The authors acknowledge funding sources from D&#8217;Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.

1. Prepare los diferentes medios de comunicación y componentes adicionales <ol><li> Antes del experimento, que consiste en preparar los medios DMEM u otros medios especificados con la adición de FBS normales, tratado con carbón vegetal FBS, o FBS tratado con carbón vegetal más el componente a ensayar. Tenga en cuenta que varios componentes pueden ser probados en cada experimento. </li><li> Pesar y diluir las hormonas, factores de crecimiento o citoquinas apropiadamente para ser disueltos en el suero tratado con carbón vegetal a la concentración fisiológica. </li></ol> 2. Preparar la matriz de colágeno en el hielo <ol><li> Preparar 2 ml de colágeno I matriz a 2,2 mg / ml mediante la adición de los siguientes componentes filtrados estériles en hielo: 200 l 10x PBS (pH 7,4), 5,4 l de NaOH 1 N, 600 l de doble H 2 O destilada y 1,2 ml de colágeno I (a 3,63 mg / ml). </li><li> Mantenga solución de colágeno I en hielo hasta que esté listo a la placa. </li></ol> 3. Preparar las placas de la migración / invasión de ensayo &lt;/ P&gt; <ol><li> Para cada línea celular a ensayar, utilizar una placa de cámara de 24 pocillos en la que 12-pocillos contienen insertos. Usa los 12 pozos adicionales que no contienen insertos para la adición de los medios de comunicación quimioatrayentes y transferir los insertos para el conjunto experimental arriba. NOTA: una matriz de colágeno en placas con un tereftalato de polietileno (PET) de la membrana y 8 micras de tamaño de poro es óptimo para las líneas celulares utilizan aquí. Sin embargo, una matriz de Matrigel en placas prerrevestidas también puede estar sustituido con el tamaño de poro disminuido de acuerdo con la línea celular siendo investigado. </li><li> Etiquetar claramente la placa, utilizando 3 pozos por condición de ser analizados (migración FBS, migración CS-FBS, de invasión de SFB, y la invasión CS-FBS, así como FBS a la migración para un control, línea celular no invasivo). Ensayo de migración por el movimiento a través de poros en una membrana de PET, y la invasión de ensayo por el movimiento a través de una matriz de colágeno o Matrigel y luego a través de poros en la membrana. Utilice diferentes marcadores de color para cada condición de la celda a unIdentificación en el proceso de recubrimiento. </li></ol> 4. Vierta la Matriz Invasion <ol><li> Cuidadosamente pipeta 75 l de la solución matriz de colágeno en los insertos que se utilizarán para ensayos de invasión. Tenga cuidado para evitar burbujas. Dispersar las burbujas de mediante la aplicación de una punta de pipeta invertida a la superficie. </li><li> Transferir la placa con los insertos recubiertos con colágeno a una incubadora de CO 2 37 ° C y 5% durante 30 min para permitir que el gel se solidifique. </li></ol> 5. Placa de las células en la membrana o matriz Invasion <ol><li> Mientras tanto, trypsinize células y añadir medios con 10% de SFB. Centrifugar las células a 200 xg durante 5 minutos en una centrífuga de mesa y enjuague 3x en medio libre de suero. </li><li> Volver a suspender en medio libre de suero. Contar las células con un hemocitómetro o un contador de diapositivas automatizada. Añadir medio libre de suero a una concentración final de 5 x 10 4 células / ml. </li><li> Cuando la matriz de colágeno se ha solidificado (después de 30 minutos), añadir 700 l de los medios de comunicación, ya sea con2% FBS o definidos con carbón vegetal FBS a cada pocillo. De las 12 inserciones por placa: <ul><li> 3 insertos tienen colágeno y pozos con los medios de comunicación + FBS al 2% </li><li> 3 insertos tienen colágeno y pozos con los medios de comunicación + 2% CS-FBS </li><li> 3 insertos no tienen colágeno y pozos con los medios de + 2% de FBS </li><li> 3 insertos no tienen colágeno y pozos con los medios de comunicación + 2% CS-FBS </li></ul><ol><li> Use platos adicionales dependiendo del número de factores siendo probado y con un control sin colágeno correspondiente a cada condición. </li></ol></li><li> Añadir suspensión celular a los insertos en 5 x 10 4 células / ml, placas 500 células l por inserción en todas las inserciones de migración e invasión. </li><li> Se incuban las células durante 22 horas a 37 ° C. </li></ol> 6. cuantificar el número de Migración y células invasoras <ol><li> Configure tinción de pozos utilizando fijador metanol, eosina y hematoxilina, en pocillos separados. </li><li> Use hisopos de algodón para eliminar las células y la matriz de cada pocillo.Rrepeat con segunda aplicación hisopo para cada pozo. </li><li> Con unas pinzas, sumerja cada inserto 5 veces durante 1 seg en cada una de las 3 soluciones en sucesión. </li><li> Permitir inserciones se sequen O / N. </li><li> O bien i) eliminar filtros con un bisturí, cortar cuidadosamente alrededor de los bordes y montar en un portaobjetos con cubreobjetos y de inmersión en aceite, o ii) permitir que las inserciones se sequen O / N invierte y se utilizan los insertos directamente para microscopía. </li><li> El día siguiente, ver diapositivas o insertos bajo un microscopio con un objetivo de 20X y tomar 5 imágenes de diferentes regiones del filtro. Para mejorar la consistencia, tome 4 campos exteriores y uno central. </li><li> Contar las células para todas las condiciones utilizando el software ImageJ y se aplican a las siguientes fórmulas. </li><li> Determinar la invasión por ciento de la siguiente manera: La media de # de células invasoras a través de colágeno inserto = a La media de # de células que migran a través de inserción de control = b Invasion% = (a / b) * 100 </li><li> Determinar el índice de invasión en 2% de FBS como sigue: % Invasión de las células se sometió a ensayo (en 2% FBS) = c % Invasión de las células no invasivas de control en (2% FBS) = d Invasión Index (FBS) = (c / d) </li><li> Determinar el índice de invasión en 2% CS-FBS como sigue: % Invasión de las células se sometió a ensayo (en 2% CS-FBS) = e % Invasión de las células no invasivas de control en (2% CS-FBS) = f Invasión Index (CS-FBS) = (E / F) </li></ol> 7. Repita Protocolo experimental Comparando con carbón vegetal FBS al FBS despojado-carbón + X n con múltiples factores combinados <ol><li> Repetir el procedimiento varias veces como sea necesario el uso de diferentes componentes para &quot;X&quot; o una combinación de componentes. </li><li> Aplicar los cálculos para determinar la contribución de cada factor &quot;X&quot; para los efectos de la migración y la invasión. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Metástasis tumoral es un proceso de varios pasos. Las células deben romper a través de la membrana basal, intravasate en cualquiera del sistema linfático o de la sangre microvasos, en los que se transporten a sitios distantes. Las células tumorales entonces extravasan y colonizan en un macrometástasis 12. La progresión a través de la epitelial a mesenquimal (EMT), invasión tumoral y la metástasis se ha mejorado por las hormonas esteroides 13,14, factores de crecimiento 15-18, 19-21 y citoquinas. Estas moléculas son tan importantes para hacer frente a la vía de señalización de la progresión del tumor, que el desarrollo de un ensayo para hacer frente a su papel en la posibilidad de invasión tumoral es un paso importante hacia el desciframiento de las vías de señalización intrincados. Este ensayo de la utilización de suero con carbón vegetal tiene una ventaja sobre los métodos existentes, ya que tiene como objetivo identificar la fuerza motriz a la que las células tumorales están migrando. Un ensayo anterior tieneha publicado el uso de fibroblastos normales de mama primario en cámaras de invasión. En este estudio, los autores utilizaron los medios de comunicación con carbón vegetal y agregar de nuevo el estrógeno en cámaras matrigel que no causan invasión como se esperaba ya que las células no eran tumorigénico. Sin embargo, la presencia de los medios de comunicación de macrófagos acondicionado en la presencia o ausencia de estrógenos incrementó significativamente la invasión y en un grado similar 22. Mientras que este ensayo fue similar que utiliza ensayos de invasión con suero tratado con carbón vegetal en ausencia o presencia de estrógeno, que no era un ensayo de tumor y fue dirigido en el estudio de las interacciones paracrinas entre macrófagos y fibroblastos 22. Otro ensayo utilizado los medios de comunicación con carbón vegetal para mostrar que la adición de bajos niveles de estrógeno aumenta la proliferación de células de cáncer de mama, pero la resistencia causados ​​a inhibidores de la cinasa 23. Nuestro estudio es único en que es un ensayo de invasión aplicable a diversos tipos de células cancerosas diseñados para estudiar laefecto de las hormonas individuales, factores de crecimiento y citoquinas, ya sea solos o en combinación. Además, sujeto a la literatura disponible, hemos determinado las concentraciones de la hormona necesario añadir al suero con carbón vegetal para lograr niveles fisiológicamente relevantes (Tabla 1). La adición del componente individual, &quot;X&quot; en los niveles normalmente presentes en el suero es un parámetro crítico del ensayo. Mientras que este ensayo puede parecer estar limitado por los niveles publicados de hormonas, factores de crecimiento y citoquinas en el suero, el investigador puede usar ensayos de ELISA para determinar los niveles de factores adicionales. Mientras que el protocolo es específico para el uso de colágeno I, matrigel también podría ser sustituido si el investigador fue consistentemente utilizando esa matriz. La razón por la que preferimos utilizar colágeno I es porque es un único componente que se define y es el componente principal de la dermis. Además, utilizamos 75 l de 100 μg / ml de colágeno para hacer la matriz de invasión. Esto también puede ser modificado para lograr los resultados deseados. Lo mejor es optimizar la concentración de manera que un número razonable de células se pueden contar con los filtros. Si las células son altamente invasivo, puede ser mejor usar 100 l de colágeno I para la matriz o para aumentar la concentración de colágeno. Si bien esta técnica puede ayudar al investigador obtener información importante, que sólo es útil si las células tumorales están invadiendo hacia un quimioatrayente que se elimina por el carbón desmonte del suero. Si no hay ninguna diferencia entre los resultados para el control y el suero con carbón vegetal, a continuación, el ensayo no sería vale la pena. El ensayo también se ocupa de los resultados para quimioatrayentes individuales, así como supresores de la quimiotaxis. Además, en la comparación de resultados posibles (Figura 3), se utilizó la desviación estándar como el nivel de error experimental aceptado para cada experimento. Sin embargo, el val realUES pueden ser determinados por el investigador basado en la desviación estándar o el error estándar y un valor de p significativo. Además, la información obtenida de este ensayo podría resultar útil en el diseño de inhibidores farmacológicos a ciertas vías de señalización. Por ejemplo, si una o más hormonas, factores de crecimiento y / o citoquinas se encuentra estar implicada en el mecanismo de invasión para una mutación de células tumorales en particular, que un agente farmacológico existente puede ser utilizado o un nuevo fármaco diseñado para inhibir esa vía. El ensayo es también una herramienta eficaz para el estudio de la mutación tumor particular y si alterar el residuo de aminoácido o su posición mantiene la misma afinidad a la quimioatrayente que fue identificado por este ensayo. De este modo, nuestro ensayo ofrece un nuevo enfoque para proporcionar pistas sobre el mecanismo de invasión de células cancerosas y métodos posiblemente para prevenir la invasión tumoral.

Un nuevo ensayo de invasión se ha desarrollado con el objetivo de identificar la participación de hormonas específicas, citoquinas y / o factores de crecimiento como quimioatrayentes en la invasión de células de cáncer. La capacidad de las células tumorales para invadir a través de la matriz extracelular (ECM) es una característica del fenotipo metastásico 1-3. Cámaras de invasión se han utilizado ampliamente como herramientas in vitro para estudiar la invasión de células de cáncer y la migración y pueden proporcionar conocimiento en cuanto a los mecanismos de invasión tumoral in vivo y la metástasis en. Las cámaras consisten en insertos de cultivo de células cilíndricas anidadas dentro de los pocillos de placas de cultivo celular. Los fondos de los insertos son de policarbonato o poliestireno membranas semi-permeables de tamaños de poro definidos. En el ensayo de invasión estándar, las células se sembraron sobre la membrana inserto con medio libre de suero y se colocaron en pocillos de cultivo celular que se llenan con suero o sin suero como quimioatrayentes para set un grupo de quimioatractivas. Esto lleva a la fuerza de las células para moverse a través de la membrana semi-permeable (migración) o, alternativamente, a través de una capa de matriz extracelular (invasión), que luego se pueden teñir usando tintes convencionales para detectar y cuantificar el número de células. El número de células se normaliza entonces de acuerdo con la medida de la migración y la invasión en una línea celular no invasivo. Este método permite a un investigador para evaluar el potencial invasivo de diferentes tipos celulares bajo una variedad de condiciones, incluyendo manipulaciones genéticas. Hormonas, citoquinas y factores de crecimiento son componentes críticos de suero y cada vez más se están demostrado estar asociados con la conducción del fenotipo invasivo 4. Sin embargo, la naturaleza, la función y la especificidad de estas moléculas séricas quimioatractivas en la mediación de la invasión sigue siendo difícil de alcanzar. El reto sigue siendo para determinar qué factores específicos en suero o suero como quimioatrayentes son responsables de la conduccióninvasión de células cancerosas, así como qué moléculas pueden inhibir el proceso de invasión. En este reporte se describe una metodología para evaluar la posible participación de las hormonas, citoquinas y / o factores de crecimiento presentes en el suero, como moléculas que impulsan la quimioatracción y la invasión de las células cancerosas. En este protocolo modificado propuesto, el decapado de carbón se usa para eliminar las hormonas, citoquinas y factores de crecimiento de 2% de suero bovino fetal (FBS) para generar FBS 2% tratado con carbón vegetal (CS-FBS). Tanto FBS al 2% y 2% CS-FBS se utilizan como agentes para establecer la fuerza de quimioatrayentes para conducir la invasión de células de cáncer. Uso de 2% CS-FBS como un agente quimioatrayentes en comparación a la normalidad 2% de FBS proporciona varios beneficios, incluyendo en primer lugar, y lo más prominente, la capacidad de estudiar el fenotipo de la invasión del cáncer en el reducido / ausencia relativa de hormonas, citoquinas y factores de crecimiento. También permite al investigador evaluar si la eliminación colectiva de las hormonas, factores de crecimiento, y Cycitoci- provoca un aumento o disminución en el índice invasiva. El ensayo es entonces diseñado para determinar si la adición de un componente individual, designado como &quot;X&quot; puede inhibir, aumento, descenso o restaurar el índice invasiva a su valor original (véanse las Figuras 2 y 3). Aunque esta metodología es específico para el logro de los niveles fisiológicos del componente que se retira a partir del suero durante el decapado de carbón, también debe tenerse en cuenta que decapado de carbón también puede afectar a vías de transducción de señal. Por ejemplo, se ha informado de que decapado de carbón puede disminuir la actividad de la fosfatasa alcalina de las células osteoprogenitoras e inducir la adipogénesis mediante la reducción de los activadores de MAPK 5. De carbón medios pelados están disponibles comercialmente y se basan en el protocolo descrito que combina carbón de leña con dextrano y se incubaron con suero bovino fetal O / N 6. Este ensayo se desarrolló en RESPONSE a un resultado reportado por Zucker et al. 7 Los autores demostraron que un fenotipo mutante que afecta a la comunicación brecha de la salida demostró un aumento en el índice de invasión al migrar hacia los medios normales con 2% de FBS. Este aumento fue eliminado con la sustitución de suero con carbón vegetal. De este resultado, los autores concluyeron que esta migración afectados mutante hacia una molécula lipófila (más específicamente, una hormona, factor de crecimiento o citoquinas) 7. Es bien sabido que las hormonas, factores de crecimiento y citoquinas median en las vías de señalización implicadas en la promoción de tumores y la invasión 4. Por lo tanto, es importante para los investigadores científicos para determinar qué factor (s) están impulsando la invasión tumoral de sus células de cáncer en particular o mutantes bajo estudio. El ensayo está diseñado para abordar el papel de componentes individuales en su concentración fisiológica como se determina de acuerdo con la diferencia entre la concentración del componente y# 8220; X &quot;en FBS normal y el CS-FBS. Mediante el desarrollo de este ensayo, los investigadores pueden obtener mayor conocimiento en la vía invasiva específica que regule su sistema. Hormonas, factores de crecimiento y citocinas a menudo han sido clasificados como promotores tumorales 8. Algunos de estos factores, tales como EGF se utilizan como fuentes directas para quimioatrayentes en cámaras de invasión 9. Por lo tanto, parece probable que estos representan los principales componentes del suero que la invasión tumoral directa. Este protocolo propone una simple, pero significativa, modificación el ensayo in vitro convencional en la invasión que permite a un investigador para evaluar la participación de las hormonas, factores de crecimiento y citoquinas en la mediación del potencial invasivo de las células cancerosas. Sin embargo, el ensayo está diseñado para proporcionar al investigador con una respuesta de si el procedimiento será eficaz para su estudio en una primera etapa en el análisis, a fin de no utilizar un tiempo precioso y resources si consideran innecesarios. Este método utiliza CS-FBS y se basa en la discreción investigadores en cuanto a que las moléculas de perseguir como candidatos de plomo que potencialmente median invasión de células cancerosas. Los resultados de estos análisis deben demostrar ser útil en la identificación de los componentes del suero que sirven como quimioatrayentes o inhibidores de la línea celular en particular o mutante siendo estudiados. Además, este enfoque puede ayudar al investigador a identificar vías de señalización clave, ya sea que promueven o inhiben la invasión de células de cáncer; dirigiendo así el futuro diseño de fármacos.

<table><tbody><tr><td>BioCoat Control Inserts with 8.0 &amp;micro;m PET membrane</td><td>Corning</td><td>354578</td><td>12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate</td></tr><tr><td>Collagen I, rat tail</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Source = rat tail tendon, purity = 90%</td></tr><tr><td>Fixative; Diff-Quick</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9844047</td><td>Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000</td><td>Designated as FBS</td></tr><tr><td>Charcoal stripped fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>12676</td><td>Designated as CS-FBS</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30070</td><td>Designated as FBS</td></tr><tr><td>Charcoal stripped fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30068</td><td>Designated as CS-FBS</td></tr></tbody></table>

a modified in vitro invasion assay to determine the potential role of hormones, cytokines and/or growth factors in mediating cancer cell invasion

Suero de la sangre sirve como un quimioatrayente hacia el cual las células cancerosas migran e invaden, facilitando su intravasación en microvasos. Sin embargo, las moléculas reales hacia el que las células migran siendo difícil de alcanzar. Este ensayo de invasión modificado ha sido desarrollado para identificar objetivos que impulsan la migración celular y la invasión. Esta técnica compara el índice de invasión en tres condiciones para determinar si una hormona específica, factor de crecimiento o citoquina juega un papel en la mediación el potencial invasivo de una célula de cáncer. Estas condiciones incluyen i) de suero bovino fetal normal (FBS), ii) con carbón vegetal FBS (CS-FBS), que elimina hormonas, factores de crecimiento y citoquinas y iii) CS-FBS + molécula (denotado &quot;X&quot;). Un cambio significativo en la invasión de células con CS-FBS en comparación con FBS, indica la implicación de las hormonas, citoquinas o factores de crecimiento en la mediación del cambio. Las moléculas individuales se pueden agregar de nuevo a CS-FBS para ensayar su capacidad de volververso o rescatar el fenotipo invasión. Además, dos o más factores pueden combinarse para evaluar el efectos aditivos o sinérgicos de los múltiples moléculas en la conducción o inhibir la invasión. En general, este método permite al investigador determinar si las hormonas, citoquinas, y / o factores de crecimiento juegan un papel en la invasión de células sirviendo como quimioatrayentes o inhibidores de la invasión para un tipo particular de célula de cáncer o un mutante específico. Mediante la identificación de factores quimiotácticos y los inhibidores específicos, este ensayo de invasión modificado puede ayudar a dilucidar las vías de señalización que dirigen la invasión de células de cáncer.

El índice de invasión se calcula para cada condición de acuerdo a la normalización a una línea celular no invasivo. Para nuestros experimentos, utilizamos la línea celular de melanoma 1205Lu y variantes establecido líneas celulares estables como nuestras líneas invasivos, así como la variante no invasiva premaligna, WM793 de la que se derivaron las células 1205Lu 10 que sirve como un control lógico. También utilizamos colágeno I como la matriz invasión, ya que es el componente principal de la dermis. Esto está de acuerdo con un estudio previo por el cual la matriz óptima invasión varía en función de la línea celular y el grado de concordancia con resultados in vivo 11. Este ensayo de invasión se describe esquemáticamente según los resultados posibles del investigador podría obtener. Inicialmente, el índice de invasión de 2% FBS debe ser significativamente mayor o menor que el índice de invasión para CS-FBS el fin de lograr este ensayo (Figuras 1 y 2). Si un incr significativafacilidad o disminución en el índice de invasión es evidente con FBS tratado con carbón vegetal, este ensayo no es útil para el investigador (Figuras 2 y 3). Si este aumento se elimina con FBS tratado con carbón vegetal, el investigador ya tiene el conocimiento de que la invasión mejorado se dirige hacia una hormona, factor de crecimiento o citoquina (Figuras 2 y 3). Entonces, el investigador debe utilizar la información sobre el tipo específico de tumor y la mutación para determinar qué candidato (s) presentes mecanismos plausibles como quimioatrayentes. El investigador puede comenzar por tratar uno o varios componentes de forma individual a la concentración fisiológica mediante la adición del componente a la diferencia de concentración entre el 2% de FBS y 2% CS-FBS (Tabla 1). Si un componente añadido al suero con carbón vegetal aumenta significativamente disminuye el potencial de invasión en comparación con el suero con carbón vegetal solo, ese candidato, &quot;X&quot;, puede servir como un parcial orescatador completa dependiendo de la magnitud de aumento (Figuras 2 y 3). Dos o más componentes se pueden combinar para lograr un aumento aditivo o sinérgico, (indicada como X 1 + X 2 + X 3 ...) (Figura 3). Un factor que disminuye la extensión de la invasión sería clasificado como un factor inhibidor (Figuras 2 - 4). En nuestros experimentos, hemos demostrado que el uso de una línea celular de melanoma mutante (1205Lu T154A) migrar hacia un quimioatrayente con sus hormonas, factores de crecimiento y citoquinas eliminado causó una disminución en la invasividad tumoral. Tres hormonas fueron probados para identificar un posible &quot;X&quot;. Estos incluyen estrógenos (estradiol), progesterona y de la hormona tiroidea (T4). Dos de estas hormonas no tuvo ningún efecto en el índice de invasión (la progesterona y la hormona tiroidea), mientras que el estrógeno se identificó como en el factor inhibidor (Figura 4). De acuerdo con los resultados potenciales enumerados en elLa Figura 3, los resultados experimentales en este ejemplo demostrar una disminución con la Condición 2 y una inhibición con la Condición 3. Es probable que el estrógeno se utiliza, además, en este ensayo, ya que puede ser importante en la identificación de las vías que secuestran ciertos factores de señalización para las futuras estrategias de diseño de fármacos. Experimentos adicionales estarán dirigidos a los factores de crecimiento y citoquinas para identificar otros componentes que pueden servir como &quot;rescate fenotipo&quot; quimioatractantes pro-invasión. Identificación de ambas moléculas pro-invasivas e inhibitorias puede dilucidar colectivamente el potencial invasor de las líneas celulares y variantes mutantes que se investigan. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51480/51480fig1.jpg" /> Figura 1. Montaje experimental y el diseño. Modelo de la puesta a punto para el proceso experimental que muestra células sembradas ya sea sobre la membrana de PET directa o la ccapa ollagen en medio libre de suero. Las células son o migrando o invadir a través de la matriz de colágeno hacia un quimioatrayente que se modifica de acuerdo con el protocolo y se describe como la condición 1, 2 y 3. Las células migradas o invadidas son entonces fijadas y teñidas. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51480/51480fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51480/51480fig2.jpg" /> Figura 2. Posibles consecuencias de un resultado estándar membrana ensayo de invasión. Este modelo demuestra los resultados potenciales que el investigador puede encontrar para el ensayo de invasión y cómo interpretar estos resultados. Cada círculo es un resultado representativo para un filtro teñidas utilizando las mismas 3 condiciones que se describe en la Figura 1. Cada punto representa una célula que ha pasado a través de la invasiónMatrix y manchado en la parte inferior de la membrana. Las células se cuantificaron y analizaron en consecuencia apropiada. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51480/51480fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51480/51480fig3.jpg" /> Figura 3. La interpretación de datos para la invasión con CS-FBS ± X. Este esquema describe cómo los cálculos del Índice Invasión determinan las conclusiones experimentales. CS-FBS es el suero con carbón vegetal y X se refiere a los componentes individuales añadidos a los medios de comunicación CS-FBS descritos en el texto. Los autores establecen la desviación estándar (SD) como la variabilidad aceptado debido a un error experimental en nuestras condiciones. Sin embargo, dependiendo de las condiciones en observación y el número de repeticiones, este factor se puede ajustar para estar dentro de la gama de estatistaical importancia para el investigador. El experimento se puede repetir con múltiples moléculas de &quot;X&quot;, (denota como X 1 + X 2 + X 3 ...). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51480/51480fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51480/51480fig4.jpg" /> Figura 4. Resultados de ensayo de invasión. Este gráfico representa los resultados experimentales obtenidos al utilizar una línea variante de células mutantes 3 ​​establecido a partir de las células del melanoma metastásico 1205Lu. Las concentraciones de las hormonas añadidas son como sigue: estrógenos (0.566 pg / ml), progesterona (0,001 ng / ml), la hormona tiroidea (0.283 mg / dl). El control, la línea celular no invasivo utilizado para estos experimentos fue WM793B. Este experimento se repitió 3 veces con resultados similares, y un gráfico representativo se muestra. <tableborder = &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2" style="padding-left:2px;padding-right:2px"></td><td style="width:41px"> Unidades </td><td style="width:52px;padding-left:4px;padding-right:4px"> Definido FBS </td><td> CS FBS </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> Diferencia </td><td style="width:70px"> [2% de FBS] - [2% CS-FBS] </td><td style="width:85px"> Fuente </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td rowspan="5" style="padding-left:4px;padding-right:2px"> Hormonas </td><td style="padding-left:7px;padding-right:4px"> El estrógeno (estradiol) </td><td> pg / ml </td><td> 28.30 </td><td> 8.76 </td><td> 19.540 </td><td> 0,566 </td><td rowspan="5"> Life Technologies FBS cat # 16000 cs FBS cat # 12676 </td><td> Sigma E2257 </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> uIU / ml </td><td> 8.61 </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> sin ser detectado </td><td> 8,610 </td><td> 0,172 </td><td> Sigma I3536 </td></tr><tr><td> Progesterona </td><td> ng / ml </td><td> 0.05 </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> sin ser detectado </td><td> 0,050 </td><td> 0,001 </td><td> Sigma P8783 </td></tr><tr><td> La testosterona </td><td> ng / ml </td><td> 0.10 </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> sin ser detectado </td><td> 0,100 </td><td> 0,002 </td><td> Sigma T1500 </td></tr><tr><td> La hormona tiroidea (T4) </td><td> ug / dl </td><td> 14.14 </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> sin ser detectado </td><td> 14.140 </td><td> 0,283 </td><td> Sigma T1775 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Factores de crecimiento </td><td> IGF </td><td> ng / ml </td><td> 111.00 </td><td> 49.30 </td><td> 61.70 </td><td> 1.23 </td><td rowspan="3"> Thermo Scientific Hyclone <br/&gt; FBS gato # SH30070 cs FBS gato # SH30068 </td><td> Sigma I3769 </td></tr><tr><td> TGF-β </td><td> ng / ml </td><td> 12.60 </td><td> 7.30 </td><td> 5.30 </td><td> 0.11 </td><td> Sigma SRP3170 </td></tr><tr><td> FGF-2 </td><td> pg / ml </td><td> 37.30 </td><td> 32.70 </td><td> 4.60 </td><td> 0.09 </td><td> Sigma SRP4037 </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td> Unidades </td><td style="padding-left:6px;padding-right:2px"> Sera Humano </td><td colspan="3"></td><td> Fuente </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td rowspan="4" style="padding-left:4px;padding-right:2px"> Las citoquinas </td><td> G-CSF </td><td> pg / ml </td><td> 14,7 ± 13,2 </td><td colspan="3" rowspan="4"> N / A </td><td rowspan="4"> PMID: 21774806 </td><td> Sigma SRP3331 </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> pg / ml </td><td> 40.9 ± 108,6 </td><td> Sigma SRP3201 </td></tr><tr><td> MCP 1 </td><td> pg / ml </td><td style="padding-left:7px;padding-right:4px"> 213,5 ± 100,7 </td><td> Sigma SRP3109 </td></tr><tr><td> TGF-α </td><td> pg / ml </td><td> 3,2 ± 4,0 </td><td> Sigma T7924 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Ejemplos de intervalos de concentración de seleccione hormonas, factores de crecimiento y citoquinas en el suero de bovino y humano. La diferencia de concentración entre 2% de FBS y 2% CS-FBS representa la cantidad añadida para conseguir concentraciones fisiológicas.

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A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Un Modificado<em&gt; In vitro</em&gt; Invasión Ensayo para determinar el papel potencial de hormonas, citoquinas y / o factores de crecimiento en la invasión de células del cáncer de Mediación

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

10.6K vistas.  Roswell Park Cancer Institute. This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Video: A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

Mover hacia arriba: Un Simple y Flexible In Vitro invasión tridimensional protocolo

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Medicina

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a porous membrane in a process analogous to the initial steps of cancer cell metastasis. The tested cells can be altered for the gene expression or treated with inhibitors to test for changes in the invasion potential. This experiment tests the aggressive phenotype of the mouse mammary tumor cells to discover and characterize the potential oncogenes that promote cell invasion. This technique, however, can be versatile and adapted to many different applications. The experiment itself can be done in one day and the results are acquired by light microscopy in less than a day. The results include counts of the number of invading cells for comparison and analysis. The in vitro invasion assay is a rapid, inexpensive, and clear-cut method for determining cell behavior in a culture that can be used as an initial assessment before more involved in vivo assays.

The in vitro cell invasion assay is used to measure the potential of cancer metastasis by quantifying the cellular potential for invasion and migration using cell culture inserts containing protein matrix. Cells are challenged to migrate through the protein matrix and a porous membrane, towards a chemoattractant, and then quantified by light microscopy.

El uso de células tumorales mamarias de ratón en un ensayo de invasión in vitro como medida del comportamiento de las células oncogénicas

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

Genética

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

Monitoreo de la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el cultivo 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Modelos 3D en Biología del Cáncer: Dinámica de Invasión en Heterosferoides

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

Autor destacado: Descifrando la diafonía entre el cáncer y las células inmunitarias durante la progresión del cáncer de cabeza y cuello

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

Estrategia alternativa para analizar la invasión celular in vitro de cultivos 3D

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish between invasive and non-invasive cells, and enables study of the effects of test compounds on tumor invasion. Cancer cells - either as aggregates or single cells - are confronted with fragments of embryonic chick heart. After organ culture in suspension for a few days or weeks the confronting cultures are fixed and embedded in paraffin for histological analysis. The three-dimensional interaction between the cancer cells and the normal tissue is then reconstructed from serial sections stained with hematoxylin-eosin or after immunohistochemical staining for epitopes in the heart tissue or the confronting cancer cells. The assay is consistent with the recent concept that cancer invasion is the result of molecular interactions between the cancer cells and their neighbouring stromal host elements (myofibroblasts, endothelial cells, extracellular matrix components, etc.). Here, this stromal environment is offered to the cancer cells as a living tissue fragment. Supporting aspects to the relevance of the assay are multiple. Invasion in the assay is in accordance with the criteria of cancer invasion: progressive occupation and replacement in time and space of the host tissue, and invasiveness and non-invasiveness in vivo of the confronting cells generally correlates with the outcome of the assay. Furthermore, the invasion pattern of cells in vivo, as defined by pathologists, is reflected in the histological images in the assay. Quantitative structure-activity relation (QSAR) analysis of the results obtained with numerous potentially anti-invasive organic congener compounds allowed the study of structure-activity relations for flavonoids and chalcones, and known anti-metastatic drugs used in the clinic (e.g., microtubule inhibitors) inhibit invasion in the assay as well. However, the assay does not take into account immunological contributions to cancer invasion.

Here, we present a protocol to study the invasion of tumor cells into living normal tissue fragments in three dimensions. This organ culture technique is mainly applied to test potentially anti-invasive drugs in vitro.

Ensayo Invasión polluelo corazón para probar la invasividad de las células del cáncer y de la actividad de los compuestos potencialmente anti-invasivos

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

Un Modificado

Resumen

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Estrategia alternativa para analizar la invasión celular in vitro de cultivos 3D

Estrategia alternativa para analizar la invasión celular in vitro de cultivos 3D

Estrategia alternativa para analizar la invasión celular in vitro de cultivos 3D

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Ensayo Invasión polluelo corazón para probar la invasividad de las células del cáncer y de la actividad de los compuestos potencialmente anti-invasivos