אנו מודים למדעי חיים ופקולטה לאמנויות ומדעים באוניברסיטה של ​​המלכה למימון עבודה זו. כמו כן, אנו מודים למעבדת צ&#39;ין-סאנג במתן החומרים הכימיים הדרושים, הציוד והתמיכה טכנית. אנו מודים גם QGEM 2011, טוני במיוחד הוא על תרומתו לדיון.

1. הכנה / שטיפת התולעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנכרן את התולעים עד 11 בוגרים צעירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיליליטר פיפטה 2 מתוך סל S על צלחת Chemotaxis ס&quot;מ 5 של מבוים תולעים שפשוט ניקית את הדשא של OP50 E. coli. הטה את הצלחת לפי צורך כדי להבטיח את התולעים נשטפים מפני שטח הצלחת לתוך המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מיליליטר פיפטה של ​​הפתרון בסל תולעת-S לתוך צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 10 שניות תוך שימוש בPicoFuge 6,600 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב סל S, משאיר את הכדור ללא הפרעה של תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון 1 S מ&quot;ל בסל לצינור microcentrifuge, להפוך כמה פעמים כדי לשטוף את התולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.4-1.6 עוד שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 10 שניות פעם החמישית, הפעם aspirating supernatant לנפח סופי של CA. 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 2 של התולעים על גבי צלחת NGM על מנת להבטיח שיש בין 50 ל 250 תולעים בכל דגימת μl 2. להתאיםהריכוז של תולעים בסל S לפי צורך על ידי resuspending את התולעים בנפח קטן יותר או גדול יותר של סל S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתולעים בassay מייד לאחר שטיפה את התולעים עד שעה 1. </li></ol> 2. הכנת לוחות המבחן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סימון התחתון של צלחת 5 ס&quot;מ, לחלק את המנה ל 4 רבעים שווים. ניתן להשתמש בו אגר chemotaxis או NGM. מינימום של 3 ניסויים נדרשים לזן גנטי הנבדקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את העיגול ברדיוס של 0.5 ס&quot;מ סביב המוצא (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את נקודה בכל רבע עם או &quot;T&quot; עבור &quot;מבחן&quot; או &quot;C&quot; עבור &quot;בקרה&quot;, להבטיח כי באתרים הם במרחק שווה ממקורו ואחד את השני. הנקודות חייבים להיות לפחות 2 ס&quot;מ מהמקור. סמן את הרביעים שמאליים והימניים תחתון כעליונים רביעים מבחן וצד ימין למעלה ורביעים שמאליים תחתונים כקבוצת ביקורת (איור 1). </li></ol> 3. פועל Assay </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הפתרון על ידי שילוב של בדיקת כמויות שווה של מתחם הבדיקה ו0.5 מ &#39;אזיד (הרדמה משמשת לעצור את התולעים עם הגיע ברבע). מערבבים את הפתרון על ידי שילוב של שליטת הממס משמש לדילול מתחם הבדיקה עם אזיד M 0.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 2 מפתרון התולעת (שהוכן ב1.8) מהגלולה על המקור (שבו שתי השורות מצטלבות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר מכן, פיפטה μl 2 של פתרון המבחן על שני האתרים &quot;T&quot;. כמו כן, פיפטה את אותה הכמות של תמיסת הבקרה על גבי שני האתרים &quot;C&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתולעת ואת טיפות odorant כבר נספגו באגרו, החלף את המכסים ולהפוך את הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 60 דקות, הנח את התולעים ב4 ° C בחממה. להסיר רק צלחת מן החממה, כאשר ניתן לספור אותו. השארת תולעים בטמפרטורת חדר עשויה לאפשר להם לגייס שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את מספר התולעים בכל רבע שחצה את circ הפנימי לחלוטיןLe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.2-3.6 באמצעות תמיסת הבקרה בשני ורביעי מבחן שליטה. זה ישמש כצלחת שליטה. שלוש צלחות כאלה צריכים להיעשות ולרוץ לשמש כשליטה מתאימה. </li></ol> 4. לפרש את הציונים / קביעת מדד Chemotaxis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מדד chemotaxis באמצעות משוואה 1. זו תניב מדד chemotactic בין -1.0 ו 1.0. </li></ol> (1) Chemotaxis מדד = (# תולעים בשני רביעי מבחן - # תולעים בשני רביעי בקרה) / (סה&quot;כ # מוורמס הבקיע) ציון 1.0 מציין משיכה מקסימלי לעבר המטרה ומייצג 100% מהתולעים המגיעים ברביעים המכילים את היעד הכימי. מדד -1.0 מעיד על דחייה מקסימלי. שיטות assay דומות כבר מועסקות 3 (טבלת 1). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דווח על ממוצע Chemotaxiשל מדד (CI) ושגיאת תקן של משמעות (SEM). לבצע מבחן t של סטודנט השוואת הנתונים מצלחות הבדיקה ובקרה. </li></ol>

<ol><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-527 (1993).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7, 729-742 (1991).</li>
<li>Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+preference+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Ethanol preference in C. elegans.</a> Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).</li>
<li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).</li>
<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14, 803-812 (1995).</li>
<li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Positive+Butanone+Learning%2C+Short-term%2C+and+Long-term+Associative+Memory+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490(2011).</li>
<li>Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+chemotaxis+responses%3A+sensory+neurons+define+olfactory+preferences+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans.</a> Cell. 91, 161-169 (1997).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+pirouettes+in+Caenorhabditis+elegans+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis.</a> J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).</li>
<li>Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonium-acetate+is+sensed+by+gustatory+and+olfactory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 3, e2467(2008).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods%3A+Synchronization+and+Observation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).</li>
<li>Sengupta, P., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+specification+and+differentiation+in+the+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).</li>
<li>Hart, A. C. Behavior. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHart%2C+AC+%22WormBook%22">WormBook</a>. , (1895).</li>
</ol>

יש לנו מה למסור.

Chemotaxis, למרות שנשלט על ידי מערכת מורכבת של מנגנונים עצביים וסלולריים, יכול להיות בקלות ובאופן אובייקטיבי לכמת באמצעות מבחני chemotaxis. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר מכל מבחני, יש לנקוט בצעדים קריטיים מסוימים. ראשית, בימוי התולעים הוא חיוני במניב תוצאות ניסוי עולות בקנה אחד. תולעים בשלבי חיים שונים מתנהגים בצורה שונה 13; תולעים בשלב כל כך מעורבים עשויים להטות תוצאות ניסוי. שנית, להבטיח לכל א &#39; coli הוא לשטוף את התולעים הוא קריטי, כשיירי חיידקים עלולים להפריע לassay. כמו כן, חשוב לציין כי חומר ההרדמה, 0.5-1 אזיד M-נתרן, יעצור את התולעים ברדיוס של 1 ס&quot;מ למקום שבו הוצב. לאור זאת, זה הוא בעל חשיבות עליונה, כי אזיד להיות ממוקם לפחות 2 ס&quot;מ מהמקור. אם אזיד הוא הבחין 1.5 ס&quot;מ או פחות ממקור התולעים יהיו משותקים בתוך המעגל הפנימי ואף יקבלו ניקוד. עוד אזיד ממוקם, נוסף לתוךרביעים את התולעים יכולים לזוז. גם צלחות צריכים להיות כל הזמן ברמה כדי להבטיח עקביות לאורך ניסויים ועל מנת להבטיח תוצאות לא בלבלו על ידי הטיות כבידה. בנוסף לכך, לא יותר מ 250 תולעים יש להשתמש בניסוי. צפיפות עלולה לעכב תנועת תולעת למספר סיבות. מצאנו כי תולעים התקבצו נוטים להישאר ביחד, לטובת נסיעה לרבע. לבסוף, מניח את צלחות assay על 4 מעלות צלזיוס לאחר 60 דקות שומר את התולעים מההזזה, המאפשר לחוקר לשמור על המדינה של הצלחת עד שהוא מסוגל להיות בספירה. צלחות יכולות לאחסן ב 4 ° C וכבש כעבור כמה ימים מבלי להשפיע על התוצאות. כמה שינויים פרוצדורליים יכולים לשפר עוד יותר את השירות של פרוטוקול זה. כמו שהוא, פרוטוקול זה יכול לשמש כשיטת בדיקת מגוון של פנוטיפים בניסויים נפרדים. באופן אידיאלי, את התוצאות של ניסויי מוטציה יש להשוות באותם תנאים. שימוש בזנים שהמפורש fluorescחלבוני ent כגון GFP או RFP הייתי להשיג את זה. שינוי זה ייתן חוקר עקביות ניסיונית יותר על ידי הצבת את הזנים השונים על אותה צלחת assay ויתרון של הבקיע צלחת אחת במקום הבקיע צלחות בדיקה מול בקרה. מבחני chemotaxis עשויים לשמש גם כדי לאפיין את התנהגות chemotactic של לנמטודות מהונדס גנטי. זה מאפשר זיקה המחייבת של קולטנים שנלקחו ממינים אחרים כדי להיבדק. אם קולטנים אלה באים לידי ביטוי בנוירונים chemoattractant או chemorepulsive של התולעת באופן תואם, יש לשים לב תוצאות chemotactic צפוי 8. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם יותר לצורכים אחרים גם כן. נכון לעכשיו, שיטה זו אינה מאפשרת לחוקר לעקוב אחר התנועה של תולעים. בגלל 5 ס&quot;מ צלחות מקובלות למבחנים אלה, מצלמת וידאו המחוברת לstereomicroscope יכולה למעשה לצלם התנועהשל התולעים לכיוון רבע אחד של assay ללא השימוש בבמה ממונעת ותוכנת מעקב תולעת. לבסוף, למרות שchemoattractants מופנים בעיקר כלתרכובות הבדיקה בפרוטוקול, chemorepellents עשוי לשמש גם. פרוטוקול זה, כפי שהוא או שונה, הוא פשוט ויעיל ויכול לשמש ככלי יעיל לכימות התנהגות chemotactic של ג elegans, או להוכחת ההתנהגות לתלמידים בבית הספר התיכון או ברמת התואר הראשון.

וורד פותח לראשונה בשנת 1973 assay chemotaxis 5, ומאז יש לו יישומים מרחיקים לכת. נוירוביולוגיה היא תחום אחד שיש לו יתרון בשימוש במגוון רחב של מבחני chemotaxis. הסתגלות חוש הריח, צורה פשוטה של למידה וזיכרון, הודגמה בג elegans באמצעות מבחני chemotaxis 6. הם גם היו בשימוש כדי להראות שג elegans יכול לפתח אתנול סובלנות-תוצאה שמדגימה את הגמישות התנהגותית של התולעים לא רק, אבל זה גם מראה כי התולעים יכולים להיות שימושיים מאוד במחקר של תלות באלכוהול בבני אדם 3. מבחני אפילו פותחו כדי להדגים את יכולתו של ג elegans לאחסון קצר וזיכרון לטווח ארוך על ידי מראה כי עמותות מבוצעות על ידי התולעים בין chemoattractants ומזון (OP50) 7. בנוסף, בהתחשב במידע הרב זמין כרגע לגבי ג elegans הגנום, chemotaxiהתנהגותו של ג של elegans השתנה פעמים רבות על ידי גרימת מוטציות 1,8. זה מאפשר להרבה אפשרויות הנדסיות מרגשות, כגון פיתוח של ג elegans ככלי bioremediation. לכן, מאז הפיתוח הראשוני של assay chemotaxis בשנת 1973, זה כבר שינה בתדירות גבוהה ומשמש להבהיר תעלומות במגוון רחב של תחומים. מבחני מסוימים שנועדו לגלות את המסלול הספציפי שצולם על ידי את התולעים לכיוון יעד. Assay הטיפוסי מסוג זה פותח על ידי וורד 5. שלושה תולעים הונחו על אגר נמסו במשך 15 דקות. התנועות שלהם אותרו על ידי החותם שהשאיר כמו שהם נסעו מהפריפריה של הצלחת עד לשיפוע attractant במרכז הצלחת. כל התולעים על הצלחת נעצרו באמצעות כלורופורם בסופו של כל משפט. צאצא אחד של שיטה זו הניח תולעת אחת באמצע הצלחת עם attractant ושליטהמרחקים שווים והפך לא מהמקור 2. פירס-Shimomura et al. פיתחה assay להתבוננות בטבעה של התנועה מעורבת בchemotaxis 9 המדויק. תולעים בודדים הוצבו ב9 מנות ס&quot;מ פטרי המכילים גם ריכוז אחיד של attractant או שיפוע בצורה רדיאלית, שהגיעו לשיא במקור attractant. תוכנת מחשב שזיהתה את התולעת הייתה בשימוש כדי להקליט את ההתנהגות הנצפית. מצלמת וידאו המחוברת למיקרוסקופ עבדה בשיתוף עם הבמה כדי להתאים את צלחת פטרי באופן אוטומטי כassay רץ על מנת להבטיח את התולעת נשארה בשדה הראייה. מזה, מידע מפורט יותר התגלה לגבי הגורם לפירואטים המוצגים על ידי ג elegans. מבחני אחרים, יותר דומים לזה שתואר כאן, בדקו את התגובה של אוכלוסייה גדולה של תולעים לתרכובות בדיקה. מבחני chemotaxis שתי כבר ברבעהשתמש כדי לחקור את התפקידים שנוירונים שונים, קולטנים, ומולקולות העברת אותות שיחק כאשר ג elegans נחשף לתרכובות שונות 1. בין 20-50 תולעי שטף הוצבו בסמוך למרכז הצלחת עם attractant ושליטה בשני קצוות קוטביים יחד עם ההרדמה, אזיד הנתרן (NAN 3). לאחר 60 דקות, מדד chemotactic עם ערכים מ -1.0 ל 1.0 נוצר על בסיס ההפרש בין כמה תולעים הוצמדו לattractant או השליטה. מדד chemotactic דומה היה בשימוש בassay דיווח במאמר זה, אם כי assay קודם לכן לא הצליח להעריך אך ורק תולעים שאינן ניעתי. assay זה היה לאחר מכן הוחל בהמשך לבדיקת ההשפעות של אבלציה העצבית בchemotaxis. וריאציה נוספת של assay האמור בוצעה בו 100-200 תולעים הונחו במרכז צלחת המכילה ארבעה רביעים 3. רביעים סמוכים גם הכילו את המבחן אולשלוט בחומר. כמו במבחנים קודמים, התולעים היו משותקים על ידי הפעולה של אזיד הנתרן לפני שהבקיע. שיטה דומה מתוארת כאן כדרך להעריך את התגובות של ג elegans לתרכובות שונות. עם זאת, יש לו את השיטה מתחת לערך מוסף של הערכה רק תולעים שעברו מרחק סף המפריד נייד מנייחים תולעים. מבחני אחרים לא שולבו הנחיות דומות להתעלמות תולעים נייחים. Frøkjær-ג&#39;נסן et al. פיתחה assay תכליתי אשר יכול לשמש כדי לבדוק את תרכובות מסיסים שניהם נדיפים ומים 10. צלחת פטרי הייתה מחולקת לארבעה רבעים. הרביעים העליונים ותחתונים לא מכילים ממסים. הרבע השמאלי הכיל מים, והזכות הכילה attractant. כאשר בודקים odorants נדיפים, אנליטי הונח על המכסה של הצלחת, מעל רבע הראוי, ואילו תרכובות מסיסים במים הונחו ישירות על אגאr. השיטות קיימים כיום להערכת תגובת chemotactic של ג elegans כל הזמן להיות מעודן כדי לייעל את נוחות השימוש, יעיל, ודיוק שלהם. כך, בעוד שיש לו את assay המתואר כאן את היכולת להעריך את המספר הגדול ביותר של תולעים (תפוקה המקסימלית:. 250 תולעים / לשעה לכל צלחת, מעט גדולה יותר מהתפוקה שהפגינה לי ואח&#39; 3); הוא כוח האמיתי של שיטה זו שיאו תמציתי של רבים מהמאפיינים של מבחני קודמים (טבלת 1).

<table><tbody><tr><td>S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter.] Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoFuge</td><td>Stratagene</td><td>400552</td><td></td></tr><tr><td>Microscopes</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P10 Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Sodium Azide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol/Distilled Water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0600</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Amresco</td><td>CA97062-046</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>VWR</td><td>CA12001-120</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>BDH</td><td>CABDH8641-2</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans chemotaxis assay

אורגניזמים רבים משתמשים chemotaxis לחפש מקורות מזון, להימנע מחומרים רעילים, ולמצוא בני זוג. Caenorhabditis elegans יש התנהגות chemotaxis מרשימה. הנחת היסוד מאחורי בודק את התגובה של התולעים לodorant הוא למקם אותם בשטח ולבחון את התנועה עוררה בתגובה לodorant. אפילו עם מבחני הזמינים רבים, אופטימיזציה של תולעת מתחילה מיקום יחסי הן לשליטה ואזורי מבחן, תוך מזעור האינטראקציה של תולעים אחד עם השני, תוך שמירה על גודל מדגם משמעותי נשארה בתהליך עבודה 1-10. השיטה המתוארת כאן שואפת לטפל בבעיות אלה על ידי שינוי assay שפותח על ידי Bargmann et al. 1. צלחת פטרי מחולקת לארבעה רבעים, שני רביעים מול מסומנים &quot;בדיקה&quot; ושתיים מיועדים &quot;שליטה&quot;. הרדמה ממוקמת בכל המבחן ובאתרי בקרה. את התולעים ממוקמים במרכזה של הצלחת עם circlדואר מסומן סביב המוצא כדי להבטיח שתולעים אינם נעימים ביהיו להתעלם ממנו. ניצול מערכת של ארבעה רביעים ולא אחד או שתיים 1 2 מבטל הטיה בתנועה של התולעים, כפי שהם במרחק שווה מדגימות בדיקה ובקרה, ללא קשר לאיזה צד של המקור שהם התחילו. זה עוקף את הבעיה של תולעים נאלצים לנסוע דרך מקבץ של תולעים אחרים להגיב לodorant, אשר יכול לעכב את התולעים או להכריח אותם לקחת דרך עקיפה יותר, מניב פרשנות שגויה של הנתיב המיועד שלהם. שיטה זו מראה גם יתרונות מעשיים על ידי בעל מדגם גדול יותר ומאפשר לחוקר להפעיל את assay ללא השגחה ולהבקיע את תולעי פעם אחת הזמן המוקצב פג.

השוואה בין ג פראי סוג (N2) elegans לODR-10 (ky10) שעברו המוטציה. אנחנו השתמשנו דיאצטיל, ג ידוע chemoattractant elegans, להשוות תולעי wildtype לזה של מוטציה שחסרה את הקולטן ל1,12 דיאצטיל. לwildtype (N2) תולעי מדד chemotactic היה 0.100 ± 0.066 לאתנול, ו0.839 ± .031-.5% דיאצטיל. כצפוי, דיאצטיל מעורר תגובת chemoattractive משמעותית מwild-type תולעים (P &lt;0.003). בניגוד לODR-10 (ky10) מוטציות שחסרו את הקולטנים דיאצטיל היו CI דיאצטיל שלא היה שונה באופן משמעותי מקבוצת הביקורת (איור 3). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מחבר </td><td> # תולעים / צלחת </td><td> משך (דקות) </td><td> 1 תפוקה לשעה (תולעי # מקסימום) </td><td> Pros </td><td> חסרונות </td&gt; </tr><tr><td> וורד 5 </td><td> 3 </td><td> 15 </td><td> 12 </td><td rowspan="2"> • מסלול תנועה • דין וחשבון על תולעים נייחים על ידי התבוננות ברורה </td><td> תלוי בחוקר מעורבות @ מרווחי זמן קצרים (15 דקות) </td></tr><tr><td> Bargmann &amp; הורביץ 2 </td><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 1 </td><td> • תפוקה נמוכה • מפזר attractant במשך 12-24 שעות </td></tr><tr><td> Bargmann, Hartwieg, 1 הורביץ </td><td> 20-50 </td><td> 60 </td><td> 50 </td><td> • מעורבות חוקר מינימאלי (NAN 3 בשימוש) • # תולעים מתונים </td><td rowspan="2"> • אין שיטת ניקוד הנייחת דיסקרטית • לא לעקוב אחר תנועה </td></tr><tr><td> לי, ג&#39;י, McIntire 3 </td><td> 100-200 </td><td> 60 </td><td> 200 </td><td> • מעורבות חוקר מינימאלי (NAN 3 בשימוש) • גבוה #<html> תולעים </td></tr><tr><td> פירס-Shimomura, מורס, Lockery 9 </td><td> 1 </td><td> 20 (או עד ללהיטי תולעת קצה הצלחת) </td><td> 3 </td><td> • מסלול תנועה • דין וחשבון על תולעים נייחים על ידי התבוננות ברורה • תיעוד מפורט, קבוע של תנועת תולעת </td><td> דורש מערכת מעקב מחשב מתקדמת </td></tr><tr><td> מרג&#39;י, פאלמר, צ&#39;ין-סאנג (בשיטה זו) </td><td> 50-250 </td><td> 60 </td><td> 250 </td><td> • מעורבות חוקר מינימאלי (NAN 3 בשימוש) • • תולעי חשבונות גבוהים # לתולעים נייחים </td><td> • לא לעקוב אחר תנועה </td></tr></tbody></table> טבלת מס &#39;1. השוואה בין שיטות assay תאר. עבור: לשמור-together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50069/50069fig1.jpg" /> איור 1. צלחת פטרי 5 ס&quot;מ מחולקת לארבעה רבעים, שכל אחד מיועד או כמבחן (&quot;T&quot;) או באזור בקרה (&quot;C&quot;). המעגל הפנימי תוחם אזור שבו תנועה היא לא הבקיע. זה מונע תולעים נייחים מגרם להטיה בנתונים. הרביעים ליצור תבנית לסירוגין של בדיקה ובקרה כדי למנוע כל הטיה שעלולה להתרחש מהמיקום הראשוני של התולעים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50069/50069fig2.jpg" /> איור 2. סכמטי של assay מותאם Lee et al. (2009). צלחות נחלקות למבחן הרביעים שניים (A ו-B) ושני פקדים (C &amp; D). אזיד הנתרן כלול גם עם הנקודות הבדיקה ובקרה כדי לשתק את התולעים. תולעים ממוקמים במרכז הצלחת ולאחר 60 דקות תולעים נספרים על כל QuadraNT. אנשים שלא לחצות את המעגל הפנימי לא קלעו. דוגמאות סכמטי של ניטראלי וattractant מצוינות. מדד חישוב chemotactic (CI) מוצג להלן. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50069/50069fig3.jpg" /> איור 3. מדדי chemotactic שנוצרו ממבחנים שבוצעו עם wild-type תולעים (WT) וODR-10 (ky10) או באמצעות דיאצטיל כattractant מבחן או אתנול (צלחות שליטה). ערכים הם ממוצעים של לפחות 3 ניסויים בלתי תלויים (N&gt; 200 תולעים) עבור כל תנאי. ברים שגיאה משקפים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM) * = P &lt;0.003 מבחן t של הסטודנט.

Watch this Scientific Journal Video about C. elegans Chemotaxis Assay at JoVE.com

C. elegans Chemotaxis Assay

שיטת הערכת כמותית תגובת chemotactic של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מתואר. מדד chemotactic (CI) הועסק כדרך להעריך בדיוק את התגובה של תולעים למטרות מסוימות, ומשמש כפלטפורמה להשוואה בין זנים ותרכובות של עניין.

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

C. elegans Chemotaxis Assay

45.7K Views.  Queen's University. שיטת הערכת כמותית תגובת chemotactic של Elegans Caenorhabditis מתואר. מדד chemotactic (CI) הועסק כדרך להעריך בדיוק את התגובה של תולעים למטרות מסוימות, ומשמש כפלטפורמה להשוואה בין זנים ותרכובות של עניין.

Video: C. elegans Chemotaxis Assay

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Bioengineering

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

ניתוח אוטומטי של אוכלוסיה מבוססת נמטודות מבוססי Assay העדפה

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Behavior

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates movement. Additionally, gravity sensation, which occurs in the mammalian inner ear, is closely related to hearing - thus, understanding this process has implications for auditory and vestibular research. Gravitaxis assays exist for some model organisms, including Drosophila. Single worms have previously been assayed for their orientation preference as they settle in solution. However, a reliable and robust assay for Caenorhabditis gravitaxis has not been described. The present protocol outlines a procedure for performing gravitaxis assays that can be used to test hundreds of Caenorhabditis dauers at a time. This large-scale, long-distance assay allows for detailed data collection, revealing phenotypes that may be missed on a standard plate-based assay. Dauer movement along the vertical axis is compared with horizontal controls to ensure that directional bias is due to gravity. Gravitactic preference can then be compared between strains or experimental conditions. This method can determine molecular, cellular, and environmental requirements for gravitaxis in worms.

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

The present protocol outlines methods for conducting a large-scale gravitaxis assay with Caenorhabditis dauer larvae. This protocol allows for better detection of gravitaxis behavior compared with a plate-based assay.

בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול של זחלי Caenorhabditis Dauer

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

<meta charset="utf8"></head><body>מיצוי וכימות של תגובות פרומון מין נדיפות ב- C. elegans

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and computations governing these signals remains an active area of research. The nematode Caenorhabditis elegans provides a powerful model for studying these processes as it produces a volatile sex pheromone. This pheromone is synthesized by virgin females or sperm-depleted hermaphrodites and serves as an attractant for males.
This protocol describes a detailed method for isolating the volatile sex pheromone from several C. elegans strains (WT strain N2, daf-22, and fog-2) and C. remanei. We also provide a protocol for quantifying the male chemotaxis response to the volatile sex pheromone. Our analysis utilizes measurements such as chemotaxis index (C.I.), arrival time (A.T.), and a trajectory plot to compare male responses under various conditions accurately. This method allows for robust comparisons between males of different genetic backgrounds or developmental stages. Furthermore, the experimental setup outlined here is adaptable to investigating other chemoattraction chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: בחינת השפעת פרומון המין הנדיף על התנהגות גברי C. elegans

This protocol establishes methods for extracting and quantifying responses to the volatile sex pheromone in C. elegans, providing tools to study chemical communication and navigation trajectory.

מיצוי פרומון מין נדיף ובדיקת כימותרפיה ב- Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

מדידת Chemotaxis סלולרי עם ECIS / מוניות

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Chemotaxis is a process in which cells or organisms move in response to a chemical stimulus. In nature, chemotaxis is important for organisms to sense and move toward food sources and move away from stimuli that may be toxic or harmful. Chemotaxis is also important at the cellular level. For example, chemotaxis is required for the movement of sperm toward an egg prior to fertilization. In the lab, chemotaxis is frequently examined in the nematode, C. elegans, which is known to migrate towards food sources in soil, but away from toxins such as heavy metals, substances with a low pH, and detergents. This video demonstrates how to perform a chemotaxis assay, which includes preparing the chemotaxis plates and the worms, running the assay, and analyzing the data. Then, we discuss examples of how chemotaxis assays can be used in C. elegans as a tool to understand learning and memory, olfactory adaptation, and neurological disease such as Alzheimer&quot;s disease. Chemotaxis experiments in C. elegans have near-limitless possibilities for learning more about the cellular and genetic mechanisms of many biological processes, and may lead to a greater understanding of human biology, development, and disease.

Chemotaxis Assay in Caenorhabditis elegans

ג. אלגנס Chemotaxis Assay

Chemotaxis is a process in which cells or organisms move in response to a chemical stimulus. In nature, chemotaxis is important for organisms to sense and ...

Education

JoVE Science Education

Basic Biology

Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

C. elegans Chemotaxis Assay: A Method to Test Chemosensation in Worms

Source: Campbell, J. C., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/55939/a-caenorhabditis-elegans-nutritional-status-based-copper-aversion">A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video introduces chemotaxis in the nematode C. elegans and shows a sample protocol testing chemotactic aversion to copper sulfate.

ג. אלגנס בדיקת כימוטקסיס: שיטה לבדיקת כימוסנסציה בתולעים

Source: Campbell, J. C., et al. A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay. J. Vis. Exp. (2017).
This video introduces ...

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Summary

Explore More Videos

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של

ניתוח אוטומטי של אוכלוסיה מבוססת נמטודות מבוססי Assay העדפה

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול של זחלי Caenorhabditis Dauer

מיצוי פרומון מין נדיף ובדיקת כימותרפיה ב- Caenorhabditis elegans

מיצוי פרומון מין נדיף ובדיקת כימותרפיה ב- Caenorhabditis elegans

מיצוי פרומון מין נדיף ובדיקת כימותרפיה ב- Caenorhabditis elegans

מדידת Chemotaxis סלולרי עם ECIS / מוניות

ג. אלגנס Chemotaxis Assay

ג. אלגנס בדיקת כימוטקסיס: שיטה לבדיקת כימוסנסציה בתולעים