The authors acknowledge funding sources from D&#8217;Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.

1. מכין את אמצעי התקשורת שונה ורכיבים נוספים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הניסוי, להכין תקשורת בהיקף של DMEM או מדיה אחרת שצוינה בתוספת או FBS הנורמלי, הפחם הפשיט FBS, או FBS פחם הופשט בתוספת הרכיב להיבדק. שימו לב שניתן לבדוק רכיבים מרובים בכל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את ולדלל את ההורמונים, גורמי גדילה, או ציטוקינים כראוי להיות מומסים בסרום הפחם הופשט בריכוז הפיזיולוגי. </li></ol> 2. מכין את מטריקס קולגן על קרח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2 מיליליטר קולגן אני מטריקס ב -2.2 מ&quot;ג / מיליליטר על ידי הוספת הרכיבים המסוננים סטרילי הבאים על קרח: 200 10x μl PBS (pH 7.4), 5.4 μl 1 N NaOH, 600 μl של H 2 O מזוקק פעמיים, ואני 1.2 מיליליטר קולגן (ב3.63 מ&quot;ג / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור לי פתרון קולגן על קרח עד מוכן לצלחת. </li></ol> 3. להכין צלחות הגירה / פלישה לAssay &lt;/ P&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל קו תא להיבדק, להשתמש צלחת תא 24 גם אחד שבו 12 בארות להכיל מוסיף. השתמש 12 בארות נוספות שאינו מכילות מוסיף להוספת תקשורת chemoattractant והעברת ההכנסות לקבוצת הניסיון. הערה: מטריצת קולגן על צלחות עם קרום teraphthalate פוליאתילן (PET) וגודל נקבובית 8 מיקרומטר היא אופטימלית לשורות התאים להשתמש כאן. עם זאת, מטריצת matrigel בצלחות Precoated יכולה גם להחליף עם הגודל הנקבובית ירד בהתאם לשורת התאים נחקרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברור לתייג את הצלחת, באמצעות 3 בארות לכל מצב להיות מנותחות (הגירת FBS, הגירת CS-FBS, פלישת FBS, ופלישת CS-FBS כמו גם FBS הגירה לשליטה, שורת תאים לא פולשנית). הגירת assay על ידי תנועה דרך נקבוביות בקרום PET, ופלישת assay על ידי תנועה באמצעות מטריצת קולגן או matrigel ולאחר מכן דרך נקבוביות בקרום. השתמש בסמני צבע שונים לכל מצב תא לid בתהליך הציפוי. </li></ol> 4. לוותר מטריקס הפלישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות פיפטה 75 μl של פתרון מטריצת קולגן למוסיף לשמש למבחני פלישה. השתמש בזהירות כדי למנוע בועות. לפזר בועות על ידי יישום קצה פיפטה הפוך אל פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצלחת עם מוסיף מצופה קולגן ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור למשך 30 דקות כדי לאפשר ג&#39;ל כדי לחזק. </li></ol> 5. פלייט התאים על גבי ממברנה או הפלישה מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, trypsinize תאים ולהוסיף מדיה עם 10% FBS. תאי ספין ב XG 200 במשך 5 דקות על צנטריפוגה בראש הטבלה ולשטוף 3x בתקשורת חופשית בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלול בתקשורת חופשית בסרום. ספירת תאים עם hemocytometer או נגד שקופיות אוטומטיות. הוסף מדיה סרום ללא לריכוז סופי של 5 x 10 4 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מטריצת קולגן יש הקרושה (לאחר 30 דקות), להוסיף 700 μl של תקשורת עם או2% FBS מוגדר או פחם-הפשיט FBS היטב כל אחד. של 12 מוסיף לכל צלחת: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש 3 מוסיף קולגן ובארות עם תקשורת + 2% FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש 3 מוסיף קולגן ובארות עם תקשורת + 2% CS-FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש 3 מוסיף שום קולגן ובארות עם תקשורת + 2% FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש 3 מוסיף שום קולגן ובארות עם תקשורת + 2% CS-FBS </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בצלחות נוספות בהתאם למספר גורמים הנבדקים ועם שליטה לא קולגן המתאים לכל מצב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף השעיה תא למוסיף בשעה 5 x 10 4 תאים / מיליליטר, ציפוי 500 תאי μl לכל כנס בכל מוסיף ההגירה ופלישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים במשך 22 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> 6. לכמת את מספר הנודד ותאים פולשים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צביעת הגדר של בארות באמצעות מקבע מתנול, eosin, וhemotoxylin, בבארות נפרדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בצמר גפן כדי להסיר תאים ומטריצה ​​מכל טוב.Rrepeat עם יישום ספוגית שני לכל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים, לטבול להכניס כל אחד 5 פעמים 1 שניות לכל אחד מהפתרונים 3 ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר מוסיף לייבוש O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כך או i) להסיר את המסננים עם אזמל, החיתוך בזהירות מסביב לקצוות ולעלות בשקופית עם שמן coverslip וטבילה, או ii) תאפשר מוסיף לייבוש O / N ההפוך ולהשתמש במוסיף ישירות למיקרוסקופיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להציג שקופיות או מוסיף תחת מיקרוסקופ עם מטרת 20X ולקחת 5 תמונות מאזורים שונים של המסנן. כדי לשפר את העקביות, לקחת 4 שדות חיצוניים ומרכז אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים לכל תנאי שימוש בתוכנת ImageJ ואחול על נוסחות להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את פלישת אחוזים כדלקמן: אומר # תאים הפולשים באמצעות קולגן אני מכניס = אומר # של תאים הנודדים דרך להכניס שליטה = b פלישת% = (a / b) * 100 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע מדד הפלישה ב 2% FBS כדלקמן: פלישת% מתאים שassayed (ב 2% FBS) = ג % פלישה של תאים לא פולשנית שליטה ב( 2% FBS) = d הפלישה Index (FBS) = (ג / ד) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע מדד הפלישה ב 2% CS-FBS כדלקמן: פלישת% מתאים שassayed (ב 2% CS-FBS) = e פלישת% מתאים לא פולשנית שליטה ב( 2% CS-FBS) = f הפלישה Index (CS-FBS) = (ה / ו) </li></ol> 7. חזור על הפרוטוקול ניסויי השוואה-הפשיט פחם FBS לFBS הפשיט פחם + X n עם גורמים מרובים משולבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך מספר פעמים לפי הצורך תוך שימוש ברכיבים שונים עבור &quot;X&quot; או שילוב של רכיבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל החישובים כדי לקבוע את תרומתו של כל &quot;X&quot; גורם לתופעות הגירה ופלישה. </li></ol>

<ol>
	<li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of Cancer. , (2013).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+molecular+insights+and+evolving+paradigms.">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li><li>Dang, Z. C., Lowik, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+serum+factors+by+charcoal+treatment+promotes+adipogenesis+via+a+MAPK-dependent+pathway.">Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway.</a> Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).</li><li>Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+serum+in+the+developmental+expression+of+alkaline+phosphatase+in+MC3T3-E1+osteoblasts.">Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts.</a> J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).</li><li>Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye, ., Bagati, B., Berezney, A., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dominant+negative+Cx43+mutant+differentially+affects+tumorigenic+and+invasive+properties+in+human+metastatic+melanoma+cells.">A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells.</a> J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).</li><li>Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+actions+of+estrogen+to+promote+proliferation:+integration+of+cytoplasmic+and+nuclear+pathways.">Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways.</a> Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).</li><li>Meierjohann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP13+mediates+cell+cycle+progression+in+melanocytes+and+melanoma+cells:+in+vitro+studies+of+migration+and+proliferation.">MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation.</a> Molecular Cancer. 9, 201 (2010).</li><li>Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+signaling+pathways+must+be+targeted+to+overcome+drug+resistance+in+cell+lines+derived+from+melanoma+metastases.">Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases.</a> Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).</li><li>Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+evaluation+of+various+invasion+assays+testing+colon+carcinoma+cell+lines.">A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines.</a> Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+cancer+metastasis:+the+'seed+and+soil'+hypothesis+revisited.">The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+breast+epithelial+cells+transformed+by+17beta-estradiol.">Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol.</a> Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).</li><li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+regulation+of+miR-21+enhances+migration+and+invasion+of+hepatoma.">Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma.</a> Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).</li><li>Scheel, C., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+epithelial-mesenchymal+transition:+concepts+and+molecular+links.">Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links.</a> Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).</li><li>Kojima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts.Proc.">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc.</a> Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).</li><li>Maehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transforming+growth+factor-&#946;1+in+invasion+and+metastasis+in+gastric+carcinoma.">Role of transforming growth factor-&#946;1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma.</a> J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).</li><li>Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor-induced+tumor+cell+invasion+and+metastasis+initiated+by+dephosphorylation+and+downregulation+of+focal+adhesion+kinase.">Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase.</a> Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).</li><li>Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Cancer+stem+cells,+cytokine+networks,+and+the+tumor+microenvironment.">Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment.</a> J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).</li><li>Rosen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interrogation+of+HGF-SF+with+other+cytokines+in+tumor+invasion+and+metastasis.">The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis.</a> EXS. 65, 301-310 (1993).</li><li>Sanz-Moreno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+and+JAK1+signaling+cooperate+to+control+actomyosin+contractility+in+tumor+cells+and+stroma.">ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma.</a> Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).</li><li>Fleming, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+interactions+between+primary+human+human+fibroblasts+enhance+murine+mammary+gland+humanization+in+vivo.">Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo.</a> Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).</li><li>Sikora, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M.J.,+V.,+M.E.,+M.D.,+J.M.">M.J., V., M.E., M.D., J.M.</a> Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

גרורות סרטנית היא תהליך רב שלבי. התאים חייבים לפרוץ את הקרום במרתף, intravasate לmicrovessels או מערכת הלימפה או הדם, שבו הם מועברים לאתרים מרוחקים. תאי הגידול אז extravasate וליישב לmacrometastasis 12. התקדמות דרך אפיתל מעבר mesenchymal (EMT), פלישת גידול, וגרורות שופרה על ידי הורמוני סטרואידי 13,14, צמיחת גורמי 15-18, וציטוקינים 19-21. מולקולות אלה הן כל כך קריטיות לטיפול במסלול האיתות של התקדמות גידול, כי הפיתוח של assay כדי לטפל בתפקידם בפוטנציאל גידול הוא חודרני צעד חשוב לקראת פענוח מסלולי איתות המורכבים. assay זה של שימוש בסרום-הפשיט פחם יש יתרון על פני שיטות קיימות, מאחר שמטרתו לזהות את הכוח המניע שלגידול תאים נודדים. יש assay קודםפורסם באמצעות fibroblasts שד ראשוני הנורמלי בתאי פלישה. במחקר זה, החוקרים השתמשו בתקשורת-הפשיט פחם והוסיפו בחזרה אסטרוגן בתאי matrigel שלא גרם לפלישה כצפוי מאז התאים לא היו סרטניים. עם זאת, הנוכחות של תקשורת ממוזגת מקרופאג בנוכחותו או היעדריו של אסטרוגן מוגבר פלישה באופן משמעותי ולמידה דומה 22. בעוד assay זה היה דומה שהיא משמשת מבחני פלישה עם סרום-הפשיט פחם בהעדר או הנוכחות של אסטרוגן, זה לא היה assay גידול והופנה לחקר אינטראקציות אוטוקריני בין מקרופאגים וfibroblasts 22. assay נוסף המשמש תקשורת-הפשיט פחם להראות כי התוספת של רמות נמוכות של אסטרוגן הגדילה את ההתפשטות של תאי סרטן השד, אך גרמה להתנגדות לkinase מעכבים 23. המחקר שלנו הוא ייחודי בכך שהוא assay פלישה החל על סוגים שונים של תאי סרטן שנועדו ללמודהשפעה של הורמוני פרט, גורמי גדילה, וציטוקינים לבד או בשילוב. יתר על כן, בכפוף לספרות זמינה, קבעו הריכוזים של הורמון צורך להוסיף לסרום-הפשיט פחם כדי להשיג רמות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית (טבלה 1). התוספת של הרכיב הבודד, &quot;X&quot; ברמות הנוכחיות בסרום היא פרמטר קריטי של assay. בעוד assay זה אולי נראה להיות מוגבל על ידי הרמות של הורמונים שפורסמו, גורמי גדילה, וציטוקינים בסרום, החוקר יכול להשתמש במבחני ELISA כדי לקבוע את הרמות של גורמים נוספים. בעוד הפרוטוקול הוא ספציפי לשימוש אני קולגן, matrigel יכול גם להחליף אם החוקר השתמש מטריצת שאופן עקבי. הסיבה שאנחנו מעדיפים להשתמש אני קולגן היא כי זה הוא מרכיב יחיד שמוגדר והוא המרכיב העיקרי של הדרמיס. בנוסף, אנו משתמשים 75 μl של 100 μg / ml קולגן כדי להפוך את מטריצת הפלישה. זה גם יכול להיות שונה כדי להשיג את התוצאות הרצויות. זה הכי טוב כדי לייעל את הריכוז כדי שמספר סביר של תאים ניתן לספור על המסננים. אם התאים פולשניים מאוד, זה יכול להיות טוב יותר לשימוש שלי קולגן 100 μl למטריצה ​​או להגדיל את ריכוז קולגן. אמנם שיטה זו עשויה לסייע לחוקר לקבל מידע חשוב, זה שימושי רק אם תאי גידולים פולשים לchemoattractant שהוסר על ידי הפחם-ההפשטה של ​​הסרום. אם אין הבדל בין התוצאות עבור שליטה וסרום-הפשיט פחם, אז assay לא יהיה שווה להשקיע. Assay מתייחס גם לתוצאות לchemoattractants בודד, כמו גם מדכאי של chemotaxis. יתר על כן, בהשוואה של תוצאות אפשריות (איור 3), השתמשנו בסטיית התקן ככל שרמת שגיאה ניסיונית מקובלת עבור כל ניסוי. עם זאת, בפועל values יכול להיקבע על ידי החוקר המבוסס על סטיית התקן או שגיאה סטנדרטית וערך p משמעותי. יתר על כן, המידע שלקט מassay זה יכול להיות שימושי בעיצוב של מעכבים תרופתיים למסלולי איתות מסוימים. לדוגמא, אם אחד או יותר הורמונים, גורמי גדילה, ו / או ציטוקינים יימצא מעורב במנגנון הפלישה למוטצית תאים סרטניים מסוימת, שאינו סוכן הקיים תרופתי יכול לשמש או תרופה חדשה שנועדה לעכב אותו מסלול. Assay הוא גם כלי יעיל ללימוד המוטציה גידול המסוימת והאם לשנות את שאריות חומצת אמינו או את עמדתה שומרת על אותה הזיקה לchemoattractant שזוהה על ידי assay זה. בדרך זו, assay שלנו מציע גישה חדשנית כדי לספק רמזים לגבי מנגנון הפלישה של תאים סרטניים ואולי שיטות למניעת פלישת גידול.

Assay פלישת רומן פותח במטרה לזהות את מעורבותם של הורמונים מסוימים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה כchemoattractants בפלישת תאי סרטן. היכולת של תאים סרטניים לפלוש דרך המטריצה ​​תאית (ECM) היא סימן היכר של פנוטיפ גרורתי 1-3. תאי פלישה נעשו שימוש נרחב כמו במבחנה כלים ללמוד פלישת תאי סרטן והגירה ועשויים לספק ידע באשר למנגנוני in vivo פלישת גידול וגרור. התאים מורכבים מהתרבות מוסיף תא גלילי קיננו בתוך הבארות של צלחות תרבית תאים. התחתיות מוסיף הן קרומי פוליקרבונט או קלקר חדיר למחצה של גודל נקבובית מוגדר. בassay הפלישה הסטנדרטי, תאים הם זורעים על הממברנה להכניס את עם תקשורת חופשית בסרום והניחו לתוך בארות תרבית תאים שמלאות בchemoattractants סרום או כמו סרום-ליםet עד כוח chemoattractive. תאי כונני הכוח הזה כדי לנוע בקרום חדיר למחצה (ההגירה) או לחלופין, באמצעות ציפוי של מטריצה ​​תאית (פלישה), אז מה שיכול להיות מוכתמת באמצעות צבעים קונבנציונליים כדי לזהות ולכמת את מספר התאים. מספר התא אז מנורמל לפי העומק של הגירה ופלישה בשורת תאים לא פולשנית. שיטה זו מאפשרת לחוקר להעריך את הפוטנציאל פולשני של סוגי תאים שונים תחת מגוון רחב של תנאים, כוללים מניפולציות גנטיות. הורמונים, ציטוקינים וגורמי גדילה הם רכיבים קריטיים של סרום ויותר ויותר במוצגים להיות קשורים לנהיגת פנוטיפ פולשני 4. עם זאת, הטבע, התפקיד, וספציפיות של מולקולות סרום chemoattractive אלה בתיווך פלישה עדיין להישאר חמקמקים. האתגר נשאר כדי לקבוע מה ספציפי גורמים בchemoattractants סרום או כמו סרום-הם אחראים לנהיגהפלישת סרטן תאים, כמו גם את מה שמולקולות עלולות לעכב את תהליך הפלישה. בדוח זה, אנו מתארים שיטה להעריך את המעורבות האפשרית של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי צמיחה הנוכחיים בסרום, כמו מולקולות הנהיגה chemoattraction והפלישה של תאים סרטניים. בהציע פרוטוקול שונה זו, הפשטת פחם משמשת כדי להסיר הורמונים, ציטוקינים וגורמי גדילה מסרום 2% שור עוברי (FBS) כדי ליצור FBS פחם 2% הפשיט (CS-FBS). שני 2% FBS ו -2% CS-FBS משמשים כסוכנים להקים כוח chemoattractive לנהוג פלישת תאי סרטן. באמצעות 2% CS-FBS כסוכן chemoattractive בהשוואה ל -2% FBS הרגיל מעניק מספר יתרונות הכוללים ראשון, ובולט ביותר, היכולת ללמוד את הפנוטיפ פלישת הסרטן בהעדר המופחת / היחסי של הורמונים, ציטוקינים וגורמי גדילה. הוא גם מאפשר לחוקר להעריך אם ההסרה הקולקטיבית של הורמונים, גורמי גדילה, וCYtokines גורם לעלייה או ירידה במדד פולשנית. Assay לאחר מכן נועד לקבוע אם התוספת של רכיב בודד, המיועד כ&quot; X &quot;יכולה לעכב, ירידה, עלייה, או לשחזר את המדד פולשנית לערכו המקורי (ראה איורים 2 ו -3). למרות שמתודולוגיה זו היא ספציפית להשגת הרמות הפיזיולוגיות של הרכיב שהוסר מהסרום במהלך הפשטת פחם, זה צריך להיות גם ציין כי הפשטת פחם יכולה להשפיע גם על מסלולי העברת אותות. לדוגמא, זה כבר דווח כי הפשטת פחם יכולה להפחית את פעילות phosphatase אלקליין של תאי osteoprogenitor ולגרום adipogenesis באמצעות הפחתה של מפעילי MAPK 5. תקשורת הפשיטה פחם היא זמינה באופן מסחרי, ומבוססות על הפרוטוקול שתוארה המשלב פחם עם dextran וטופחו עם O בסרום שור עוברי / N 6. assay זו פותח בrespoNSE לתוצאה שדווחה על ידי צוקר et al. 7 המחברים הוכיחו כי פנוטיפ מוטנטי משפיע תקשורת צומת הפער הפגין עליית מדד הפלישה בעת העברה לתקשורת עם FBS 2% נורמלים. עלייה זו בוטלה עם ההחלפה של סרום-הפשיט פחם. מתוצאה זו, החוקרים הסיקו כי הגירה מושפעת זה מוטציה למולקולת lipophilic (לייתר דיוק, הורמון, גורם גדילה, או ציטוקינים) 7. זה ידוע היטב כי הורמונים, גורמי גדילה, וציטוקינים לתווך מסלולי איתות מעורבים בקידום גידול ופלישה 4. לפיכך, חשוב לחוקרים מדעיים כדי לקבוע מה גורם (ים) נוהג פלישת הגידול של תאי הסרטן המסוים שלהם או מוטציות תחת מחקר. Assay נועד לעסוק בתפקיד של רכיבים בודדים בריכוז הפיזיולוגי שלהם, כפי שנקבע על פי ההפרש בין הריכוז של הרכיב ו# 8220; X &quot;בFBS הנורמלי וCS-FBS. באמצעות הפיתוח של assay זה, חוקרים יכולים להשיג תובנה רבה יותר על המסלול פולשנית הספציפי המסדירים את המערכת שלהם. הורמונים, גורמי גדילה, וציטוקינים לעתים קרובות סווגו כמקדמי גידול 8. חלק מגורמים אלה כמו EGF משמש כמקורות ישירים לchemoattractants בתאי פלישה 9. לפיכך, סביר להניח כי אלה מייצגים את המרכיבים העיקריים של הסרום שפלישת גידול ישיר. פרוטוקול זה מציע פשוט, אך משמעותי, שינוי במבחנת assay הפלישה הקונבנציונלי המאפשר חוקר להעריך את מעורבותם של הורמונים, גורמי גדילה, וציטוקינים בתיווך הפוטנציאל פולשני של תאים סרטניים. עם זאת, assay נועד לספק החוקר עם תשובה באשר לשאלה האם ההליך יהיה יעיל למחקר שלהם בכל צעד בתחילת הניתוח, כדי שלא לנצל את הזמן וr יקריםesources אם כמיותר. שיטה זו משתמשת CS-FBS והוא מסתמך על שיקול דעתו החוקרים שכמולקולות להמשיך כמועמדים מובילים שפוטנציאל לתווך פלישת תאי הסרטן. התוצאות מניתוחים אלו צריכים להוכיח להיות שימושיים בזיהוי רכיבי שסרום לשמש chemoattractants או מעכבים עבור קו תא המסוים או מוטציה הנלמד. בנוסף, גישה זו עשויה לעזור לחוקר לזהות מסלולי איתות מפתח או קידום או עיכוב פלישת תאים סרטניים; כך מכוון את עיצוב סמים עתיד.

<table><tbody><tr><td>BioCoat Control Inserts with 8.0 &amp;micro;m PET membrane</td><td>Corning</td><td>354578</td><td>12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate</td></tr><tr><td>Collagen I, rat tail</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Source = rat tail tendon, purity = 90%</td></tr><tr><td>Fixative; Diff-Quick</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9844047</td><td>Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000</td><td>Designated as FBS</td></tr><tr><td>Charcoal stripped fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>12676</td><td>Designated as CS-FBS</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30070</td><td>Designated as FBS</td></tr><tr><td>Charcoal stripped fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30068</td><td>Designated as CS-FBS</td></tr></tbody></table>

a modified in vitro invasion assay to determine the potential role of hormones, cytokines and/or growth factors in mediating cancer cell invasion

סרום דם משמש כchemoattractant כיוון שתאי הסרטן להגר ולפלוש, להקל intravasation לmicrovessels. עם זאת, המולקולות בפועל כיוון שבו התאים לנדוד להישאר חמקמקות. assay פלישה שונה זו פותח כדי לזהות מטרות שנוהגות נדידת תאים ופלישה. טכניקה זו משווה את מדד הפלישה תחת שלושה תנאים כדי לקבוע אם הורמון מסוים, גורם גדילה, או ציטוקינים משחק תפקיד בתיווך הפוטנציאל פולשני של תאים סרטניים. תנאים אלה כוללים אני) בסרום שור עוברי נורמלי (FBS), ii)-הפשיט פחם FBS (CS-FBS), אשר מסיר הורמונים, גורמי גדילה, וציטוקינים וiii) מולקולת CS-FBS + (מסומן &quot;X&quot;). שינוי משמעותי בפלישת תא עם CS-FBS בהשוואה לFBS, מצביע על מעורבותם של הורמונים, ציטוקינים או גורמי גדילה בתיווך השינוי. אז יכולות להיות הוסיפו בחזרה מולקולות בודדות לCS-FBS לassay יכולתם מחדשפסוק או להציל את הפנוטיפ הפלישה. יתר על כן, ניתן לשלב שתיים או יותר גורמים כדי להעריך את התוסף או תופעות סינרגיסטי של מולקולות רבות בנהיגה או עיכוב פלישה. בסך הכל, בשיטה זו מאפשרת לחוקר כדי לקבוע אם הורמונים, ציטוקינים, ואו גורמי גדילה / לשחק תפקיד בפלישת תא על ידי המשרת כchemoattractants או מעכבים של פלישה לסוג מסוים של תאי סרטן או מוטציה ספציפית. על ידי זיהוי chemoattractants ומעכבים ספציפיים, assay הפלישה שונה זה עשוי לעזור להבהיר מסלולי איתות המכוונים את פלישת תאי הסרטן.

מדד הפלישה מחושב עבור כל תנאי לפי נורמליזציה לשורת תאים לא פולשנית. בניסויים שלנו, אנו משתמשים בקו 1205Lu תא מלנומה ושורות תאי יציבות גרסה הוקמה כקווים פולשנית שלנו, כמו גם את הגרסה טרום לא פולשנית, WM793 ממנו התאים 1205Lu נגזרו 10 המשמשים כבקרה לוגית. גם אנו מנצלים אני קולגן כמטריצת הפלישה משום שהוא המרכיב העיקרי של הדרמיס. זה בהתאם למחקר קודם לפי מטריצת הפלישה האופטימלית משתנית בהתאם לקו התא ועם in vivo מידת ההתאמה תוצאות 11. assay פלישה זו מתואר באופן סכמטי על פי התוצאות אפשרי החוקר יכול להשיג. בתחילה, מדד הפלישה לFBS 2% צריך להיות גבוה יותר באופן משמעותי או נמוך ממדד הפלישה לCS-FBS כדי להמשיך assay זה (איורים 1 ו -2). אם אינקר משמעותילהקל או ירידה במדד הפלישה היא לכאורה עם FBS-הפשיט פחם, assay זה לא שימושי לחוקר (איורים 2 ו -3). אם עלייה זו בוטלה עם FBS-הפשיט פחם, החוקר כבר יש את הידע שהפלישה המשופרת היא מכוונת כלפי הורמון, גורם גדילה, או ציטוקינים (איורים 2 ו -3). לאחר מכן, החוקר חייב לנצל מידע על סוג הגידול הספציפי ומוטציה כדי לקבוע איזה מועמד (ים) מתקבלים על הדעת מנגנונים נוכחי כchemoattractants. החוקר יכול להתחיל בכך שניסה רכיב אחד או כמה בנפרד בריכוז הפיזיולוגי על ידי הוספת הרכיב בהבדל הריכוז בין 2% FBS ו -2% CS-FBS (טבלת 1). אם רכיב יתווסף לסרום-הפשיט פחם מגביר באופן משמעותי ממקטין את פוטנציאל הפלישה לעומת הסרום-הפשיט פחם לבד, מועמד ש, &quot;X&quot;, עשוי לשמש כחלקי אומציל מלא בהתאם ל( איורים 2 ו -3) במידה של עלייה. ניתן לשלב שני רכיבים או יותר על מנת להשיג גידול תוסף או סינרגיסטי, (מסומן כX 1 + X 2 + X 3 ...) (איור 3). גורם אשר מקטין את היקף הפלישה יסווג כגורם מעכב (איורים 2-4). בניסויים שלנו, שהראינו כי השימוש בקו מוטציה תא מלנומה (T154A 1205Lu) נודד לכיוון chemoattractant עם ההורמונים שלה, גורמי גדילה, וציטוקינים הוסרו גרם לירידה בהפולשנות גידול. שלושה הורמונים נבדקו לזהות &quot;X&quot; אפשרי. אלה כוללים אסטרוגן (אסטרדיול), פרוגסטרון, הורמון בלוטת התריס ו( T4). שני הורמונים אלה לא היו השפעה על מדד הפלישה (פרוגסטרון והורמון בלוטת התריס), ואילו אסטרוגן זוהה כגורם מעכב ב( איור 4). על פי התוצאות האפשריות מופיעות באיור 3, את תוצאות הניסוי בדוגמא זו מדגים ירידה במצב 2 ועיכוב במצב 3. סביר להניח כי אסטרוגן ישמש עוד בassay זה, שכן הוא עשוי להיות חשוב בזיהוי של מסלולים שלעקל גורמי איתות מסוימים לאסטרטגיות עיצוב סמים עתיד. ניסויים נוספים יופנו בגורמי גדילה וציטוקינים לזהות רכיבים אחרים שעשויים לשמש כchemoattractants פרו-פלישה &quot;הצלת פנוטיפ&quot;. זיהוי של שני מולקולות פרו-פולשני והמעכבים עשוי קולקטיבי להבהיר את הפוטנציאל פולשני לשורות תאים וגרסאות מוטציה תחת חקירה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51480/51480fig1.jpg" /> איור 1. התקנה ניסיונית ועיצוב. דגם של להגדיר עבור ניסיוני התהליך מראה תאים מצופים או על הממברנה PET ישירות או גשכבת ollagen תקשורת חופשית בסרום. התאים נודדים או או פולש באמצעות מטריצת קולגן כלפי chemoattractant ששונה בהתאם לפרוטוקול וכפי שתואר תנאי 1, 2, ולאחר מכן 3. התאים שהועברו או פלשו קבועים ומוכתמים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51480/51480fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר גרסה של נתון זה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51480/51480fig2.jpg" /> איור 2. תוצאות אפשריות מתוצאת קרום אחד סטנדרטית assay הפלישה. מודל זה מדגים את התוצאות הפוטנציאליות שהחוקר עלול להיתקל עבור assay הפלישה וכיצד לפרש את התוצאות הללו. כל מעגל הוא תוצאת נציג למסנן מוכתם באמצעות אותו 3 התנאים המפורטים באיור 1. כל נקודה מייצגת תא שעבר דרך הפלישהמטריקס ומוכתם בתחתית הקרום. התאים היו לכמת כראוי ונותחו בהתאם. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51480/51480fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51480/51480fig3.jpg" /> פרשנות נתונים איור 3. לפלישה עם CS-FBS ± X. מתווה זה מתארת ​​כיצד החישובים של מדד הפלישה לקבוע מסקנות ניסוי. CS-FBS הוא הסרום-הפשיט הפחם וX מתייחס לרכיבים הבודדים נוספו תקשורת CS-FBS המתואר בטקסט. המחברים להגדיר את סטיית התקן (SD) כהשתנות התקבלו בשל שגיאה ניסיונית בתנאים שלנו. עם זאת, בהתאם לתנאי תצפית ומספר החזרות, גורם זה יכול להיות מותאם כדי להיות בטווח של ממלכתימשמעות iCal לחוקר. הניסוי ניתן לחזור עם מולקולות &quot;X&quot; מרובות, (מסומן כX 1 + X 2 + X 3 ...). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51480/51480fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/51480/51480fig4.jpg" /> איור 4. תוצאות assay פלישה. גרף מתאר את תוצאות הניסוי הושגו בעת השימוש בקו תא גרסת מוטציה 3 הוקמו מהתאים מלנומה גרורתית 1205Lu. הריכוזים של ההורמונים הוסיפו הם כדלקמן: אסטרוגן (.566 pg / ml), פרוגסטרון (מיליליטר / 0.001 ng), הורמון בלוטת התריס (0.283 מיקרוגרם / dl). השליטה, שורת התאים לא פולשנית המשמשת לניסויים אלה הייתה WM793B. ניסוי זה חזר על עצמו 3 פעמים עם תוצאות דומות, וגרף נציג מוצג. <tableגבול = cellpadding &quot;0&quot; = cellspacing &quot;0&quot; = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2" style="padding-left:2px;padding-right:2px"></td><td style="width:41px"> יחידות </td><td style="width:52px;padding-left:4px;padding-right:4px"> FBS המוגדר </td><td> CS FBS </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> הבדל </td><td style="width:70px"> [2% FBS] - [2% CS-FBS] </td><td style="width:85px"> מקור </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td rowspan="5" style="padding-left:4px;padding-right:2px"> הורמונים </td><td style="padding-left:7px;padding-right:4px"> אסטרוגן (אסטרדיול) </td><td> pg / ml </td><td> 28.30 </td><td> 8.76 </td><td> 19.540 </td><td> .566 </td><td rowspan="5"> Life Technologies # חתול FBS 16000 cs FBS # חתול 12,676 </td><td> Sigma E2257 </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> uIU / ml </td><td> 8.61 </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> מבלי שיבחינו </td><td> 8.610 </td><td> .172 </td><td> Sigma I3536 </td></tr><tr><td> פרוגסטרון </td><td> ng / ml </td><td> 0.05 </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> מבלי שיבחינו </td><td> 0.050 </td><td> 0.001 </td><td> Sigma P8783 </td></tr><tr><td> טסטוסטרון </td><td> ng / ml </td><td> 0.10 </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> מבלי שיבחינו </td><td> 0.100 </td><td> 0.002 </td><td> Sigma T1500 </td></tr><tr><td> בלוטת התריס הורמון (T4) </td><td> UG / dl </td><td> 14.14 </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> מבלי שיבחינו </td><td> 14.140 </td><td> 0.283 </td><td> Sigma T1775 </td></tr><tr><td rowspan="3"> גורמי גדילה </td><td> IGF </td><td> ng / ml </td><td> 111.00 </td><td> 49.30 </td><td> 61.70 </td><td> 1.23 </td><td rowspan="3"> Thermo Scientific Hyclone <br/&gt; # חתול FBS SH30070 # חתול SH30068 cs FBS </td><td> Sigma I3769 </td></tr><tr><td> TGF-β </td><td> ng / ml </td><td> 12.60 </td><td> 7.30 </td><td> 5.30 </td><td> 0.11 </td><td> Sigma SRP3170 </td></tr><tr><td> FGF-2 </td><td> pg / ml </td><td> 37.30 </td><td> 32.70 </td><td> 4.60 </td><td> 0.09 </td><td> Sigma SRP4037 </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td> יחידות </td><td style="padding-left:6px;padding-right:2px"> סרה אדם </td><td colspan="3"></td><td> מקור </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td rowspan="4" style="padding-left:4px;padding-right:2px"> ציטוקינים </td><td> G-CSF </td><td> pg / ml </td><td> 14.7 ± 13.2 </td><td colspan="3" rowspan="4"> N / A </td><td rowspan="4"> PMID: 21774806 </td><td> Sigma SRP3331 </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> pg / ml </td><td> 40.9 ± 108.6 </td><td> Sigma SRP3201 </td></tr><tr><td> MCP 1 </td><td> pg / ml </td><td style="padding-left:7px;padding-right:4px"> 213.5 ± 100.7 </td><td> Sigma SRP3109 </td></tr><tr><td> TGF-α </td><td> pg / ml </td><td> 3.2 ± 4.0 </td><td> Sigma T7924 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. דוגמאות לטווחי ריכוז של הורמונים בחרו, גורמי גדילה וציטוקינים בשור וסרום אנושי. ההבדל בין הריכוז FBS 2% ו -2% CS-FBS מייצג את הסכום נוסף להשגת ריכוזים פיסיולוגיים.

Watch this Scientific Journal Video about A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion at JoVE.com

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

השתנה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלישת Assay כדי לקבוע את התפקיד הפוטנציאלי של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה בפלישת תאי הסרטן המתווך

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

a-modified-vitro-invasion-assay-to-determine-potential-role-hormones

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

10.6K Views.  Roswell Park Cancer Institute. This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Video: A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Cancer Research

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a porous membrane in a process analogous to the initial steps of cancer cell metastasis. The tested cells can be altered for the gene expression or treated with inhibitors to test for changes in the invasion potential. This experiment tests the aggressive phenotype of the mouse mammary tumor cells to discover and characterize the potential oncogenes that promote cell invasion. This technique, however, can be versatile and adapted to many different applications. The experiment itself can be done in one day and the results are acquired by light microscopy in less than a day. The results include counts of the number of invading cells for comparison and analysis. The in vitro invasion assay is a rapid, inexpensive, and clear-cut method for determining cell behavior in a culture that can be used as an initial assessment before more involved in vivo assays.

The in vitro cell invasion assay is used to measure the potential of cancer metastasis by quantifying the cellular potential for invasion and migration using cell culture inserts containing protein matrix. Cells are challenged to migrate through the protein matrix and a porous membrane, towards a chemoattractant, and then quantified by light microscopy.

השימוש של העכבר בתאי סרטן הגידול בתוך שיטת הפלישה מחוץ למבחנה כמדד של התנהגות התא אונגניים

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

Genetics

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

מודלים תלת-ממדיים בביולוגיה של סרטן: דינמיקת פלישה בהטרוספרואידים

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

מחבר זרקור: פענוח ההצלבה בין סרטן לתאי מערכת החיסון במהלך התקדמות סרטן הראש והצוואר

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish between invasive and non-invasive cells, and enables study of the effects of test compounds on tumor invasion. Cancer cells - either as aggregates or single cells - are confronted with fragments of embryonic chick heart. After organ culture in suspension for a few days or weeks the confronting cultures are fixed and embedded in paraffin for histological analysis. The three-dimensional interaction between the cancer cells and the normal tissue is then reconstructed from serial sections stained with hematoxylin-eosin or after immunohistochemical staining for epitopes in the heart tissue or the confronting cancer cells. The assay is consistent with the recent concept that cancer invasion is the result of molecular interactions between the cancer cells and their neighbouring stromal host elements (myofibroblasts, endothelial cells, extracellular matrix components, etc.). Here, this stromal environment is offered to the cancer cells as a living tissue fragment. Supporting aspects to the relevance of the assay are multiple. Invasion in the assay is in accordance with the criteria of cancer invasion: progressive occupation and replacement in time and space of the host tissue, and invasiveness and non-invasiveness in vivo of the confronting cells generally correlates with the outcome of the assay. Furthermore, the invasion pattern of cells in vivo, as defined by pathologists, is reflected in the histological images in the assay. Quantitative structure-activity relation (QSAR) analysis of the results obtained with numerous potentially anti-invasive organic congener compounds allowed the study of structure-activity relations for flavonoids and chalcones, and known anti-metastatic drugs used in the clinic (e.g., microtubule inhibitors) inhibit invasion in the assay as well. However, the assay does not take into account immunological contributions to cancer invasion.

Here, we present a protocol to study the invasion of tumor cells into living normal tissue fragments in three dimensions. This organ culture technique is mainly applied to test potentially anti-invasive drugs in vitro.

חומוס לב הפלישה Assay עבור בדיקת הפולשנות של תאי סרטן והפעילות של תרכובות פוטנציאלית אנטי-פולשנית

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

השתנה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

השימוש של העכבר בתאי סרטן הגידול בתוך שיטת הפלישה מחוץ למבחנה כמדד של התנהגות התא אונגניים

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

חומוס לב הפלישה Assay עבור בדיקת הפולשנות של תאי סרטן והפעילות של תרכובות פוטנציאלית אנטי-פולשנית