המימון עבודתנו מסופק על ידי ה-NIH, מצעד הפרוטות, ואת האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן.

<ol>
	<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122, 3173-3183 (1996).</li><li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos.">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods Mol Biol. 97, 393-414 (1999).</li><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hartley, K. O., Hardcastle, Z., Friday, R. V., Amaya, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+reveal+that+anterior+neural+development+requires+continued+suppression+of+BMP+signaling+after+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos reveal that anterior neural development requires continued suppression of BMP signaling after gastrulation.</a> Developmental Biology. 238, 168-184 (2001).</li><li>Karaulanov, E., Kn&#246;chel, W., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+BMP4+synexpression+in+transgenic+Xenopus.">Transcriptional regulation of BMP4 synexpression in transgenic Xenopus.</a> EMBO J. 23, 844-856 (2004).</li><li>Ogino, H., Fisher, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+a+head-field+selector+Otx2+and+Notch+signaling:+a+mechanism+for+lens+specification.">Convergence of a head-field selector Otx2 and Notch signaling: a mechanism for lens specification.</a> Development. 135, 249-2458 (2008).</li><li>Taylor, J. J., Wang, T., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf-+and+Vent-binding+sites+regulate+neural-specific+geminin+expression+in+the+gastrula+embryo.">Tcf- and Vent-binding sites regulate neural-specific geminin expression in the gastrula embryo.</a> Developmental Biology. 289, 494-506 (2006).</li><li>Marsh-Armstrong, N., Huang, H., Berry, D. L., Brown, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+transgenes+in+Xenopus+laevis.">Germ-line transmission of transgenes in Xenopus laevis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14389-14393 (1999).</li><li>Offield, M. F., Hirsch, N., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Xenopus+tropicalis+transgenic+lines+and+their+use+in+studying+lens+developmental+timing+in+living+embryos.">The development of Xenopus tropicalis transgenic lines and their use in studying lens developmental timing in living embryos.</a> Development. 127, 1789-1797 (2000).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים ושימוש ועדת באוניברסיטת וושינגטון בית הספר לרפואה.

עבור כל אחד לבנות מהונדס להיבדק, אנחנו בדרך כלל השתלת גרעינים לתוך 500-1000 ביצים, בקנה המידה הזה, אנחנו יכולים ליצור עוברים מהונדס המבטא עד 10 מבנים שונים ליום, תלוי כמה נקבות רבות המושרה להטיל ביצים. של השתלות אלו, כשליש לדבוק ביצים 60-80% מהם עוברים דרך gastrulation ביקוע להמשיך כרגיל. בהתאם לתנאי התגובה המשמש, בין 10-50% של עוברים אלה מבטאים את transgene של עניין. לכן, לאחר הליך זה היא הוקמה בשנת במעבדה, זה אפשרי עבור עובד אחד כדי ליצור אוכלוסיות של עוברים מהונדס המבטא מספר פלסמידים שונים ביום אחד. Transgenes להשתלב בגנום כמו concatemer (5-35 עותקים), ולכן שיטה זו יכולה לשמש גם כדי cointegrate יותר transgene שונים לתוך הגנום של עובר יחיד בתדר גבוה (80-90%) 4. הגישה המתוארת כאן transgenesis בהצלחה שימשו misexpress הגנים של עניין, ללמוד ויסות הגנים, וליצור עוברים המבטאים סמן / כתב ניאון תאים או מבנים בעלי עניין (לדוגמה, 4-7). Transgenes להיות מופצות דרך germline 8. לבסוף, למרות הנוהל הוא הוכיח לשימוש עם Xenopus laevis כאן, יש גם הותאמו לשימוש המינים דיפלואידי בנושא, Xenopus tropicalis 9.

גרעינים א זרע הכנה ריאגנטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X MMR (2mm CaCl 2, HEPES 5mm, pH7.5, 2mm KCl, 1mm MgCl 2, NaCl 100mm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1% Tricaine Methanesulfonate (MS222, aminobenzoic חומצה אתיל אסתר, Sigma A-5040), סודיום ביקרבונט 0.1%. להתמוסס במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמאת 2X הכנה גרעיני (NPB). ביום הכנת הגרעינים זרע, לפצות 30 מ&quot;ל NPB 2X מ aliquots של פתרונות מניות מאוחסנים קפוא: סוכרוז 500 מ&quot;מ (1.5 המניות M), 30 HEPES מ&quot;מ (1M המניות; לכיל עם KOH כך pH 7.7 נמצא 15 מ&quot;מ), 1 spermidine mM trihydrochloride (Sigma S-2501: 10 מניות מ&quot;מ), 0.4 mM tetrahydrochloride spermine (Sigma S-1141: 10 מניות מ&quot;מ), 2 מ&quot;מ dithiothreitol (Sigma D-0632: 100 מניות מ&quot;מ), 2 מ&quot;מ EDTA (500 mM EDTA, pH 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 2XNPB לעשות א 30 מ&quot;ל 1X NPB, ב 10 מ&quot;ל 1XNPB 3% BSA (חלק V, Sigma A-7906), כ 5 מ&quot;ל 1XNPB 0.3% BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lysolecithin: 100 μl של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​L-α-lyso, לציטין, חלמון ביצה (Calbiochem, 440,154); מתמוססים בטמפרטורת החדר לפני השימוש. חנות מניות מוצק בטמפרטורה של 20 ° C. מחק את אבקת המניות אם הוא הופך להיות דביק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שור בסרום אלבומין (BSA): 10% (w / v) BSA (חלק V, Sigma A-7906) מאפרים 5 מ&quot;ל מים ביום הכנת גרעיני זרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסון זרע חיץ (1ml) 1X NPB, גליצרול 30%, BSA 0.3%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילול חיץ זרע: סוכרוז 250 מ&quot;מ, 75 מ&quot;מ KCl, spermidine trihydrochloride 0.5 מ&quot;מ, 0.2 mM tetrahydrochloride spermine. לכיל ל-pH 7.3-7.5 ולאחסן aliquots 0.5-1 מ&quot;ל ב 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hoechst מס &#39;33342 (Sigma B-2261): 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל המניות DH 2 O, חנות כלי חזק אור ב 20 ° C. </li></ol> ציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלי הרוטור נדנוד צנטריפוגות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסקציה של כלים (מלקחיים ומספריים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ פלואורסצנטי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משפך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפפות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hemocytometer </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטים (26 מד) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגבות נייר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פטרי (60 מ&quot;מ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pipettes </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסטיק (5 ו - 10 מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipetman טיפים (1 מ&quot;ל ו 200μl) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרקים (1 מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות (14 מ&quot;ל; פלקון, 2059) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microcentrifuge (1.5 מ&quot;ל) </li></ul> ב הכנת תמצית מהירות גבוהה ריאגנטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X מארק השתנה Ringer (MMR): 100 מ&quot;מ NaCl, KCl mM 2, 1 mM MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 HEPES מ&quot;מ, pH 7.5. הכינו מלאי 10X, ולהתאים pH עם NaOH עד 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20X חלץ חיץ (XB) מניות מלח: 2 M KCl, 20 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, מסנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית חיץ (XB, שזה עתה הוכנו מאוחסנים על הקרח): 1X XB מלחים, סוכרוז 50 מ&quot;מ, HEPES 10mm (1 מ &#39;מניות, עם KOH טיטרציה pH כך כי הוא 7.7 כאשר מדולל ל 15 מ&quot;מ; פילטר לעקר, ולאחסן aliquots בשעה 20 ° C). הכן על 100 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2% (w / v) L-ציסטאין הידרוכלוריד 1-מימה: Made למעלה 1X מלחי XB לפני השימוש טיטרציה pH 7.8 עם NaOH. הכן על 300 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CSF-XB: 1X מלחי XB, 1 mM MgCl 2 (בנוסף MgCl 2 המצויים מלחי XB; הריכוז הסופי 2 מ&quot;מ), 10 HEPES מ&quot;מ, pH 7.7, סוכרוז 50 מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ EGTA, pH 7.7. הכן 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעכבי פרוטאז: תערובת של leupeptin, chymostatin ו pepstatin, כל מומסים לריכוז סופי של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​sulfoxide דימתיל (DMSO). אחסן aliquots קטן 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 M CaCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמהיל אנרגיה: 150 mM קריאטין פוספט, 20 mM ATP, 20 מ&quot;מ MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהריון Mare סרום גונדוטרופין (PMSG): 100 U / ml PMSG (PG600 ®, Intervet, Inc, 021,825). מתמוססים במים ומאוחסנים בטמפרטורה של 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוריוני אנושי גונדוטרופין (HCG): 1000 U / ml HCG (CHORULON ®, Intervet, Inc, 057,176). מתמוססים במים מאוחסנים 4 ° C. </li></ol> ציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Xenopus laevis נקבות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטים (18 ו - 26 מד) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פסטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רחב לשעמם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרקים (1 מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות, microcentrifuge (0.5 מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות, בעובי קיר פוליקרבונט (Beckman, 349,622) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות, ultraclear (14 x 95 מ&quot;מ; Beckman, 344,060) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge ו הרוטורים (למשל, Beckman TL-100 עם רוטורים SW 40 טי ו-TLA 100.3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוסות איסוף ביצים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דליים או מיכלי לקיום צפרדעים הנשי (למשל, 4-L כוסות פלסטיק עם מכסים רשת). </li></ul> ג השתלה גרעינית. ריאגנטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agarose 2.5% ב 0.1XMMR (להכנת מנות הזרקה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציסטאין 2.5% ב 1XMMR, PH8.0, שהוכן ביום להשתמש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ficoll </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​gentamycin (מניות 1000x) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות גבוהה לחלץ ביצה (ראה לעיל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 MgCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MMR 10X (ראה לעיל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלת אנזים (למשל NotI מניו אינגלנד Biolabs) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילול זרע חיץ (sdb: ראה לעיל) גרעינים זרע (ראה לעיל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG) לעיל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמן מינרלי (Sigma, M8410) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לינארית פלסמיד להיות הציג כמו transgene: הכן לינארית פלסמיד בריכוז של כ - 100 ng / μl ב סטרילי, nuclease ללא מים (אנו נמנעים טריס ו EDTA המכילים מאגרים, שהם רעילים מעט עוברים). אנזים הגבלה משמש linearize הפלסמיד אינו חייב להיות זהה לזה המשמש בתגובה העברת גרעיני. אנחנו בדרך כלל להשתמש NotI לתגובות כל, ולא משנה מה היא לינארית עם פלסמיד. חלק כיול של דילול האנזים המשמש התגובה עשוי להיות נחוץ, אנזים כמו יותר מדי יכול לגרום להשפעות שליליות על התפתחות שלאחר gastrula. פלסמיד יכול להיות מטוהרים במספר דרכים שונות: בדרך כלל אנו משתמשים Qiaquick Qiagen ערכת טיהור PCR על פי הנחיות היצרנים, טיהור של להקה אחת מן ג&#39;ל אינו הכרחי. אם הפלסמיד הוא מטוהרים באמצעות פנול / כלורופורם עקירות ומשקעים אתנול, להיות בטוח כדי להסיר את כל עקבות של חומרים אורגניים ואתנול. </li></ol> ציוד: מנות agarose להזרקה: ב 60 מ&quot;מ צלחת פטרי מפלסטיק, להניח 35mmX35mm קטן שוקל סירה על agarose 2.5% מותך 0.1XMMR מים כדי ליצור דיכאון עם תחתית agarose מצופה למילוי עם ביצים. לאחר agarose התקשה, עוטפים ומאחסנים parafilm ב 4 ° C עד השימוש. בצע 2-3 מנות מראש על כל תגובה מהונדס אתה מתכנן לעשות. משאבת עירוי: אנו משתמשים מזרק אחד אינפוזיה משאבה מ Apparatus הרווארד, מצויד מזרק 3 סמ&quot;ק / מחט מלא שמן מינרלי (Sigma M-8410). בלאנט את מחט המזרק קצה (כדי למנוע ממנו ניקוב בצינור) וכן לצרף את צינורות tygon בסדר. הפעל את המשאבה ב ~ 10nl/sec; זו מניחה כי זמן המחט היא כל ביצה לא יהיה גדול מ -1 שניות. משאבה צריך להיות מראש לרוץ במשך כמה דקות לפני transgenesis החל היום כדי להבטיח את הבוכנה של המזרק הוא מיושר עם בוכנה וכי תזרים חיובי יציב של שמן מתוך הצינור מתרחש. מחטים עבור העברות גרעיני. בעזרת חולץ micropipette, ליצור עם מחטים, טיפים ארוך משופע. תמונות אלה עם המלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח מצויד מיקרומטר עינית להשיג ~ 80 מיקרון הפתיחה עם צורה משופעים. ציוד נוסף: Xenopus laevis נקבות, stereomicroscope, חממה, micromanipulator, מחט microinjection חולץ (למשל דגם P-87, סאטר), מחטי מזרק (26 מד), microinjection מחטים זכוכית, מיקרומטר עינית מכויל עבור קטיעה של מחט טיפים microinjection לקוטר 80μm, בצלחות פטרי, לשקול סירות 35mm, צינורות Tygon (ID = 1 / 32 בו, OD = 3 / 32 אינץ&#39;)

production of transgenic xenopus laevis by restriction enzyme mediated integration and nuclear transplantation

שילוב יציב של מוצרים גן משובט לתוך הגנום Xenopus יש צורך לשלוט על הזמן והמקום של ביטוי, להביע את הגנים בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות העוברית, וכדי להגדיר כיצד משפרי ומקדמי לווסת התבטאות גנים בתוך העובר. פרוטוקול הפגינו כאן ניתן להשתמש כדי לייצר ביעילות מהונדס Xenopus laevis עוברים. גישה זו transgenesis כוללת שלושה חלקים: 1. גרעינים זרע מבודדים מבוגר X. laevis testis על ידי טיפול lysolecithin, אשר permeabilizes הממברנה הפלסמטית הזרע. 2. ביצה היא תמצית שהוכנה על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה, תוספת של סידן לגרום לחלץ להתקדם שלבי הביניים של מחזור התא, וכן צנטריפוגה במהירות גבוהה לבודד cytosol שלבי הביניים. 3. השתלת גרעיני: גרעין ותמצית בשילוב עם ה-DNA פלסמיד לינארית להיות הציג כמו transgene ואת כמות קטנה של אנזים הגבלה. במהלך התגובה קצר, לחלץ ביצה חלקית decondenses הכרומטין זרע האנזים הגבלה יוצרת הפסקות כרומוזומליות המקדמים של transgene רקומבינציה לתוך הגנום. גרעינים זרע שטופלו מושתלים מכן לתוך ביצים מופרית. שילוב של transgene מתרחשת בדרך כלל לפני המחשוף העוברית הראשונה כגון כי עוברי וכתוצאה מכך הם לא chimeric. עוברים אלו ניתן לנתח ללא כל צורך לגדל את הדור הבא, המאפשר לדור יעיל ומהיר של עוברים מהונדס עבור ניתוחים של האמרגן ותפקוד הגן. למבוגרים X. laevis הנובע הליך זה גם להפיץ את דרך transgene germline והוא יכול לשמש כדי ליצור שורות של חיות טרנסגניות למטרות מרובות.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation at JoVE.com

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה להפקת מהונדס<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; על ידי הכנסת transgenes לתוך גרעין הזרע בעקבות השתלת גרעיני ביצים מופרית.

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

production-transgenic-xenopus-laevis-restriction-enzyme-mediated

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

11.9K Views.  University of Manchester. זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה להפקת מהונדס Xenopus laevis על ידי הכנסת transgenes לתוך גרעין הזרע בעקבות השתלת גרעיני ביצים מופרית.

Video: Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

פלסטיק הטבעת ואת חתך של עוברים Xenopus laevis

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

קבלת ביצים Xenopus laevis נקבות

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

הכנה ההיפוך חלוקה של Xenopus laevis ביצה תמציות

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissection של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; העצבי קרסט עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Explant תרבות או<em&gt; In vivo</em&gt; השתלות

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally scales with the size of the cell, notably during embryogenesis when dramatic reductions in both cell and nuclear sizes occur. Mechanisms of nuclear size regulation are largely unknown and may be relevant to cancer where altered nuclear size is a key diagnostic and prognostic parameter. In vivo approaches to identifying nuclear size regulators are complicated by the essential and complex nature of nuclear function. The in vitro approach described here to study nuclear size control takes advantage of the normal reductions in nuclear size that occur during Xenopus laevis development. First, nuclei are assembled in X. laevis egg extract. Then, these nuclei are isolated and resuspended in cytoplasm from late stage embryos. After a 30 - 90 min incubation period, nuclear surface area decreases by 20 - 60%, providing a useful assay to identify cytoplasmic components present in late stage embryos that contribute to developmental nuclear size scaling. A major advantage of this approach is the relative facility with which the egg and embryo extracts can be biochemically manipulated, allowing for the identification of novel proteins and activities that regulate nuclear size. As with any in vitro approach, validation of results in an in vivo system is important, and microinjection of X. laevis embryos is particularly appropriate for these studies.

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Assay חינם-נייד באמצעות<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברי מחלץ לחקור מנגנונים של תקנת גודל גרעינית

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...