Nous remercions Laurie Lee pour la lecture critique du manuscrit. TWC est soutenu par une bourse prédoctorale American Heart Association (12PRE6590007). MRB est soutenu par une subvention de formation de l&#39;Institut national du cancer (T32 CA119925). SSH est soutenue par les Instituts nationaux de la santé (R01DK078640). EL est soutenue par les National Institutes of Health (R01GM081635 et R01GM103926).

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Xenopus extrait d&#39;oeuf est un système biochimique robuste pour enquêter sur le chiffre d&#39;affaires β-caténine. La concentration de β-caténine chez Xenopus extrait d&#39;œuf est 25 ~ 2 nM. Dans des conditions optimales, l&#39;extrait d&#39;œuf est capable de dégrader les β-caténine à un débit de 50 à 100 nM / h et est semi-maximale à 24 200 nM. Il ya plusieurs étapes essentielles pour la reconstitution réussie de la dégradation de β-caténine utilisant Xenopus extrait d&#39;oeufs. Ceux-ci comprennent 1) la génération d&#39;une grande qualité extrait d&#39;oeufs de Xénope et la manière par laquelle l&#39;extrait d&#39;oeuf est préparé, 2) générant la qualité radiomarqué β-caténine et de la protéine β-caténine-luciférase, 3) l&#39;optimisation des conditions de réaction pour soutenir la dégradation de β-caténine et 4 ) traitement approprié des points de temps de réaction. Une préparation de haute qualité de Xenopus extrait d&#39;oeufs dans laquelle β-caténine est robuste dégradé dépend à la fois de la qualité des ee oeufs et la façon dont les oeufs sont traitées avant l&#39;étape de broyage, ainsi comment l&#39;extrait est ensuite centrifugé pour obtenir l&#39;extrait final. Comme mentionné dans le protocole, il est important de s&#39;assurer que les œufs de qualité ne élevés (matérialisés par contraste entre l&#39;hémisphère animal noir et hémisphère végétatif lumière) sont utilisés, que les œufs de mauvaise qualité (bouffées filandreux, tachetées ou blanc) sont supprimés dans l&#39;ensemble le processus, que les oeufs sont maintenus à une température fraîche (16 ° C) tout au long de la procédure, et que la procédure est effectuée le plus rapidement possible. Il est important de ne pas sacrifier la qualité pour la quantité d&#39;extrait. De plus, tel que mentionné précédemment, les œufs de grenouille qui pond des œufs de mauvaise qualité (&gt; 10%) devraient être entièrement éliminés. L&#39;extrait ci-dessus est une modification de la méiose II-arrêté extrait de CSF 11. La préparation de Xenopus extrait d&#39;oeufs pour la dégradation β-caténine (extrait de vitesse intermédiaire) diffteurs à partir d&#39;extraits classiques préparés pour l&#39;étude du cycle cellulaire 30-32, qui sont à basse vitesse ou haute vitesse extrait 35. Adaptation Xenopus extrait d&#39;oeufs pour dégradation optimale des autres protéines peut exiger la modification de la vitesse de centrifugation et le nombre de tours. Extrait à basse vitesse contient des organites intacts et d&#39;autres grands composants cellulaires. Ainsi, les rotations à vitesse plus élevée vont modifier la composition de l&#39;extrait et éventuellement éliminer les composants inhibiteurs et / ou essentiels qui affecteront la dégradation de la protéine d&#39;intérêt. La préparation de l&#39;extrait de vitesse intermédiaire décrit ici est optimisée pour la dégradation de la β-caténine par des composants de la voie Wnt. Spinning l&#39;extrait supérieure à 4X peut réduire considérablement la capacité de l&#39;extrait de dégrader β-caténine (même si elle a un effet minime sur la dégradation d&#39;un autre composant Wnt, Axin). β-caténine est sensible à la protéolyse de la caspase-médiée dans l&#39;extrait par centrifugation à basse vitesse et ne noticdégrader eably dans l&#39;extrait de rotation à grande vitesse. Ainsi, il est probable que des extraits de vitesse différents seront optimales pour la dégradation des composants d&#39;autres voies de signalisation. La génération de 35 S-β-caténine et la β-caténine-luciférase peut être effectuée en utilisant un certain nombre de kits disponibles dans le commerce. La production de protéines à l&#39;aide de transcription-traduction systèmes couplés est très dépendante de la qualité du plasmide: midi-préparations très pures de plasmides fonctionnent mieux et sont plus fiables par rapport à l&#39;ADN des mini-préparations. Pour le radiomarquage de β-caténine, fraîchement obtenue [35 S] méthionine ou Translabel ([35S] methionine plus de [35S] cysteine) est préféré. On notera que la méthionine et la cystéine ont tous deux tendance à s&#39;oxyder avec un stockage prolongé diminuant ainsi leur incorporation dans des β-caténine dans la transcription-traduction in vitro couplées réaction. Parce que le stockage prolongé et répété de gel-dégelcycles peuvent inhiber la dégradation, de petites quantités de la β-caténine radiomarqué sont préparés à la fois et utilisés peu de temps après. La quantité de protéine traduite et le nombre de methionines à la protéine à déterminer la puissance du signal radio-marqué. Pour β-caténine, il devrait y avoir aucun problème à obtenir des signaux forts radioactifs pour des essais de dégradation. Pour les protéines avec quelques methionines et / ou qui ne se traduisent pas bien, une méthionine [35S] et [35 S] cystéine mélange peut être utilisé à la place de [35 S] méthionine et / ou ajouté une étiquette d&#39;épitope (Myc) qui contient plusieurs methionines. Bien que le succès avec différents plasmides d&#39;expression contenant les promoteurs de phage appropriées (T7, T3 et SP6) peuvent être obtenues in vitro pour des réactions de transcription-traduction, à base de plasmide pCS2 donne généralement de meilleurs résultats. En outre, le signal de la protéine traduite peut parfois être considérablement augmentée par la suppression du 5 endogène&#39;UTR. Enfin, pour des expériences à grande échelle (par exemple, criblage à haut débit), une grande quantité de β-caténine-luciférase recombinante peut être nécessaire. β-caténine-luciférase à partir de la / système baculovirus Sf9 se dégrade avec des cinétiques similaires à celles du type sauvage β-caténine dans l&#39;extrait et d&#39;embryons de Xenopus 2. Alternativement, un haut rendement dans le système d&#39;expression in vitro (par exemple les germes à base de blé) a été utilisée avec succès pour criblage à haut débit 19, 20. Afin de mesurer de façon fiable la dégradation de la β-caténine dans le système d&#39;extraction, il est important que le signal initial à partir de l&#39;une ou l&#39;autre β-caténine radiomarqué ou la luciférase β-caténine fusion est suffisamment robuste. Ainsi, une certaine quantité de l&#39;optimisation par l&#39;expérimentateur, de la taille de l&#39;essai de dégradation, le nombre de points de temps nécessaire, et l&#39;efficacité in vitro de la réaction de traduction will nécessaire. Lors du montage de la réaction de dégradation, il ya plusieurs étapes qui peuvent être prises pour améliorer les chances d&#39;obtenir la dégradation robuste. Tout d&#39;abord, tous les réactifs doivent être décongelés rapidement et placés sur de la glace avant leur dégel complet. Étant donné que la dégradation de la β-caténine est très dépendante de l&#39;énergie, il est important que le ER est relativement fraîche. D&#39;autre part, l&#39;extrait de l&#39;oeuf de Xénope est visqueux, et il est essentiel que la réaction est soigneusement mélangé après addition de fusion β-catenin/β-catenin-luciferase radiomarqué, ER, les protéines, les petites molécules modulateurs, etc En troisième lieu, la pré-incubation de la réaction mélanger pendant 20-30 min sur la glace donne des résultats plus reproductibles lors des tests des effets de modulateurs à petites molécules. La capacité à épuiser les protéines de Xenopus extrait d&#39;oeufs représente un outil puissant pour évaluer la fonction des protéines et de leurs effets dépendant de la concentration. A titre d&#39;exemple, nous démontrons que l&#39;appauvrissement de GSK3 de Xenopus extrait bloque oeuf la dégradation de β-caténine, indiquant le rôle important de la GSK3 dans le chiffre d&#39;affaires β-caténine. Différentes conditions d&#39;appauvrissement devront être déterminée empiriquement pour des protéines différentes. Par exemple, les protéines abondantes, il faudra une augmentation de la quantité d&#39;anticorps ou de ligands d&#39;affinité perles utilisées pour parvenir à la pleine épuisement. Un bon point de départ est d&#39;utiliser des billes emballés à 1/10 du volume de l&#39;extrait afin de minimiser extrait dilution. En plus de la force de liaison du ligand / anticorps d&#39;affinité pour la protéine cible, le type de billes (par exemple, sépharose, l&#39;agarose, ou magnétique) utilisé peut influer sur l&#39;efficacité de l&#39;appauvrissement de la protéine de Xenopus extrait d&#39;oeufs 36. Enfin, il serait idéal pour analyser le degré d&#39;épuisement (typiquement par immunoblot). Une fois la réaction β-caténine est terminée, la manière par laquelle les échantillons sont traités peut grandement affecter les résultats de l&#39;expérience. La concentration de l&#39;Xenopus oeuf préparations d&#39;extraits préparés de la manière décrite est 52,41 mg / ml ± 5,40 mg / ml, et il est important de ne pas surcharger la capacité du gel SDS-PAGE; ce n&#39;est pas un problème avec le dosage de la luciférase-β-caténine. Ainsi, pour chaque point dans le temps, pas plus de 1 ml, soit de l&#39;extrait doivent être chargés dans chaque voie d&#39;un gel de SDS-PAGE. Afin d&#39;améliorer encore la qualité des résultats, l&#39;étape de fixation de gel (facultatif) diminue la radioactivité de fond et d&#39;accroître le rapport signal-sur-bruit. Pour le dosage de la luciférase, une diminution d&#39;un signal initial de 100 000 RLU dans Xenopus extrait d&#39;oeufs reflète fidèlement la variation dans les niveaux de la protéine de fusion β-caténine-luciférase protéines. Le système d&#39;extraction d&#39;oeufs de Xenopus représente un système attrayant pour étudier la régulation de la dégradation de β-caténine. Le système d&#39;extraction permet le contrôle précis de la concentration en protéines individuelles par l&#39;intermédiaire d&#39;épuisement et de reconstitution<html> tion. La capacité de contrôler leurs effets sur la cinétique de rotation β-caténine dans le temps permet de mieux comprendre le mécanisme biochimique de cette étape cruciale dans la transduction du signal Wnt. Ces manipulations ont permis de mieux comprendre en profondeur les interactions moléculaires complexes entre les composants de la voie de signalisation Wnt et sont essentiels pour le développement du premier modèle mathématique de la voie Wnt 24. Un inconvénient est que les concentrations des composants de la voie Wnt dans Xenopus extrait d&#39;oeufs et des lysats de cellules de mammifères se sont révélés différer, reflétant peut-être les différences dans la façon dont la voie Wnt est régulée pendant l&#39;embryogenèse par rapport à la situation de l&#39;adulte 37. La capacité d&#39;effectuer des essais, sur la base de la luciférase, à la fois radioactifs et enzymatiques en utilisant Xenopus extrait d&#39;oeufs fournit ajouté outils qualitatifs et qualitatifs complémentaires puissants pour étudier la régulation biochimique de la dégradation de β-caténine. t &quot;&gt; En plus de surveiller le chiffre d&#39;affaires de β-caténine, la dégradation du régulateur Wnt négatif, Axin, peut être surveillée chez Xenopus extrait d&#39;oeufs soit comme une protéine radiomarquée ou la fusion de la luciférase. l&#39;aide d&#39;une variante de la luciférase, Renilla, fusionné à Axin, a déjà été adapté pour la luciférase dégradation essai dans un format à haut débit à écran simultanément pour des modulateurs de deux protéines de la voie Wnt, β-caténine et Axin 19, 20. Cet écran biochimique identifié le médicament approuvé par la FDA, pyrvinium qui a augmenté et diminution du taux de β-caténine et axine, la dégradation, respectivement, dans Xenopus extrait d&#39;oeufs 19. pyrvinium a ensuite été validé dans des cellules humaines en culture et dans divers organismes modèles (par exemple, Xenopus et C. elegans) comme un inhibiteur de petite molécule de la voie Wnt canonique voie. En résumé, le système d&#39;extraction d&#39;oeufs de Xenopus est biochimique tha système polyvalentt peut être exploitée dans une multitude de façons d&#39;étudier le mécanisme de signalisation Wnt ainsi que pour l&#39;identification de modulateurs à petites molécules de la voie Wnt. Procédé biochimique décrit ici peut être appliqué à d&#39;autres voies de signalisation dans laquelle la dégradation des protéines peut jouer un rôle essentiel.

A correction was made to <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/51425">Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract</a>. At the time of publication there were some instances where an incorrect volume notation was used. These instances were corrected from:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 ml pelleted beads to 200 ml extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 ml extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 ml of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/ml of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 ml of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).
to:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 &#181;l pelleted beads to 200 &#181;l extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 &#181;l extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 &#181;l of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 &#181;l equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/&#181;l of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 &#181;l of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).

Erratum: Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis extrait d&#39;oeufs a été largement utilisée pour étudier de nombreux processus biologiques cellulaires, y compris la dynamique du cytosquelette, l&#39;assemblage nucléaire et l&#39;importation, l&#39;apoptose, le métabolisme de l&#39;ubiquitine, la progression du cycle cellulaire, la transduction du signal, et le renouvellement des protéines 1-17. Le système d&#39;extraction d&#39;oeufs de Xenopus se prête à l&#39;analyse biochimique d&#39;une légion de processus cellulaires parce extrait d&#39;oeufs représente essentiellement cytoplasme non dilué qui contient tous les composants cytoplasmiques essentielles nécessaires à l&#39;exécution de ces processus et de permettre l&#39;enquête. De grandes quantités d&#39;extrait d&#39;œufs peuvent être préparés en même temps pour des manipulations biochimiques qui nécessitent de grandes quantités de matière (par exemple, la purification des protéines ou criblage à haut débit) 18-20. Un autre avantage est que la concentration de protéines spécifiques dans des œufs de Xenopus extrait peut être ajustée avec précision par l&#39;addition de protéine et / ou recombinant immunodéplétion de EndoGprotéines tones, par opposition à la transfection d&#39;ADN plasmidique, où l&#39;expression de la protéine d&#39;intérêt est difficile à contrôler. En outre, le manque de protéines recombinantes disponibles peut être surmonté par l&#39;addition de transcrits codant pour la protéine d&#39;intérêt, en profitant de grande capacité de l&#39;extrait d&#39;oeufs de Xénope fraîchement préparée de traduire l&#39;ARNm ajoutées de manière exogène. La régulation de la dégradation des protéines est essentielle pour le contrôle de plusieurs voies cellulaires et traite 21. Xenopus extrait d&#39;oeufs a été largement utilisée pour étudier la dégradation des protéines que le système permet de multiples façons de surveiller le renouvellement des protéines sans facteurs de confusion de la transcription et de la traduction. La voie de signalisation Wnt est une voie de signalisation hautement conservée qui joue un rôle critique dans le développement et la maladie. Le chiffre d&#39;affaires de β-caténine, le principal effecteur de la voie Wnt, est très réglementée, et une augmentation de l&#39;état d&#39;équilibre liveau de β-caténine est essentiel pour l&#39;activation des gènes cibles de Wnt. L&#39;importance de la dégradation de β-caténine est mis en évidence par le fait que des mutations dans la voie Wnt qui inhibent la dégradation de β-caténine trouvent dans ~ 90% des cas sporadiques de cancer colorectal 22. dégradation β-caténine par des composants de la voie Wnt peut être fidèlement récapitulé dans Xenopus extrait d&#39;oeufs pour étudier le mécanisme de son chiffre d&#39;affaires ainsi que pour identifier de nouveaux modulateurs à petites molécules de sa dégradation 2, 19, 20, 23-29. Des procédés pour la préparation d&#39;extrait d&#39;oeufs de Xenopus pour l&#39;étude du cycle cellulaire ont été décrits dans des publications antérieures JoVE 30-32. Le protocole actuel décrit une modification de ces méthodes, et est optimisé pour la dégradation de la [35S]-radiomarqué β-caténine et de la luciférase-marqué β-caténine dansExtrait d&#39;oeufs de Xénope. Le dosage radio-marqué de dégradation permet la visualisation directe du taux de protéines par l&#39;intermédiaire d&#39;une autoradiographie. [35 S] méthionine est incorporé dans la protéine d&#39;intérêt en utilisant une réaction de traduction in vitro qui peut alors être directement ajouté à une réaction de dégradation. En outre, le dosage de la rotation de la protéine radiomarquée ne nécessite pas un anticorps dirigé contre la protéine d&#39;intérêt ou un marqueur d&#39;épitope, ce qui peut influencer la stabilité de la protéine. Parce que même de petits changements dans les niveaux de protéines, dont témoignent des modifications de l&#39;intensité de la bande de protéine radiomarquée, sont facilement visualisés par autoradiographie, la [35 S] radiomarqué essai de dégradation représente une méthode très utile pour la visualisation du chiffre d&#39;affaires de la protéine 2. Fusion de β-caténine de la luciférase de luciole (ci-après dénommé simplement &quot;luciférase&quot;) permet des mesures quantitatives précises et faciles des niveaux de protéines, afinpour déterminer les propriétés cinétiques de la β-caténine roulement 19, 20. Un avantage majeur du dosage de la luciférase est qu&#39;elle fournit un système quantitatif solide qui est facilement mis à l&#39;échelle vers le haut. Le protocole suivant fournit des méthodes simples pour doser la dégradation β-caténine et une méthode robuste, efficace, et efficace pour le criblage à haut débit de nouveaux modulateurs β-caténine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:709px;" width="710">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Material</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:243px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)</td>
			<td style="width:132px;">ProSpec</td>
			<td style="width:119px;">hor-272-A</td>
			<td>Reconstituted with distilled water before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CG10-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Research Products International</td>
			<td style="width:119px;">S23020-5000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC42352-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:132px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC17360-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L2884-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aprotinin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1153-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pepstatin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4265-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C8273-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3 mL syringe: Luer Lock tip</td>
			<td style="width:132px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">27G1 needle</td>
			<td style="width:132px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Steady-Glo Luciferase assay system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2520</td>
			<td>Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">L4600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">L3260</td>
			<td>Generally higher yield than reticulocyte lysate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35]</td>
			<td style="width:132px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEG772007MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Creatine phosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">27920-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Creatine phosphokinase</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3755-35KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dual-Glo luciferase assay system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2920</td>
			<td>Same storage conditions as Steady-Glo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0556214D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sorvall SS-34 fixed angle rotor</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">115 V 50/60 Hz Minicentrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-090-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine Sp6 kit</td>
			<td style="width:132px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Firefly Luciferase antibody</td>
			<td style="width:132px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab16466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-GSK3 antibody</td>
			<td style="width:132px;">BD Transduction Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">610201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FLUOStar Optima</td>
			<td style="width:132px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sorvall RC-6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">16&#176;C Incubator</td>
			<td style="width:132px;">Percival Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of &#946;-catenin degradation in xenopus egg extract

Xenopus extrait d&#39;oeufs de laevis est un système robuste et bien caractérisés pour étudier la biochimie de divers processus cellulaires. Xenopus extrait d&#39;œuf a été utilisé pour étudier le renouvellement des protéines dans de nombreux contextes cellulaires, y compris le cycle cellulaire et la transduction du signal des voies 1-3. Le présent mémoire, on décrit un procédé pour isoler l&#39;extrait d&#39;oeuf de Xénope qui a été optimisé pour favoriser la dégradation de la protéine de la voie Wnt critique, β-caténine. Deux méthodes différentes sont décrites pour évaluer β-caténine la dégradation des protéines dans Xenopus extrait d&#39;oeufs. Une méthode est visuellement informatif ([35 S] radiomarqué protéines), tandis que l&#39;autre est plus facilement mis à l&#39;échelle pour les essais à haut débit (luciole protéines de fusion luciférase marqués). Les techniques décrites peuvent être utilisés, mais ne sont pas limités à, d&#39;évaluer β-caténine renouvellement des protéines et identifier les composants moléculaires qui contribuent à son chiffre d&#39;affaires. En outre, la capalité de purifier de grands volumes de homogène extrait d&#39;oeufs de Xénope combinée à la lecture facile et quantitative des protéines de la luciférase à marquage de ce système permet d&#39;être facilement adaptée pour le criblage à haut débit pour des modulateurs de la dégradation de β-caténine.

Un schéma de dégradation de β-caténine chez Xenopus extrait d&#39;œuf est représenté sur la figure 2A. 35S marqué β-caténine a été incubé dans Xenopus extrait de l&#39;oeuf, des fractions aliquotes (1 ml d&#39;extrait équivalent) ont été prélevés à des moments appropriés, et des échantillons ont été soumis à SDS-PAGE suivie d&#39;une autoradiographie. la dégradation de β-caténine par des composants de la voie Wnt est médiée par le système ubiquitine-protéasome 2, et la dégradation de β-caténine [35 S]-radiomarquée dans l&#39;extrait de Xenopus est inhibée par l&#39;addition de l&#39;inhibiteur de protéasome MG132 Figure 2B. La dégradation de la β-caténine par des composants de la voie Wnt est dépendante de sa phosphorylation par GSK3 34. dégradation de la GSK3-dépendante peut être aisément démontrée dans plusieurs façons en utilisant l&#39;extrait de l&#39;oeuf de Xénope: 1) La β-caténine (SA) mutant (les sites de phosphorylation de GSK3 mutés en alanines) est stabilisé dans Xenopus oeuf extrait par rapport à la protéine sauvage β-caténine figure 2B. 2) des inhibiteurs à petites molécules de la GSK3 (LiCl) inhibent la dégradation de la même façon β-caténine (Figure 2C). 3) Finalement, l&#39;épuisement de la GSK3 à partir de l&#39;extrait de l&#39;oeuf de Xénope inhibe la dégradation de la β-caténine; dégradation peut être sauvé par addition exogène GSK3 Figures 2D-E. Le dosage de la β-caténine dégradation radiomarqué fournit une évaluation visuelle particulièrement instructif de son mode de dégradation (par exemple de la dégradation ubiquitine contre le clivage par apoptose). L&#39;autoradiographie, cependant, beaucoup de travail, et, pour la plupart, limitée pour l&#39;analyse à haut débit de la voie (par exemple, le dépistage des modulateurs à petites molécules de la voie Wnt). Le dosage de dégradation β-caténine-luciférase est plus facilement et plus rapidement quantifiable comme la quantité de luminescence émise est directement proportionnelle à l&#39;amontant de la protéine β-caténine-luciférase. Cette caractéristique rend le dosage de la luciférase simple et facilement adaptable pour tests à haut débit. Il est important de déterminer que la fusion de la luciférase a des propriétés similaires à celle de la protéine non fusionnée. Ceci peut être déterminé de façon empirique par fusion de la protéine de luciférase à l&#39;extrémité N-terminale, C-terminale, ou interne. Fusion de la luciférase à l&#39;extrémité N-ou C-terminale de la β-caténine n&#39;affecte pas sa capacité à activer les gènes cibles de Wnt inculturée cellules de mammifère ou de sa vitesse de rotation dans l&#39;extrait de l&#39;oeuf de Xénope 2, 19, 20. Un β-caténine-luciférase dégradation dosage représentatif de Xenopus dans l&#39;extrait d&#39;œuf est représenté sur la figure 3A, dans lequel la dégradation de la β-caténine-luciférase a été évaluée par SDS-PAGE/autoradiography de la protéine et l&#39;activité luciférase radiomarqué de la fusion. Le taux de degradation de la β-caténine-luciférase est similaire à la protéine β-caténine non marqué. La régulation de la dégradation de la β-caténine fusion-luciférase est essentiellement identique à la protéine non fusionnée que l&#39;addition de LiCl ou de l&#39;épuisement de la GSK3 conduit à l&#39;inhibition de la β-caténine-luciférase roulement. Comme représenté sur les figures 3B-C, les variations de signal radioactif de la protéine β-caténine-luciférase est parallèle à la modification de l&#39;activité enzymatique de la luciférase dans le temps. Un problème qui se pose de l&#39;utilisation de β-caténine-luciférase (en particulier la protéine de fusion produite à partir du système de transcription-traduction in vitro) est le signal de la luciférase de fond causé par l&#39;utilisation de sites d&#39;initiation de la traduction interne ou la terminaison prématurée de la traduction Figure 3D. Ce problème peut parfois être surmonté par l&#39;optimisation de la concentration d&#39;ADN utilisée dans la réaction d&#39;IVT. Nous n&#39;avons pas, cependant, observe une diminution de l&#39;activité de la luciférase de fond lorsque nous avons fait varierla concentration d&#39;ADN plasmidique de notre concept particulier β-caténine-luciférase. Il est probable que nous aurons besoin de restructurer la protéine de fusion par mutagenèse afin de réduire davantage les sites de démarrage de la traduction interne et / ou la cessation prématurée de la traduction de la protéine de fusion β-caténine-luciférase. Étant donné que la protéine de luciférase est relativement stable au cours du temps de la réaction de dégradation dans Xenopus oeuf extrait figure 3A, cependant, ce signal de fond peut être simplement soustraite si le rapport de la protéine de luciférase tronqué à la longueur complète β-caténine fusion est connue . A force de le dosage de la luciférase est la capacité à l&#39;échelle dans un format multi-puits qui permet d&#39;effectuer le criblage à haut débit pour des modulateurs de la dégradation de β-caténine. Sur la figure 4, une analyse de damier représentant est affiché en utilisant un inhibiteur de la dégradation de β-caténine, MG132, qui inhibe l&#39;<html> protéasome. Le résultat de l&#39;expérience en damier indique que le test est uniforme et reproductible dans un format à 96 puits et démontre son aptitude à l&#39;criblage à haut débit. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51425/51425fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51425/51425fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation schématique de la préparation du concentré extrait d&#39;oeufs de Xenopus. Oeufs sont collectés à partir de HCG-injecté Xenopus laevis femelles, compactés avec une faible vitesse (400 xg) de spin, et broyés et séparés par une vitesse moyenne (15 000 xg ) de spin. Prenez soin d&#39;injecter en sous-cutané dans le sac dorsal de la lymphe, retirer délicatement les œufs pourris, et bien séparer l&#39;extrait cytoplasmique de haute qualité de la moindre qualité extrait sombre comme indiqué dans le texte. igure 2 &quot;fo: contenu width =&quot; 5 po &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51425/51425fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51425/51425fig2.jpg &quot;/&gt; Β-caténine Figure 2. Β-caténine dégrade robuste quand il est incubé dans Xenopus extrait d&#39;œuf. A) Un schématique d&#39;un essai de dégradation. B) [35 S]-marqué préparé par une réaction d&#39;IVT dégrade robuste quand il est incubé dans Xenopus extrait d&#39;œuf. Ajout de MG132 (200 M) à Xenopus extrait d&#39;oeufs inhibe la dégradation β-caténine. Mutation à des alanines phosphosites GSK3 sein β-caténine (β-caténine SA) ou l&#39;ajout de LiCl (25 mM) C) inhibe la dégradation de β-caténine. D) Le site de liaison de GSK3 Axin (acides aminés 506-560) épuise efficacement GSK3 de Xenopus extrait d&#39;oeufs. E) Xenopus extrait d&#39;oeufs de GSK3 appauvri inhibe la dégradation β-caténine et peut être sauvé par addition of GSK3 recombinante (0,1 mg / ml). Ajout de LiCl (25 mm) bloque la capacité de GSK3 recombinant pour sauver la dégradation β-caténine dans l&#39;extrait de GSK3 appauvri. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51425/51425fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51425/51425fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51425/51425fig3.jpg" /> Figure 3. Β-caténine de la luciférase marqués dégrade lorsqu&#39;elle est incubée dans Xenopus extrait d&#39;oeufs. A) Radiolabeled β-caténine-luciférase dégrade à une vitesse similaire à celle de la protéine β untagged-caténine. Comme avec la protéine de type sauvage, l&#39;addition de LiCl (25 mM) inhibe la β-caténine-luciférase dégradation. Luciférase seul ne tourne pas sensiblement au cours de Xenopus extrait d&#39;oeufs. Changements dans l&#39;activité luciférase de la β-caténine-luciferase fusion parallèle l&#39;évolution de son taux de protéines. B) Ajout de LiCl (25 mM) ou de l&#39;épuisement de GSK3 C) inhibe β-caténine-luciférase chiffre d&#39;affaires évaluée en mesurant l&#39;activité de la luciférase. D) Immunoblotting pour traduite in vitro β-caténine- luciférase (en utilisant un anticorps anti-luciférase) a révélé des quantités importantes de protéine luciférase libre dans certaines préparations qui contribue probablement à l&#39;arrière-plan plus élevé par rapport à l&#39;analyse de la dégradation radiomarqué. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51425/51425fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51425/51425fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51425/51425fig4.jpg" /> Figure 4. Régulée dégradation de β-caténine-luciférase dans l&#39;extrait de Xenopus peut être adapté pourun format à haut débit. Une analyse en damier représentant de β-caténine en utilisant la luciférase-MG132 (450 uM) en tant qu&#39;inhibiteur de la dégradation de β-caténine. Colonnes grisées indiquent puits MG132-traités, et des colonnes légères représentent véhicule puits (DMSO) traités. Quantification et résultat du calcul facteur Z dans une note de 0,3 indiquant un dosage acceptable pour une utilisation potentielle dans le criblage à haut débit.

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Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Un procédé est décrit pour l&#39;analyse de la dégradation des protéines en utilisant des protéines radiomarquées et la luciférase-fusion dans Xenopus extrait d&#39;oeufs et de son adaptation pour le criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de la dégradation des protéines.

Reconstitution de β-caténine dégradation dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Extrait des oeufs

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

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Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

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12.0K vues.  Vanderbilt University Medical Center.  Un procédé est décrit pour l'analyse de la dégradation des protéines en utilisant des protéines radiomarquées et la luciférase-fusion dans Xenopus extrait d'oeufs et de son adaptation pour le criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de la dégradation des protéines. 

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Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Préparation et fractionnement de Xenopus laevis oeufs Extraits

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

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In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Assemblée nucléaire utilisant fractionnée extraits d&#39;œufs de Xénope

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualisation de localisation de l&#39;ARN Xenopus Les ovocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Etude de l&#39;ADN à l&#39;aide de Checkpoint dommages<em&gt; Xenopus</emExtraits d&#39;oeufs&gt;

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Production d&#39;<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Œuf Extraits pour identifier les ARN associée aux microtubules

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Transplantations faciales<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

La<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovocytes Cut-ouvert vaseline Gap voltage-clamp Technique Avec Fluorimétrie

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Reconstitution in vitro de complexes collecteurs de lumière de plantes et d&#39;algues vertes

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.