח בעוצמה גבוהה. שבעה לשתילי ארבידופסיס ישנים 10 יום הראה תגובת Ca 2 + רקמה או גירויים ספציפיים, אם כי שתילים בשלבים פיסיולוגיים שונים עשויים להיות רגישים וסגוליות שונים בתגובה לגירוי נתון. לכן זהעדיף להשתמש ישנים שתילי 7-10 יום כדי להגדיל את התפוקה של מדידות FAS, שבו יכולים להיות דבקות סביב 100 שתילים על גבי פיסת סרט אחד. יחד עם ביצועים קלים ופשוטים, רגישות גבוהה ושחזור, מערכת FAS יכולה גם להיות מותאמת להקרנת מוטציות EMS mutagenized לתגובות Ca 2 + שינו. לסינון מטרות, זה חיוני שיהיו שתילים אחידים, כי הם גדלו גם על הצלחת ודבקה על הסרט. ארבעה עד חמש שעות דגירה של שתילי סרט דבק עם h-CTZ בדרך כלל מספיק לכינון מחדש של aequorin. שימוש בסרט דבק עם חורים הוא עדיף משום שתגובה של apoaequorin וcofactor דורש חמצן. להשוואה של רקמה או גירויים ספציפיים תגובות Ca 2 +, באמצעות קבוצות של שתילים במקור מאותו הסרט הוא קריטי משום שהמדינה של שתילים ו / או מצב הכינון מחדש עשוי להשפיע על הסכום הכולל של aequorin הפונקציונלי. כאשר requireme אלהNTS הם נפגשו, ההבדל של תגובת הארה הוא פרופורציונאלי לתגובת Ca 2 + ברקמה או גירוי ספציפי. Aequorin מדידה של אותות 2 + Ca מבוסס משקף את התגובה של אוכלוסייה של התאים. Ca 2 + מדידות עם זאת, בהתחשב בהטרוגניות של סוגי תאים ו / או הנגישות של תאים ברקמות לגירויים השונים, המבוססות על תוצאות Aequorin אינן שווה להתנהגותם של כל תא אחד. הבנת Ca 2 + דינמיקה ברמה התאית דורשת מחוון Ca 2 + שניתן לאתרם ברזולוציה subcellular. ההדמיה חיה תא confocal חלבון פלואורסצנטי של (FP) מבוסס מדדי Ca 2 + מספק מערכת איתור Ca 2 + מתקדמת להקלטת Ca 2 + דינמיקה סלולרית עם רזולוציה סלולרית ברקמה רצויה. כאן, באמצעות הדמיה confocal תא חי ו2 + אינדיקטורים Ca מבוססי FP, הקלטנו Ca subcellular 2 + </sup&gt; ארעיים בשני ציטופלסמה וגרעינים בו זמנית. שני סוגים של אינדיקטורים Ca 2 + מבוסס FP יושמו בצמחים בעלי מאפיינים שונים. בהשוואה לYCS, יש מחוון המבוסס על GFP יחיד Ca 2 + כמה יתרונות: 1 Case12 אינו דורש סטי YFP וCFP מסנן או הנחות רבות וחישובים מורכבים הדרושים כדי למדוד 22 סריג. יש Case12 עירור / מקסימום פליטה בודד וניתן לאתר בקלות באמצעות מערכת סינון GFP סטנדרטית. .2 Case12 יציב תחת pH הפיזיולוגי, והוא יחסית חלבון קטן (46 KDA). כאשר הביע בצמחים, Case12 הממוקד שאינו מופיע בציטופלסמה, כמו גם את הגרעינים, כך ניתן להשתמש בם צמחים מהונדסים Case12 כדי לעקוב אחר Ca 2 + דינמיקת cytosolic והגרעינית בו זמנית. חסרון של הכתב הזה הוא שזה הוא אינדיקטור שאינה ratiometric, כך רמות הקרינה מושפעות גם מגורמים שאינם קשורים לCa 2 + ריכוז, כגון רמת הביטוי שלCase12 וpH המקומי. אף על פי כן, Case12 הוא נאות כדי לקבוע Ca 2 + ריכוז סלולארי להשוואה של 2 + דינמיקה של מרחב והזמן Ca בציטופלסמה ואברונים בין חומרים עם רקע גנטי שונה באותם תנאי הניסוי. בעתיד, GFP החדש Ca 2 + מחוונים עם גבוה יותר יחס אות לרעש, קינטיקה מהירה ותגובה טובה יותר, כמו 24 GCaMP3 וGCaMP5 25 הפגין בבעלי חיים מבוססים, יכול להיות אינדיקטורים טובים יותר להקלטה סלולרית או subcelluar Ca 2 + דינמיקה ב צמחים. מערכות גילוי Aequorin וCase12 המתוארות כאן לספק הורסות in vivo גישות למדידת 2 + דינמיקת Ca מרחב וזמן בכל השתיל ורמות subcellular, בהתאמה. בשתי המערכות, בתנאי המדינה או צמיחה הפיזיולוגיות יכולים להשפיע על Ca 2 + תגובות של השתילים או תאים. אם physically פגום או לא גדל במצב טוב, יש לי תאים יכולים 2 + תגובות חלשות או אפילו לא Ca. בנוסף, משך הזמן של Ca 2 + אותות מרחב ובזמן מושפע גם מהתנאים של השתיל במהלך המדידות. אותות הארה או הקרינה עלולים להפחית לאורך זמן בשל נזק הנגרם על ידי גירויים, ו / או צילום הנזק הנגרם על ידי הלייזר במקרה של ההדמיה confocal. למרות שלא ניתן להימנע מניזק הנגרם על ידי גירוי, phototoxicity יכול להיות מופחת על ידי הגבלת עוצמת ו / או תדירות של חשיפת לייזר. בנוסף, מערכת הקלטה מבוססת Aequorin Ca 2 + מחייבת צעד הכינון מחדש. גורמים שיפריעו לדיפוזיה של CTZ לסלולרי ו / או תגובה של apoaequorin עם CTZ ישפיעו אותות הארה שקשורות ישירות לריכוז Ca 2 +. לכן הריכוז של CTZ, כמו גם את משך הזמן והתנאים של הדגירה CTZ צריך להיות מותאמים לרגישות וreproducibil הטובות ביותרity. Ca 2 + אינדיקטורים מקודד גנטי עשויים לא מדויקים לדווח Ca 2 + ריכוזים סלולריים מסיבות אחרות, ובכלל זה לא מכוון מיקוד לתאים ספציפיים subcellular, רגישות טמפרטורה, או הפרעה של הכתב עם Ca2 הסלולרי + איתות מכונות 23. מצאנו שיש לי Aequorin או Case12 צמחים מביעים שום פנוטיפים מורפולוגיים או מותנים ברורים כגון סובלנות מתח שונה. לכן לא סביר שיש לי Ca 2 + אינדיקטורים מקודד גנטי אלה הפרעות עיקריות עם Ca 2 + איתות בצמחים. לסיכום, אנו מציגים כאן הוראות מפורטות לשימוש בשני Ca 2 + מערכות גילוי למדידת Ca מרחב ובזמן 2 + אותות בשני כל שתיל הצמח ורמות subcellular. שתי מערכות אלו יכולות לשמש כדי לקבוע רקמות (או סוג תא) או Ca גירויים ספציפי 2 + דפוסים דינמיים עם רגישות גבוהה ושחזור. לכן הם כלים רבי עוצמה להבהרת רשתות גנים העומדות בבסיס איתות Ca 2 + בתגובה לרמזים סביבתיים שונים.

תא הצמח מגיב לסביבה באמצעות איתות שהוא מתאם את פעולות תא. תא מוקדם איתות אירוע בתגובה לגירויים סביבתיים הוא עליית Ca 2 + ארעית. הדפוס, או החתימה של עלייה זמנית בריכוז Ca 2 + חינם מאופיין במשרעת, התדירות, ומשך הזמן שלה. חתימות 2 + Ca מרחב ובזמן שונים מסדירות את הפעילות סלולרית שונה 1. גירויים ספציפיים, כגון חום, קור, מלח, הבצורת, אור, או הורמונים צמחיים, עשויים לכוונן את פעילות מרחב ובזמן של ערוצים מקומי קרום Ca 2 + ו / או מובילים, וכתוצאה מכך Ca 2 + חתימות ספציפיות. למרות Ca 2 + מובילים כבר מאופיינים היטב, מעט מאוד ידוע על הזהות המולקולרית ופונקציות של ערוצי 2 + Ca בצמחי 1. מסכי גנטיים למוטציות בתגובה שינתה Ca 2 + להדגיש גירויים עשויים להיות appr יעילאוח לזיהוי הרכיבים שמרכיבים את חתימות Ca 2 +. מערכות גילוי Ca 2 + לאחרונה מבוססים כמה Aequorin פותחו המאפשרות מסכי גנטיים לCa 2 + איתות רכיבים בתגובה להתקפת הפתוגן ואביוטי מתח 2-4. Aequorin שימש לראשונה כדי לזהות Ca 2 + אותות בצמחים בתחילת 1990 5. מאז, Aequorin כבר ממוקד לתאים סלולריים שונים, כגון ציטופלסמה 5, גרעין 6, כלורופלסטים 7, tonoplast 8, מיטוכונדריה 9, וסטרומה 10, כמו גם לסוגים שונים של תאים בשורש כדי לפקח על תא ספציפי Ca 2 + אותות 11. מדידות Ca 2 + מבוסס Aequorin לחשוף את Ca 2 + תגובת מרחב ובזמן של אוכלוסייה של תאים להדגיש גירויים. עם זאת, ברוב המקרים, תגובות Ca 2 + של תאים בודדים הן unsynchronized ברקמות להגיב 4. לכן, הקלטת 2 + Aequorin Ca לא בהכרח לדווח אות Ca 2 + בתאים בודדים. בשנים האחרונות, חלבון פלואורסצנטי מקודד גנטי (FP) המבוסס Ca 2 + אינדיקטורים, כגון Cameleon הצהוב (YCS) 12 ו13 CASEs12 היה בשימוש ללמוד Ca 2 + איתות עם רזולוציה subcellular גבוהה. YCS הוא העברת אנרגיית תהודת הקרינה (סריג) המבוסס Ca 2 + אינדיקטורים, המכילה CFP ו YFP ריאנטים מקושר על ידי Ca 2 + -binding calmodulin החלבון ופפטיד מחייב calmodulin M13. Calmodulin עובר שינוי קונפורמציה כפי שהוא נקשר לCa 2 +, ובכך מביא CFP ו YFP ביחד קרוב, וכתוצאה מכך העברת אנרגיה מוגברת (סריג משופר). רמת סריג לאורך זמן, מחושבת בערך כמו היחס של YFP לעוצמות אות CFP, משקפת תאיים Ca 2 + דינמיקה. כמה גרסאות י&quot;ס היו בשימוש בצמחים. YC3.6 היה targeted לcytosol 14,15, גרעין 16, מיטוכונדריה 17, וקרום פלזמה 18, וYC4.6 וD4ER היו ממוקד לחדר המיון 15,19, וD3cpv היה ממוקד peroxisomes 20. צמחים מהונדסים מבטא YCS לאפשר ההדמיה לחיות התאים של Ca 2 + דינמיקה בתוך תאים סלולריים שונים של סוגי תאים שונים. מקרים (כנראה Ca lcium se nsor) הם חלבונים יחידים מעגלי permuted ניאון (cpFPs) מחסה calmodulin ופפטיד מחייב calmodulin M13. על הכריכה לCa 2 +, מקרים עוברים שינויי קונפורמציה, שהובילו לגידול של עוצמת הקרינה. המתאם בין תגובת הקרינה של CASE וריכוז Ca 2 + 2 + מאפשר דינמיקה תאית Ca להימדד כמותית. גרסת Case12 יש לקפל 12 עלתה הקרינה בCa 2 + צורות -saturated. נ צמחי benthiminana זמני exprEssing Case12 או צמחי ארבידופסיס ביציבות להביע 12 מקרה שמשו ללמוד איתות Ca 2 + במתח הבטחוני ואביוטי 4,21. 2 + תנודות Ca מרחב ובזמן אסינכרוני בתאים מגיבים להתקפת הפתוגן, או ללחץ התייבשות נחשפו עם ההדמיה Ca 2 + מבוסס Case12. כאן, אנו מציגים הוראות מפורטות להדמית Aequorin מבוססת הארה של ברקמה וגירויים ספציפית Ca 2 + דינמיקה בשתילי ארבידופסיס, והדמית confocal של cytosolic וCa הגרעיני 2 + דינמיקה בתאי שורש ארבידופסיס המבטאות מקרה 12. הדמיה הארה של FAS יכול להיות מותאם כדי לנתח דינמיקת Ca 2 + מתח מושרה בצמחים או ברקמות אינן מתוארות כאן בשלמותה, או כדי לסנן אוכלוסיות צמח ארבידופסיס mutagenized למוטציות עם לחץ שינה המושרה Ca 2 + אותות. התקנת ההדמיה התא החי Ca 2 + יכולה להיות מותאמת כדי לנתח Ca2 + דינמיקה בתוך תאי subcelluar שונים או בתאים מסוגים שונים באמצעות Ca 2 + אינדיקטורים אחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="887">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:184px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X10 cm square petri dish&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:175px;">60872-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">adhesive film&#160;</td>
			<td style="width:172px;">VWR</td>
			<td>60941-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyethylene tubing</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td style="width:175px;">9908265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:172px;">VWR</td>
			<td style="width:175px;">53548-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">silicone grease&#160;</td>
			<td style="width:172px;">Beckman</td>
			<td style="width:175px;">335148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-well chambered cover glass&#160;</td>
			<td>Nalge Nunc international</td>
			<td>155379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">8-well chambered cover glass</td>
			<td>Nalge Nunc international</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luminescence imaging system&#160;</td>
			<td>Princeton Instruments</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">inverted confocal laser-scanning microscope&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:184px;">Nikon A1R&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Imaging software</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td>Nikon Elements&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">ImageJ</td>
			<td style="width:172px;">NIH</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td>Public domain, Java-based image processing program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DataGraph</td>
			<td>Visual Data Tools Inc</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td>DataGraph 3.1.1 is the newest version</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">coelenterazine</td>
			<td>NanoLight Technolgies</td>
			<td style="width:175px;">#301B NF-BCTZ-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">All purpose Bleach</td>
			<td style="width:172px;">Any local store</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:172px;">Fisher</td>
			<td style="width:175px;">BP151500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">MS salt</td>
			<td style="width:172px;">Phytotechnology Labs</td>
			<td style="width:175px;">M524-50L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">sucrose</td>
			<td style="width:172px;">VWR</td>
			<td style="width:175px;">BDH8029-12KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Agar</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">A1296-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Phytagel</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">P8169-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring spatial and temporal ca2+ signals in arabidopsis plants

רמזים התפתחותית וסביבתיים לגרום Ca 2 + תנודות בתאי צמח. Ca 2 + דפוסי מרחב וזמן גירוי ספציפי חשו על ידי חלבוני Ca 2 + מחייב סלולריים שליזום Ca 2 + מפלי איתות. עם זאת, אנחנו עדיין יודעים מעט על איך גירוי האותות 2 + Ca הספציפי נוצרים. הספציפיות של אות Ca 2 + ניתן לייחס לרגולציה המתוחכמת של הפעילויות של הערוצים ו / או מובילי Ca 2 + בתגובה לגירוי נתון. לזהות מרכיבים תאיים אלה ולהבין את תפקידם, זה קריטי לשימוש במערכות המאפשרות הקלטה רגישה וחזקה של אותות 2 + Ca בשתי הרקמות ורמות תאיות. Ca 2 + אינדיקטורים מקודד גנטי שממוקדות לתאים סלולריים שונים סיפקו פלטפורמה להדמית confocal תא חי של Ca 2 + אותות סלולריים. כאן אנו מתארים הוראהים לשימושם של שני Ca 2 + מערכות גילוי: aequorin FAS (שתילי דבק סרט) הדמיה הארה Ca 2 + וcase12 הקרינה confocal תא חי המבוססת הדמיה Ca 2 + מבוסס. הדמיה הארה באמצעות מערכת FAS מספקת זיהוי פשוט, חזק ורגיש של 2 + אותות מרחב ובזמן Ca ברמת הרקמה, תוך הדמיה confocal תא חי באמצעות Case12 מספקת זיהוי בו זמני של cytosolic ו2 + אותות Ca גרעיניים ברזולוציה גבוהה.

מניטול, NaCl וH 2 O 2 שמשו כשליחים לגירויי התייבשות, מלח וסטרס חמצונים, בהתאמה. כדי לבדוק אם יון המתכת הכבד Cu 2 + synergizes עם כל אחד משלושת גירויי מתח אלה, השווינו את תגובת Ca 2 + לכל גירויים בנוכחותו או היעדריו של Cu 2 +. כפי שניתן לראות באיור 2, הדמיה הארה FAS גילתה כי שתילי Arabidoposis הגיבו באופן שונה להתייבשות, מלח וסטרס חמצונים. לריכוז של גירויים נבחנו במחקר זה, 75 mM NaCl מושרה Ca 2 + התגובה החזקה ביותר בעלים ושורשים במהלך 40 שניות הראשונות של חשיפה (פנל איור 2A אמצע ואיור 2), ואילו 1 מ&quot;מ H 2 O 2 מושרה Ca 2 + תגובה חזקה הן בעלים ושורשים במהלך 40 שניות הראשונות ושנייה (פנל מימין איור 2 א). הפתרון של 400 מניטול מ&quot;מ מושרה רקתגובת Ca 2 + בשורשים במהלך 40s הראשון ואותות חלשים מאוד בעלים בשניות 40 השניה. Cu 2 + מאוד משופר אמפליטודות ומשך 2 + אותות Ca מופעלים על ידי NaCl ומניטול (פנל משמאל איור 2 א). נראה כי היו לי Cu 2 + השפעות מעכבות על H 2 O 2 מושרה Ca 2 + אותות, הפחתת שני משרעת ומשך (פנל איור 2A תקין ו2B). שימוש בצמחי ארבידופסיס להביע Case12, מדדנו Ca 2 + דינמיקה בcytosol וגרעינים בו זמנית. משקל מולקולרי של Case12 הוא 46 kDa, יש צמחים לכן מהונדסים מבטא Case12 אותות GFP בשני cytosol וגרעינים של עלה ותאי שורש (איור 4 א). תאים מותאמים אישית (איור 3 א ו 3 ב) או מסחריים (איור 3 ג) שמשו להדמית תא חי עם confocalמיקרוסקופ. החלת 150 mM NaCl לשתיל בתא, ראה שינויים של עוצמת הקרינה בשני cytosol והגרעין של התאים הבודדים (איור 4 וC; משלים סרט 1). שימוש בש&quot;ח-אלמנטים (תוכנת הדמיה, Nikon אינסטרומנטס), מדדנו את עוצמת הקרינה באזורים של עניין (ROI) לאורך זמן. משרעת, המשך והתדירות של cytosolic ותנודת Ca 2 + גרעינית מוצגים באופן גרפי באיור 4. משרעת ותקופה של Ca 2 + קוצים בציטופלסמה והגרעינים להשתנות במידה רבה בין תאים מאותו השורש, כמו גם על פני תאים בשורשים שונים. משרעת ותקופה של Ca 2 + קוצים cytosolic היו 60.36 ± 45.22 AU (יחידה שרירותית) ו58.24 ± 15.70 שניות, בהתאמה. משרעת ותקופה של Ca 2 + קוצים גרעיניים היו 316.26 ± 75.24 (AU) ו61.71 ± 16.31 שניות, בהתאמה. בניגוד לכך,משך Ca 2 + הקוצים cytosolic והגרעיניים היו דומה בין תאים, אשר היו 17.43 ± 3.67 שניות ו17.33 ± 2 שניות, בהתאמה. המשרעת של Ca 2 + קוצים ירדו לאורך זמן, וזה יכול להיות כתוצאה מהשינוי של מישור המוקד ו / או הפסד של תגובה ללחץ גירויים בגלל שלילי במצב מבחנה. תוצאות אלו מראות כי לחץ מלח מפעיל תנודת Ca 2 + בשתי הציטופלסמה לבין הגרעין. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51945/51945fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1 Aequorin מערכת FAS מבוסס למדידת 2 + דינמיקת Ca מרחב וזמן בתגובה ללחץ גירויים. ) לגדול שתילי ארבידופסיס אנכי על צלחת המכילה MS תקשורת. B, C) ​​מניחים סרט דבק (ב &#39;) בחלק העליון של שתילים (C). D, E) </ישנים שתילי strong&gt; העברת היום 10 על הסרט דבק. F) דגירה שתילים דבקו בסרט עם 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל של h-CTZ במים למשך 4 שעות. G) חותך את הסרט באמצע ולמקם את כל חתיכה לשונה צלחת ריקה. השאר את הצלחות בחושך במשך 5 דקות. במקביל, לשלוט ופתרונות גירויים (הקפידו השתילים מכוסים לחלוטין), ולרכוש תמונות באופן מיידי. סרגל קנה המידה הוא 5 סנטימטר. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51945/51945fig2highres.jpg" width="600" /> השוואת איור 2 של Ca מרחב והזמן 2 + תגובה של שתילי יום 10 לגירויי לחץ שונים. ) סדרת זמן של תמונות הארה של שתילים נתון 400 מניטול מ&quot;מ ו400 מניטול מ&quot;מ בתוספת 1 ​​CuCl 2 פנל מ&quot;מ (, משמאל), 75 mM NaCl ו75 mM NaCl בתוספת 1 ​​מ&quot;מ CuCl2 (, הפנל באמצע), ו1 מ&quot;מ H 2 O 2 או 1 מ&quot;מ H 2 O 2 בתוספת 1 ​​מ&quot;מ CuCl 2 (, פנל מימין). פנלים העליונים ותחתונים שלהם תמונות הארה נרכשו במהלך שניות הראשונות 40 ושניות 40 השניה, בהתאמה. סרגל קנה מידה אינטנסיביות מצביע על עלייה של אותות הארה מנמוך (שחור) עד גבוה (לבן). B) תרשים בר של עוצמת הארה הממוצעת של שתילים בתגובה לגירויים לחץ המצוין. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51945/51945fig3highres.jpg" width="600" /> איור 3 התקנה של ניסוי הדמיה confocal תא חי. ) קאמרי מותאם אישית בנוי עם שקופיות, coverslip עם ארבע פיסות טין וצמר גפן. שני זקני שתילים 5 יום מונחים על השקופית. קצה אחד של צינור פוליאתילן ממוקם ליד התא התאסף וקבוע עםחתיכות של נייר ואילו הקצה השני מחובר לשקופית 1 מ&quot;ל מזרק. B) מותאמת אישית שנעשתה עם פרספקס יש תא פתוח באמצע ושני ערוצים שמחוברים לשני צידי הערוץ. coverslip אחד ממוקם בחלק העליון של המגלשה ושני צינורות POLYETHLENE ממוקמים בערוץ. Coverslip וצינורות קבועים בעמדה עם גריז סיליקון. סוף אחד הצינורות מחובר למזרק 1 מ&quot;ל וסוף צינור אחר נשאר פתוח. שתיל בן 5 ימים ממוקם בתא וcoveslip הוא לשים על החלק העליון של השתיל ונחתם בגריז סיליקון. שקופית plexigalss עם התא התאסף מושם על השלב של המיקרוסקופ. שתילי C) ארבידופסיס גדלים בשתי בארות (משמאל) או 8 בארות (מימין) של מכסה זכוכית chambered המכילה שכבה דקה של 0.6% מphytagel בטרשת נפוצה תקשורת. <img alt="איור 4" fo:content-width= Src &quot;6in&quot; = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 51,945 / 51945fig4highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; איור 4 Cytosolic וCa הגרעיני 2 + תנודה בתגובה ללחץ מלח. ) תמונות Confocal מראות כי Case12 באו לידי הביטוי בציטופלסמה והגרעינים של תאי שורש (פנל משמאל) ותאי עלה (פנל מימין) של צמחים מהונדסים מבטא Case12. התמונה על הלוח הימני היא תמונה ממוזגת של autofluorescence האדום של כלורופלסטים וקרינה ירוקה של Case12. B) מתח מלח (150 mM NaCl) הנגרם על Ca 2 + תנודה בcytosol (פנל עליון) וגרעינים (פנל תחתון) של תאי שורש. מיקומם של התאים נמדדו מסומן על ידי חיצים עם מספרים על לוח.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants at JoVE.com

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

איתות 2 + Ca מסדירה תהליכים ביולוגיים מגוונים בצמחים. כאן אנו מציגים גישות לניטור לחץ אביוטי המושרה Ca מרחב ובזמן 2 + אותות בתאי ארבידופסיס ורקמות באמצעות Ca 2 + אינדיקטורים מקודד גנטי Aequorin או Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בצמחים ארבידופסיס

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

measuring-spatial-and-temporal-ca2-signals-in-arabidopsis-plants

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

12.0K Views.  Purdue University.  איתות 2 + Ca מסדירה תהליכים ביולוגיים מגוונים בצמחים. כאן אנו מציגים גישות לניטור לחץ אביוטי המושרה Ca מרחב ובזמן 2 + אותות בתאי ארבידופסיס ורקמות באמצעות Ca 2 + אינדיקטורים מקודד גנטי Aequorin או Case12. 

Video: Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology used in electrophysiology. The same equipment is used in the membrane model as on live preparations. Some properties of an isolated nerve cord are investigated: nerve action potentials, recruitment of neurons, and responsiveness of the nerve cord to environmental factors.

This is a demonstration of how biological membranes can be understood using electrical models. We also demonstrate procedures for recording action potentials from the ventral nerve cord of the crayfish for student orientated laboratories.

דוגמנות ממברנות ביולוגיות עם מעגלים מדידת אותות חשמליים בתוך האקסונים: מעבדה תרגילים סטודנטים

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice יתר: שיטה גידול ארבידופסיס צמחים עגבניות ב 96-פלטות היטב genotyping תפוקה גבוהה

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

ניתוח האוטומטי של דינמי Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות ברצפי תמונות

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

מדידת תגובת האכלה מושרה גלוטתיון בהידרה

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

מערכת עין מתנהל שורש לרוחב ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; ותירס

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

בזמן אמת In Vivo הקלטה של תודרנית סידן אותות שהאכילה חרקים באמצעות ביוסנסור פלורסנט

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

יישומים של מיפוי-עתיים, טכניקות ניתוח חלקיקים לכמת Ca תאיים2 + איתות בחיי עיר

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

לכידת לייזר מיקרודיסציה RNA-רצף לניתוח ביטוי גנים ספציפי רקמה מרחבית וזמנית בצמחים

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. Upon wounding of a leaf, an increase in cytosolic calcium ion concentration (Ca2+ signal) occurs at the wound site. This signal is rapidly transmitted to undamaged leaves, where defense responses are activated. Our recent research revealed that glutamate leaking from the wounded cells of the leaf into the apoplast around them serves as a wound signal. This glutamate activates glutamate receptor-like Ca2+ permeable channels, which then leads to long-distance Ca2+ signal propagation throughout the plant. The spatial and temporal characteristics of these events can be captured with real-time imaging of living plants expressing genetically encoded fluorescent biosensors. Here we introduce a plant-wide, real-time imaging method to monitor the dynamics of both the Ca2+ signals and changes in apoplastic glutamate that occur in response to wounding. This approach uses a wide-field fluorescence microscope and transgenic Arabidopsis plants expressing Green Fluorescent Protein (GFP)-based Ca2+ and glutamate biosensors. In addition, we present methodology to easily elicit wound-induced, glutamate-triggered rapid and long-distance Ca2+ signal propagation. This protocol can also be applied to studies on other plant stresses to help investigate how plant systemic signaling might be involved in their signaling and response networks.

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Extracellular glutamate-triggered systemic calcium signaling is critical for the induction of plant defense responses to mechanical wounding and herbivore attack in plants. This article describes a method to visualize the spatial and temporal dynamics of both these factors using Arabidopsis thaliana plants expressing calcium- and glutamate-sensitive fluorescent biosensors.

שדה רחב, הדמיה בזמן אמת של אותות פצע מקומיים ומערכתיים ב Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...