<p class="jove_content"&gt; אנו מודים DD אנג לדיון תובנה בנדיבות מתן חומרים כימיים. MJ נתמך על ידי NIH לב וכלי דם הדרכה גרנט, טכנולוגיה יוזמת אריזונה קרן מחקר, פרסים עבור הישגים מדענים קולג&#39;. עבודה זו נתמכת על ידי פרס ממציא ניו המנהל של NIH (1DP2OD007161-01), הקרן הלאומית למדע (0,855,890), ואת ג&#39;יימס ס &#39;מקדונל קרן.</p

1. יצירת תבניות בשימוש דפוסים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב קונספטואלי של דפוסי. דפוסי נוצרות המשמשים ליצירת רשתות התא, תא קשר שליטה, לבודד תאים, לחקות מבנים טבעי, או בכל דרך אחרת מדריך הידבקות התא והשמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מחשב או יצירת עיצוב CAD המבוססת על דפוס ויצירת photomask. התבנית הרצויה מעוצב תוכנות CAD, כגון AutoCAD, ו לאחר מכן נשלחת חברה חיצונית לייצור photomask. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Photolithography לייצר דפוס מאסטר. שקופיות הזכוכית הם בדוגמת עם או חיובי דק להתנגד או שלילי עבה להתנגד תלוי בגודל המבנה נוצר. שקופיות הזכוכית משמשים היתרונות שלהם להיות בעלות נמוכה, חזקה יותר פרוסות סיליקון לייצור אבק ולא פחות כאשר שבור. לחלופין, מבנים נוח אחרים כגון gratings עקיפה יכול לשמש תבנית האב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקופית בדוגמת מחובר ערימה של שקופיות אשר לא היו בדוגמת. כל הצעדים נעשים בתוך ברדס תזרים נקי כדי למזער את האבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת תבניות מאסטר. מיכל של נייר כסף מעט גדול יותר ערימה של שקופיות נוצר להחזיק 30 גרם של polydimethylsiloxane (PDMS) הנשפך אז על פני השטח בדוגמת photolithographically ליצור עובש הראשונית. PDMS היא degassed ואיפשר לרפא עבור 1-2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נרפא לאחר PDMS הוא קילף של דפוס מאסטר ויוצר עובש לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 גרם של אפוקסי חלק 2 (devcon # 14310 (6 גרם) מעורבב דקה 1 ולאחר מכן שפכו לתוך תבנית האב, degassed ואיפשר לרפא. Degassing אפוקסי חייב להיעשות מהר (&lt;8 דקות) באמצעות בועות רבות שבירת מחזורי ושימוש רק שכבה דקה לפני שהוא קובע אפוקסי הסרת בועה בלתי אפשרי להוציא את בועות. ז 6 השתמשו מייצרת שכבה דקה המאפשרת הסרה מהירה בועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שעה, אפוקסי 2 חלק יירפאו באופן חלקי אפוקסי יותר ניתן להוסיף על גבי ללא degassing לייצר מבנה עבה אשר easer לטפל בצעדים מאוחר יותר. אפוקסי מותר אז תרופה 1-2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נרפא פעם, אפוקסי נמחקת עובש האב PDMS קלטת כרוך סביב העובש אפוקסי להקים מיכל. עובש עובד אז נוצר על ידי שפיכת PDMS על התבנית אפוקסי, degassing PDMS, וריפוי במשך 1-2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נרפא פעם, עובש העבודה הוא קילף של אפוקסי ומאוחסנים לשמור על הניקיון. </li></ol> 2. דפוסים של משטחים עם תבניות להדרכה תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקים קטנים של עובש העבודה נחתכות החוצה והניח על צלחת פטרי קלקר. המיקומים של סעיפים אלה עובש מסומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חצובה נוצר מתוך בסעיפים קטנים משוקלל כדי להבטיח קשר בין עובש קונפורמי העבודה ואת משטח צלחת פטרי. מיקום טוב ניתן לראות על ידי התבוננות בחלק התחתון של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה ממוקם לתא פלזמה. טיפול פלזמה היא יזמה והמשיך בבית אבא 150 ב 29.6 W (מקסימום כוח) במשך 10 דקות באמצעות אוויר פלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הטיפול פלזמה, עובש לבין הגשת כתב האישום משקל יוסרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת פטרי היא תחת אור UV למשך 10 דקות של עיקור בתוך ארון biosafety ומאוחסנים שם עד seeded עם תאים. </li></ol> 3. מתזמן משטחים עם תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים SH-SY5Y CRL-2266 Neuroblastoma אדם או אחרים תרבותי באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים עבור סוג תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפגש של SH-SY5Y CRL-2266 תאים Neuroblastoma האדם נמדד חזותית לפני זריעה על פני השטח בדוגמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תא רגיל מתבצעת כדי להסיר את התאים מפני השטח של צלחת פטרי שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים, צף ללא תשלום פעם אחת, הם זורעים על פני השטח של צלחת פטרי בדוגמת לאחר דילול כדי להשיג את המפגש הרצוי כאשר הוא ממוקם על פני השטח בדוגמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מותר להתיישב ולצרף אל פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת פטרי היא בדוגמת מודגרות למשך מספר שעות עד מספר ימים תוך התאים להרכיב על גבי התבנית נוצרה על ידי הפלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר נוירובלסטומה culturing התאים, החומצה הרטינואית (10 מיקרומטר) מתווסף מדי יום על מנת לגרום לתאים להתמיין המדינה נוירון דמוי. תוספת של חומצה רטינואית נעשית בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החומצה הרטינואית מתווסף מדי יום במשך כמה ימים, שלאחריו הבידול יהיה הנצפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיה מוחלף מדי 3-4 ימים. </li></ol> 4. תצפית וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות תקופתיים של תאים חיים או קטעי וידאו נלקחים על מנת לבחון את התנהגות התא לאורך זמן. לקבלת תמונות לחיות, התאים ממוקמים שלב מיקרוסקופ חממה העליון אשר שומר את התאים ב 37 ° C, לחות 100%, 5% CO 2. תאים יכולים גם להיות קבועים מוכתם להסתכלות תחת פלואורסצנטי </li><li&gt; תמונות או קטעי וידאו של תאים נתפסו מיובאים למערכת ניתוח התמונה מדידות מתבצעות כולל שיעור הצמיחה, גודל התא, מהירות הגירה, בידול, יישור, מיקום של חלבונים מסוימים, ואחרים. </li></ol> 5. נציג תוצאות: תוצאה אופיינית של יישום טכניקה ליתוגרפיה פלזמה היא היווצרות דפוס של תאים הדומה קצת מבנה שרירותי או טבעי. הדבר בא לידי ביטוי איור 1a-b שם שורות רשתות של נוירונים נוצרו. סוגי תאים אחרים יכולים לשמש היטב כפי שניתן לראות באיור 1c-d, המציג אדם וריד הטבור לתאי אנדותל (HUVEC) ו C2C12 לתאי שריר השלד ויוצרים רשתות. חומרים כגון פולי-L-ליזין יכול להיות גם בדוגמת, איור 1e כדי להקל על ההתקשרות של סוגי תאים מסוימים לשימושים אחרים. במקרה של הנוירונים הראו, מה נוצר הן רשתות של תאים שבהם יש קשרים ביניהם. זה משכפל מה מתרחש באופן טבעי במוח שבו נוירונים יש קשרים דיסקרטית בין תאים שכנים, אשר משפיע על פעולת המוח. עם הקמת מבנה כזה במעבדה, מספר, מיקום, תדירות וגורמים אחרים של קשרים ניתן לשלוט באופן שיטתי. התוצאה של הקראות אלו ניתן למדוד חזותית תשומות נוספות כגון כימיים או גירוי חשמלי יכול להיות מיושם כדי לחקור את התנהגות הרשת. תוצאה שלילית יהיה דפוס מגודל או חלקי או מדגם מזוהמים. דפוס שלם או מגודל היה תוצאה של זריעת את המצע עם תאים או מעט מדי או יותר מדי שלא תספק את התבנית עם כמות אידיאלי של תאים. בנוסף, אם הדפוס לא נועד נכונה (למשל, קווים צרים מדי) התאים לא יוכלו לצרף ולגדול בהצלחה על זה. במקרה של מדגם מזוהמים, ניקיון נאותה לא היה נשמר במהלך אחד השלבים אם כי זה נדיר כאשר הבאים לתא הנכון תרבות פרוטוקול בשל העובדה כי דפוסים פלזמה גם sterilizes את המצע. <img src="/files/ftp_upload/3115/3115fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. דפוסים של תאים וחלבונים.

<ol>
	<li>Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-Guided+Self-Assembly+of+Colloidal+Quantum+Dots+Using+Plasma+Lithography.">Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography.</a> Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).</li><li>Junkin, M., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cell+migration+in+confined+environments+by+plasma+lithography.">Probing cell migration in confined environments by plasma lithography.</a> Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).</li><li>Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaporation-induced+assembly+of+biomimetic+polypeptides.">Evaporation-induced assembly of biomimetic polypeptides.</a> Appl Phys Lett. 93, 023120-023 (2008).</li><li>Langowski, B. A., Uhrich, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+Plasma-Initiated+Patterning+(&#956;PIP).">Microscale Plasma-Initiated Patterning (&#956;PIP).</a> Langmuir. 21, 10509-10514 (2005).</li><li>Tourovskaia, A., Barber, T., Wickes, B. T., Hirdes, D., Grin, B., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterns+of+Chemisorbed+Cell+Adhesion-Repellent+Films+Using+Oxygen+Plasma+Etching+and+Elastomeric+Masks.">Micropatterns of Chemisorbed Cell Adhesion-Repellent Films Using Oxygen Plasma Etching and Elastomeric Masks.</a> Langmuir. 19, 4754-4764 (2003).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death.">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li><li>Johansson, B. -. L., Larsson, A., Ocklind, A., Ohrlund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Air+Plasma-Treated+Polymer+Surfaces+by+ESCA+and+Contact+Angle+Measurements+for+Optimization+of+Surface+Stability+and+Cell+Growth.">Characterization of Air Plasma-Treated Polymer Surfaces by ESCA and Contact Angle Measurements for Optimization of Surface Stability and Cell Growth.</a> Journal of Applied Polymer Science. 86, 26185-26185 (2002).</li><li>Murakami, T., Kuroda, S. -. i., Osawa, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Polymeric+Solid+Surfaces+Treated+with+Oxygen+Plasma:+Effect+of+Aging+Media+after+Plasma+Treatment.">Dynamics of Polymeric Solid Surfaces Treated with Oxygen Plasma: Effect of Aging Media after Plasma Treatment.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 202, 37-44 (1998).</li><li>Strobel, M., Lyons, C. S., Mittal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plasma surface modification of polymers: Relevance to adhesion. , (1994).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 37, 550-575 (1998).</li><li>Song, M., Uhrich, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+Micropattern+Dimensions+Enhance+Neurite+Outgrowth+Rates,+Lengths,+and+Orientations.">Optimal Micropattern Dimensions Enhance Neurite Outgrowth Rates, Lengths, and Orientations.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 1812-1820 (2007).</li><li>Zhao, F., Wu, T., Lau, A., Jiang, T., Huang, Z., Wang, X. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+promotes+neuronal+cell+differentiation.">Nrf2 promotes neuronal cell differentiation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47, 867-879 (2009).</li><li>Ohl, A., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-induced+chemical+micropatterning+for+cell+culturing+applications:+a+brief+review.">Plasma-induced chemical micropatterning for cell culturing applications: a brief review.</a> Surface and Coatings Technology. 116-119, 820-830 (1999).</li><li>van Kooten, T. G., Spijker, H. T., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-treated+polystyrene+surfaces:+model+surfaces+for+studying+cell-biomaterial+interactions.">Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions.</a> Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).</li><li>Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Sch&#246;n, P., Figdor, C. G., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+at+which+substrate+nanogroove+dimensions+may+influence+fibroblast+alignment+and+adhesion.">The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion.</a> Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

החקירה תא השיטה המוצגת כאן מאפשרת יצירת תבניות מורכבות של רשתות תאיים אשר לחקות מבנים ביולוגיים כמו גם מספק שיטה לייצר גירויים שאינם subcellular בטבע אשר לאחר מכן מאפשר חקירה של התנהגות שני תאים מקובצים ותגובות תא יחיד לגורמים סביבתיים. השימוש בשיטה זו הוא פשוט עדיין חזקים כפי שהוא יכול להתבצע במהירות במעבדה כמו התרבות תאים עם ציוד בעלות נמוכה. הוא גם מאוד רגיש התא, מאפשר התבוננות קלה של התנהגות כתוצאה והוא מטבעו יציב למשך תקופות זמן ארוכות, המאפשרת חקירה של התנהגות התא ארוך טווח. בנוסף הוא מאפשר מגוון רחב של ניסויים להתבצע כפי שהוא תואם סוגי תאים רבים יכולים ליצור דפוסי שרירותי. יציבות לטווח ארוך של הטכניקה נובעת מהעובדה functionalization משטח הנחילה ידי הפלזמה הוא חלק השטח אינו ציפוי או שכבת אחרים אשר ניתן להסירו או מושפל. אם כל הזמן תחת נוזל, זה סוג של שינוי יכולים לשמור על היכולת תא המנחה שלה במשך חודשים. החלק הקריטי ביותר של הניסוי הדרושים כדי להבטיח תוצאות משמעותיות היא יצירת דפוס מאסטר אשר תביא בסופו של דבר לשמש הדרכה התא. אם דפוס זה אינו מתוכנן כראוי, התאים לא מגיבים כראוי לדפוס ולא יכול לייצר התנהגות שימושי. פרמטרים כגון רוחב קו, ריווח דפוס, ואחרים יכול מאוד להשפיע על תאימות תא עם דפוס מסוים, בדרך כלל מגוון רחב של פרמטרים כגון ניתן ליצור photomask הראשונית למסך על העיצוב המתאים ביותר. פרמטרים חשובים אחרים הקשורים בביצוע דפוסים כוללים יצירת עובש, שמירה על הסביבה אבק חינם, זריעת תאים עקרות הכללי של תרבית תאים. יצירת עובש עשוי להתבצע על ידי העברת צעדים שונים אשר נעשים על מנת לאפשר חזרה PDMS את הליהוק עובש אפוקסי. עובש אפוקסי נוצר כי זה לא יהיה לבזות באותו אופן כמו להתנגד עובש עם קטן, יחס גבוה מבנים ההיבט תחת הליהוק חוזרות ונשנות. אם דפוס ההעברה נעשית בצורה נכונה, הממדים ואת התשואה לא יושפעו אבל אם נעשה בצורה לא נכונה על ידי ריפוי, degassing גרוע שלם, או חימום יתר כגון, בועות, חיספוס דפורמציה של דפוס יכול להתרחש אשר משפיע על התוצאה הסופית. ביחס לשמירה על סביבת אבק חינם, תבניות חייב להישמר נקי ככל האפשר אבק כל יכול להפריע הקשר הנכון בין עובש העבודה PDMS לבין השטח הנכון ובכך פלזמה מיגון דפוסים כימיים. צפיפות זריעה של התאים גם חייב להיות מותאם על מנת להבטיח כי לא התאים מעט מדי או יותר מדי מאכלסים את השטח דפוס ועקרות חייבת להישמר כדי למנוע זיהום חיידקי אחרים של תאים בשימוש. הטכניקה יכולה גם להיות משולב עם יסודות אחרים כגון מיקרופלואידיקה, microelectrodes, ואת בדיקות מכניות. זה מספק גירויים נוספים על התאים כדי לשכפל טוב יותר בתנאים פיסיולוגיים שונים במהלך ניסויים ולעבוד בעתיד הוא התמקד בחקר ההשפעות של שילובים אלה

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> פלזמה נקי לשכת אבק </td><td> Harrick פלזמה </td><td> PDC-001 </td><td></td></tr><tr><td> הקרינה הפוך והניגודיות מיקרוסקופ שלב </td><td> ניקון </td><td> TE2000-U </td><td></td></tr><tr><td> בשלב מיקרוסקופ העליון חממה </td><td> AmScope </td><td> דגם TCS-100 </td><td> השתנה לכלול מתחם המספק אווירה מתאימה </td></tr><tr><td> צלחת פטרי פוליסטירן </td><td> VWR </td><td> 25384-090 </td><td></td></tr><tr><td> Polydimethylsiloxane (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> אפוקסי </td><td> Devcon </td><td> 2 טון אפוקסי ברור # 14310 </td><td></td></tr><tr><td> תרבית תאים התקשורת </td><td> שונים </td><td></td><td> מדיה כדלקמן ניסוחים תקן סוג התא </td></tr><tr><td> Retinoic חומצה </td><td> סיגמא </td><td> R2625 </td><td></td></tr></tbody></table>

plasma lithography surface patterning for creation of cell networks

מניפולציה שיטתית של microenvironment תא עם רזולוציה מיקרו ו ננו נדרש לעתים קרובות לפענוח תופעות תאית ומולקולרית שונים. כדי לענות על דרישה זו, פיתחנו ליתוגרפיה פלזמה טכניקה כדי לתפעל את microenvironment הסלולר על ידי יצירת משטח עם הדפס גדלים תכונה החל מ 100 ננומטר ל מילימטרים. מטרת טכניקה זו היא להיות מסוגלים ללמוד, בצורה מבוקרת, התנהגויות של תאים בודדים, כמו גם קבוצות של תאים ואת האינטראקציות ביניהם. שיטה זו ליתוגרפיה פלזמה מבוסס על שינוי סלקטיבית של כימיה את פני השטח על מצע באמצעות מיגון הקשר של פלסמה בטמפרטורה נמוכה עם עובש פיזי. זה מיגון סלקטיבי עלים דפוס כימיים אשר יכול להנחות מצורף תא ותנועה. דפוס זה, או תבנית פני השטח, לאחר מכן ניתן להשתמש כדי ליצור רשתות של תאים, אשר יכולים לחקות את המבנה בטבע ומייצרת סביבה לשליטה לחקירות ניסיוני. הטכניקה היא גם מתאים ללימוד תופעה ביולוגית כפי שהוא מייצר דפוסי משטח יציב על מצעים פולימריים שקוף בצורה ביולוגית. דפוסי משטח להימשך שבועות עד חודשים ולכן יכול להנחות אינטראקציה עם תאים לפרקי זמן המאפשר לימוד של תהליכים ארוכי טווח הסלולר, כגון בידול adaption. שינוי על פני השטח הוא כימיים בעיקר בטבע, ולכן לא מציגים הפרעה טופוגרפית או פיזית על הפרשנות של התוצאות. הוא גם אינו דורש שימוש בחומרים קשים או רעילים להשיג דפוסים והוא תואם עבור בתרבית רקמה. יתר על כן, ניתן ליישם לשנות סוגים שונים של מצעים פולימריים, אשר בשל היכולת לכוון את הנכסים שלהם הם אידיאליים עבור נמצאים בשימוש נרחב ביישומים ביולוגיים. ההחלטה השגה הוא גם מועיל, כמו בידוד של תהליכים ספציפיים, כגון הגירה, הדבקה, קשירה או מאפשרת, תצפיות נפרדות ברור לכל אחד לרמה multicell. שיטה זו כבר מועסק כדי ליצור רשתות רחב של סוגי תאים שונים לחקירות מעורבים הגירה, איתות, היווצרות רקמה, ואת התנהגות ואינטראקציות של נוירונים לדין ברשת.

Watch this Scientific Journal Video about Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks at JoVE.com

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

טכניקה צדדי ליתוגרפיה פלזמה פותחה כדי ליצור דפוסים משטח יציב להדרכת מצורף הסלולר. טכניקה זו יכולה להיות מיושם כדי ליצור רשתות התא כולל אלה המחקות רקמות טבעיות שימש לחקר מספר סוגי תאים שונים.

Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

plasma-lithography-surface-patterning-for-creation-of-cell-networks

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.6K Views.  University of Arizona. טכניקה צדדי ליתוגרפיה פלזמה פותחה כדי ליצור דפוסים משטח יציב להדרכת מצורף הסלולר. טכניקה זו יכולה להיות מיושם כדי ליצור רשתות התא כולל אלה המחקות רקמות טבעיות שימש לחקר מספר סוגי תאים שונים.

Video: Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

תא דפוסים על photolithographically מוגדר Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; מצעים

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

באמצעות דפוסים דבקים כדי לבנות התקני 3D נייר Microfluidic

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

דפוסי Subtractive מהירים של שכבות תא חיות עם בדיקת Microfluidic

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass substrate, that precisely controls the generation of tandem bubbles and individual cells patterned nearby with well-defined locations and shapes. We then demonstrate the generation of tandem bubbles by using two pulsed lasers illuminating a pair of gold dots with a few-microsecond time delay. We visualize the bubble-bubble interaction and jet formation by high-speed imaging and characterize the resultant flow field using particle image velocimetry (PIV). Finally, we present some applications of this technique for single cell analysis, including cell membrane poration with macromolecule uptake, localized membrane deformation determined by the displacements of attached integrin-binding beads, and intracellular calcium response from ratiometric imaging. Our results show that a fast and directional jetting flow is produced by the tandem bubble interaction, which can impose a highly localized shear stress on the surface of a cell grown in close proximity. Furthermore, different bioeffects can be induced by altering the strength of the jetting flow by adjusting the standoff distance from the cell to the tandem bubbles.

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

מערכת Microfluidic עם דפוסי Surface לחקירת בועת Cavitation (ים) אינטראקציה דו תא ואת Bioeffects הנובע מהן ברמת התא הבודד

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

שיטה צדדית של חלבוני דפוסי תאים

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...