פרוטוקול זה, הבדיקה הפלישה במבחנה, הוא כלי שימושי למדידה כמותית של תאים קווי היכולת לנדוד דרך מטריצה עשירה בחלבון ולעבור דרך קרום נקבובי, בתהליך דומה לשלבים המוקדמים של פלישת תאים סרטניים. קווי תאים אלה יכולים להשתנות גנטית על מנת לבטא מעל גן או להפחית את הביטוי של גן על מנת לקבוע אם גן זה ממלא תפקיד בנדידת תאים או פלישת תאים. סוגי סרטן אגרסיביים רבים כרוכים בשינויים דרמטיים בהתנהגות התאים, כולל הגירה מוגברת ופלישה.
אז זה במבחנה הפלישה הבדיקה יכולה לאפשר לנו להבין טוב יותר את הגנים וגורמים אחרים המעורבים בתהליך זה. כדי להתחיל בהליך זה, לגדל תאים סרטניים חלביים עכבר חסיד בבקבוק T25 ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני ו 100% לחות עד שהם 70%-90% confluent ליום הראשון של הניסוי. לאחזר את החדר בוידן מכניס מאחסון ולהעביר אותם למכסה המנוע תרבות התא להתחמם לטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
השתמש בשלוש הוספות כדי ליצור נתונים חוקיים סטטיסטית עבור כל שורת תא עבור כל ניסוי. ולאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מדיית DMEM נטולת סרום מחוממת מראש למוסיפים, כך שהמברנה הנקבובית וג'ל יהיו hydrated משני הצדדים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני ו 100% לחות לפחות שעתיים.
לאחר מכן, להכין את התאים על ידי הסרת מדיה הצמיחה ושטיפת התאים עם חמישה מיליליטר של HBSS. הסר את HBSS והוסף מיליליטר אחד של 0.25%פתרון EDTA טריפסין. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה עד חמש דקות או עד התאים מופיעים מעוגלים או להראות סימנים של ניתוק.
לאחר מכן הקישו בעדינות על הבקבוק כדי לנתק את כל התאים. השהה מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של DMEM עם 10%FBS. ולהעביר את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה סטרילי 15 מיליליטר.
צנטריפוגה התאים ו 1000 פעמים g במשך חמש דקות בעדינות גלולה התאים. הסר את המדיה והשהה מחדש את גלולת הכדור בחמישה מיליליטר של DMEM ללא סרום. חזור על תהליך הצנטריפוגה והשעתה מחדש פעמיים נוספות עבור סך של שלוש שטיפות.
לאחר מכן, להשעות מחדש ביסודיות את התאים בחמשת המיליליטרים האחרונים של DMEM ללא סרום ולהבטיח שאין גושים של תאים. השתמש hemocytometer כדי לקבוע את ריכוז התא לוודא רק לספור תאים קיימא. ולדלל את ההשעיה התא ל50, 000 תאים למיליליטר בחמישה מיליליטר של DMEM ללא סרום.
לאחר מכן, מוציאים את המנה עם המוסיף מהחממה, ושואבים בעדינות את המדיה מהתוספה. הרם את ההוספה ושוגם את המדיה מה באר. עובדים במהירות, מוסיפים את הכימותרפיה לתא התחתון.
מניחים את הכנס לתוך הבאר, ועל צלחת 24 גם, להוסיף 500 microliters של ההשעיה התא לתוסף. ודא כי אין בועות אוויר נוכח משני צדי הממברנה. מחזירים את המנה לאנקובטור תרבות התאים למשך 22 שעות.
לאחר 22 שעות, הכינו פתרון של 1%paraformaldehyde ואחד X PBS עבור קיבעון. בצלחת נקייה של 24 בארות לתרבות התאים, הוסיפו מיליליטר אחד של התיקון ל בארות בודדות כך שיש באר אחת לכל הכנסה. לאחר מכן, להכין את פתרון הכתמים של 0.1% סגול גביש בתתיק של PBS עם 10%אתנול.
הוסף מיליליטר אחד של פתרון מכתים זה לנקייה עבור כל הכנסה. באמצעות מדפים, הסר כל הוספה אחת בכל פעם. מניחים צמר גפן סטרילי ספוגית בתוך כל הכנס לנגב את הצד העליון של הממברנה כדי להסיר את כל התאים unmigrated.
חזור על תהליך זה עם ספוגית כותנה שנייה. לאחר מכן, הסר את כל המדיה שנותרה מבפנים של הכנס והוסף 750 מיקרוליטרים של PBS כדי לשטוף את כל התאים המנותקים. הסר את PBS ולחזור על לשטוף עם PBS טרי.
לאחר מכן מקם את ההוספה לתוך תיקון המכיל היטב כדי לתקן את התאים שהועברו בצד התחתון של הממברנה. חזור על תהליך זה עבור כל ההוספות ותן לתוספות לתקן במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להסיר כל הכנס אחד בכל פעם מן באר שלה לשטוף אותו עם 750 microliters של PBS.
מניחים את הכנס לתוך פתרון כתמים המכיל היטב ולהשאיר אותו במשך 15 דקות כדי להכתים את כל התאים שהועברו קבוע. לאחר מכן להסיר את מוסיף לטבול אותם לתוך מקור המכיל מים מזוקקים עד המים זורמים את הכנס ברור. הסר טיפות מים עודפות והצב את ההוספה לצדדים על פיסת נייר סינון.
תן לתוספות אוויר להתייבש. הכן את הממברנה להדמיה על ידי תיוג שקופית מיקרוסקופ זכוכית נקייה עבור כל הכנסה, והצבת טיפה קטנה של שמן טבילה מיקרוסקופ למרכז כל שקופית. באמצעות אזמל, לחתוך סביב ההיקף של הממברנה בצד הפנימי של מוסיף פלסטיק כדי לנתק את הממברנה.
השתמש במדפים כדי להסיר את הממברנה ולהציב אותו על גבי טיפת השמן על השקופית שכותרתו. באמצעות מיקרוסקופ מורכב, הצג תאים בהגדלה של חמש פעמים, פי 10 או פי 20. לכימות, יש לצלם מספר תמונות שאינן חופפות בהגדלה של פי 10.
קבע את המספר הכולל של תאים או תאים פולשים לכל אזור עבור כל הדגימות. עבור כל ניסוי, בצע כל תנאי בבחינה עם שלוש הוספות שכפול וחזור מספר פעמים לקבלת תוצאות שימושיות סטטיסטית. במחקר זה, פלישה במבחנה דרך מטריצת חלבון משמש כדי להעריך את פנוטיפים אגרסיביים התנהגויות תאים אונקוגניים של תאי גידול החלב העכבר עם ביטוי שונה של חלבון אצבע אבץ, Zc3h8.
רמות גבוהות יותר של ביטוי Zc3h8 נתפסת בשורות תאים סרטניים או על ידי ביטוי בתיווך מפלסמיד, וכתוצאה מכך שיעורים מהירים של התפשטות תאים, הגירה מהירה, צמיחה בסביבות 3D, פלישה מוגברת בתוך ההקדמה הפלישה במבחנה. לעומת זאת, ירידה בביטוי על ידי מבני shRNA גורמת לתפוצה פחות אגרסיבית, הגירה ופלישה. בעוד פלישת התא פוחתת עם הפלת shRNA של ביטוי Zc3h8, פלישה זו ניצלת כאשר הביטוי ניצל.
טכניקת ההקדמה של הפלישה במבחנה שימושית ביותר מכיוון שהיא גישה מהירה, זולה, גמישה וקלה יחסית ללימוד התנהגות תאים. תאים הגדלים בתרבות קלים לתפעל גנטית. הם יכולים אפילו להיבדק למוטציות ספציפיות.
מערכת הפלישה במבחנה מאפשרת גם ניתוח של מעכבי מולקולות קטנות, כמו גם סוכנים ביולוגיים כמו מיקרו RNAs להשפעותיהם על נדידת תאים ופלישה. מצוף זה כולל גם מידה רבה של גמישות, המאפשרת שינוי של תוכן החלבון של המטריצה, גודל הנקבוביות והכימותרפיה.
