culturing fibroblasts ב רקמת גידול recapitulate כדורית הרבה יותר טוב מאשר מערכת 2D נפוץ על פלסטיק נוקשה. זה מאפשר ללמוד התברואה fibroblasts בסביבה דמוית גידול. בשיטה זו, הנוקשות של עבודת הפלסטיק של תרבות התאים אינה משפיעה באופן בלתי הפיברובלסטי על ההתברות הפיברובלסטית.
במקום זאת, ההשפעה של אינטראקציה מטריצת התא על הגידול המושרה בידול של fibroblast ניתן לנתח במבחנה. כדי להתחיל בהליך זה, השג את מדיית תרבות התאים, שהיא MEM בתוספת FBS מושבת בחום של 1% ו- 1%פניצילין סטרפטומיצין. כמו כן, להשיג פתרון מתיילקולוז שישה מיליגרם למיליליטר.
מערבבים חלק אחד של מתיילקולוז עם שלושה חלקים של התקשורת תרבות התא כדי להכין את פתרון היווצרות כדורית. התפשרו מחדש על פיברובלסטים נורמליים מונצחים שהופשרו זה על המידה או סוגי תאים אחרים כמפורט בפרוטוקול הטקסט בתספור היווצרות הכדור. אם ציטוקיני או מעכבי אינטגרין כלולים במחקר, להוסיף תרכובות אלה ההשעיה התא על מנת להנחית אותם לתוך כדוריות במהלך היווצרותם.
במידת הצורך, להוסיף תרכובות מעכב יחד עם 10 ננוגרם למיליליטר של TGF בטא אחד כדי לעורר התממשות פיברובלסטים נורמליים מונצחים. להפיץ 100 microliters של פתרון היווצרות כדורית לתוך כל באר של צלחת עגולה למטה 96 multi-well. פיפטה הפתרון בכל באר למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב.
לאחר מכן, להחרים את הצלחת באינקובטור תרבות התא ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך 24 שעות כדי לאפשר ספרואיד אחד להיווצר בכל באר. ראשית, חותכים את הקצה של קצה פיפטה כדי להגדיל את ה orifice. לאחר הדגירה הושלמה, להשתמש פיפטה לחתוך זה כדי לאסוף את הכדורואידים לתוך צינור תגובה אחד 1.5 מיליליטר לכל מצב ניסיוני או לכל חלבון להיות מנותח.
צנטריפוגה הספרואידים ב 1000 פעמים G במשך כ 30 עד 60 שניות. בזהירות להסיר את methylcellulose המכיל על טבעי על ידי צינורות הקפדה לא להפריע כדורי כדורי. יש לנקוט בזהירות מיוחדת בעת העברת הכדורואידים לצינורות התגובה.
ודא שאין לך גזירה להיסחף כוחות על ידי חיתוך הקצה. חשוב גם שתאסוף את כל הכדורים. במהלך שלב הכביסה, ודא שאתה לא מאבד את הכדורואידים על ידי שאיפה.
כדי לשטוף את הכדורים להוסיף 50 microliters של אחד X PBS. צנטריפוגה ב 1000 פעמים G במשך 30 עד 60 שניות. ואז להסיר בזהירות את PBS על ידי צינורות.
בהתאם החלבון להיות מוכתם, לתקן את הכדורידים או עם 50 microliters של 4% paraformaldehyde ו PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הכדורים עם PBS כפי שתואר קודם לכן. יש לייסוף התאים ב-0.1% טריטון X ו-PBS למשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, לשטוף את הכדורידים ב PBS שלוש פעמים כפי שתואר קודם לכן. הוסיפו PBS המכיל 5%FBS ו-2%BSA לספרואידים ודגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה כדי לחסום אתרי אינטראקציה לא ספציפיים עם חלבונים. עכשיו, הדגירה spheroids עם 30 microliters של נוגדנים ראשוניים PBS עם 2.5% FBS ו 1% BSA בארבע מעלות צלזיוס לילה.
למחרת, לשטוף את כדוריות PBS שלוש פעמים כמתואר קודם לכן. לאחר מכן, הדגירה את הספירואידים עם 30 מיקרוליטרים של נוגדנים משניים PBS עם 2.5% FBS ו 1% BSA בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות. לשטוף את הכדורים ב PBS שלוש פעמים כפי שתואר קודם לכן.
לאחר מכן, הדגירה את התאים עם 30 microliters של פתרון כתמים דאפי במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הכדורים ב PBS פעם אחת כפי שתואר קודם לכן. באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, מניחים את הכדורואידים על מגלשת זכוכית טיפה של PBS.
השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר כדי לדמיין את הכדורואידים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 10 פעמים. קח חתך אופטי שונה של הספרואיד במישורים אופטיים שונים של מחסנית Z. תמונה מייצגת של כתמים immunofluorescent של כדוריות הומו של פיברובלסטים הלבלב נורמלי לעומת spheroids הומו של פיברובלסטים הקשורים לסרטן מונצח מראה אות מוגבר עבור אלפא שלוש subunit בתאים מובחנים.
אות הפלואורסצנטיות של התאים בספירואיד מכומתים לאחר מכן עם תמונות מחסנית Z של הכדוריד תלת-מימדי ורמות התמלול של גן האלפא האלפא שלוש של האונטגרין נקבעות על ידי qPCR. כל התוצאות האלה מראות כי אלפא איטגרין שלוש הוא upregulated בסרטן מונצח הקשורים fibroblasts לעומת המקבילה הרגילה. זה מוכיח כי אלפא integrin שלוש בטא אחד יכול להיחשב סמן עבור הלבלב פיברובלסטים ההידול.
שיטה זו מתאימה באופן אידיאלי להיכנע לרקמה עצמית שנמצאת בדרך כלל באיברים ובהמוני סרטן שבהם נוקשות מטריצת התא הנוספת קובעת את גורל התא. תרבות הכדורידים היא מודל רב-תכליתי שניתן לשלב עם משגיחים אנליטיים אחרים לאחר דיסוציאציה ספרואידית כגון PCR בזמן אמת כמות וציטומטריה מלאה. Paraformaldehyde המשמש קיבעון של כדוריות הוא חומר כימי מסוכן.
כפפות ללבוש את העין צריך להיות משוחק להגנה.
