אנו מודים שאו-Ming Lu ו האריס א גלברד לשימוש משאבה vibratome peristaltic ו, כמו גם קארן ל בנטלי וגייל שניידר במתקן Core מיקרוסקופ אלקטרונים מחקר של אוניברסיטת רוצ&#39;סטר המרכז הרפואי לקבלת סיוע טכני. עבודה זו מומנה על ידי מענקים מ-NIH (EY019277), וייטהול Foundation, קרן Wellcome בורוז, ואת פ אלפרד סלואן קרן אל AKM. M.-È.T. ממומנת על ידי דה Fonds en la משוכלל ונדיר סנטה קוויבק (FRSQ) בפרס אימון דוקטורט.

1. בעלי חיים זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלפני זלוף, להכין: - 2 ליטר של חיץ פוספט (PB, 100 מ&quot;מ, pH 7.4) ו - 1 ליטר של סודיום פוספט בופר סליין (PBS; 0.9% NaCl ב 50 מ&quot;מ PB, pH 7.4) במים מזוקקים כפול. חנות PBS ו 1 ליטר של PB ב 4 ° C. אלה ישמשו זלוף והטבעה מראש immunocytochemistry. - 1 ליטר של paraformaldehyde 4.0% (PFA, pH 7.4) מקבע פתרון, אשר יאפשר זלוף של 6 עכברים. לשם כך, לחמם 1 ליטר מתחת למכסה המנוע של PB קטר. שקול 40 גרם של גרגירי paraformaldehyde (PFA) ויוצקים לתוך הפתרון PB כאשר הוא מגיע 60 ° C. כאשר הפתרון הוא ברור, עם PFA נמס לגמרי, להתקרר לטמפרטורת החדר (RT) ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום זלוף, להכין 500 מ&quot;ל של תמיסת acrolein 3.5% ב PB מתחת למכסה המנוע קטר. ואז, המסנן acrolein 3.5% ו -4.0% באמצעות פתרונות PFA נייר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הרדמה העכבר, להזריק נתרן pentobarbital (80 מ&quot;ג / ק&quot;ג) תוך הצפק עם מד 27 ½ &quot;מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך זלוף, 50 מ&quot;ל של PBS, 75 מ&quot;ל של acrolein, ו -150 מ&quot;ל של PFA יהיה ברצף לעבור למחזור העכבר. כדי להגדיר את המשאבה peristaltic, למלא את צינורות עם PBS ולתקן מד 23 ¾ &quot;מחט פרפר בקצה אחד. לטבול את הקצה השני של הצינור לתוך הפתרון זלוף (PBS, acrolein או PFA). קבע את המהירות של peristaltic משאבת 20-25 mL / min עבור עכברים צעירים ומבוגרים. ברחבי זלוף, בזהירות למנוע בועות אוויר להרכיב בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן עד העכבר מורדם כבר לא מגיב לגירויים מכאיבים, כגון צביטה זנב, לפני שתמשיך. הנח את החיה מגש לנתיחה ולתקן את הכפות באמצעות קלטת. עם פינצטה ומספריים, לפתוח את עור החזה כדי לחשוף את הלב. כדי למזער איסכמיה, זלוף צריך להיות נכתבו במהירות. גזור לפתוח את אטריום ימין עם מספריים קטנים להתחיל את המשאבה peristaltic. בעוד מחזיק את הלב עם פינצטה, הכנס את המחט לתוך פרפר לשיא של החדר השמאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת שינוי הפתרון, להפסיק את המשאבה peristaltic, להעביר את צינורות מפתרון אחד למשנהו, ולהפעיל מחדש את המשאבה מיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר 150 מ&quot;ל של PFA עבר, להפסיק את המשאבה peristaltic. בעזרת מספריים קטנים, חותכים את הראש, לפתוח את העור, לשבור את הגולגולת בין העיניים. בעזרת פינצטה קטנה, שבב בזהירות את חתיכות קטנות של הגולגולת עד שהמוח ניתן להסיר בקלות. פוסט לתקן את המוח 2 שעות 4 מעלות צלזיוס PFA. לשטוף 3 פעמים 10 דקות PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לחתוך את המוח רוחבי (50 חלקים עבים מיקרומטר) בקרח מקורר PBS באמצעות vibratome. בעזרת מברשת עדינה, העברת חלקים נבחרים immunocytochemistry לתוך בקבוקון זכוכית המכיל PBS. אחסן את החלקים הנותרים ב -20 מעלות צלזיוס cryoprotectant (30% אתילן גליקול גליצרול ו 30% ב-PBS) עד מספר שנים. </li></ol> 2. טרום הטבעה immunocytochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור immunocytochemistry, קטעים מעובדים בחופשיות צף צלוחיות זכוכית. לאורך כל ההליך, צריך להיזהר לתת חלקים להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להסיר את PBS בעזרת פיפטה העברה מיד להחליף עם פתרון חדש של borohydride נתרן 0.1% ב PBS במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים עם PBS 3 פעמים 10 דקות, להסיר את כל הבועות, ו דגירה עבור 2 שעות RT בפתרון חסימת PBS המכיל 0.5% לטין בסרום נורמלי 5% של החיה שבה נוגדנים משני שנוצר (נסיוב עז נורמלית הדוגמה הנוכחית immunostaining-Iba1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 48 שעות עם נוגדן ראשוני חסימת פתרון. עבור immunostaining-Iba1, להשתמש אנטי Iba1 ארנבת הנוגדן (1:1000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים עם PBS 3 פעמים 10 דקות דגירה של נוגדנים משני מצומדות כדי ביוטין (1:1000) בחסימת פתרון 2 שעות RT. עבור immunostaining-Iba1, השתמש נגד ארנב IgGs עז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים עם PBS 3 פעמים 10 דקות דגירה של peroxidase-streptavidin חזרת (1:1000) בחסימת פתרון לשעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים עם PBS 10 דקות עם טריס / HCl שנאגרו מלוחים (TBS, 50 מ&quot;מ, ה-pH 7.4) 2 פעמים 10 דקות. כדי לחשוף את התיוג, דגירה קטעים עם DAB 0.05% ו 0.01% חמצן ב TBS (פתרון מוכן טרי). כאשר מכתים הוא חום כהה (ראה דוגמה באיור 1), לעצור את התגובה על ידי שטיפה ב TBS. בכל מקרה, בסוף התגובה לאחר למקסימום של 5 דקות. לשטוף חלקים עם כפות 10 דקות עם PB 2 פעמים 10 דקות. </li></ol> 3. עיבוד עבור במיקרוסקופ אלקטרונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקים לתוך PB בצלחת תרבות multiwell בעזרת מברשת בסדר. הכן 1% tetroxide אוסמיום פתרון PB מתחת למכסה המנוע רותח. הסר PB מבארות הצלחת תרבות<html> להפיץ את הסעיפים שטוח עם מברשת עדינה. סעיפים לטבול מיד אוסמיום 1% למשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקים לתוך צלוחיות זכוכית, לשטוף עם PB 3 פעמים 10 דקות, מייבשים דרך התעמקות 2 דקות לתוך עולה ריכוזי אתנול: 2 פעמים 35%, 1 בכל פעם של 50%, 70%, 80%, 90% ו 95 %, 3 פעמים 100%, ואחריו 3 פעמים פרופילן אוקסיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את שרף Durcupan, לשלב 20 גרם של רכיב, 20 גרם של רכיב ב &#39;, 0.6 גרם של רכיב C, ו - 0.4 גרם של מרכיב D לכוס חד פעמיות, ומערבבים היטב עד שהצבע הופך אחיד, ויוצקים לתוך אלומיניום לשקול צלחת. במידת הצורך, אבני שרף יכול להיות מוכן על ידי שפיכת שרף לתוך הטבעת תבניות תנור ריפוי ב 55 מעלות צלזיוס במשך 48-72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מברשת בסדר לשטוף עם פרופילן אוקסיד, להסיר קטעים מתוך תחמוצת פרופילן לטבול לתוך שרף Durcupan הספגה עבור לילה בבית RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשים האלומיניום לשקול מאכל לתוך תנור 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לרכך את שרף. בעזרת מברשת שטפה עם פרופילן אוקסיד, מעיל סרט הטבעה ACLAR בשכבה דקה של שרף, שכב הסעיפים, מכסים עם סרט אחר הטבעה, ובאופן שווה להפיץ משקולות קלות (כ -2 גרם, למשל את פקקי פלסטיק של צלוחיות זכוכית) על גבי לעזור שרף מתפשטת. עבור פילמור שרף, דגירה בתנור למשך 48-72 שעות (ב 55 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פילמור, להסיר את המשקולות אור הסרט הטבעה על החלק העליון של הסעיפים. תחת מיקרוסקופ המשקפת, בחר תחומי עניין מרובע (כ 2x2 מ&quot;מ) ובלו אותם בקפידה מתוך הסרט באמצעות סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק תחומי עניין בקצה גושי שרף באמצעות דבק מגע מרפא את התנור ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקראת חתך, חתוך את גוש שרף בצורת טרפז שווה שוקיים עם סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ultramicrotome וסכין זכוכית, להסיר את דבק שרף על פני השטח של הרקמה. ממלאים את הסירה של סכין זכוכית עם מים מזוקקים כפול לחתוך כמה חצי דקה חלקים (0.5-1 מיקרומטר עבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקים לשקופית SuperFrost עם לולאה מושלמת. יבש את החלקים על ידי הצבת את השקופית על צלחת חימום על 80 מעלות צלזיוס למשך דקה 1. מכסים עם כמה טיפות של 0.1% toluidine כחול (borate 2 גרם נתרן ו -0.2 גרם toluidine כחול במים מזוקקים 200 מ&quot;ל כפול) כתם במשך דקה 1. יש לשטוף את הכתם עם עודף מים מזוקקים כפול. בחינת הסעיפים עם מיקרוסקופ אור יאפשר להבחין בין רקמה צבעונית של שרף (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורות חיים חיתוך עד הגבול בין רקמות שרף מגיע באמצע הקטעים. שים לב כי ההליך הבא דורש הכשרה. החלף את הסכין בכוס עם סכין יהלום ולמלא את הסירה במים מזוקקים כפול. גזור כסף כסף זהב סעיפים Ultrathin (60-80 ננומטר עבה) בזהירות לאסוף אותם על רשת רשתות נחושת באמצעות פינצטה הפוכה בסדר. יבש את רשתות על נייר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשפר לעומת זאת, בסעיפים Ultrathin יכול להיות מוכתם להוביל ציטראט (citrate 0.03 גרם עופרת 0.1 מ&quot;ל נתרן הידרוקסיד 10N במים מזוקקים 10 מ&quot;ל כפול 1). בעזרת פינצטה הפוכה בסדר, העברת רשת ירידה של ציטרט להוביל במשך 2 דקות. הסר את הרשת בעדינות ולשטוף ב 3 אמבטיות רצופים של מים מזוקקים כפול. לבסוף, לייבש את רשתות על נייר לסנן ולאחסן אותם בתוך קופסת רשת עד בדיקה מיקרוסקופית אלקטרונים (איורים 3-6). </li></ol> 4. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. Iba1 מוכתם בסעיף ברמה המיקרוסקופית אור. הפצה הסלולר של Iba1 מוגבל microglia, אשר מציג את הספציפיות של immunostaining. בר סולם = 100 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="איור 2" /> 2. איור Toluidine כחול מוכתם חצי דקה בסעיף ברמה המיקרוסקופית אור. הערה הגבול בין רקמות שרף שבו immunostaining יופיע אינטנסיבי ביותר מיקרוסקופ אלקטרונים. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="איור 3" /> 3. איור Ultrathin סעיף מראה Iba1-immunopositive perikaryon microglial ותהליכים ברמה מיקרוסקופית אלקטרונים. אלמנטים מבניים Iba1 חיובי מוכרים על ידי המשקע אימונו-DAB אלקטרונים צפופה שלהם. בר סולם = 2 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="איור 4" /> 4. איור Ultrathin סעיף הצגת Iba1-immunopositive תהליכים microglial גדלים וצורות שונים ברמה מיקרוסקופית אלקטרונים. בר סולם = 2 מיקרומטר. ה 5 &quot;/&gt; איור 5. סעיף Ultrathin מראה בהגדלה גבוהה תהליך Iba1 חיובי microglial מ איור 4, המאפשר זיהוי של אברונים תאיים שלה. בר סולם = 1 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6. Ultrathin סעיף חושף בהגדלה גבוהה יותר את היחסים בין ultrastructural Iba1 תהליך חיובי microglial אלמנטים הסמוך neuropil כולל סינפסות. בר סולם = 1μm.

<ol>
	<li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy.">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li><li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain.">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus.">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus.">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain.">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain.">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כאן יש לנו תיאר פרוטוקול להכנת רקמת המוח העכבר עבור מיקרוסקופיה immunoelectron המספק פשרה מצוינת בין שימור ultrastructural אופטימלית זיהוי immunocytochemical, כאשר הנהלים מבוצעים בקפדנות. בשילוב עם TEM, שיטה זו מאפשרת להבחין בין אלמנטים הסלולר עם מאפיינים בולטים כמה קריטריונים זיהוי. בפרט, מכתים אימונו-DAB של Iba1 מאפשר לזהות perikarya microglial ותהליכים, בתוך neuropil, כמו גם לנתח מורפולוגיה שלהם, אברונים תאיים, ומערכות יחסים ultrastructural עם אלמנטים סלולריים אחרים (איורים 3-6). בנוסף, הפרוטוקול הזה מאפשר לנתח את המיקומים ultrastructural של חלבונים מסיסים או קרום כרוכים אלמנטים גליה או נוירונים, כמו גם הקשר שלהם עם אברונים תאיים. ואכן, בפרוטוקול זה עם נוגדנים ספציפיים, יש לנו חשף בעבר את לוקליזציה ultrastructural של 5-5-HT1A ו HT1B קולטנים serotonergic ב perikarya, דנדריטים עצביים, הקוצים הדנדריטים, האקסונים unmyelinated, ותאי האנדותל של מבוגר עכברוש raphe dorsalis גרעין, substantia nigra, pallidus גלובוס, ו 2 בהיפוקמפוס. הראינו גם לוקליזציה ultrastructural של EphA4 ו EphB2 קולטנים טירוזין קינאז ב clathrin מצופה שלפוחית ​​אלמנטים astrocytic ו עצביים שונים העכבר ההיפוקמפוס חולדה קליפת המוח, במהלך ההתפתחות לאחר הלידה והבגרות 3,4,5,6. לבסוף, פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם טרום הטבעה immunogold לנתח את יחסי הגומלין בין שני חלבונים ultrastructural שכותרתו בו זמנית, למשל שיתוף לוקליזציה של טרנספורטר Vglut1 glutamatergic ו EphA4 קולטן מסופי האקסון של עכבר בוגר קליפת המוח 6. לכן, הטכניקה הזו יכול להיות מיושם בהצלחה, לבד או בשילוב עם תיוג immunogold, לניתוח ultrastructural של חלבונים שונים בתוך אזורים שונים ועל סוגי תאים של מערכת העצבים המרכזית, לאורך כל החיים לאחר הלידה, בריאות ומחלות.

* תמיד צריך לעבוד מתחת למכסה המנוע קטר ללבוש כפפות בעת טיפול nitrile acrolein, paraformaldehyde ו אוסמיום ויש גם להשליך את הפסולת שלהם כראוי.

preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy

הילוכים במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) הוא מאוד שימושי עבור חזותי microglial, תאים subcellular oligodendrocytic, astrocytic, ואת עצבי (דנדריט, עמוד השדרה דנדריטים, האקסון, האקסון לטרמינל, perikaryon), כמו גם אברונים תאיים שלהם cytoskeleton, במערכת העצבים המרכזית ברזולוציה מרחבית גבוהה. בשילוב עם TEM, טרום הטבעה immunocytochemistry מאפשר את האפליה של אלמנטים הסלולר עם מאפיינים בולטים כמה קריטריונים הזדהות (למשל, microglial perikarya ותהליכים, כאשר באמצעות נוגדן כנגד סמן microglia ספציפית Iba1 (סידן מיונן מחייב מתאם המולקולה 1, כפי שהוצגו כאן)), זיהוי תוכן הנוירוטרנסמיטר של אלמנטים הסלולרי (למשל, serotonergic) ולוקליזציה ultrastructural שלהם של חלבונים מסיסים או קרום הנכנס (למשל, 5 ו HT1A EphA4 קולטנים). כאן אנו מתארים פרוטוקול זלוף transcardiac של עכברים עם acrolein מקבע, הסרת חתך של המוח, כמו גם אימונו-diaminobenzidine (DAB) מכתים, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של בסעיפים המוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן לבדיקה עם TEM. כאשר מבוצע בקפידה, טכניקה זו מהווה פשרה מצוינת בין שימור ultrastructural אופטימלית זיהוי immunocytochemical.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy at JoVE.com

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

אנו מתארים פרוטוקול עבור זלוף transcardiac של הסרת, עכברים חתך של המוח, כמו גם מכתים אימונו, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של חלקים במוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

preparation-of-mouse-brain-tissue-for-immunoelectron-microscopy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.8K Views.  University of Rochester. אנו מתארים פרוטוקול עבור זלוף transcardiac של הסרת, עכברים חתך של המוח, כמו גם מכתים אימונו, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של חלקים במוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

Video: Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphoton מיקרוסקופי של מוח העכבר הותר הבעת YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

מיקרון בקנה מידת רזולוציה אופטית טומוגרפיה של מוח עכבר השלם עם מיקרוסקופית גיליון Confocal אור

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

הכנת התינוק היילוד רקמת המוח עבור ניתוח בדיקת מבנית באולטרסאונד של הפצת שלפוחית סינפטית במסופי העצבים

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה טורית של פרצוף בלוק (SBEM) לחקר קוצים דנדריטים

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...