עבודה זו נתמכה על ידי מענקים R01-HL87290, R01-HL87290-S1 ו-R01 AI082610 מן המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב כדי LJMC.

1. Craniotomy Craniotomy ב 8 ל-10-שבוע בעכברים הישנים יש לבצע מראש כמו 1 שתואר לעיל, פרט לכך בר טיטניום אינו ממוקם בראש של החיה. חלון גולגולתי כרוני הוא יציב ומאפשר בדיקה הכנה של microcirculation pial אפילו חודשים לאחר השתלה. בדרך כלל, אנו מבצעים מחקרים שלנו 2-3 שבועות לאחר ההשתלה את החלון גולגולתי. 2. Intravital מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני שלושה שבועות לאחר craniotomy, טמפרטורת הגוף מסומנת ולאחר מכן העכבר הוא הרדים קלות isoflurane (4% לזירוז,% 1-2 לצורך תחזוקה). הרדמה אור משמש כדי למנוע מתח חיה ואי נוחות במהלך ההליך הניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים ממוקמות אז על מסגרת stereotaxic וראש מאובטח בקפידה באמצעות מוטות אוזן בעמדת מועדים. רמת מותאם באמצעות מנופים על ימין ועל שמאל. טמפרטורת הגוף Core נשמר באמצעות כרית חימום. כי עכברים עם מלריה מוחית לפתח היפותרמיה, את הגדרות הטמפרטורה צריך להיות מותאם עבור כל חיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליק לכסות על חלון גולגולתי הוא ניקה בעדינות עם ספוגית צמר גפן טבולה שמן מינרלי תמונה פנורמית של כלי מתחת לחלון נלקחת בעזרת stereomicroscope לבין מצלמה דיגיטלית (Nikon Coolpix 995, יפן). התמונה מודפסת, המזוהה ומתוארך וישמש כמפה עבור מדידות של קוטר כלי ו כדוריות דם אדומות (RBC) מהירויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העכבר הוא הועבר לאחר מכן בשלב מיקרוסקופ intravital (אישית לייקה-McBain, סן דייגו, קליפורניה). טיפת מים מונחת על החלון גולגולתי מנצל את יצרו גם אקריליק על ידי השיניים, להתמקד מותאם. המדידות מתבצעות באמצעות טבילה 20X (LUMPFL-לאגודה, מספרי הצמצם 0.6, אולימפוס) המטרה מים. הכלים אותם הם בעקבות כך השוואה ישירה לרמות הבסיס שלהם ניתן לבצעו המאפשר סטטיסטיקה יציב יותר עבור אוכלוסיות מדגם קטן. תמונות נלכדים באמצעות אור דיגיטלי נמוך במהירות גבוהה המצלמה (C9300 Hamamatsu-221, יפן), או אור נמוך מצלמה אנלוגית (COHU 4815, בסן דייגו, קליפורניה) קשור לקלטת וידאו (JVC, יפן), חותמת זמן (וידאו MicroImage מערכות, Boyertown, PA) וצג צבע (PELCO, קלוביס, CA). הקלטת מזוהה כראוי לפני תחילת ההקלטה, ואת חותמת הזמן מאפשר זיהוי של האירועים על ידי המתעדים את הזמן שבמהלכו אירועים כאלה היו recoded. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המחאה הראשונה של כלי נעשית על מנת להעריך את איכות של התכשיר ואם הדם זורם בתוך כלי כל. ואז, מבחר של כלי למדוד מורכב וזה צריך לכלול venules ו arterioles של קטרים ​​שונים (בהכנות עכבר pial שלנו, רוב כלי בטווח בין 20 ל 80μm) ומכסים במקומות שונים בשטח חשוף ליד החלון. Arterioles ו venules ניתן להבדיל בקלות על ידי בדיקת כיוון זרימת הדם ההשלכות של כלי השיט (אם זה מפיץ או אוסף דם). במחקרים שלנו, מדידות נעשות 12 כלי שיט. המיקום המדויק של כל נקודה כדי להימדד הוא המבואר בתמונה של vasculature pial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל נקודה, קוטר כלי נמדד באמצעות מכשיר גזירה התמונה (לגזור תמונה, Vista אלקטרוניקה, בסן דייגו, קליפורניה) 2. לאחר נקודה זו מסומנת, תמונה של כלי מיושר במצב אנכי ואת התמונה הוא טעון עד הקצוות בניגוד מיושרים והקריאה מתועדת. ערך זה יכול להיתרגם מיקרומטר ידי כיול הקודם עבור כל הגדלה מסוימת באמצעות כיול reticle שלב מיקרומטר (אדמונד Optics Inc, ברינגטון, NJ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום כל שנרשמו במהלך 30 שניות לפחות למעקב כדורית אדומה. במשך המעקב, דגימת דם נאסף ו אריתרוציטים מסומנים fluorescently עם carbocyanine לצבוע דיל (בדיקות מולקולריות, Carlsbad, CA) ואת חדורים דרך וריד הזנב להשיג ריכוז vivo של 0.4-0.5% ~ 3. אצל בעלי חיים נגועים Plasmodium berghei אנקה (PBA) המבטאים את חלבון הפלואורסצנט הירוק (PBA-GFP, תרומה מן המחקר מלריה מגיב הפניה מרכז MR4, Manassas, VA, שהופקד על ידי CJ Janse ו AP ווטרס), לא עירוי של תווית התא הוא הכרחי. התמונות וידאו נרשמות 150 מסגרות לשנייה. שיעור זה מוגדר להשיג 05:59 תמונות של תא על מסגרת וידאו אחד לקביעת מהירויות של עד 8 מ&quot;מ / s. תמונות וידאו דיגיטלית עם מחשב אישי באמצעות תוכנת Adobe Premier 4.0, ו - xy נתונים לתאם עבור כל תמונה התא מתקבלים באמצעות SigmaScan Pro 4.0 התוכנה (SPSS שיקגו, אילינוי) 4. עמדות Cell נקבעים באופן ידני ולא על ידי ניתוח התמונה, בהתחשב בכך את עינו של הצופה מיומן הוצגה לתת הערכה טובה של מיקום מרכז התא, אשרח בכלל מתאים למיקום של הקרינה המרבית נצפתה עבור אוריינטציות תא ביותר. קביעות מרובות של המיקום ואת המהירות מיוצרים עבור כל תא ממוצעים להשיג ממוצע מהירות RBC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המדידות RBC מהירות מבוצעות מקוון, זמן תצפית סך כל עכבר אינו עולה על 10-15 דקות מזעור ההשפעות cardiodepressive של הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קוטר כלי מדידות מהירות RBC זמינים, החישוב של זרימת הדם בכלי זה יכול להתבצע באמצעות הנוסחה: Q = V x π (D / 2) 2, שם ש = זרימת הדם, V = מהירות RBC ו-D = קוטר כלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהלים אלה ניתן לחזור לאורך זמן. לדוגמה, במודל עכבר של קדחת המוח, אנו מבצעים מדידות יומי החל ביום 4 של זיהום. הערכים המתקבלים כל יום במשך כל עכבר מנורמל הן ביחס ליום 0 (טרום זיהום), אשר נחשב 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף קוטר כלי הדם וזרימת מדידות, הערכות נוספות יכול להתבצע, למשל הערכה משופרת של זלוף ועל ניתוח של גלגול ליקוציט ו / או טסיות דם דבקות בכלי pial. מדידות אלה מבוצעות בעזרת סמנים ניאון שכותרתו. במקרה של מלריה, אנו יכולים גם לזהות במחזור או טפילים חסיד באמצעות שימוש זן PBA המבטא GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להערכת זלוף אנו משתמשים בפתרון של FITC שכותרתו אלבומין (Sigma, סנט לואיס, מיזורי 50μg/mouse), וכן לכמת דבקות ליקוציט לכלי pial אנו משתמשים נוגדנים כנגד סמן הפאן ליקוציט CD45 שכותרתו עם טקסס אדום (TxR) ( Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה 4μg/mouse). לשם כך, 25μL של אלבומין-FITC (2mg/mL) ו 20μL של נוגדנים נגד CD45-PE (200μg/mL) מעורבבים והזריקו ברוח טרום חימם את הזנב. עכבר אז יכול להיות צילמו מיד, אולם אם מדידות זליגה ייקח אלבומין-FITC מותר להסתובב במשך 15 דקות. פלואורסצנטי ירוק (518nm) הנפלטת אלבומין-FITC ו-GFP (PBA-GFP pRBC) הוא שנתפסו באמצעות אלפא ו Vivid: XF100-2 (אומגה אופטי, Brattleboro, VT), אנטי-CD45 TxR פלואורסצנטי (615nm) הוא יצא ו שנתפסו עם תקן Vivid: XF42. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניאון שכותרתו אלבומין מאפשרת הדמיה משופרת של רשת כלי הדם, כולל כלי חודר, והיא שימושית במיוחד במצבי מחלה כמו מלריה מוחית כדי לבדוק את כלי הלא perfused או מתחת perfused. זה יכול לשמש גם כדי למדוד את זליגת הדם 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניאון שכותרתו אנטי CD45 נוגדנים לעשות את זה קל לזהות ולכמת מתגלגל הידבקות לויקוציטים וכן כלי pial. כדי למנוע הטיה כימות, אנו לכמת מתגלגלת הידבקות באותם המקומות שהוגדרו מראש כדי למדוד את זרימת הדם. כימות של הידבקות לויקוציטים נעשית על ידי ספירת לויקוציטים באורך 100μm-כלי. רולינג היא לכמת ידי ספירת לויקוציטים נע במהירות איטית יותר באופן משמעותי את מהירות דם באורך 100μm זאת, במהלך 30 שניות. </li></ol> 3. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. (שלב 2.6) תמונות של רשת כלי הדם עכבר pial נגיש דרך החלון גולגולתי. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. (שלבים 3.1-3.5) סכמטי התצוגה של הגדרת עבור מיקרוסקופיה intravital של microcirculation העכבר pial. 1: מיקרוסקופ intravital; 2: 20X טבילה במים אובייקטיבי; 3: מקור אור, 4a: דיגיטלי נמוך לאור מהירות גבוהה המצלמה; 4b: מצלמה אנלוגית: 5: עכבר במסגרת stereotaxic; 6: צג המחשב; 7: אנלוגי שירר צג מראה כיצד הגז תמונה (חץ) נעשה כדי למדוד קוטר כלי הדם. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. (שלב 3.6-3.8) כלי הדם כדוריות דם אדומות מהירות מדידות על ידי מעקב התא גבוה הקלטות מהירות הקרינה וידאו. תמונות ל-F הם תמונות ברצף של כלי one pial, מראה RBC נע אחד חוצה את התחום בשדה מיקרוסקופי על ידי המצלמה. קביעה ידנית של מסגרת על ידי עמדות מסגרת של 15 תאים או יותר חוצה את השדה, עם המרחק מראש מכויל שלה, המאפשר חישוב מהירות RBC אומר בכלי זה בעזרת גיליון אלקטרוני של Excel. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. (שלב 3.9) נתוני הניסוי נציג מראה את השינויים בזרימת הדם pial לאורך זמן Plasmodium berghei אנקה (PBA) עכברים נגועים (n = 5) ו בעכברים השליטה נגוע (n = 5). בעוד עכברים לשלוט על זרימת הדם pial יציב יחסית לאורך זמן, PBA נגועים עכברים להראות ירידה ניכרת בזרימת הדםבזמן התפתחות מלריה מוחית (יום 6). הנתונים הם ממוצע ± SEM. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. (שלב 4.3) מספר רב של לויקוציטים חסיד לכלי pial של עכבר נגוע Plasmodium berghei אנקה, כפי שעולה מכתים עם אנטי-CD45 טקסס נוגדנים אדום ניאון.

<ol>
	<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li><li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting.">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li><li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile.">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li><li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules.">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li><li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery.">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li><li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction,+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine.">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המתוארת כאן מיקרוסקופיה intravital מספק כלי ייחודי ורב עוצמה להתבוננות מפורטת של microcirculation pial בתוך העכבר. זה מאפשר בידודם arterioles הפרט venules ומדידת שינויים של מספר פרמטרים כגון קוטר כלי, מהירויות RBC, זרימת הדם, היצמדות וגלגול של לויקוציטים, טסיות הדם וגורמים אחרים, דליפת הדם, pH רקמות pO2 רבות אפשריות אחרות יישומים. בתגובה וסקולרית vivo ניתן להעריך באופן מיידי על התערבויות הממשל כגון תרופות, או במהלך תהליכים פתולוגיים. יתר על כן, התנהגות microcirculatory ניתן בעקבות דינמי לאורך זמן. אנו השתמשו בטכנולוגיה זו כדי לחקור את השינויים microcirculatory pial במהלך קדחת המוח הנגרמת על ידי פ berghei אנקה בעכבר, ואת הראו כי תסמונת נוירולוגית במודל זה קשור בתפקוד microcirculatory מאופיין על ידי זרימת דם מופחתת vasoconstriction מוחין, זלוף לקויי התמוטטות כלי הדם ובסופו של דבר 6.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>FDG9623</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbocyanine dye Dil </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>D306</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin-FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A9771</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-CD45-TxR Ab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>MCD4517</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P. berghei ANKA-GFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MR4</td>
<td>MRA-865</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window

מודל זה הניסוי תוכנן לאמוד את microcirculation עכבר pial במהלך hemodynamic, אקוטי וכרוני פיזיולוגיים pathophysiological, התנאים דלקתיות מטבולית, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב vivo. חלון סגור גולגולתי ממוקמת מעל קליפת parieto-העורפית השמאלית של העכברים. Microcirculation מקומי נרשם בזמן אמת דרך החלון באמצעות EPI ו תאורה פלואורסצנטי, מדידות של קטרים ​​כלי שיט תא הדם האדומים (RBC) מהירויות מבוצעות. מהירות RBC נמדד בזמן אמת צולבות מתאם ו / או אריתרוציטים ניאון שכותרתו. דבקות ליקוציט ואת טסיות לכלי pial והערכה של זלוף ו דליפה של כלי הדם נעשים בעזרת סמנים פלואורסצנציה שכותרתו כגון אלבומין-FITC נוגדנים אנטי-CD45 TxR. Microcirculation ניתן וידאו מוקלט שוב ​​ושוב על פני כמה ימים. השתמשנו בפעם הראשונה את החלון קרוב המוח מיקרוסקופיה intravital ללמוד את microcirculation pial לעקוב אחרי שינויים דינמיים במהלך זיהום Plasmodium אנקה berghei בעכברים מראים ביטוי של CM קשורה בתפקוד microcirculatory מאופיין vasoconstriction, הירידה העמוקה בדם זרימת הדם ובסופו של דבר לקרוס.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window at JoVE.com

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.3K Views.  University of California, San Diego. מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

Video: Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphoton מיקרוסקופי של מוח העכבר הותר הבעת YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

אימון הכחדה במהלך חלון Reconsolidation מונע שחזור של פחד

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

ניסויי נוירו-רובוטית לולאה סגורה כדי לבדוק את מאפיינים חישובית של רשתות עצבי

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

שיטה לגרום סגור ראש הפגיעה מוחית טראומטית ב<em&gt; דרוזופילה</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated thinning of the skull. Cranial window surgery is typically performed with a high speed rotary drill, and many investigators find it challenging to prevent the drill from damaging the delicate dura and blood vessels. Extensive training and practice is required to remove the bone without damage to underlying tissue and thus cranial window surgery can be difficult, time consuming, and produce tissue damage. Piezoelectric surgery, which is extensively used for maxillofacial and dental surgery, utilizes ultrasonic vibrations to remove bone without damaging soft tissues. We have developed a method applying piezoelectric surgery to improve cranial window surgery in mice in preparation for multiphoton imaging. Comparisons within our lab find that the method requires less surgery time and has a lower average rate of complications due to dural bleeding than cranial window surgery with a rotary drill.

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezoelectric surgery has led to improvements in human maxillofacial and dental surgery. We have developed a protocol to optimize piezoelectric surgery for cranial window surgery in mice.

Piezo גבוהה דיוק Osteal הסרה כירורגית (פאזור): שיטה לניתוח חלון הגולגולת משופרת בעכברים

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

כריתת למינציה ואת חוט השדרה חלון השרשה בעכבר

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...