מימון למחקר זה סופק על ידי ועדת ניו ג&#39;רזי בחקר חוט השדרה (NJCSCR) (כדי FHK), להעניק CSCR14IRG005 (כדי BLF), NIH מענק R15NS087501 (כדי CHC), וקרן קירבי FM (כדי ETA).

הערה: אנא להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. חלק מהכימיקלים המשמשים פרוטוקול זה הוא רעיל ומסרטן. השתמש כל נוהלי הבטיחות המתאים (במנדף, שבתא הכפפות) וציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, חלוק, מכנסיים באורך מלא, נעליים סגורות) בעת השימוש בחומרים רעילים או חומצה / בסיס. ייצור 1. של תבניות אב ליתוגרפיה באמצעות ליתוגרפיה Soft <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את הפריסה של microchannel באמצעות כלי ציור תכנון בעזרת מחשב (CAD). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדפס את הפריסה על צלחת מסיכה אטומה באמצעות סופר מסכת ליזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פרוסות סיליקון 4 אינץ &#39;עם אצטון ואחריו isopropanol ויבש עם אקדח אוויר חנקן, כדי לוודא ששום ממס נותר על פרוסות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את הפרוסות על ידי אפייה זה על צלחת חמה ב 200 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר photoresist שלילית המיועד לגובה הרצוי של microchannels. Fאו למשל, להשתמש photoresist השלילי SU-8 50 להשיג microchannels עם גובה של 50 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר רקיק להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן ליישר את רקיק על צ&#39;אק של coater ספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 4 מ&quot;ל (1 מ&quot;ל / אינץ בקוטר של פרוסות סיליקון) של photoresist שלילית על מרכז של פרוסות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין המעיל רקיק עם הסחיטה שני שלבים באמצעות הצנטריפוגה. ראשית, להחיל מחזור התפשטות 500 סל&quot;ד עם תאוצה של 100 סל&quot;ד / s עבור 10 שניות. ואז להחיל מחזור סחיטה של 2,000 סל&quot;ד עם תאוצה של 300 סל&quot;ד / s 2 למשך 30 שניות כדי לקבל ציפוי 50 מיקרומטר של photoresist על פרוסות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפות Soft רקיק בשני שלבים על פלטה חשמלית על פי הנחיות היצרן. לקבלת ציפוי 50 מיקרומטר של photoresist, הראשון מראש לאפות את פרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות ולאחר מכן מיד תעלי את הטמפרטורה פלטה חשמלית כדי לפרסם לאפות את פרוסות סיליקון ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר רקיק להתקרר לטמפרטורת החדר ולאחר מכן לטעון אתוופל לבמה ליתוגרפיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את המסכה על פרוסות סיליקון באמצעות aligner מסכה ולחשוף את רקיק לאור UV (על פי הוראות היצרן) בעצימות של 1.5 mW / 2 ס&quot;מ על 146 s ליישם את המינון UV כולל של 220 mJ / 2 ס&quot;מ הנדרשים 50 מיקרומטר שכבת photoresist עבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לאפות חשיפה לפרסם רקיק בשני שלבים על פלטה חשמלית. לקבלת ציפוי 50 מיקרומטר של photoresist, ראשון מראש לאפות את הפרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות ומייד תעלה את טמפרטורת הפלטה החשמלית כדי לפרסם לאפות אותו על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את רקיק על ידי השריית רקיק מפתח SU-8 ורועדת בעדינות עד תכונות להתבהר על פרוסות סיליקון. פיתוח רקיק עבור ~ 6 דקות עבור photoresist עבה 50 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מפתח עודף עם isopropanol ואתנול, ולאחר מכן לייבש את הפרוסות עם אקדח אוויר חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קשה לאפות את פרוסות סיליקון על פלטה חשמלית ב 150 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אתרקיק ייבוש עם 25 μL של סוכן silanizing tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-trichlorosilane. הערה: סוכן silanizing הוא מאכל, ולכן יש להשתמש בתוך במנדף חומצה / בסיס, עם ציוד מגן אישי מתאים (משקפי מגן, כפפות, חלוק, מכנסיים באורך מלאים, סגורות נעליים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את ואקום במשך 5 דקות ולחשוף את רקיק האדים של silane במשך 30 דקות מבלי לשחרר את הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את פרוסות לתוך צלחת כראוי בגודל פטרי. </li></ol> ייצור 2. מגיסטר תבניות ליתוגרפיה Soft באמצעות דבק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את הפריסה של microchannel באמצעות כלי ציור CAD ולהדפיס את הציור על נייר לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה שקופיות זכוכית גדולות מספיק כדי להכיל את העיצוב עם isopropanol ולאחר מכן לייבש את השקופית עם רובה אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף דבק לשקופית זכוכית לנקות. היזהר שלא מלכודת כל בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת את הצדדים של GLAss להחליק על הנייר עם העיצוב, עם למעלה בצד הקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אזמל לחתוך את הקלטת בשקופית הזכוכית באמצעות עיצוב נייר כהפניה ולאחר מכן לקלף קלטת מאזורים לא רצויים של שקופיות הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופית זכוכית עם isopropanol ואז יבש עם רובה אוויר. אופה את שקופיות זכוכית בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגלגל את הקלטת עם מכבש גומי כדי להסיר בועות אוויר ולאפשר את השקופית להתקרר לטמפרטורת החדר. </li></ol> 3. ייצור ליתוגרפיה Soft של מכשירי PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבי PDMS אלסטומר סוכן הריפוי שלה ביחס של 10: 1 (w: w), מערבב את התערובת במרץ, ולאחר מכן דג את התערובת על ידי צבת אותו לתוך תא ואקום עד שאין בועות אוויר מופיעות התערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת על תבנית סיליקון silanized או עובש דבק בצלחת פטרי להשיג ~ 2 מ&quot;מ שכבה עבה של PDMS דגה עד שכל האוויר בועות להיעלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרפא את PDMS בתנורעל 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אזמל לחתוך את שכבת PDMS במרחק של לפחות 5 מ&quot;מ מן התכונות ולאחר מכן לקלף את PDMS נרפא את התבנית באמצעות פינצטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פאנץ חור כניסת יחיד עם ביופסיה 1 מ&quot;מ אגרוף בכל מקום על microchannel, רצוי בסוף רשת של microchannels כפי שניתן לראות באיור 2a ו -4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את PDMS יצוק עם סרט דביק על מנת להסיר חלקיקי אבק adsorbed על גבי המכשיר. לעקר את המכשיר microchannel PDMS (יצוק PDMS) על ידי שטיפה עם תמיסה של אתנול 70% ואחריו מים סטריליים deionized (DI), ולחשוף את UV למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את המכשיר PDMS סטרילי בצלחת פטרי סטרילית עד השימוש. </li></ol> 4. תשתית דפוסים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את PDMS סטרילי יצוק באמצעות פינצטה על coverslip כוס סטרילית או בצלחת פטרי להפעיל לחץ עדין באמצעות קצה של פינצטה. הערה: צוות השחקנים PDMS עושה קונפורמי אבל חותם הפיך עם GLcoverslip התחת או בצלחת פטרי להרכיב microchannels ללא שימוש בכל דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח טיפה (20 - 40 μL) של פתרון המצע על הכניסה לגמרי מכסה את חור המפרצון. תבנית Poly-D- ליזין (PDL) על ידי הצבת אגל 20 μL של PDL חיץ נתרן tetraborate על מפרצון של microchannels. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת פטרי בחלל ריק של ~ 254 mmHgA (שווה ערך ל לשכן ואקום במעבדות ביולוגיות) במשך 10 דקות, ולבחון אוויר היוצא של הערוץ בצורת בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר את הוואקום ולבחון את פתרון המצע זורם לתוך microchannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחת על התנאים המתאימים דבקות מצע. ראה לוחות 1 ו -2 תנאי דגירה (אלה משתנות בהתאם למצע). לקבלת דפוסי PDL, דגירה של 1 ש &#39;על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לקלף את חותמת PDMS באמצעות פינצטה סטרילית לשטוף את התבנית על coverslip זכוכית שלוש פעמים עם מים די. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת אלבומין 1% שור פתרון (BSA) כדי בצלחת פטרי לכסות את התבשיל או coverslip הזכוכית דגירה לילה בשעה 37 ° C. הערה: זה יקטין דבקות שאינן ספציפיות באזורים ללא ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון 1% BSA, ואת המצע בדוגמת עכשיו הוא מוכן לשימוש. </li></ol> 5. דפוסים עקיפים של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ההשעיה תא בינוני תרבות סרום ללא. סוג התא צפיפות התאים מפורטים בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ההשעיה תא אל צלחת פטרי בדוגמת ובאופן מוחלט לצלול באזור בדוגמת ההשעיה הסלולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צלחת פטרי על 37 מעלות צלזיוס באינקובטור במשך 15 דקות כדי לאפשר לתאים לצרף מצע בדוגמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את השעית התא העודפת מצלחת פטרי לשטוף את התאים בדוגמת שלוש פעמים עם בופר פוספט (PBS) תוך רעד בעדינות במשך 10 שניות כדי להסיר תאים פנויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אמדיום תרבות ppropriate אל בתרביות תאים בדוגמת דגירת התאים בדוגמת ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור. </li></ol> 6. דפוסים ישירים של תאים הערה: טכניקה זו היא חלופת דפוסי התא העקיף כמתוארים בשלב 5. עם זאת, שלא כמו בשלב 5, בטכניקה זו תאים הם בדוגמת על משטחים בתרבית רקמה עם או בלי ציפוי מצע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את המכשיר microfluidic על ידי שטיפה עם תמיסה של 70% אתנול ואחריו מים DI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את המכשיר לילה בתמיסה של BSA 1% כדי למנוע את הידבקות התא אל PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש את המכשיר בטמפרטורת החדר וצרף אותו לחלק התחתון של צלחת פטרי שטופלו בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את השעית תא תקשורת ותרבות סרום ללא. סוג תא צפיפות תאים מפורטים בטבלה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפה (4 - 8 μL) של ההשעיה תא, מספיק כדי למלא אתmicrochannels, על הכניסה לגמרי מכסה את חור המפרצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת פטרי בחלל ריק במשך 10 דקות ולבחון אוויר היוצא של הערוץ בצורת בועות. לשחרר את הוואקום ולבחון את ההשעיה תא לזרום לתוך microchannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צלחת פטרי באינקובטור כדי לקדם את הידבקות תא בהתאם לתנאי הדגירה (תלוי בסוג של תא בדוגמת) ציין בטבלה 2. להוסיף PBS על צלחת פטרי השריית מכשיר PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקלפים את PDMS בזהירות מעל צלחת פטרי עם פינצטה לשטוף את התבנית עם PBS. הוסף מדיה תרבית תאים כדי בצלחת פטרי ומקום תרבית התאים בחממה. </li></ol>

<ol>
	<li>Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+proteins+and+cells+using+soft+lithography.">Patterning proteins and cells using soft lithography.</a> Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).</li><li>Lin, R. Z., Ho, C. T., Liu, C. H., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoresis+based-cell+patterning+for+tissue+engineering.">Dielectrophoresis based-cell patterning for tissue engineering.</a> Biotechnol J. 1 (9), 949-957 (2006).</li><li>Veiseh, M., Zareie, M. H., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Selective+Protein+Patterning+on+Gold-Silicon+Substrates+for+Biosensor+Applications.">Highly Selective Protein Patterning on Gold-Silicon Substrates for Biosensor Applications.</a> Langmuir. 18 (17), 6671-6678 (2002).</li><li>Kung, F., Wang, J., Perez-Castillejos, R., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+along+the+nasal/temporal+plane+affects+synaptic+development+by+adult+photoreceptors,+revealed+by+micropatterning.">Position along the nasal/temporal plane affects synaptic development by adult photoreceptors, revealed by micropatterning.</a> Integr Biol. 7 (3), 313-323 (2015).</li><li>Dickinson, L. E., Lutgebaucks, C., Lewis, D. M., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+microscale+extracellular+matrices+to+study+endothelial+and+cancer+cell+interactions+in+vitro.">Patterning microscale extracellular matrices to study endothelial and cancer cell interactions in vitro.</a> Lab Chip. 12 (21), 4244-4248 (2012).</li><li>Khademhosseini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+human+embryonic+stem+cells+with+murine+embryonic+fibroblasts+on+microwell-patterned+substrates.">Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates.</a> Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cell-cell+communication+in+co-culture.">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnol J. 8 (4), 395-396 (2013).</li><li>Choi, Y., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+cell+growth+through+surface+treatments.">Guided cell growth through surface treatments.</a> J of Mech Sci Technol. 19 (11), 2133-2137 (2005).</li><li>Hwang, I. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Immobilization+and+Patterning+of+Biomolecules+on+Poly(ethylene+terephthalate)+Films+Functionalized+by+Ion+Irradiation+for+Biosensor+Applications.">Efficient Immobilization and Patterning of Biomolecules on Poly(ethylene terephthalate) Films Functionalized by Ion Irradiation for Biosensor Applications.</a> ACS Appl Mater Interf. 3 (7), 2235-2239 (2011).</li><li>Clark, P., Britland, S., Connolly, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+guidance+and+neuron+morphology+on+micropatterned+laminin+surfaces.">Growth cone guidance and neuron morphology on micropatterned laminin surfaces.</a> J Cell Sci. 105 (1), 203-212 (1993).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> J Cell Sci. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Douvas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+photolithographic+process+for+the+patterning+of+biomolecules.">Biocompatible photolithographic process for the patterning of biomolecules.</a> Biosens Bioelectron. 17 (4), 269-278 (2002).</li><li>Alom, R. S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing:+A+tool+to+pattern.">Microcontact printing: A tool to pattern.</a> Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).</li><li>Ess&#246;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifying+Polydimethylsiloxane+(PDMS)+surfaces.">Modifying Polydimethylsiloxane (PDMS) surfaces.</a> Institutionen f&#246;r biologi och kemiteknik. , (2007).</li><li>Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+PDMS+surface+modification+for+microfluidic+devices.">Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices.</a> Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).</li><li>Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+elastomeric+stencils+for+micropatterning+cell+cultures.">Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures.</a> J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).</li><li>Yeo, W. S., Yousaf, M. N., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+interfaces+between+cells+and+surfaces:+electroactive+substrates+that+sequentially+release+and+attach+cells.">Dynamic interfaces between cells and surfaces: electroactive substrates that sequentially release and attach cells.</a> J Am Chem Soc. 125 (49), 14994-14995 (2003).</li><li>Bhatia, S. N., Toner, M., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adhesion+of+hepatocytes+on+patterned+surfaces.">Selective adhesion of hepatocytes on patterned surfaces.</a> Ann N Y Acad Sci. 745, 187-209 (1994).</li><li>Song, E., Kim, S. Y., Chun, T., Byun, H. -. J., Lee, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+scaffolds+derived+from+a+marine+source+and+their+biocompatibility.">Collagen scaffolds derived from a marine source and their biocompatibility.</a> Biomaterials. 27 (15), 2951-2961 (2006).</li><li>Yamato, M., Konno, C., Utsumi, M., Kikuchi, A., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+responsive+polymer-grafted+surfaces+facilitate+patterned+cell+seeding+and+co-culture.">Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture.</a> Biomaterials. 23 (2), 561-567 (2002).</li><li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+cells+and+their+environments+using+multiple+laminar+fluid+flows+in+capillary+networks.">Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (10), 5545-5548 (1999).</li><li>Kim, D. S., Lee, K. -. C., Kwon, T. H., Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-channel+filling+flow+considering+surface+tension+effect.">Micro-channel filling flow considering surface tension effect.</a> J of Micromech Microeng. 12 (3), 236 (2002).</li><li>Kim, E., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromolding+in+Capillaries:+Applications+in+Materials+Science.">Micromolding in Capillaries: Applications in Materials Science.</a> J Am Chem Soc. 118 (24), 5722-5731 (1996).</li><li>Kim, E., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Microstructures+Formed+by+Molding+in+Capillaries.">Polymer Microstructures Formed by Molding in Capillaries.</a> Nature. 376 (6541), 581-584 (1995).</li><li>Jeon, N. L., Choi, I. S., Xu, B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-area+patterning+by+vacuum-assisted+micromolding.">Large-area patterning by vacuum-assisted micromolding.</a> Adv Mater. 11 (11), 946 (1999).</li><li>Shrirao, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System+and+method+for+novel+microfluidic+device.">System and method for novel microfluidic device.</a> US patent. , (2010).</li><li>Merkel, T. C., Bondar, V. I., Nagai, K., Freeman, B. D., Pinnau, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+sorption,+diffusion,+and+permeation+in+poly(dimethylsiloxane).">Gas sorption, diffusion, and permeation in poly(dimethylsiloxane).</a> J Polym Sci Part B Polym Phys. 38 (3), 415-434 (2000).</li><li>Shrirao, A. B., Hussain, A., Cho, C. H., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive-tape+soft+lithography+for+patterning+mammalian+cells:+application+to+wound-healing+assays.">Adhesive-tape soft lithography for patterning mammalian cells: application to wound-healing assays.</a> Biotechniques. 53 (5), 315-318 (2012).</li><li>Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chips+&amp;+tips:+simple+fabrication+of+microfluidic+devices+by+replicating+scotch-tape+masters.">Chips &amp; tips: simple fabrication of microfluidic devices by replicating scotch-tape masters.</a> Lab Chip. , (2010).</li><li>Anil, B. S., Frank, H. K., Derek, Y., Cheul, H. C., Ellen, T. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuum-assisted+fluid+flow+in+microchannels+to+pattern+substrates+and+cells.">Vacuum-assisted fluid flow in microchannels to pattern substrates and cells.</a> Biofabrication. 6 (3), 035016 (2014).</li><li>Yuen, P. K., Goral, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+rapid+prototyping+of+flexible+microfluidic+devices+using+a+desktop+digital+craft+cutter.">Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter.</a> Lab on a Chip. 10 (3), 384-387 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-loading+and+cell+culture+in+one+layer+microfluidic+devices.">Self-loading and cell culture in one layer microfluidic devices.</a> Biomed Microdevices. 11 (3), 679-684 (2009).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mammalian+cells+under+high+vacuum+condition+for+ion+bombardment.">Survival of mammalian cells under high vacuum condition for ion bombardment.</a> Cryobiology. 49 (3), 241-249 (2004).</li><li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+bonding+by+means+of+a+portable,+low-cost+corona+system.">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li><li>Fan, D. -. H., Yuan, S. -. W., Shen, Y. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modification+with+BSA+blocking+based+on+in+situ+synthesized+gold+nanoparticles+in+poly+(dimethylsiloxane)+microchip.">Surface modification with BSA blocking based on in situ synthesized gold nanoparticles in poly (dimethylsiloxane) microchip.</a> Colloids Surf, B. 75 (2), 608-611 (2010).</li><li>Hideshima, S., Sato, R., Inoue, S., Kuroiwa, S., Osaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+tumor+marker+in+blood+serum+using+antibody-modified+field+effect+transistor+with+optimized+BSA+blocking.">Detection of tumor marker in blood serum using antibody-modified field effect transistor with optimized BSA blocking.</a> Sens Actuator B-Chem. 161 (1), 146-150 (2012).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+immunoassay+through+in-channel+microfluidic+patterning.">High-throughput immunoassay through in-channel microfluidic patterning.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2487-2490 (2012).</li><li>MacLeish, P., Barnstable, C., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+monoclonal+antibody+as+a+substrate+for+mature+neurons+in+vitro.">Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro.</a> Procs Nat Acad of Sci. 80 (22), 7014-7018 (1983).</li><li>Suchodolskis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+chemically+modified+baker's+yeast+cells+studied+by+AFM.">Elastic properties of chemically modified baker's yeast cells studied by AFM.</a> Surf Interface Anal. 43 (13), 1636-1640 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

בעוד photolithography הקונבנציונלי היא טכניקה מבוססת היטב ליצירת תבניות עבור ליתוגרפיה רכה, הציוד, חומרים, ואת כישורים דרושים כדי להשתמש photolithography הקונבנציונלי אינם זמינים ברוב המעבדות. למעבדות ללא גישה למשאבים אלה, והצגנו ייצור סרט דביק כשיטה של ​​יצירת תבניות עם תכונות פשוטות יחסית למכשירי microfluidic. שיטה זו מאפשרת לכל מעבדה ליצור ולנצל מכשירי microfluidic למטרות מחקר עם כלים זמינים. השיטה הדבקה ניתן לשפר עם חותך ויניל שולחן העבודה בעלות נמוכה 31. חותכים ויניל השולחן עשויים להגדיל שחזור, רזולוציה, וכן מורכבות פריסה. לכל אחת מהאפשרויות האלו, photolithography הקונבנציונלי, חותכי שולחן עבודה, או ייצור סרט דביק יש יכולות שונות ומגבלות וחוקר לשקול בזהירות איזו שיטה יספיקלצרכיהם. בשנת PDMS נרפא, שרשרות פולימריות הארוכות של siloxane דימתיל יוצרות סריג, מבנה nanoporous היוצרת אזורים ריקים שניתן למלא עם מולקולות אוויר 27. רכוש חדיר גז זה הוא המפתח לשיטה שלנו של מילוי ערוצי microfluidic. כאשר מכניסים בסביבה בלחץ נמוך, מולקולות אוויר יוסרו עיקר החומר PDMS כמו גם microchannels עצמם 25. כאשר PDMS חשוף ואז הלחץ האטמוספרי, עיקר החומר PDMS ו microchannels לשמור על לחץ שלילי במשך זמן מה 25, 30. הלחץ השלילי הזה שואב נוזל לתוך microchannels אוטומטי מילוי ערוצי microfluidic. הלחץ השלילי הזה ממשיך לצייר נוזלי לתוך התעלה עד PDMS בתפזורת equilibrates עם הלחץ האטמוספרי. טכניקת ואקום בסיוע זה מאפשרת patterning של חלבוני מצעים ספציפיים על מצע גידול. במחקר זה, הצלחנו דפוס כמה מצעים שונים סוגי תאים הן במישרין והן בעקיפין (טבלה 1 ו -2). עם זאת, הניסוי ייתכן שיהיה הצורך לבדוק פעמי דגירה שונות, צפיפות תא, או בתקשורת זריעת התאים מהסוג המסוים שלהם. משתנה אלה מתייחסים צפויים היכולת המולדת של מי מבני התא או המצע לדבוק פני השטח הוא שיוצב על. לדוגמא, כאן C2C12 תאים נדרשו השימוש בסרום ללא מדיה עבור מדיה הזריעה לפני culturing תאי DMEM עם סרום סוס 2%. בנוסף, תנאים עשויים להשתנות בהתאם אם coverslip כוס או צלחת פטרי פלסטיק מתבצע בדוגמת. כאן, הן עבדו היטב כדי לאפשר דפוסים ספציפיים של תאים מסוגים שונים. אחד החששות הראשוניים שהיו לנו תוך שימוש בטכניקה זו היה איך החשיפה ואקום עשוי להשפיע על כדאיות התא. לימוד p זהמחקרים revious, לעומת זאת, צריך להקל על חששות אלה כפי שהראינו כי יש ואקום לא מעט על מנת להשפיע על מגוון של תאים 30. וואנג et al. בעבר נוצל degassed אטום באופן בלתי הפיך לתאי microfluidic לטעון תאי הלה 32. מחקרים אחרים השתמשו זריעת תאים בסיוע ואקום עבור מגוון רחב של סוגי תאים כולל תאי גזע אנושיים, תאים חסידים ולא חסידים, וקו תא כלאיים האוגר (א L) תאים לטעון לתוך ערוצי microfluidic 33. בנוסף, חוקרים אחרים החילו תאים ללחצי ואקום גדולים בהרבה בהשוואת המחקר הנוכחי עם מעט שום השפעה ניכרת על התאים 33. הבועות הנוצרות במהלך הסרת האוויר מן microchannel נוטים להתאסף על פני השטח של אגל של השעיה על כניסת. לעתים קרובות אלה בועות לא להתפקע עקב מתח הפנים של ההשעיה. אנחנו לא observאד ירידה ניכרת כדאיות התא עקב בועות. בנוסף, הניסוי עם Calcein-AM אינו מציע ירידה משמעותית כדאיות התא. בגלל זה, יש לנו לא בדק ביסודיות מוות של תאים במיוחד בשל בועות. ניסיונות קודמים מצעי דפוס או תאים היו מנוגע לעתים קרובות על ידי בעיות כגון ההיווצרות של בועות אוויר בתוך מכשירי microfluidic. היווצרות של בועות אוויר הקשתה להזריק נוזלים בקלות וביעילות ללא שימוש בציוד או חומרים שאינם זמינים ברוב המעבדות. לדוגמה, השיטות הקודמות ניצלו את השימוש בטיפול פלזמה או טיפול קורונה כדי להקטין את הידרופוביות של microchannels PDMS 15, 34. בעוד יעיל, פלזמה כישוף קורונה אינם זמינים ברוב המעבדות. בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים את יכולת תאי דפוס מצעים פשוט באמצעות labora המשותףחללים טורי. באמצעות טכניקת ייצור סרט דביק, המתודולוגיה יכול להיות מנוצל כדי ליצור ערוצי microfluidic PDMS מצעים או תאים דפוס בכל מעבדה כמעט. על מנת מצעי דפוס או תאים עם פרוטוקול דפוסי הוואקום, כמה צעדים חיוניים עבור דפוסים מוצלחים. ראשית, לפברק המאסטר קלטת דבק, דבק יש לצרף לחלוטין לשקופית זכוכית ללא בועות אוויר. בועות האוויר להחליש את הקשר בין הסרט לבין שקופיות זכוכית ועלול להוביל את הקלטת להיות קילף כאשר נרפא PDMS הוא קילף את התבנית בנייר דבק. בנוסף, בועות תעוותנה את הגיאומטריה של ערוץ microfluidic גרימת פני השטח של הערוצים להיות מישורים שאינם. כדי להפוך את PDMS שנוצקו עובש SU-8, עובש SU-8 חייב להיות silanized לפני הליהוק עם PDMS. שלב זה הוא קריטי במניעת הזוגיות הקבועה של PDMS אל עובש SU-8 לאחר הריפוי של PDMS. לפני איטום קונפורמישל ערוץ microfluidic PDMS כדי coverslips זכוכית או צלחות פטרי פלסטיק, יש לנקות את PDMS של כל חלקיקי האבק. חלקיקים אלה עשויים למנוע היווצרות של חותם קונפורמי בין PDMS וזכוכית ובכך למנוע הזרקה של תאים או מצעים לתוך הערוץ microfluidic. כאמור בפרוטוקול לעיל, ניקוי ערוצי PDMS עם דבק הוא קריטי לפני דבקות microchannel כדי coverslips זכוכית או צלחות פטרי פלסטיק. לבסוף, לאחר צבת המכשיר לתוך תא הוואקום, הוואקום חייב להשתחרר בעדינות כדי למנוע תזוזה של רביב של פתרון מצע או תא מחור המפרצון. אם לא נוזל הוא ציין זורם לתוך תעלת microfluidic, ייתכנו דליפת ערוץ microfluidic שימנע נוזל לזרום לתוך התעלה. הסר את חותמת PDMS, יבשים לנקות אותו ולאחר מכן חזור על שלב 4, 5, או 6 של הטכניקה. אם הפתרון אינו זורם לתוך microchannel לאחר releASE של ואקום, להבטיח כי הפתרון מכסה את הפתח כליל של microchannel. ניתן לעשות זאת על ידי pipetting הפתרון מעלה ומטה מספר פעמים תוך שימת אותו בבור מפרצון. אם המצע, לאחר הזרקת לתוך microchannel, לא לצרף את הכוס, להעריך ולקבוע את תנאי הדגירה אופטימלית הכרחי המצע בשימוש. אם הסרת PDMS יצוק מפני השטח כוס או צלחת פטרי פלסטיק גורם לתאי או מצעים בדוגמת להיהרס, להשתמש בגבס PDMS רזה, להטביע את PDMS נוצקו PBS או מדיה, ולאט לאט ובעדינות לקלף את PDMS יצוק מן הכוס או משטח פלסטיק עם פינצטה. לבסוף, BSA עשוי להיות קריטי בהפחתת הידבקות ספציפית של תאים משתי זכוכית unpatterned או משטח פלסטיק. BSA משמש בדרך כלל בתור הגיב חסימה מערבי סופג, immunostaining, וטכניקות ביולוגיה מולקולריות אחרות. חוקרים אחרים גם ניצלו את זה עקיף או ישירפרוטוקולי דפוסים כדי להקטין הידבקות תא ספציפי 35, 36, 37. מצאנו דגירה של המצע עם BSA הייתה הכרחית סוגי התאים ביותר למעט בתאי רשתית סלמנדרה. זה עשוי להיות בשל אופיו מיוחדים יותר של המצע (נוגדן בשם סאל-1) ששימש גם היעדר כללי של הידבקות התא על ידי תאים מסוג 38. בידיים שלנו, BSA גם לא ניכרת להקטין את הדבקות של תאים לאזורים בדוגמת ובעיקר הקטינו דבקות ספציפי. אמנם שיטה זו נועדה להיות תכליתי וגמיש בבקשתה סוגי מצע תאים שונים, ישנם מספר מגבלות לפרוטוקול זה והתאים ואת המצע התואם. בגלל טבעו של דפוסי תאים על גבי משטח, סוגי התאים כי טכניקה זו ניתן ליישם מוגבלי those אשר ניתן לכל פרוטוקול דפוסים כגון אלה תאים מסוגלים לשרוד עם תא מוגבל יותר קשר תא, כמו גם אלה שיכולים לשרוד בריכוזי זריעת תא תחתונים. לדוגמא, אחד יישומים פוטנציאליים הם הדפוסים של תאי שמרים במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) 39. בעוד אנו בחנו רבי מצעי תאים שונים, מצעים אחרים לא יפעלו עם טכניקה מסוימת זה כמו אלה היוצרות ג&#39;ל תלת ממדי. בשלב זה, יש לנו לא בדק אם ג&#39;לים כראוי ליצור ולהישאר על פני השטח של coverslip כוס או צלחת פטרי פלסטיק אחרי דפוסים. טכניקה זו מסוגלת patterning צורות מורכבות שטחים גדולים. עם זאת, זה לא יכול דפוס מערך של צורות מופרדות בודדות ללא microchannels מקשרת. בהעדר microchannels ביניהם, כל צורה בודדת תדרוש כניסה משלה מה שהופכת את הטכניקה מסורבלת. למרות שאנו לא הבחנו בשום-אחידים אי patterning חלבון, חלוקת תאים בדוגמת בתוך microchannel עשויה להיות לא אחיד. הלא אחידות זה עשויה להיות בשל ההתפלגות האקראית של תאי המתלים תא, גיאומטריה וממדים של microchannels, וצמיגות של השעית התא. בעתיד, טכניקה זו עשויה להיות מיושמת על סוגים אחרים של מצעים ותאים. לדוגמה, תלת ממדי ג&#39;ל כגון מטריקס קרום במרתף או פיגומים קולגן פוטנציאלי עלול להיות בדוגמת ויצרו באמצעות PDMS ערוצי microfluidic. על ידי הזרקת הידרוג&#39;ל לתוך המכשיר microfluidic, הידרוג יכול לקחת על עצמו את הצורה של המכשיר microfluidic ולהיות מסוגלים ליצור תבניות מורכבות ללא שימוש מדפסות 3-D או טכנולוגיות אחרות. אלו ייאפשרו ליצירה מהירה של פיגומים מובנים עם כלים זמינים והתקני microfluidic.

בהנדסת רקמות biosensing, את היכולת לשלוט בארגון המרחבי של חלבונים בתאים בסולם מיקרומטר, הפך חשוב יותר ויותר במהלך ארבעת העשורים האחרונים 1, 2, 3. ארגון המרחבי מדויק של חלבונים בתאים אפשר לחוקרים לבחון את יחסי הגומלין בין תאי מצעים המכילים סוגים דומים או שונים של תאים, כדי להדריך את גדילת תאים, וכדי לשתק ביומולקולות עבור הייצור של חיישנים ביולוגיים 4, 5, 6, 7, 8, 9. השיטות הקיימות כיום של חלבונים דפוסים כוללים photopatterning והדפסה microcontact. Photopatterning מנצל חומר רגיש לאור אשר crosslinked בחשיפה ultrאור סגול (UV). אור UV מכוון photomask (מורכב האזורים שקופים עם אזורים כהים כדי למנוע העברת אור UV) גורם crosslinking באזורים ספציפיים אשר לאחר מכן ניתן להשתמש עבור ההתקשרות הבאה של חומרים ביולוגיים או תאים 10, 11. בעוד תכנית זו היא מאוד מדויקת ומאפשרת שליטה מדויקת של הטופוגרפיה של שטח התרבות, היא מוגבלת ביומולקולות UV הרגיש שניתן בדוגמת ידי קרינת UV 12. הדפסת Microcontact היא עוד שיטה פופולרית של דפוסי חלבונים ספציפיים 13, 14. בשיטה זו, siloxane פולי-דימתיל (PDMS) חותמת מטופל עם מגוון רחב של חומרים כימיים שינוי פני השטח בטרם ספוג בתמיסה של המצע וביומולקולרית הנבחר. הוא הקיש בעדינות על coverslip זכוכית או משטח אחר כך &quot;הטבעה&quot; את biomolecule על גבי משטח תרבות. הוwever, ביול מוגבל לסוג החומר שניתן להעביר כמו גם יכולת רטיבות של ביומולקולות אל פני השטח של PDMS להחתים 15. דפוסים ישירים של תאים יכולים להיות יותר קשים ומסתמכים על שיטות מורכבות כגון מצעים להחלפה, שיטות המבוסס סטנסיל, או דפוסים עם מולקולות הדבקת תא ספציפיות 16, 17. שיטות אלו מוגבלים ביכולתם תאי דפוס בשל חוסר מצעי הידבקות תא תואמים, אי התאמה של התהליך לעבוד עם תאים ואילוצים ביולוגיים רגישים, חוסר עקביות לשחזר את הדפוסים, ומורכבות ההליך. לדוגמא, עם מצעים להחלפה, מצעים מותאמים אישית צריכים להיות מתוכננים עבור כל סוג תא, לעבור דבקותם סוגי תאים מסוימים ללא שפלה בחשיפה לאור UV והחום המשמש בתהליך 17, &lt;<html> sup class = &quot;Xref&quot;&gt; 18, 19, 20. שיטות דפוסים סטנסיל מבוססות הם צדדים ביכולתם תאי דפוס; עם זאת, קשה לייצר שבלונות PDMS על עוביים המתאים לשימוש 16, 21. הזרקה ישירה של תאים לתוך ערוצי microfluidic PDMS יש כמה יתרונות כגון: 1) להקל על ייצור של ערוצי microfluidic ו -2) והתאמתו תאי מצעים שונים. עם זאת, הנושא הרווחת ללכוד בועות אוויר במהלך תהליך ההזרקה בשל הידרופוביות של PDMS ללא שימוש ניקוי פלזמה, או בשיטות אחרות כדי להקטין בועות אוויר, מקשה ליצור תאים בדוגמת בעקביות על משטחי זכוכית או פלסטיק 21. עבודה זו מרחיבה נימי micromolding 22, 23,= ילדה &quot;Xref&quot;&gt; 24, 25, 26 ו מדווח שיטה להזריק השעיות חלבון התא לתוך microchannels. השיטה כאן מדגימה את הדפוסים של מצעים ושניהם דפוסים ישירים ועקיפים של סוגי תאים מסוימים. טכניקה זו מתגברת על הידרופוביות הגבוהה של PDMS ומונעת את הנוכחות של בועות במהלך ההזרקה של או מצעים או תאים על ידי ניצול של חדירות הגז של 27 PDMS. מסמך זה מדגים את השימוש בטכניקה עם כמה מצעים שונים סוגי תאים. המאמר מדגיש גם הייצור של תבניות עבור ליתוגרפיה רכה באמצעות photolithography קונבנציונלי וכן פשוטה ושיטת דבק בעלות הנמוכה שימושית משאבי הגדרות מוגבלות 28, 29.

<table><tbody><tr><td>CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools</td><td>Corel Corporation, Canada</td><td>X4 Version 14.0.0.701</td><td>CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device</td></tr><tr><td>Laser Printer HP</td><td>Hewlett Packard, CA</td><td>1739629</td><td>Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique</td></tr><tr><td>Bel-Art Dessicator</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-594-16B</td><td>Used to degass the PDMS mixture</td></tr><tr><td>Adhesive Scotch Tape</td><td>3M Product, MN</td><td>Tape 600</td><td>Used to fabricate adhesive tape Master</td></tr><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning, MI</td><td>1064291</td><td>Casting polymer</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-772-23</td><td>Used to keep the mold to cast with PDMS</td></tr><tr><td>Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)</td><td>Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan</td><td>2976#11</td><td>Used to cut the PDMS</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Ted Pella, CA</td><td>5627-07</td><td>Used to handle the PDMS cast during peeling</td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-546-2</td><td>Used as surface to pattern the Substrate</td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-544-4</td><td>Used as surface to pattern the Substrate</td></tr><tr><td>Rubber Roller</td><td>Dick Blick Art Materials, IL</td><td>40104-1004</td><td>Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles</td></tr><tr><td>Laser Mask Writer</td><td>Heidelberg Instruments, Germany</td><td>DWL66fs</td><td>Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process</td></tr><tr><td>EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)</td><td>EV Group, Germany</td><td>EVG 620T(B)</td><td>Used to expose the photoresist to UV light</td></tr><tr><td>Spin Coater Headway</td><td>Headway Research Inc, TX</td><td>PWM32-PS-CB15PL</td><td>Used to spin coat the photoresist on silicon wafer</td></tr><tr><td>Photoresists SU-8 50</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y131269</td><td>Negative photoresist used for mold fabrication</td></tr><tr><td>SU-8 Devloper</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y020100</td><td>Photoresist developer</td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane</td><td>UCT Specialties, PA</td><td>T2492-KG</td><td>Coat mold to avoid PDMS adhesion</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>190764</td><td>Cleaning Solvent</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>24102</td><td>Sterilization Solvent</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P0899-10MG</td><td>PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>L2020</td><td>Laminin aliquoted into 10 &amp;micro;L aliquots and diluted to 20 &amp;micro;g/&amp;micro;L in PBS prior to use</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>BP1605100</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>C2C12 Myoblast cell lline</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1722</td><td>Used to demonstrate C2C12 patterning</td></tr><tr><td>PC12 Cell Line</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1721</td><td>Used to demonstrate PC12 patterning</td></tr><tr><td>Collagen type 1, rat tail</td><td>BD Biosciences</td><td>40236</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, MA</td><td>11965-084</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Horse Serum, heat inactivated</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>26050-070</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P1951</td><td>To label cells</td></tr><tr><td>Calcein-AM live dead cell Assay kit</td><td>Invitrogen, MA</td><td>L-3224</td><td>Cell viability Assay</td></tr><tr><td>Biopsy Hole Punch</td><td>Ted Pella, CA</td><td>15110-10</td><td>Punched hole in PDMS</td></tr></tbody></table>

a versatile method of patterning proteins and cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

שיטה זו מאפשרת יצירת הדפוסים של חלבוני דפוסים עקיפים של תאים באמצעות ערוצי microfluidic למבוי סתומים עם ממדים קטנים כמו 10 מיקרומטר וציוד זמין כמעט בכל מעבדות ביולוגיות פעם עובש האמן הוא עשה. טכניקה זו יכולה להיות מנוצלת עם ערוצי microfluidic PDMS נוצרו באמצעות photolithography הרך מסורתי, או עם ערוצי microfluidic PDMS שנוצרו עם ייצור סרט דביק (איור 1) 28, 29. אנחנו הוכחנו בעבר את השימוש בהליך זה ב דפוסים עקיפים של תאים עצביים להערכה של הדרכת האקסון קולטני אור 4, 30, ועכשיו הוכחנו את השימוש בו כמה סוגי תאים נוספים ממקורות שונים. נוירונים בקליפת המוח עכברוש עובריים בדוגמת על פולי- D- ליזין (PDL) ומשטחים laminin להפגין adherenc כללידואר לאזורים בדוגמת והצמיחה לאורך PDL ופסי laminin (איור 3 א). שורות תאים myoblast C2C12 גם לדבוק באזור בדוגמת ולהפגין היתוך לתוך myotubes multinucleated (איור 3 ב). כמו כן, אנו צריכים להתאים את הטכניקה הזו עבור דפוסי תא ישירים כפי שראיתי עם פיברובלסטים באיור 4. כפי שדווח בעבר, שיטת דפוסי תא ישירה זה לא הראתה כל השפעה שלילית על תא הישרדות 30. המשתנה להוביל דפוסים ישירים או עקיפים מוצלחים של סוגי תאים כאמורים מפורטים בטבלת 1 ו -2. כך בעתיד, חוקרים עשויים לנצל את הטכניקה הזו לתאי דפוס ולגלות תופעות הקשורות הדפוסים הספציפיים שלהם. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55513/55513fig1.jpg" /> איור 1: ייצור של עובש על ידי רך ליתוגרפיה. משמאל: Photolithographתהליך y. SU-8 הוא ספין מצופה על גבי פרוסות סיליקון, חשוף לקרינת UV, ופתחתי להסיר SU-8 העודף. מימין: תהליך ייצור סקוטש. סקוטש מצורף לשקופית זכוכית נקיה, לחתוך עם סכין מנתחים, וכן קלטת עודפת מוסר בזהירות. יצוק PDMS הוא מפוברק ומכל אחד עובש באמצעות ליתוגרפיה רך. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55513/55513fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55513/55513fig2.jpg" /> איור 2: דוגמה להתקן PDMS עבור דפוסים המצע. (א) PDMS יצוק microfluidic עם כניסה המשמשת דפוסי microfluidic של מצעים. מפרצון היה אגרוף החוצה בקצה אחד של microchannels. (ב) ערוץ Microfluidic כפי שניתן לראות תחת מיקרוסקופ לעומת שלב. ערוצי Microfluidic הם 15 מ&quot;מ אורך, 20 מיקרומטר רחב,ד מופרד 200 מיקרומטר. איור 2 הוא לשכפל באישור מלפרסם IOP. כל הזכויות שמורות 30. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55513/55513fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55513/55513fig3.jpg" /> איור 3: דפוסי תא עקיפים. (א) תהליך דפוסי חלבון סייע אבק. מכשיר PDMS ערוץ microfluidic מצורף בצלחת פטרי, פתרון מצע הוא נטען לתוך מפרצון, ואקום מוחל בקצרה לתא ושוחרר, מכשיר PDMS מוסר, דפוס נשטף, ומוכן לשימוש. (ב) נוירונים בקליפת המוח עכברוש עובריים זורעים על coverslip עם מצע PDL ו laminin בדוגמת. (ג) C2C12 שורות תאי myoblast גדלו על PDL ו laminin בדוגמת. 3 א ו 3C הדמויים הם בתמונות עם permission מלפרסם IOP. כל הזכויות שמורות 30. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55513/55513fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55513/55513fig4.jpg" /> איור 4: דפוסי תא ישירים. (א - ג) פיברובלסטים בדוגמת באמצעות דפוסי תא ישירים. (א) מכשיר ערוץ Microfluidic מפוברק באמצעות ליתוגרפיה דבק. (ב) ערוצי Microfluidic לאחר המילוי עם השעית תא פיברובלסטים באמצעות טכניקת דפוסים סייעו ואקום. (ג) Fibroblasts לאחר הסרת המכשיר microfluidic. (ד) Calcein-AM מכתים של פיברובלסטים אחרי דפוסים microfluidic. (ה) שלב תמונה בעלת ניגודיות של פיברובלסטים אחרי דפוסי microfluidic. (ו - g </strong&gt;) פיברובלסטים מוכתם phalloidin-TRITC (אדום) ו DAPI (כחול). איור 4 הוא לשכפל באישור מלפרסם IOP. כל הזכויות שמורות 30. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55513/55513fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> דפוסי תא עקיפים </td><td> מצע </td><td> תנאי דגירה חלבון </td><td> צפיפות התאים </td><td> Cell הדבקה משך </td></tr><tr><td> PC12 </td><td> קולגן-1 </td><td> 1 שעות ב 50 ° C </td><td> 5 x 10 6 / מ&quot;ל </td><td> 1 ש &#39;ב 37 מעלות צלזיוס </td></tr><tr><td> פיברובלסטים </td><td> קולגן-1 </td><td> 1 שעות ב 50 ° C </td><td> 5 x 10 6 / מ&quot;ל </td><td> 1 ש &#39;ב 37 מעלות צלזיוס </td></tr><tr><html><td> C2C12 </td><td> PDL + Laminin </td><td> 1 ש &#39;ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף PBS, הלילה ב 37 מעלות צלזיוס </td><td> 2 x 10 6 / מ&quot;ל </td><td> 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס </td></tr><tr><td> נוירונים עובריים עכברוש קורטיקלי </td><td> PDL + Laminin </td><td> 1 ש &#39;ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף PBS, הלילה ב 37 מעלות צלזיוס </td><td> 2 x 10 6 / מ&quot;ל </td><td> 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס </td></tr><tr><td> נוירונים רשתית סלמנדרה </td><td> סאל-1 </td><td> הלילה ב 10 ° C </td><td> N / A </td><td> 1 שעות ב 10 ° C </td></tr></tbody></table> טבלת 1: תנאי דפוסי תא עקיפים. רשימה של תנאי דגירה כגון סוג מצע, זמן, טמפרטורה, צפיפות תאים עבור סוגי תא טיפוסיים. חוקרים צריכים לייעל את תנאי הדגירה של מצעי הדגם וסוג התא שלהם. סאל-1 הוא המצע הנוגדן משמש לגדול נוירונים הסלמנדרה רשתית. <table border=</html style=";text-align:right;direction:rtl"><html> &quot;1&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot; FO: keep-עם-next.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <tbody><tr><td> דפוסי תא ישירים </td><td> מצע </td><td> צפיפות התאים </td><td> זמן הידבקות התא </td></tr><tr><td> PC12 </td><td> קולגן-1 </td><td> 6 x 10 6 / מ&quot;ל </td><td> 1 ש &#39;ב 37 מעלות צלזיוס </td></tr><tr><td> פיברובלסטים </td><td> קולגן-1 </td><td> 6 x 10 6 / מ&quot;ל </td><td> 1 ש &#39;ב 37 מעלות צלזיוס </td></tr><tr><td> C2C12 </td><td> PDL + Laminin </td><td> 2 x 10 6 / מ&quot;ל </td><td> 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס </td></tr><tr><td> נוירונים עובריים עכברוש קורטיקלי </td><td> PDL + Laminin </td><td> 2 x 10 6 / מ&quot;ל </td><td> 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס </td></tr><tr><td> נוירונים רשתית סלמנדרה </td><td> סאל-1 </td><td> N / A </td><td> 1 שעות ב 10 ° C </td></tr></tbody></table>= &quot;1&quot;&gt; טבלה 2: תנאי דפוסי תא ישירים. רשימה של תנאי דגירה כגון טמפרטורה, זמן, ואת צפיפות תאים עבור סוגי תא טיפוסיים. חוקרים צריכים לייעל את תנאי הדגירה של סוג תא מודל שלהם.

Watch this Scientific Journal Video about A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells at JoVE.com

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

שיטה צדדית של חלבוני דפוסי תאים

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

a-versatile-method-of-patterning-proteins-and-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.3K Views.  Rutgers University. This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Video: A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

דפוסים של תאים עובריים באמצעות שבב להעיף ביו

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Biology

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

תא דפוסים על photolithographically מוגדר Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; מצעים

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Microcontact הדפסה של חלבונים עבור ביולוגיה של התא

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro when stem cells are spatially confined onto micropatterns, thus setting up experimental models which offer unique opportunities to identify, in vitro, the fundamental principles of biological organisation.
Here we describe our own implementation of the methodology. We adapted a photo-patterning technique to reduce the need for specialized equipment to make it easier to establish the method in a standard cell biology laboratory. We also developed a free, open-source and easy to install image analysis framework in order to precisely measure the preferential positioning of sub-populations of cells within colonies of standard shapes and sizes. This method makes it possible to reveal the existence of patterning events even in seemingly disorganized populations of cells. The technique provides quantitative insights and can be used to decouple influences of the environment (e.g., physical cues or endogenous signaling), on a given patterning process.

The method presented here uses micropatterning together with quantitative imaging to reveal spatial organization within mammalian cultures. The technique is easy to establish in a standard cell biology laboratory and offers a tractable system to study patterning in vitro.

מיפוי הארגון המרחבי של תאי היונקים באמצעות מיקרודפוסים והדמיה כמותית

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Developmental Biology

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

הכנת למימדי מיקרותאי מטריצה מטריצות להערכת Schwann מפרט Cell

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

דפוס פשוט, זול ומודולרי של תאים המשתמשים ב- DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular compartments while circumventing complications arising from natural cell-to-cell variations. To standardize cell shape, cells are either confined in 3D molds or controlled for adhesive geometry through adhesive islands. However, traditional micropatterning techniques based on photolithography and deep UV etching heavily depend on clean rooms or specialized equipment. Here we present an infrared laser assisted micropatterning technique (microphotopatterning) modified from Doyle et al. that can be conveniently set up with commercially available imaging systems. In this protocol, we use a Nikon A1R MP+ imaging system to generate micropatterns with micron precision through an infrared (IR) laser that ablates preset regions on poly-vinyl alcohol coated coverslips. We employ a custom script to enable automated pattern fabrication with high efficiency and accuracy in systems not equipped with a hardware autofocus. We show that this IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol results in defined patterns to which cells attach exclusively and take on the desired shape. Furthermore, data from a large number of cells can be averaged due to the standardization of cell shape. Patterns generated with this protocol, combined with high resolution imaging and quantitative analysis, can be used for relatively high throughput screens to identify molecular players mediating the link between form and function.

The protocol presented here enables automated fabrication of micropatterns that standardizes cell shape to study cytoskeletal structures within mammalian cells. This user-friendly technique can be set up with commercially available imaging systems and does not require specialized equipment inaccessible to standard cell biology laboratories.

שליטה בגיאומטריית התא באמצעות מיקרופטרנינג בסיוע לייזר אינפרא אדום

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...