<ol>
	<li>Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+genomic+and+complementary+DNA+from+Shaker,+a+putative+potassium+channel+gene+from+Drosophila.">Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila.</a> Science. 237, 749-753 (1987).</li><li>Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+a+probable+potassium+channel+component+encoded+at+Shaker+locus+of+Drosophila.">Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila.</a> Science. 237, 770-775 (1987).</li><li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Cell+Recordings+from+Brain+of+Adult+Drosophila.">Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (6), e248 (2007).</li><li>Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cav2-type+calcium+channels+encoded+by+cac+regulate+AP-independent+neurotransmitter+release+at+cholinergic+synapses+in+adult+Drosophila+brain.">Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain.</a> J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).</li><li>Baines, R. A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+development+of+central+neurons+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo.</a> J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).</li><li>Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+in+the+voltage-gated+sodium+channel+DmNav+regulates+activation,+inactivation,+and+persistent+current.">Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current.</a> J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).</li><li>Worrell, J. W., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+voltage-dependent+Ca2++currents+in+identified+Drosophila+motoneurons+in+situ.">Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ.</a> J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).</li><li>Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+differences+in+firing+properties+and+potassium+currents+in+Drosophila+larval+motoneurons.">Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons.</a> J. Neurophysiol. , (2011).</li><li>Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+identified+motor+neurons+in+the+Drosophila+third+instar+larva+central+nervous+system.">Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system.</a> J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).</li><li>Pulver, S. R., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike+integration+and+cellular+memory+in+a+rhythmic+network+from+Na+/K++pump+current+dynamics.">Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics.</a> Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).</li><li>Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nicotinic+acetylcholine+receptor+Dalpha7+is+required+for+an+escape+behavior+in+Drosophila.">The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila.</a> PLoS Biol. 4, e63 (2006).</li><li>Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite+elongation+and+dendritic+branching+are+affected+separately+by+different+forms+of+intrinsic+motoneuron+excitability.">Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability.</a> J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).</li><li>Ryglewski, S., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaker+and+Shal+mediate+transient+calcium-independent+potassium+current+in+a+Drosophila+flight+motoneuron.">Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron.</a> J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).</li><li>Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cav2+Channels+Mediate+LVA+and+HVA+Calcium+Currents+in+Drosophila+Motoneurons.">Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons.</a> J. Physiol. , (2011).</li><li>Ikeda, K., Koenig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+identification+of+the+motor+neurons+innervating+the+dorsal+longitudinal+flight+muscle+of+Drosophila+melanogaster.">Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).</li><li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Mount+Preparation+of+the+Adult+Drosophila+Ventral+Nerve+Cord+for+Giant+Fiber+Dye+Injection.">Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection.</a> J. Vis. Exp. (52), e3080 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

כשמדמיינים את התאים עם חלבוני ניאון כמו GFP, חשוב לא מעל לחשוף את ההכנה ליותר מדי אור. זה עלול לגרום לניזק תמונה. אנו משתמשים בנורות 100W HBO קצרות קשת כספית לתאורה, ואנחנו משתמשים גם בצפיפות ניטראלית (ND) של 0.8 (מסנני ND Chroma 0.3 ו -0.5). כדי להיות מסוגל לשפוט על איכות הראות הטובה הניקוי הוא קריטי. לכן, מסנני ND ניתן להסיר לתקופות קצרות של כ 20 שניות למספר רבות של פעמים. כשהחלים קצת לחץ חיובי, גוף התא &quot;דשים&quot; קטן. זה עוזר לשפוט את האיכות של ניקיון. בניגוד חוט עצב הגחון הוא נמוך מאוד, ותנועה יכולה להיות מאוד מועילה כדי להמחיש תאים. בעל האלקטרודה המשמש להליך הניקוי (וגם לתיקון clamping) צריך להיות סגור היטב; יישום לחץ נשלט אחרת לא יהיה אפשרי. Loosing לחץ יפריע הסרה מוצלחת של רקמות וdebris וימנע היווצרות גיגה חותם במקרה בהקלטות של מהדק תיקון אתרו יבוצע לאחר ניקוי התא, להיות מודע לכך שיש לא רק נדן מקיף את עצב הגחון בכללותו (שצריך להיות מוסר לכל הקלטת מהדק תיקון של כל נוירון מרכזי של זבובים בוגרים ), אך תאים עצמם עשויים להיות מוקפים בנדן גם כן. MN5, למשל, מוקף בנדן בלתי תאי שניתן לראות רק בתאורה בעצמה גבוהה קצרה. בנוסף, תאים עשויים להיות ממוקמים מתחת לקנה הנשימה. במקרה התא לא ניתן לגשת, בקנה הנשימה צריך להיות משך הצידה אם לא תלש עם פיפטה במהלך הליך הניקוי (לאחר שהסיט הצידה). כל הליך הניקוי צריך להיעשות ללא משייכת הרקמה יותר מדי. הליך זה דורש הכשרה. הניקוי הטוב יותר, הגבוה יותר יהיה התדירות של גיגה-חותמות מיידיות (בתוך 1 שלו לאחר שנגע התא וrelהקלת לחץ חיובי). בהתאם לפרוטוקול הניקוי ופריצת התרחישים הבאים אפשריים: ראשית, אם התאים לא ניקו מספיק טוב, גיגה חותם אינו אפשרי והניסוי חייב להיפסק. שנית, במקרים מסוימים ניקוי הוא מספיק טוב להיווצרות גיגה חותם אבל שריד דק, כמעט בלתי נראה לעין של הנדן נותר סביב סומה. זה יגרום לקרע בקרום ולגרום לזרמי דליפה של אמפליטודות שונות. תוצאה חמורה פחות מניקוי תא המספיק היא שחלק משרידי סיבת הנדן מגדיל בהתנגדות גישה. בהתאם לקריטריוני האיכות השונים הניסיוניים העיצוב לתיקון עשוי לחול. לניטור דפוסי פעולה פוטנציאליים במהדק נוכחי פוטנציאל הממברנה של התא חייב להיות בריא (-55 mV או יותר hyperpolarized במקרה של MN5), אבל התנגדות גישה היא לא נושא חשוב. עם זאת, כאשר לעורר פוטנציאל פעולה מחדש על ידי הזרקת גישה הנוכחיתsistance הופך לנושא. למעורר זרמי אשלגן משרעת גדולים שמקורם בסמוך לאתר הקלטת הדליפה צריכה להיות קטנה (במקרה של התנגדות הכניסה MN5 חייבת ידי יותר מ 80 MΩ) והתנגדות גישה לא צריכה להיות גדולה יותר מ 15 MΩ. לתפס המקום שיש צורך בהקלטות מהדק מתח של זרמי סיד הדנדריטים משרעת קטנים שמקורם בלמדי מרחק מה מן הסומא אין דליפה יכולה להיות הציגה (להתנגדות כניסת MN5 חייבת להיות מעל 120 MΩ) והתנגדות גישה לא יכולה להיות גבוהה יותר מ 12 MΩ. ברוב ההקלטות אנחנו מודדים זרמי סיד עם התנגדויות גישה בין 8 ל 10 MΩ (כפי שקרא מהחיוג במגבר 200B axopatch לאחר התנגדות סדרה ופיצוי קיבול תא כולו). לכל סוג תא שיירשם, קריטריוני איכות כאלה צריכים להיקבע באופן אינדיבידואלי. באמצעות הליך הניקוי המתואר כאן, אנו יכולים להחזיק את ההקלטות היציבות לapproximately 90 דקות. אנחנו לא צופים ניכרים מוזנחים (נבדקנו במיוחד עבור Cav2 וCav3 זרמי סיד ולאכר, רדוד, וזרמי אשלגן rectifier מתעכבים). עם זאת, יש לנו לא ניסיתי להחזיק את התיקון ארוך יותר ולכן לא ניתן לקבוע האם הקלטות ארוכות יותר תהיינה אפשריות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סוכן / פריט </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> פרוטאז הסוג XIV </td><td> סיגמה אולדריץ ארה&quot;ב </td><td> P5147 </td></tr><tr><td> מחט זריקה גמישה Microfil </td><td> עולם מכשירי דיוק ארה&quot;ב </td><td> MF28G-5 </td></tr><tr><td> ורוסיליקט זכוכית נימים, 1.5 מ&quot;מ OD, איד 1.0 מ&quot;מ, ללא נימה </td><td> עולם מכשירי דיוק ארה&quot;ב </td><td> PG52151-4 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen ארה&quot;ב </td><td> D3899 </td></tr><tr><td> Sylgard אלסטומר קיט 184 (Dow Corning) </td><td> <a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank">www.ellsworth.com</a> </td><td> 184 SIL Elast KIT </td></tr><tr><td> מסנן ND סט (unmounted) </td><td> Chroma </td><td> סדרת 22000b </td></tr><tr><td> בעל אלקטרודה 1-HL-U </td><td> מוהתקני lecular </td><td> 1-HL-U </td></tr></tbody></table>

preparation of drosophila central neurons for in situ patch clamping

זמני דור קצרים וטכניקות גנטיות שטחיות להפוך זבוב דרוזופילה melanogaster מודל גנטי מצוין במחקר מדעי המוח יסודי. תעלות יונים הן בסיס לכל ההתנהגות שכן הם לתווך רגישות עצבית. הערוץ הראשון המתח מגודר היון המשובט היה ערוץ תסיסנית המתח המגודר אשלגן אכר 1,2. לקראת הבנת תפקידו של תעלות יונים ורגישות הממברנה לתפקוד מערכת עצבים כדאי לשלב כלים גנטיים רבים עצמה זמינות בדרוזופילה בהקלטות עם מהדק תיקון באתרו. במשך שנים רבות הקלטות כאלה כבר הקשו על ידי הגודל הקטן של מערכת העצבים המרכזיים תסיסנית. יתר על כן, נדן חזק עשוי גליה וקולגן היווה מכשולים לגישת פיפטה תיקון לנוירונים מרכזיים. הסרת מעטה זו היא תנאי הכרחי להקלטות מהדקות תיקון מכל תא עצב במערכת עצבים מרכזיים תסיסנית הבוגרת. בשנים האחרונותמדענים הצליחו לבצע בהקלטות מהדקות תיקון באתרו מתא העצב במוח הבוגר 3,4 וחוט עצב גחון של עוברי 5,6, זחל 7,8,9,10, ומבוגר תסיסנית 11,12,13,14. יציב גיגה חותם הוא התנאי העיקרי לתיקון טוב ותלוי במגע נקי של פיפטה התיקון עם קרום התא, כדי למנוע דליפת זרמים. לכן, לכל תא בהקלטות מהדקות תיקון באתרו מתאי עצב בוגרים תסיסנית יש לנקות ביסודיות. בשלב הראשון, את נדן ganglionic יש להתייחס enzymatically ומכאני הוסר כדי להפוך את תאי היעד נגישים. בשלב השני, קרום התא חייב להיות מלוטש כך שאין שכבה של גליה, קולגן או חומר אחר עלולה להפריע היווצרות גיגה חותם. מאמר זה מתאר כיצד להכין נוירון המרכזי זיהה את כבל תסיסנית גחון העצב, טיסת 5 motoneuron (MN5 15), לסומטי השלם גהקלטות מהדקות תיקון טו. זיהוי ונראות של נוירון מושג על ידי ביטוי ממוקד של ה-GFP בMN5. אנחנו לא שואפים להסביר את טכניקת מהדק התיקון עצמו.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping at JoVE.com

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

בתיקון אתר הקלטות מהדקות משמשות לאפיון אלקטרו של הנוירונים במעגלים ללא פגע. בדרוזופילה הגנטית מודל התיקון Clamping קשה בגלל מערכת העצבים המרכזיים היא קטנה ומוקף בנדן איתן. מאמר זה מתאר את ההליך כדי להסיר את הנדן ונקי נוירונים להקלטות מהדקות תיקון לאחר מכן.

הכנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; נוירונים מרכזיים עבור<em&gt; באתר</em&gt; התיקון clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

preparation-of-drosophila-central-neurons-for-in-situ-patch-clamping

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

14.0K Views.  Arizona State University. בתיקון אתר הקלטות מהדקות משמשות לאפיון אלקטרו של הנוירונים במעגלים ללא פגע. בדרוזופילה הגנטית מודל התיקון Clamping קשה בגלל מערכת העצבים המרכזיים היא קטנה ומוקף בנדן איתן. מאמר זה מתאר את ההליך כדי להסיר את הנדן ונקי נוירונים להקלטות מהדקות תיקון לאחר מכן...

Video: Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב<em&gt; דרוזופילה</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...