מימון מBBSRC הוא הודה בחביבות (מספר מענק BB H011293 / 1).

סקירה סעיף 1 מתאר את ההכנה של nanosensors התגובה pH ואפיון של תגובת nanosensor ל-pH באמצעות ספקטרומטריית הקרינה ואת גודלם באמצעות SEM. סעיף 2 מתאר את הכנת פיגומי פולימר electrospun והאפיון של המורפולוגיה שלהם ואת הגודל באמצעות SEM. סעיף 2 גם מתאר את ההכנה של פיגומי דיווח עצמיים שהם פיגומי electrospun עם הצטרפותם של החיישנים זעירים מגיבים ה-pH. פיגומי דיווח עצמי וכתוצאה מכך הם מתאפיינים בSEM להעריך האם כל שינויים מורפולוגיים בסיבי electrospun התרחשו. הקרינה מפיגומי דיווח העצמי הנובעים מהחיישנים הזעירים המשולבים מוערכת על ידי מיקרוסקופיה confocal. סעיף 3 מתאר את התרבות של תאים על פיגום electrospun ופיגום דיווח העצמי. הפיגומים הם מעוקרים ראשון בpreparatיון לבא תרבית תאים שהפיגומים נבחנים כדי לקבוע אם עיקור והתרבות של תאים משפיעים על יכולת הקרינה של פיגומי דיווח העצמי. הפרוטוקול מתאר גם את המסירה של חיישנים זעירים לתאים שהם מתורבתים על פיגומי electrospun. צבע Lysotracker משמש כדי להבטיח שחיישנים זעירים לא נלקחו לתאים חומצי סלולריים. 1. הכנה וניתוח של Nanosensors סול תגובה pH 1.1 הכנת Nanosensors סול תגובה pH הערה: הכנה זו צריכה להתבצע במנדף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את fluorophores לשימוש בתוך nanosensors pH על ידי המסת 5 - (ו- 6)-carboxyfluorescein, succinimidyl אסתר (FAM-SE) (1.5 מ&quot;ג) בdimethylformamide (DMF) (1 מיליליטר) בסיבוב תחתית בקבוק ו6 carboxytetramethylrhodamine , Succinimidyl אסתר (טמרה-SE) (1.5 מ&quot;ג) בDMF (1 מיליליטר) בסיבוב נוסף לתחתית בקבוק.הוסף 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) (1.5 מ&quot;ל) לכל בקבוק ומערבבים תחת אווירה יבשה חנקן (21 מעלות צלזיוס) במשך 24 שעות בחושך כלומר לעטוף את הדגימות בנייר כסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת שני הצבעים לעיל (250 μl) לתערובת של אתנול (6 מיליליטר) ואמוניום הידרוקסיד (30% WT, 4 מיליליטר) הנכלל בבקבוק עגול תחתית ומערבבים במשך שעה 1 (21 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף tetraethylorthosilicate (TEOS) (0.5 מיליליטר) לתערובת, להמשיך לערבב כ 2 שעות נוספות. התערובת תהפוך מעוננת. ניתן לאסוף nanosensors על ידי אידוי סיבובי. ניתן לאחסן nanosensors בבקבוקון זכוכית בC o 4 לשימוש עתידי. זהירות: טיפול נוסף של חיישנים זעירים בצורה היבשה שלהם צריך להתבצע במנדף או במקרה של שקילתם את האיזון צריך להיות סגור, למשל בWeighsafe. </li></ol> 1.2 Nanosensor תגובה ל-pH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות חיץ פוספט של סורנסן החל 5.5-8.0 pH ידי Mixiיחסים ספציפיים ננוגרם של monobasic נתרן פוספט (0.2 M) וdibasic פוספט נתרן פתרונות מניות (0.2 M). בדוק את ה-pH הסופי באמצעות מד ה-pH. בצע את כל התאמות קלות לחומציות באמצעות סודיום הידרוקסיד (NaOH) (4 מ &#39;) או חומצה הידרוכלורית (HCl) (2 מ&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את nanosensors pH במאגרי ה-pH (5 מ&quot;ג / מיליליטר) בראשית מחזיק את הכלי המכיל את פתרון nanosensor במערבולת במשך 3 דקות לאחר מכן הצללה הכלי בultrasonicator עד הפתרון הופך עכור (כ -5 דקות). חזור על שלבים אלה כדי להשעות באופן מלא את החיישנים הזעירים בתמיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפתרון הראשון לקובט אופטי ולהשתמש באורכי גל עירור של 488 ננומטר במשך 5 - (ו- 6)-carboxyfluorescein (FAM) ו568 ננומטר במשך 6 carboxytetramethylrhodamine (טמרה). לאסוף את אורכי גל הפליטה ב500-530 ננומטר לFAM ו558-580 ננומטר לטמרה באמצעות ספקטרומטר הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את הפתרונות בקובט האופטי, כך שרמת החומציות יכולה להיות שנצפתה ב-pH שונה ולהמשיך גollecting ספקטרום הפליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את היחס של מקסימום פליטה המיוצר בכל אחד מערכי ה-pH כדי לייצר עקומת כיול. </li></ol> 1.3 SEM של Nanosensors <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מדגם של החיישנים הזעירים על בדל מיקרוסקופ אלקטרונים פחמן מצופה וגמגום מעיל עם זהב למשך 5 דקות תחת אווירת ארגון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM). במהלך ההדמיה להתאים את מרחק עבודה, מתח וגדלה כדי למזער את טעינת אלקטרונים (איור 1). </li></ol> 2. הכנה וניתוח של PLGA פיגומים 2.1 Electrospinning PLGA פיגומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף לפזר פולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA) בdichloromethane (DCM) (20% (w / w)) עם formate pyridinium (PF) (1% (w / w)). מניחים את הפתרון לתוך מזרק 10 מיליליטר עם מחט 18 G בוטה מילוי ובאופן מאובטח לנכון משאבת מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיק את קצה מחט 20 ס&quot;מ מ20סנטימטר x 15 צלחת איסוף אלומיניום סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את האלקטרודה של אספקת חשמל במתח גבוה ועד לקצה של המזרק ואת הארץ לצלחת איסוף אלומיניום. יש להקפיד שמתח גבוה נמצא בשימוש כלומר תמיד להפוך את אספקת החשמל כבוי לפני טיפול בכל ציוד electrospinning: זהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק את הפתרון באמצעות קצב זרימה מתמיד של 3.5 מ &#39;/ שעה ב12 קילו וולט עבור 2 שעות. Electrospinning באמצעות תנאים אלה ייתן עומק פיגום של כ 60 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הפיגום במנדף ל24 שעות כדי לאפשר לשאריות ממיסים להתאדות. </li></ol> 2.2 pH Electrospinning PLGA פיגומים Responsive <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפיגומים המשלבים חיישנים זעירים מגיבים pH כאמור בסעיף 2.1 אבל עם השינוי של הוספת חיישנים זעירות לפתרון הפולימר (5 מ&quot;ג / מיליליטר). להשעות את החיישנים הזעירים בפתרון PLGA בסיוע ultrasonication (כ -5 דקות) לפני<html> להצבה לתוך מזרק 10 מ&quot;ל. </li></ol> 2.3 SEM של PLGA פיגום ופיגום תגובה pH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מדגם של פיגום PLGA או הפיגום מגיב pH על בדל מיקרוסקופ פחמן מצופה אלקטרונים והמשך כמתואר עבור SEM של חיישנים זעירים (איור 1). </li></ol> 2.4 כיול של פיגום תגובה pH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מדגם של פיגום מגיב pH לתוך צלחת תרבות 35 מ&quot;מ ולטבול בפתרונות מאגר מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מיקרוסקופ confocal להשתמש בליזר ארגון 488 ננומטר כדי להלהיב את FAM וליזר קריפטון 568 ננומטר כדי להלהיב את טמרה בחיישנים הזעירים. שים לב לפליטת הקרינה לפיגומים מגיבים pH ב500-530 ננומטר לFAM ו558-580 ננומטר לטמרה. (איור 2). השתמש בסריקה רציפה כדי למנוע אוסף של אורכי גל עירור. </li></ol> 3. תא תרבות על PLGA פיגומים וpH PLGA פיגומים Responsive ntent &quot;&gt; הערה: הבאים צריכה להתבצע בקבינט תרבית תאים. 3.1 הכנת PLGA פיגומים לתרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את פיגומי PLGA מגיבים PLGA או pH ל2 סנטימטר 2 חתיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר פיגומים על ידי הקרנה באור אולטרה סגול (UV) במרחק של 8 סנטימטר ל15 דקות מכל צד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הפיגומים לצלחת תרבות 12 היטב ומניח את טבעת פלדה על גבי. הוספת פתרון של פניצילין / סטרפטומיצין (5% V / V) בופר פוספט (PBS) לחלק הפנימי וחיצוני של טבעת הפלדה, דגירה הלילה (37 ° C CO, 2 5%). שים לב לטבעת הפלדה יוצרה באוניברסיטת נוטינגהם ויש לו את הממדים הבאים: קוטר חיצוני 2 סנטימטר, קוטר פנימי 1 סנטימטר, עומק 1 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון החיטוי ולשטוף עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה תרבית תאים לחלק הפנימי (500 μl) ומחוץ (500 μl) של טבעת הפלדה, המקום באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 </תת&gt;) תוך הכנת השעיה תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ההשעיה תא ולבצע ספירת תאים באמצעות assay הדרת Trypan הכחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור השעיה תא על מנת להשיג מספר תא של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מבפנים ומחוץ לטבעת הפלדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף עם תקשורת ותרבות תא prewarmed בצד החיצוני של טבעת הפלדה (1 מ &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μl של ההשעיה התא לחלק הפנימי של טבעת הפלדה - צלחת רוק קדימה ואחורה בעדינות כדי להפיץ תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת תרבית תאים לתוך חממה (37 ° C CO, 2 5%) - מצורפים תא צריך לקחת את המקום תוך 24 שעה, עם זאת תמשיך בתרבות כל עוד הניסוי דורש - מרעננת התקשורת בכל 2-3 ימים. </li></ol> 3.2 משלוח Nanosensor לתאים בתרבית על PLGA פיגום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע על גבי פיגום PLGA כפי שתואר בסעיף 3.1. במחקר זה פיגום PLGA ריק (לא containanosensors נינג) שימש עקב חפיפה של פליטת הקרינה כאשר הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את פיגום זרע התא לתוך חממה (37 ° C CO, 2 5%) ל72 שעות כדי לאפשר לתאים לגדול ולנדוד ברחבי הפיגום לפני Nanosensor מסירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני Nanosensor משלוח לשטוף את התאים עם PBS ולשנות את התקשורת מתקשורת והתרבות סטנדרטית לתקשורת חופשית באנטיביוטיקה וסרום, דגירה (37 ° C CO, 5% 2) במשך שעה 1. הערה: תקשורת ותרבות רגילה עבור 3T3 תאים מורכב של המדיום של הנשר בתוספת עוברי עגל בסרום (10% (v / v)) פתרון, L-גלוטמין (2 מ&quot;מ), פניצילין / סטרפטומיצין השתנה Dulbecco (1% (v / v)) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופת הדגירה להכין מורכב nanosensor-יפוזום ידי sonicating בקצרה חיישנים זעירים (5 מ&quot;ג) עם OptiMEM (50 μl) כדי ליצור א פתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת הפתרון B על ידי הוספת Lipofectamine 2000 (μl 5) לOptiMEM (45 μl), דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרוןלפתרון B, דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות כדי ליצור C פתרון שהוא מורכב nanosensor-יפוזום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף C פתרון (100 μl) לתאי דגירה (37 ° C CO, 2 5%) למשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפיגומים שנזרעו תאים מן החממה, תקשורת לשאוב ולשטוף פעמיים עם PBS לפני הוספת PBS (1 מיליליטר), כדי לאפשר להדמיה תא חי על ידי מיקרוסקופיה confocal. הערה: PBS היה בשימוש בפרוטוקול זה, כך שהחיווי האדום פנול הנמצא בתרבית תאי תקשורת לא גרם autofluorescence וגם בגלל כיול ב-pH שונה שמתבצע. עם זאת תקשורת החופשית פנול האדום יכולה לשמש לניתוח לטווח ארוך יותר של תרביות תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את פיגום זרע התא לתוך מאגרים של pH שונה ולפקח על התגובה של החיישנים הזעירים הקשורים לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על אובדן כושר עבודה על ידי קביעת היחס בין עוצמות הקרינה מFAM וטמרה על ידי התבוננות הקרינה באמצעות מיקרוסקופיה confocal (figuמחדש 3). </li></ol> מיקום Nanosensor 3.3 בתוך תאי יונקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם חיישנים זעירים המכילים רק את צבע FAM כפי שתואר בסעיף 3.2 (זה בגלל פליטת הקרינה של טמרה היא באותו האזור הרפאים כאדום Lysotracker). הכן nanosensors אלה כפי שתואר בסעיף 1.1 אבל עם ההשמטה של ​​הכנה והוספת טמרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת משלוח nanosensor לדלל פתרון מניות Lysotracker אדום 50 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת aliquot של הפתרון המדולל (2 μl) לתאים בתרבית על פיגומי PLGA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם Lysotracker אדום עבור שעה 1 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה להסיר את המדיה ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS (pH 7.4) לפני שינוי התקשורת לPBS (pH 7.4) (2 מיליליטר) כהכנה לצפייה באמצעות מיקרוסקופיה confocal. הערה: תקשורת החופשית פנול האדום יכולה לשמש במקום PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הכתם הגרעיני דראעQ5 לPBS כך הריכוז הסופי הוא מיקרומטר 5 ו דגירה עם התאים במשך 3 דקות (37 ° C-CO 2 של 5%). אין זה הכרחי כדי לשנות את התקשורת לאחר תקופת הדגירה עם Draq5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בליזר 488 ארגון ננומטר כדי להלהיב את FAM רק חיישנים זעירים, לייזר קריפטון 568 ננומטר לרגש האדום Lysotracker ו633 לייזר הליום ננומטר / ניאון כדי להלהיב את chromophore Draq5 ולבחון הקרינה ב500-530 ננומטר, 580-600 ננומטר, 650 -750 בהתאמה ננומטר (איור 3). השתמש בסריקה רציפה כדי למנוע אוסף של אורכי גל עירור. </li></ol>

<ol>
	<li>Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+liver+tissue+formation+in+rats+using+a+novel+collagen-polypropylene+scaffold.">De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold.</a> Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).</li><li>Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+precoating+of+elastomeric+tissue-engineering+scaffolds+increased+cellularity,+enhanced+extracellular+matrix+protein+production,+and+differentially+regulated+the+phenotypes+of+circulating+endothelial+progenitor+cells.">Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells.</a> Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).</li><li>Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+scaffold+design+for+tissue+engineering.">Porous scaffold design for tissue engineering.</a> Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).</li><li>Li, D., Xia, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+of+nanofibers:+Reinventing+the+wheel?.">Electrospinning of nanofibers: Reinventing the wheel?.</a> Advanced Materials. 16 (14), 1151-1170 (2004).</li><li>Sill, T. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro+spinning:+Applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).</li><li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+of+polymeric+nanofibers+for+tissue+engineering+applications:+A+review.">Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review.</a> Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).</li><li>Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+monitoring+of+3D+in+vitro+cell+aggregation+using+an+optical+imaging+system.">In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).</li><li>Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+Response+to+Interstitial+Flow:+A+State-of-the-Art+Review.">Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).</li><li>Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+tools+for+tissue+engineering.">Enabling tools for tissue engineering.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).</li><li>You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+degradation+behaviour+of+non-porous+ultra-fine+poly(glycolic+acid)/poly(L-lactic+acid)+fibres+and+porous+ultra-fine+poly(glycolic+acid)+fibres.">In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres.</a> Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).</li><li>Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+degradation+behaviors+of+electrospun+PGA,+PLGA+and+P(LLA-CL)+nanofibers+cultured+with/without+cell+culture.">Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture.</a> Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).</li><li>Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+glucose+monitoring+and+control+in+a+rotating+wall+perfused+bioreactor.">Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).</li><li>Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+PLGA+fibre+sheets+incorporating+fluorescent+nanosensors:+self-reporting+scaffolds+for+application+in+tissue+engineering.">Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering.</a> Analytical Methods. 5 (1), (2013).</li><li>Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+membranes+for+highly+sensitive+optical+sensors.">Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors.</a> Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).</li><li>Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+fluorescent+monitoring+of+the+degradation+of+polymeric+scaffolds+for+tissue+engineering.">On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering.</a> Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).</li><li>Blackwood, K. A., McKean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement.">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).</li><li>Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fiber+diameter+and+orientation+on+fibroblast+morphology+and+proliferation+on+electrospun+poly(D,L-lactic-co-glycolic+acid)+meshes.">Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes.</a> Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).</li><li>Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+structure:+A+novel+scaffold+for+tissue+engineering.">Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).</li><li>Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+scaffold+degradation+rate+on+three-dimensional+cell+growth+and+angiogenesis.">The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis.</a> Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הנדסת רקמות שואפת ליצור תחליפים ביולוגיים שיכולה לשמש גם כin vivo כמו במבחנה מודלים רקמות ובטיפול בתחליפי רקמות לתקן, להחליף, לשמר או לשפר את התפקוד של רקמה או איבר מסוים. תחליפים סינטטיים היו בשימוש במשך שנים רבות כדי להחליף או לתקן את הסיוע של רקמות אך אלה לעתים קרובות אינם מצליחים בשל שילוב עני עם רקמת המארח ו / או זיהום, שסופו של דבר מוביל לדחייה או ניתוח תיקון נוסף. יצירת רקמת חיה במעבדה לפני ההשתלה יכולה להתייחס לנושא של השגת אינטגרציה מלאה ולהפחית את הצורך בניתוח לתיקון. עם זאת, עבור מטרה זו להתממש התפשטות מתאימה במבחנה ומניפולציה של תאים בתוך מבני 3D צריכה להיות בשילוב עם מיזוג פיזי מתאים של הרקמות במבחנה. זו יכולה להיות מושגת במספר הדרכים אחד להיות כדי להמשיך במחקר בביולוגיה הבסיסיתמעורב, אלא גם כדי לחקור את נושאי הנדסה וייצור הקשורים לייצור של תחליפים סינטטיים. זה העניין אחרון זה, כי הפרוטוקול המתואר שואף לתרום. השימוש המיועד של פיגומי PLGA תיארו הוא לספק תמיכה זמנית לתאי יונקים לסייע לצמיחה שלהם לתוך מבנה רלוונטי מבחינה ביולוגית. שילוב של חיישנים זעירים מגיבים אנליטי לפיגומי PLGA עלול לאפשר ריכוזי אנליטי מקומיים כדי להיות במעקב לאורך מבנה 3D במהלך תהליך צמיחת הרקמות. השימוש בפיגומים מגיבים pH עלולים לאפשר הקביעה אם חומצי על ידי מוצרים המיוצרים כתבנית מתפרקת והתאים גדלים הם סולקו ביעילות מתוך מבנה 3D. זהו צעד לכיוון טיפול בחוסר הנוכחי של מעקב אחר תהליך ובקרה של תהליכי התחדשות רקמות במבחנה. הניצול של פיגומים, כי הם עצמם חשים התקנים עשוי לאפשר בבאתרו, הערכת microenvironmental בזמן אמת. ניטור microenvironment המבנה מבלי לפגוע ברקמה חיונית ויאפשר ניטור תהליך בכל שלבי ייצור רקמה. היכולת של הפיגום מגיב pH מיוצר לדווח ריכוז אנליטי המקומי הוערכה על ידי ניטור פלט הקרינה מן החיישנים הזעירים באמצעות מיקרוסקופיה confocal. ניסוי כיול בוצע עבור פיגום חישת pH והוכיח דומה לזו של החיישנים הזעירים מגיבים pH לא שולבו סיבי PLGA. היכולת לייצר עקומת כיול מוכיחה כי nanosensors להישאר מגיב לשינויים ב-pH כאשר שולבו פיגום הפולימרים וגם כי תהליך העיקור של הפיגומים לא גרם להשפעות מזיקות ליכולת החישה של nanosensors-pH. יתר על כן, חיישנים זעירים הועברו לסביבה תאית של תאים בתרבית על פיגומי PLGA wherדואר תגובה תאית לשינויים באובדן כושר העבודה יכולה להיות במעקב. יחס בין עוצמות הקרינה מFAM וטמרה שימש כדי לפקח Phi ובהשוואה לפיגום מגיב pH, טוען כי תאי פיברובלסטים 3T3 שמרו Phi בpH הטווח 6.8-7. fibroblasts דוגרים 3T3 transfected עם חיישנים זעירים עם הכתם הגרעיני Draq5 הצביע על כך שהרוב המכריע של החיישנים זעירים הקשורים תא לא היו ממוקם באזור הגרעיני. מיקום Nanosensor אינו מופיע להיות בתוך תאים חומציים כגון endosomes או lysosomes כפי שנקבע על ידי דוגרים nanosensor transfected 3T3 fibroblasts עם Lysotracker אדום, שבו שיתוף לוקליזציה של FAM וLysotracker האדום הייתי להיות מתוארת על ידי פיקסלים צהובים בתמונות confocal. מחקרים נוספים כגון ניתוח על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) וזיהוי של סמנים ביולוגיים למסלולי הפנמה יכולים לאמת את זה עוד יותר. בנוסף, מחקרים ארוך טווח כגון מיקרוסקופיה confocal זמן נפתריכול לקבוע את גורלו לטווח הארוך של החיישנים הזעירים בתוך תאים בתרבית על פיגומי דיווח עצמיים. אם nanosensors היה להיות מועבר לסוגי תאים אחרים אז המיקום שלהם צריך להיות מזוהה כתוצאה לא יכול להיות זהה לזה שמוצג כאן. השימוש בפיגומי דיווח עצמי יש הפוטנציאל לפקח noninvasively תנאי microenvironmental בתוך מבני רקמות מהונדסות. יש לו את היכולת לבצע במדידות באתר יכול לאפשר אופטימיזציה של הצמיחה של מבני רקמת 3D במבחנה noninvasively ובזמן אמת. מיקום cytoplasmic של החיישנים הזעירים מגיבים pH יכול להיות מנוצל כדי לפקח על אובדן כושר עבודה במהלך ניסויים מתמשכים. Nanosensors נמסר לסביבה הפנימית של תאים או פיגומי דיווח עצמיים יכול גם לשמש במערכות תרבית רקמה סטטית או דינמיות ויכול להוביל לקביעת תנאי התרבות נדרשים לצמיחה אופטימלית של מבני רקמות מהונדסות במבחנה. פיתוח נוסף יכול להוביל למערכת on-line שפועלים על דלדול מזין להבטיח אספקה ​​עקבית של חומרים מזינים וחמצן בכל המבנה, בסופו נותן שיטה לשחזור מאוד לתרבות של מבני רקמות. הפרוטוקולים שתוארו הכינו פיגומים עם ממדים מתאימים שיאפשר הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal עם זאת, כדי לאפשר 3D הגדול בונה להיות צילמה עירור רב פוטון עשוי להידרש כדי לאפשר הדמיה בתוך מבנים עמוקים יותר. הציוד האופטי המשמש כגון עדשת המיקרוסקופ צריך להיות שנבחר כדי לקבוע את מרחק העבודה האופטימלי לעדשה ואת ממדי המבנה.

אסטרטגיה מרכזית בהנדסת רקמות היא השימוש בחומרים ביולוגית לפברק פיגומי המורפולוגיה דומה לרקמה שזה הולך להחליף, והוא גם מסוגל לתמוך בצמיחת תא ותפקודו 1,2. הפיגום מספק תמיכה מכאנית כך שהוא מאפשר מצורף תא ושגשוגם עדיין מאפשר נדידת תאים לאורך הסדקים של מבנה תאי 3D. הפיגום חייב גם לאפשר לתחבורה ההמונית של חומרים מזינים סלולריים ולא לעכב פינוי פסולת המטבולית 3. Electrospinning התפתחה שיטה מבטיחה עבור הייצור של פיגומים פולימריים מסוגלים לתמוך 4-6 צמיחה הסלולר. סיבי electrospun ארוגים המיוצרים מתאימים לצמיחת תאים כפי שהם לעתים קרובות נקבוביים ומאפשרים אינטראקציה בין תאים, כמו גם נדידת תאים לאורך הסדקים של מבנה תאי 3D 7. חשוב לפקח על כדאיות תא במהלך tהוא תקופה של תרבות ועל מנת להבטיח כי כדאיות תא נשמר לאורך כל מבנה 3D. לדוגמא, תנאי תרבות כגון חמצן וחומציות דורשים בקרה קפדנית, כפי הדרגתיים בריכוז אנליטי יכול להתקיים בתוך מבנה 3D. יכולה להיות מועסק bioreactors או מערכות טפטוף לחקות בתנאי vivo של זרימת ביניים וכהעברת חומרי הזנה גידול תוצאה ופינוי פסולת מטבולית 8. השאלה אם מערכות כאלה הבטחת תנאי microenvironmental קבועים ניתן לטפל על ידי הערכת microenvironment הסלולרי בזמן אמת. מדדי microenvironment מפתח שיכול להיות במעקב בזמן אמת כוללים: טמפרטורה, הרכב כימי של תקשורת סלולרי, ריכוז החמצן מומס ופחמן דו חמצני, pH, ולחות. של מדדים אלה, טמפרטורה יכולה להיות במעקב ביותר בקלות באמצעות בבדיקות באתרה. שיטות לניטור המדדים המפורטים שנותרו נפוץ בהסרת volve של aliquot לדגימה ולכן להפריע לתרבית התאים ולהגביר את הסיכון לזיהום. שיטות רציפים, בזמן אמת הם חיפשו. שיטות ניטור הנוכחיות בדרך כלל לסמוך על מכשירים שפיסיים לחקור את המבנה התאי כגון צג ה-pH או בדיקה חמצן. עם זאת, שיטות פולשניות אלה עלולות לגרום נזק למבנה התאי ולהפריע לניסוי המתמשך. ניטור פולשני של ריכוזי אנליטי בתוך מבנה 3D יכול לאפשר ניטור של היבטים סביבתיים שונים, כגון מזין דלדול 9 בזמן אמת. היכולת זו תאפשר הערכה של אספקת חומרי מזון לאזורים עמוקים יותר בתוך המבנה ולקבוע אם הפסולת המטבולית הייתה להיות הוסרה באופן יעיל 10,11. מערכות שמנסות להתייחס לנושא של הפולשנות בדרך כלל כרוכות בשימוש בתא זלוף שעובר מדיום תרבות באמצעות שני כלי התרבות וחיישנים חיצוניים כדי לפקח pH, חמצן וגלוקוז 12.מחדש הוא עניין גובר בפיתוח חיישנים שיכולים להיות משולב ישירות לתוך כלי התרבות שאינו דורשים הסרת aliquot לדגימה ובתור שכזו יספק בניטור באתרה. כדי לטפל בליקויים כגון באתר וניטור פולשני של תנאי microenvironmental יש לנו שולבו חיישנים זעירים מגיבים אנליטי לפיגומי electrospun לייצר פיגומי דיווח עצמי 13. פיגומים הפועלים התקני חישה על ידי ניטור פעילות הקרינה כבר הכינו בעבר, שבו מכשיר החישה היה או פיגום פולימרים בפועל נוצר על ידי electrospinning או באמצעות השימוש בצבע מגיב אנליטי אשר שולב לתוך הפולימר לפני היווצרות פיגום 14,15 . עם זאת, יש מכשירי חישה אלה את הפוטנציאל לתת תפוקות אופטיות מוטעות הנגרמות על ידי הפרעה אפשרית מanalytes האחר. השימוש במכשיר חישה ratiometric such כמו אלה שהוכנו בפרוטוקול המתואר בעל הפוטנציאל לחסל את תופעות לוואי אפשריות אלה, ולתת מענה ספציפי לאנליטי בשאלה. פיגומי electrospun המובאים כאן הוכנו מפולי שיתוף הפולימר הסינתטי (החומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA), שנבחרו בגלל שיש מזון ותרופות אמריקניות (FDA) אישור, בשל המאפיינים מתכלים ביולוגית שלה ואחר שיא בתמיכה בצמיחה ובתפקוד של סוגי תאים שונים 16-18. Nanosensors מגיב אנליטי ratiometric מוכן הם מגיבים לרמת חומציות. Nanosensors לשלב שני צבעי ניאון לתוך מטריצת סול ביולוגית שבו צבע אחד, FAM הוא מגיב לרמת חומציות ואחרת, טמרה פועלת כתקן פנימי כפי שהוא אינו מגיב לרמת חומציות. יתר על כן הקרינה של שני FAM וטמרה ניתן לנתח בנפרד כפי שהם אינם חופפים באופן משמעותי. קביעת היחס של EMI הקרינהssion של שני הצבעים באורכי גל ספציפיים נותן מענה pH עצמאי של תנאים סביבתיים אחרים. פיגומי דיווח העצמי עלולים לאפשר חוזרת הערכה של ה-pH באתר ובזמן אמת מבלי לשבש את מודל 3D המפותח. אנחנו הוכיחו שהפיגומים הללו מסוגלים לתמוך בקובץ מצורף תא ושגשוגם ולהישאר קשובים לאנליטי בשאלה. קינטיקה של חומץ על ידי מוצרים במבנים מהונדסים נותרת understudied וככזה באמצעות הפיגומים מגיבים pH יכולה להקל על מחקרים כאלה מאוד 19. יתר על כן, השימוש בפיגומי דיווח העצמי עבור יישומי הנדסת רקמות מציג את ההזדמנות להבין באופן מלא, לפקח ולייעל את הצמיחה של מבני רקמת מודל 3D במבחנה, noninvasively ובזמן אמת. Nanosensors התגובה pH גם הועברו לסביבה תאית של fibroblasts התרבותי על פיגומי PLGA electrospunDS. היחס של פליטת הקרינה מהצבעים שמשמשים לניטור ואובדן כושר עבודה בהשוואה לחיישנים זעירים pH דיווח עצמי פיגום שילוב. המשלוח של חיישנים זעירים לתאים בתרבית בסביבת 3D יכול לאפשר ניטור של ריכוז אנליטי העמוק בתוך המבנה בצורה הרסנית. לכן חיישנים זעירים עשויים להיות כלי הדמיה קיימא להעריך nondestructively התנהגות תא לאורך 3D בונה מאפשר ניתוח לטווח ארוך. הקרנת הריכוז אנליטי של תאים בודדים בתוך מבנה 3D יכולה להבטיח כי הם מקבלים ריכוזי חומרי מזון וחמצן מספקים. פרמטרים תהליך הניטור יכולים לסייע בפיתוח של טכניקות סטנדרטיות לתחבורה ההמונית היעילה של חמצן וחומרים מזינים. המשלוח של חיישנים זעירים לסביבה ולשילוב של חיישנים זעירים לפיגומים פולימריים תאיים יכול להיות משולב כדי לאפשר הערכה של כדאיות תא, כמו גם ביצועי פיגום בתוך const 3Dructs במהלך תהליך צמיחת הרקמות. זה עשוי להוביל לידע מוגבר של המבנים הללו והתקדמות הייצור של תחליפי רקמה רלוונטיים מבחינה ביולוגית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="481">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">32221</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Anhydrous dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">270547</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution</td>
			<td style="width:71px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:137px;">35574</td>
			<td style="width:79px;">diluted to 30% (v/v) with pure water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">TEOS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">13190-3</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A3648</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1311</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1171</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate monobasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-0876</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaOH</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S8045</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T4174</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P0781</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D8537</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D6046</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:137px;">Batch-213-101992</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G7513</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Optimem</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11058-021</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">LysoTracker Red</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">L-7528</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Draq5</td>
			<td style="width:71px;">Biostatus Ltd</td>
			<td style="width:137px;">DR50050</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Nitrogen gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DCM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">320269</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">TFA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T6508</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="211">
			<td height="211" style="height:211px;width:195px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica TCS-SP</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;">equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">UV light</td>
			<td style="width:71px;">UVLS28 UVP, USA</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Stirrer plate</td>
			<td style="width:71px;">SB161-3 Jencons-PLS</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">pH meter</td>
			<td style="width:71px;">Jenway model 3510</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Rotary Evaporator</td>
			<td style="width:71px;">Buchi Rotary Evaporator R200</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Centrifuge (nanosensors)</td>
			<td style="width:71px;">Hermle Z300</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:195px;">Centrifuge (cell culture)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Whirlimixer Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Ultrasonicator</td>
			<td style="width:71px;">FB11021 Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Aluminum sheet</td>
			<td style="width:71px;">Nottingham University</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">35mm cell culture plate</td>
			<td style="width:71px;">Iwaki</td>
			<td style="width:137px;">3000035</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickenson</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">3T3 Fibroblast cells</td>
			<td style="width:71px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">PLGA</td>
			<td style="width:71px;">Lakeshore Biomaterials</td>
			<td>7525 DLG 7E</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pyridinium formate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P8535</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-reporting scaffolds for 3-dimensional cell culture

תאי culturing ב-3D ​​על פיגומים המתאימים חשבו לחקות טוב יותר vivo microenvironment ובלהגדיל את תאי תאי אינטראקציות. המבנה התאי 3D וכתוצאה מכך לעתים קרובות יכול להיות יותר רלוונטי ללימוד אירועים המולקולריים ותאי תאי אינטראקציות יותר מניסויים דומים למדו ב2D. כדי ליצור תרבויות 3D יעילות עם כדאיות גבוהה תא לאורך כל פיגום תנאי התרבות כגון חמצן וצורך pH להיות מבוקרים בקפידה כהדרגתי בריכוז אנליטי יכולים להתקיים לאורך כל מבנה 3D. כאן אנו מתארים את השיטות של הכנת nanosensors ביולוגית pH מגיב סול ושילובם בפולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA) פיגומי electrospun יחד עם ההכנה הבאה שלהם לתרבות של תאי יונקים. הפיגומים מגיבים pH יכולים לשמש ככלי לקביעת pH microenvironmental בתוך מבנה תאי 3D. יתר על כן, אנו מפרטים את המסירה של nanose התגובה pHnsors לסביבה תאית של תאי יונקים הצמיחה שנתמך על ידי פיגומי PLGA electrospun. מיקום cytoplasmic של החיישנים הזעירים מגיבים pH יכול להיות מנוצל כדי לפקח על ה-pH תאית (אובדן כושר עבודה) במהלך ניסויים מתמשכים.

התפלגות הגודל של החיישנים הזעירים מגיבים pH מוכנים התאפיינה באמצעות SEM, שבו האוכלוסייה של nanosensors צילם נמדדה ונמצאה כי ממדי ננומטר בטווח של 240-470 ננומטר (איור 1 א). ההישג של קוטר צר וקטן למדי בקנה אחד עם שימוש בשיטת Stober להכין חלקיקים. זה נמצא כי שימוש בסביבת ה-pH בסיסית במהלך הסינתזה של חלקיקים כלומר חלקיקים מוכנים תוך שימוש בשיטת Stober, מאפשר שליטה טובה של הגודל, ואילו הכנה באמצעות תנאים חומציים מייצרת פיזור רחב בגודל חלקיקים. micrographs SEM נציג של סיבי electrospun PLGA המפוברק באמצעות השיטות שתוארו מוצג באיור 1 ב הוכחת כי פיגום PLGA מיוצר מורכב מסיבים לא ארוגים בו מוצגות אגלים או שבירה מינימאליים שבו יש הסיבים ממדי ננומטר. איור 1 ג </strong&gt; מוכיח כי התוספת של חיישנים זעירים לפתרון PLGA בריכוז של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל מייצר סיבים כי הם דומים למדגם השליטה באיור 1B, micrographs SEM לספק ראיות של עמותת nanosensor על פני השטח של הסיבים אולם הם עשויים גם להיות משולב בתוך סיבי הפיגום, מחקרי השפלה של פיגומי הפיגום / nanosensor אלה יכולים להתבצע בשיתוף עם SEM ו / או confocal כדי לקבוע אם זה משפיע על ביצועי nanosensor. היכולת של החיישנים הזעירים כדי לשמור על הפעילות האופטית שלהם בעקבות שילובם בסיבי PLGA אומתה על ידי בחינת פיגומי דיווח העצמי באמצעות מיקרוסקופיה confocal. שמירה על היכולת להישאר אופטי ופעיל מבחינה כימית כאשר שולבו סיבי הפיגום יכולה לאפשר ריכוזי אנליטי כדי להיות במעקב. הקרינה הנפלטת מהחיישנים הזעירים הוכיחה כי nanosensors retained הפעילות האופטית שלהם וקשורים לסיבי הפיגום. הקרינה הנפלטת מFAM הצבעים (הירוק) וטמרה (אדום) התאגד בחיישנים הזעירים מגיבים pH מוצג ב2A דמויות ו2B בהתאמה. זו היא תוצאה חיובית שעושה את זה אפשרי עבור ריכוזי אנליטי כדי להיות במעקב באתרם. זוהי גם הפעם הראשונה שnanosensors ratiometric הפעיל אופטי שולבו סיבי פיגום PLGA באמצעות תהליך electrospinning. לאחר שאשר כי החיישנים הזעירים ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הבא התאגדות לתוך סיבי PLGA, תגובת nanosensor לשינויים בריכוז אנליטי אומתה. טבילת הפיגום לתוך מאגרים של pH שונה הביאה לשינוי של עוצמת הקרינה מצבע FAM תוך הקרינה הנפלטת לצבוע התייחסות טמרה לא השתנה באופן ניכר. היחס בין עוצמת ניאון של שני הצבעים יכול לשמש כדי לדרבןתחיקה עקומת כיול כפי שמוצג באיור 2 ג. עקום הכיול לחיישנים זעירים העריך לבד וכאשר שולבו פיגום PLGA electrospun דומה ומוכיח כי nanosensors לשמור על הפעילות האופטית שלהם בעקבות שילובם בפיגומי דיווח העצמי. היכולת של פיגום דיווח העצמי להגיב הפיכה לערכי pH שונים הוערכה על ידי לסירוגין לטבול את הפיגום במאגרים עם ערכי ה-pH של 5.5 ו7.5. ההפיכות נמצא להיות טוב מאוד כפי שמוצגים באיור 2 ד בי פיגום דיווח העצמי יכול להגיב לשינויים מחזוריים רבים בpH. מחקרים ארוך טווח לא בוצעו על מנת להעריך את ההשפעה של השפלה PLGA על התאגדות nanosensor, היא חשבה שבגלל שnanosensors לתת מענה ratiometric כמות nanosensors הנוכחי לא תשפיע על התוצאה. אנליטי nanosensors התגובה נמסר באמצעות liposomסוכן transfection אל לסביבה תאית של 3T3 fibroblasts הצמיחה שנתמך על ידי פיגומי PLGA ריקים. תמונות מיקרוסקופיה confocal של 3T3 fibroblasts התרבותי על פיגומי PLGA ריקים להוכיח כי חיישנים זעירים הקשורים לתאים פיברובלסטים עם הקרינה נצפו מFAM וטמרה מוצג ב3A דמויות ו-B בהתאמה. כיסיתי את הקרינה מערוצים אלה מראה כי הקרינה משני הצבעים היא שיתוף מקומי, טוען כי הצבעים נשארו לכוד בתוך המטריצה ​​של החיישנים הזעירים ביולוגית (כמתואר על ידי הקרינה צהובה באיור 3 ג). החיישנים הזעירים נחשבים בתוך הציטופלסמה של fibroblasts 3T3 ולא הכיל בתוך תאי חומצי כפי שמעיד על חוסר הקרינה מקומית במשותף מFAM רק חיישנים זעירים וצבע האדום Lysotracker המתואר באיור 3D. עוצמת הקרינה של nanosensors התגובה pH לספקאד ל3T3 fibroblasts היה פיקוח תוך התאים היו נתונים לשינויים ב-pH שתוצאותיו מוצגים באיור 3E. גרף הפיק מוכיח כי התאים בתרבית על פיגום PLGA electrospun שמרו Phi בטווח 6.8-7.0. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50608/50608fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. micrographs SEM של חיישנים זעירים, סיבי PLGA ופיגומי דיווח עצמיים. () Nanosensors התגובה pH סול מראה חלקיקים ננומטרים כדורית בגודל (ב) סיבים ארוגים electrospun PLGA בי מורפולוגיה סיבים היא רגילה עם מינימאליים ואגלי ושבר פיגומים (C) pH תגובה דיווח עצמי שבו ניתן לצפות nanosensors להיות בולט מן המורפולוגיה עדיין סיבי PLGA נשארה דומה עם סיבי PLGA שליטה שאינו מכילים nanosensors. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50608/50608fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50608/50608fig2.jpg" width="500px" /> איור 2. תמונות confocal מיקרוסקופ פיגומי דיווח עצמי pH מגיבים בו הקרינה ניתן לצפות מהחיישנים הזעירים הקשורים לסיבי פיגום PLGA. () FAM (ירוקה) הצבע מגיב pH ו (ב) טמרה (אדום) צבע ההתייחסות. (C) גרפים כיול של חיישנים זעירים pH מגיבים סול ופיגומים מגיבים pH demonstשיעור שהתגובה האופטית וכימית של החיישנים הזעירים לא נפגעה כאשר שולב בתוך סיבי פיגום PLGA. הפיכות (ד &#39;) של פיגום דיווח העצמי שבוצע על ידי טבילת הפיגום בפתרונות מאגר חלופיים של pH 5.5 וpH 7.5. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50608/50608fig2highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50608/50608fig3.jpg" width="500px" /> איור 3. תמונות מיקרוסקופיה confocal של nanosensors התא הפנים וגרפים של ה-pH ותגובת Phi. הקרינה מהחיישנים הזעירים הפנימו () FAM (ירוק) (ב) טמרה (אדום) (ג) שיתוף לוקליזציה של הקרינה מFAM וטמרה (צהוב) ( D) FAM רק חיישנים זעירים (ירוק) נמסר לתרבות 3T3 fibroblastsד על פיגום PLGA עם תיוג Draq5 (מגנטה) של הגרעין וLysotracker אדום (אדום) תיוג של lysosomes. Fluoresence של FAM ואדום Lysotracker לא תשתף מקומיים ולכן הוכחת כי אין זה סביר כי nanosensors הופנם לתוך תאים חומצי סלולריים מדידות (E) Phi נלקחו מחיישנים זעירים נמסרו 3T3 fibroblasts התרבותי על פיגום PLGA ריק בהשוואה לכיול pH של פיגום חישת pH ללא התרבות של תאים. זה גם מוכיח כי מדידות pH בוצעו באמצעות החיישנים הזעירים הפנימו אינם חומצי כמו התאים בתרבית על פיגום PLGA electrospun שמרו Phi בטווח 6.8-7.0. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50608/50608fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture at JoVE.com

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

ניתן לשלב nanosensors סול ביולוגית pH מגיב לפולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA) פיגומי electrospun. פיגומי דיווח עצמיים המיוצרים יכולים לשמש לניטור באתר של תנאי microenvironmental תוך תאי culturing על הפיגום. זה מועיל כמבנה התאי 3D יכול להיות במעקב בזמן אמת מבלי להפריע לניסוי.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

self-reporting-scaffolds-for-3-dimensional-cell-culture

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.1K Views.  University of Nottingham.  ניתן לשלב nanosensors סול ביולוגית pH מגיב לפולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA) פיגומי electrospun. פיגומי דיווח עצמיים המיוצרים יכולים לשמש לניטור באתר של תנאי microenvironmental תוך תאי culturing על הפיגום. זה מועיל כמבנה התאי 3D יכול להיות במעקב בזמן אמת מבלי ל?...

Video: Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

פלטפורמות microfabricated לתרבות Cell דינמי מכאני

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS אלסטומרי פיגומים להנדסת רקמות העורקים

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

שיטה Encapsulation השחלות זקיק ותרבות מערכת 3 מתכלה Proteolytically מימדי

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent shape upon the application of a stimulus such as heat1-5. In a typical shape memory cycle, the SMP is first deformed at an elevated temperature that is higher than its transition temperature, Ttrans [either the melting temperature (Tm) or the glass transition temperature (Tg)]. The deformation is elastic in nature and mainly leads to a reduction in conformational entropy of the constituent network chains (following the rubber elasticity theory). The deformed SMP is then cooled to a temperature below its Ttrans while maintaining the external strain or stress constant. During cooling, the material transitions to a more rigid state (semi-crystalline or glassy), which kinetically traps or "freezes" the material in this low-entropy state leading to macroscopic shape fixing. Shape recovery is triggered by continuously heating the material through Ttrans under a stress-free (unconstrained) condition. By allowing the network chains (with regained mobility) to relax to their thermodynamically favored, maximal-entropy state, the material changes from the temporary shape to the permanent shape.
Cells are capable of surveying the mechanical properties of their surrounding environment6. The mechanisms through which mechanical interactions between cells and their physical environment control cell behavior are areas of active research. Substrates of defined topography have emerged as powerful tools in the investigation of these mechanisms. Mesoscale, microscale, and nanoscale patterns of substrate topography have been shown to direct cell alignment, cell adhesion, and cell traction forces7-14. These findings have underscored the potential for substrate topography to control and assay the mechanical interactions between cells and their physical environment during cell culture, but the substrates used to date have generally been passive and could not be programmed to change significantly during culture. This physical stasis has limited the potential of topographic substrates to control cells in culture.
Here, active cell culture (ACC) SMP substrates are introduced that employ surface shape memory to provide programmed control of substrate topography and deformation. These substrates demonstrate the ability to transition from a temporary grooved topography to a second, nearly flat memorized topography. This change in topography can be used to control cell behavior under standard cell culture conditions.

A method for developing cell culture substrates with the ability to change topography during culture is described. The method makes use of smart materials known as shape memory polymers that have the ability to memorize a permanent shape. This concept is adaptable to a wide range of materials and applications.

זיכרון צורה פולימרים לתרבות התא הפעיל

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

קולגן אני Assay Organotypic: פלטפורמה חשילה לבחינת התנהגות תא בהקשר 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

הכנת 3D הפיברין פיגומים יישומים סלולריים גזע תרבות

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

טיפוח האדם ובתאים עצבית ב Hydrogel עצמית להרכבת 3 מימדי פפטיד

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D Hydrogel פיגומים למפרקים הכונדרוציטים תרבות וסחוס דור

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Repopulation תאי אפיתל והכנה של מכרסמים תאיים מטריקס פיגומים לפיתוח רקמות כליה

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...