<p class="jove_content"&gt; Ringraziamo DD Zhang per la discussione penetranti e generosamente offrendo reagenti. MJ è supportato dal NIH cardiovascolare Formazione Grant, l&#39;Arizona Technology Fund Research Initiative, e ricompense Achievement per gli scienziati College. Questo lavoro è supportato da Innovator Award nuovo direttore NIH (1DP2OD007161-01), la National Science Foundation (0.855.890) e la James S. McDonnell Foundation.</p

1. Creazione di stampi utilizzati per patterning <ol><li> Progettazione concettuale di modelli. I modelli sono creati che servono a formare reti di cellule, cellule contatto di controllo, isolare le cellule, imitare strutture naturali, o comunque guida adesione cellulare e di collocamento. </li><li> Computer-aided design o la creazione del modello CAD base e la creazione di fotomaschere. Il modello desiderato è stato progettato in software CAD, come AutoCAD, e viene quindi inviato ad una società esterna per produrre un fotomaschere. </li><li> Fotolitografia per la produzione di modello master. Vetrini sono modellati sia con un sottile resistere positivo o negativo di spessore resistere a seconda delle dimensioni della struttura creata. Vetrini sono utilizzati per la loro vantaggi di essere a basso costo, più forte di wafer di silicio e non producono polveri tanto quando rotto. In alternativa, altre strutture utili come reticoli di diffrazione può essere utilizzato come il modello master. </li><li> La slitta fantasia è collegato a una pila di diapositive che non sono stati fantasia. Tutti i passaggi vengono eseguiti all&#39;interno di una cappa a flusso pulito per ridurre al minimo la polvere. </li><li> Creazione di stampi master. Un contenitore di leggermente più grande della pila di diapositive stagnola è stato creato per tenere la 30 g di Polidimetilsilossano (PDMS) che viene poi versato sulla superficie photolithographically fantasia per creare uno stampo iniziale. Il PDMS è degassificati e lasciato asciugare per 1-2 giorni. </li><li> Una volta indurito il PDMS è staccata del modello maestro e forma uno stampo per il prossimo passo. </li><li> 6 g di 2 epossidica parte (Devcon # 14310 (6 g) viene miscelato per 1 minuto e poi versato nello stampo master, degassata e ha permesso di curare. Degasaggio la resina epossidica si deve fare in fretta (&lt;8 min) con bolla molti cicli di rottura e utilizzando soltanto un sottile strato prima che il set di resina epossidica e la rimozione bolla diventa impossibile rimuovere le bolle. Il 6 g usato produce uno strato sottile che facilita la rimozione rapida bolla. </li><li> Dopo un&#39;ora, i 2 epossidica parte sarà curata in parte e più epossidica possono essere aggiunti in cima senza degassamento per produrre una struttura più spessa che è più facile da gestire nelle fasi successive. La resina epossidica viene poi lasciato asciugare per 1-2 giorni. </li><li> Una volta indurito, la resina viene rimosso dallo stampo maestro PDMS e nastro viene avvolto intorno allo stampo epossidica per formare un contenitore. Uno stampo di lavoro è poi creato versando PDMS sullo stampo epossidica, degasaggio il PDMS, e curando per uno o due giorni. </li><li> Una volta indurito, lo stampo di lavoro è staccata della resina epossidica e conservato per mantenere la pulizia. </li></ol> 2. Patterning di superfici con stampi per l&#39;orientamento delle cellule <ol><li> Piccole sezioni dello stampo di lavoro sono tagliati fuori e messi su una piastra di Petri in polistirolo. Le posizioni di queste sezioni muffa sono etichettati. </li><li> Un treppiede è formato da piccole sezioni e ponderati per assicurare il contatto conformazionale tra lo stampo di lavoro e la superficie piastra di Petri. Buon piazzamento può essere osservato, cercando sul fondo del piatto. </li><li> L&#39;assemblea è posizionato nella camera di plasma. Trattamento al plasma è iniziato e continuato a 150 Pa a 29,6 W (potenza massima) per 10 minuti, con aria plasma. </li><li> Dopo il trattamento al plasma, lo stampo e contestazione peso vengono rimossi. </li><li> La piastra di Petri è posto sotto la luce UV per 10 minuti di sterilizzazione all&#39;interno del cabinet biosicurezza e memorizzate fino a quando seminati con cellule. </li></ol> 3. Semina delle superfici con le cellule <ol><li> SH-SY5Y CRL-2266 neuroblastoma umano o di altre cellule sono coltivate utilizzando protocolli standard per il tipo di cellula. </li><li> La confluenza del SH-SY5Y CRL-2266 cellule di neuroblastoma umano è misurato visivamente prima della semina sulla superficie modellata. </li><li> Divisione cellulare standard è effettuato per rimuovere le cellule dalla superficie della loro capsula di Petri. </li><li> Le cellule, galleggiante, una volta liberi, sono seminati sulla superficie del piatto modellato Petri dopo essere stato diluito per ottenere la confluenza desiderata quando posizionati sulla superficie modellata. </li><li> Le cellule sono ammessi ad insediarsi e attaccarsi alla superficie. </li><li> Il piatto modellato Petri viene incubata per diverse ore a diversi giorni, mentre le cellule montare sul modello creato dal plasma. </li><li> Quando la coltura delle cellule di neuroblastoma, l&#39;acido retinoico (10 mM) si aggiunge ogni giorno al fine di indurre le cellule a differenziarsi in un neurone stato simile. L&#39;aggiunta di acido retinoico è fatta al buio. </li><li> L&#39;acido retinoico è aggiunto al giorno per diversi giorni, dopo di che la differenziazione sarà osservabile. </li><li> Media è sostituita ogni 3-4 giorni. </li></ol> 4. Osservazione e analisi <ol><li> Immagini periodico delle cellule vive o video sono tratte in modo da osservare il comportamento di cellule nel tempo. Per le immagini dal vivo, le cellule sono poste in un microscopio fase incubatore superiore che mantiene le cellule di CO a 37 ° C, 100% di umidità, e il 5% 2. Le cellule possono anche essere fissate e colorate per l&#39;osservazione in fluorescenza </li><li&gt; Le immagini o video delle celle che sono stati catturati vengono importati in un sistema di analisi delle immagini e misurazioni sono effettuate tra il tasso di crescita, le dimensioni delle cellule, la velocità di migrazione, la differenziazione, l&#39;allineamento, la posizione di specifiche proteine, e altri. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Un risultato tipico di attuare la tecnica litografica plasma è la formazione di un modello di cellule che assomiglia a una struttura arbitraria o naturale. Questo si vede nella figura 1a-b dove le linee e le reti di neuroni sono stati creati. Altri tipi di cellule possono essere usate così come visto in Figura 1c-d, che mostra le cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) e C2C12 cellule del muscolo scheletrico formando griglie. Materiali come il poli-L-lisina può anche essere modellato, Figura 1e per facilitare l&#39;attaccamento di certi tipi di cellule e per altri usi. Nel caso dei neuroni mostrato, ciò che è stato creato sono reti di cellule che hanno le connessioni tra di loro. Questo riproduce ciò che avviene naturalmente nel cervello dove i neuroni hanno connessioni discrete tra cellule vicine che influenza il funzionamento del cervello. Con la creazione di una tale struttura in laboratorio, il numero, posizione, frequenza e altri fattori di connessioni possono essere sistematicamente controllata. Il risultato di queste arraignments può essere misurato visivamente e ingressi supplementari come chimico o la stimolazione elettrica può essere implementato per sondare il comportamento della rete. Un risultato negativo sarebbe un modello di invaso o incompleti o un campione contaminato. Un modello incomplete o ricoperte deriverebbe da semina il substrato sia con celle troppo pochi o troppi, che non avrebbe fornito il modello con una quantità ideale di cellule. Inoltre, se il motivo non è progettato correttamente (ad esempio, linee troppo stretta) le cellule non sarà in grado di attaccare e crescere con successo su di esso. Nel caso di un campione contaminato, pulizia adeguata non sarebbe stato mantenuto durante uno dei passaggi anche se questo è raro quando si segue proprio protocollo di coltura delle cellule a causa del fatto che il modello al plasma sterilizza anche il substrato. <img src="/files/ftp_upload/3115/3115fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Patterning di cellule e proteine.

<ol>
	<li>Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-Guided+Self-Assembly+of+Colloidal+Quantum+Dots+Using+Plasma+Lithography.">Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography.</a> Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).</li><li>Junkin, M., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cell+migration+in+confined+environments+by+plasma+lithography.">Probing cell migration in confined environments by plasma lithography.</a> Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).</li><li>Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaporation-induced+assembly+of+biomimetic+polypeptides.">Evaporation-induced assembly of biomimetic polypeptides.</a> Appl Phys Lett. 93, 023120-023 (2008).</li><li>Langowski, B. A., Uhrich, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+Plasma-Initiated+Patterning+(&#956;PIP).">Microscale Plasma-Initiated Patterning (&#956;PIP).</a> Langmuir. 21, 10509-10514 (2005).</li><li>Tourovskaia, A., Barber, T., Wickes, B. T., Hirdes, D., Grin, B., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterns+of+Chemisorbed+Cell+Adhesion-Repellent+Films+Using+Oxygen+Plasma+Etching+and+Elastomeric+Masks.">Micropatterns of Chemisorbed Cell Adhesion-Repellent Films Using Oxygen Plasma Etching and Elastomeric Masks.</a> Langmuir. 19, 4754-4764 (2003).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death.">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li><li>Johansson, B. -. L., Larsson, A., Ocklind, A., Ohrlund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Air+Plasma-Treated+Polymer+Surfaces+by+ESCA+and+Contact+Angle+Measurements+for+Optimization+of+Surface+Stability+and+Cell+Growth.">Characterization of Air Plasma-Treated Polymer Surfaces by ESCA and Contact Angle Measurements for Optimization of Surface Stability and Cell Growth.</a> Journal of Applied Polymer Science. 86, 26185-26185 (2002).</li><li>Murakami, T., Kuroda, S. -. i., Osawa, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Polymeric+Solid+Surfaces+Treated+with+Oxygen+Plasma:+Effect+of+Aging+Media+after+Plasma+Treatment.">Dynamics of Polymeric Solid Surfaces Treated with Oxygen Plasma: Effect of Aging Media after Plasma Treatment.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 202, 37-44 (1998).</li><li>Strobel, M., Lyons, C. S., Mittal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plasma surface modification of polymers: Relevance to adhesion. , (1994).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 37, 550-575 (1998).</li><li>Song, M., Uhrich, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+Micropattern+Dimensions+Enhance+Neurite+Outgrowth+Rates,+Lengths,+and+Orientations.">Optimal Micropattern Dimensions Enhance Neurite Outgrowth Rates, Lengths, and Orientations.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 1812-1820 (2007).</li><li>Zhao, F., Wu, T., Lau, A., Jiang, T., Huang, Z., Wang, X. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+promotes+neuronal+cell+differentiation.">Nrf2 promotes neuronal cell differentiation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47, 867-879 (2009).</li><li>Ohl, A., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-induced+chemical+micropatterning+for+cell+culturing+applications:+a+brief+review.">Plasma-induced chemical micropatterning for cell culturing applications: a brief review.</a> Surface and Coatings Technology. 116-119, 820-830 (1999).</li><li>van Kooten, T. G., Spijker, H. T., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-treated+polystyrene+surfaces:+model+surfaces+for+studying+cell-biomaterial+interactions.">Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions.</a> Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).</li><li>Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Sch&#246;n, P., Figdor, C. G., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+threshold+at+which+substrate+nanogroove+dimensions+may+influence+fibroblast+alignment+and+adhesion.">The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion.</a> Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di indagine cellulare presentato qui permette la creazione di modelli complessi di reti pluricellulari che mimano le strutture biologiche e fornisce un metodo per produrre stimoli che sono subcellulare in natura che facilita poi le indagini sia di comportamento delle cellule e le risposte raggruppate singola cellula a fattori ambientali. L&#39;utilizzo di questo metodo è semplice ma robusto come può essere rapidamente eseguita con apparecchiature a basso costo in laboratorio come la coltura cellulare. E &#39;anche fortemente cellulari sensibili, consente di osservare facilmente il comportamento risultante ed è per sua natura stabile per lunghi periodi di tempo, che permette di indagine il comportamento delle cellule lungo termine. Permette inoltre di una vasta gamma di esperimenti da eseguire in quanto è compatibile con molti tipi di cellule e possono creare modelli di arbitrario. La stabilità a lungo termine della tecnica deriva dal fatto che la funzionalizzazione della superficie impartita dal plasma è parte della superficie e non è un rivestimento o di altro livello che può essere rimosso o degradati. Se tenute sotto liquido, questo tipo di modifica può mantenere la sua capacità delle cellule di guida per mesi. La parte più critica della sperimentazione necessaria per garantire risultati significativi è quello di creare il modello maestro che alla fine sarà utilizzato per l&#39;orientamento delle cellule. Se questo modello non è progettato correttamente, le cellule non rispecchia in modo appropriato il modello e non possono produrre comportamenti utili. Parametri quali spessore della linea, la spaziatura modello, e altri possono influenzare notevolmente la compatibilità delle cellule con un motivo particolare, e in genere una serie di parametri quali possono essere creati sul fotomaschera iniziale allo schermo per il disegno più appropriato. Altri importanti parametri relativi alla realizzazione di patterning includono la creazione dello stampo, il mantenimento di un ambiente privo di polvere, la semina delle cellule e sterilità generale di colture cellulari. Creazione dello stampo può essere effettuato mediante le fasi di trasferimento vari che sono impegnati a consentire ripetute PDMS mollare gli ormeggi uno stampo epossidica. Lo stampo epossidica è creato, perché non si degradano nello stesso modo come resistere alla muffa con le piccole, le strutture di alta proporzioni sotto getto ripetuto. Se lo stampaggio di trasferimento è fatto correttamente, le dimensioni e la resa non sarà influenzato, ma se fatto in modo errato, come da poco degasaggio, curando incomplete, o riscaldamento eccessivo, bolle, rugosità e deformazione di un pattern può verificarsi che influenza il risultato finale. In relazione a mantenere un ambiente privo di polvere, gli stampi devono essere tenuti il ​​più pulito possibile, come la polvere può interferire con il corretto contatto tra lo stampo di lavoro PDMS e la superficie, e quindi adeguato al plasma schermatura e patterning chimico. La densità di semina delle cellule inoltre deve essere ottimizzata per garantire che né le cellule troppo pochi o troppi abitano la zona pattern e sterilità deve essere mantenuto per evitare la contaminazione batterica e di altri delle cellule in uso. La tecnica può anche essere integrato con altri elementi come microfluidica, microelettrodi, e sonde meccaniche. Questo fornisce stimoli alle cellule per replicare meglio varie condizioni fisiologiche durante la sperimentazione e le future attività è focalizzata sullo studio degli effetti di queste combinazioni

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Plasma e della Camera Vacuum Cleaner </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-001 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescenza invertito e microscopio a contrasto di fase </td><td> Nikon </td><td> TE2000-U </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio stadio superiore incubatore </td><td> AmScope </td><td> Modello TCS-100 </td><td> Modificato per includere un contenitore che fornisce un ambiente appropriato </td></tr><tr><td> Piatto polistirolo Petri </td><td> VWR </td><td> 25384-090 </td><td></td></tr><tr><td> Polidimetilsilossano (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> Epossidica </td><td> Devcon </td><td> 2 epossidica tonnellata chiaro # 14310 </td><td></td></tr><tr><td> Cellula cultura dei media </td><td> Vari </td><td></td><td> Mezzi di comunicazione segue formulazioni standard per tipo di cellula </td></tr><tr><td> L&#39;acido retinoico </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td></td></tr></tbody></table>

plasma lithography surface patterning for creation of cell networks

Manipolazione sistematica di un microambiente cellulare con risoluzione micro e nanometriche è spesso necessaria per decifrare vari fenomeni cellulare e molecolare. Per soddisfare questa esigenza, abbiamo sviluppato una tecnica di litografia plasma per manipolare il microambiente cellulare, creando una superficie modellata con dimensioni caratteristiche che vanno da 100 nm a millimetri. L&#39;obiettivo di questa tecnica è quello di poter studiare, in modo controllato, i comportamenti delle singole cellule e gruppi di cellule e le loro interazioni. Questo metodo litografia plasma si basa sulla modificazione selettiva della chimica di superficie su un substrato tramite il contatto di schermatura a bassa temperatura al plasma con uno stampo fisico. Questa schermatura selettiva lascia un modello chimico che può guidare l&#39;attaccamento delle cellule e del movimento. Questo modello, o un modello di superficie, può essere utilizzato per creare reti di cellule la cui struttura in grado di simulare quella che si trova in natura e produce un ambiente controllabile per le indagini sperimentali. La tecnica è particolarmente adatto a studiare come fenomeno biologico che produce modelli di superficie stabile su substrati polimerici trasparenti in maniera biocompatibile. I modelli di superficie durare per settimane o mesi e può così guidare l&#39;interazione con le cellule per lunghi periodi di tempo che facilita lo studio dei processi cellulari a lungo termine, quali la differenziazione e adattamento. La modifica alla superficie è principalmente di natura chimica, e quindi non introduce interferenze topografica o fisica per l&#39;interpretazione dei risultati. Inoltre non comporta alcun sostanze dure o tossiche per raggiungere patterning ed è compatibile per la coltura di tessuti. Inoltre, può essere applicato a modificare i vari tipi di substrati polimerici, che per la possibilità di regolare le loro proprietà sono ideali e sono ampiamente usati in applicazioni biologiche. La risoluzione ottenibile è anche utile, come l&#39;isolamento dei processi specifici come la migrazione, adesione, o vincolante permette discrete, le osservazioni chiaro al singolo livello multicella. Questo metodo è stato impiegato per formare reti diverse di tipi cellulari diversi per le indagini che coinvolgono la migrazione, di segnalazione, formazione di tessuto, e il comportamento e le interazioni dei neuroni chiamati in giudizio in una rete.

Watch this Scientific Journal Video about Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks at JoVE.com

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Un versatile tecnica di litografia plasma è stata sviluppata per generare modelli di superficie stabile per guidare l&#39;attaccamento cellulare. Questa tecnica può essere applicata a creare reti di cellule, comprese quelle che imitano i tessuti naturali ed è stato utilizzato per lo studio dei diversi tipi di cellule distinte.

Plasma Surface Patterning litografia per la creazione di reti di cella

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

plasma-lithography-surface-patterning-for-creation-of-cell-networks

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.6K Views.  University of Arizona. Un versatile tecnica di litografia plasma è stata sviluppata per generare modelli di superficie stabile per guidare l'attaccamento cellulare. Questa tecnica può essere applicata a creare reti di cellule, comprese quelle che imitano i tessuti naturali ed è stato utilizzato per lo studio dei diversi tipi di cellule distinte.

Video: Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Ricerca

Bioingegneria

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrati

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Utilizzando adesivo Patterning per costruire dispositivi microfluidici di carta 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Rapid Patterning sottrattiva di strati cellulare dal vivo con una sonda Microfluidic

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass substrate, that precisely controls the generation of tandem bubbles and individual cells patterned nearby with well-defined locations and shapes. We then demonstrate the generation of tandem bubbles by using two pulsed lasers illuminating a pair of gold dots with a few-microsecond time delay. We visualize the bubble-bubble interaction and jet formation by high-speed imaging and characterize the resultant flow field using particle image velocimetry (PIV). Finally, we present some applications of this technique for single cell analysis, including cell membrane poration with macromolecule uptake, localized membrane deformation determined by the displacements of attached integrin-binding beads, and intracellular calcium response from ratiometric imaging. Our results show that a fast and directional jetting flow is produced by the tandem bubble interaction, which can impose a highly localized shear stress on the surface of a cell grown in close proximity. Furthermore, different bioeffects can be induced by altering the strength of the jetting flow by adjusting the standoff distance from the cell to the tandem bubbles.

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

Un sistema Microfluidic con Patterning superficie per indagare cavitazione Bubble (s) Interazione -cell e gli effetti biologici risultante nel livello di singola cellula

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Un metodo versatile di patterning proteine ​​e cellule

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Plasma Surface Patterning litografia per la creazione di reti di cella

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering

Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO

Utilizzando adesivo Patterning per costruire dispositivi microfluidici di carta 3D

Rapid Patterning sottrattiva di strati cellulare dal vivo con una sonda Microfluidic

Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Un sistema Microfluidic con Patterning superficie per indagare cavitazione Bubble (s) Interazione -cell e gli effetti biologici risultante nel livello di singola cellula

Un metodo versatile di patterning proteine e cellule

Plasma Surface Patterning litografia per la creazione di reti di cella

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering

Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO

Utilizzando adesivo Patterning per costruire dispositivi microfluidici di carta 3D

Rapid Patterning sottrattiva di strati cellulare dal vivo con una sonda Microfluidic

Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Un sistema Microfluidic con Patterning superficie per indagare cavitazione Bubble (s) Interazione -cell e gli effetti biologici risultante nel livello di singola cellula

Un metodo versatile di patterning proteine ​​e cellule

Un metodo versatile di patterning proteine e cellule