Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri LJMC için hibe R01-HL87290, R01-HL87290-S1 ve R01-AI082610 tarafından da desteklenmiştir.

1. Kraniotomi 8-10-haftalık farelerde kraniotomi titanyum çubuk baş hayvanın yer almamış olması dışında, daha önce açıklanan 1 olarak önceden yapılması gerekir. Kronik kafa penceresi pial mikrosirkülasyon hatta aylar implante edildikten sonra istikrarlı bir hazırlık izin muayene. Genellikle 2-3 hafta kafatası pencere implantasyon sonrası çalışmaları yapmak. 2. Intravital mikroskopi <ol><li> İki-üç hafta sonra kraniotomi, vücut ısısı kontrol edilmeli ve sonra fare ile hafifçe anestezi izofluran (indüksiyon için% 4, bakım için% 1-2). Hafif anestezi deneysel prosedür sırasında hayvan stres ve rahatsızlık önlemek için kullanılır. </li><li> Hayvanlar daha sonra stereotaksik bir çerçeve ve dikkatle kulak bar kullanarak güvenli bir şekilde baş yüzükoyun pozisyonda yerleştirilir. Düzeyi, sağ ve sol kolları kullanılarak ayarlanır. Çekirdek vücut ısısını bir ısıtma yastığı kullanılarak korunur. Serebral sıtma ile fareler hipotermi geliştirmek için, sıcaklık ayarları her bir hayvan için ayarlanması gerekir. </li><li> Kafa pencerede kapak kayma, mineral yağ ve pencerenin altında gemiler panoramik bir resim, bir stereomikroskopta ve bir dijital fotoğraf makinesi (Nikon Coolpix 995, Japonya) yardımı ile alınır ile ıslatılmış bir pamuk çubukla hafifçe temizlenir. Resim, basılı, tespit ve tarih ve damar çapı ve kırmızı kan hücre (RBC) hızlarının ölçümleri için bir harita olarak kullanılır. </li><li> Fare, sonra bir intravital mikroskop aşaması (Leica-McBain, San Diego, CA özel) aktarılır. Bir damla su, diş akrilik oluşturduğu yararlanarak kafatası pencere üzerine yerleştirilir, odak ayarlanır. Ölçümler bir 20X (LUMPFL-WIR, sayısal diyafram 0.6 Olympus) su altında kalacak amacı ile yapılmaktadır. Aynı damarların bazal düzeylere doğrudan karşılaştırmalar, küçük bir örnek popülasyonları için daha sağlam istatistikler için izin olabilir takip edilmektedir. Görüntüler bir dijital düşük ışık koşullarında yüksek hızlı kamera (Hamamatsu C9300-221, Japonya), veya bir VCR kaset bağlı düşük ışık analog kamera (Cohu 4815, San Diego, CA) (JVC, Japonya), damgalı zaman (MicroImage Video kullanılarak yakalanır Sistemleri, Boyertown, PA) ve renkli monitör (PELCO, Clovis, CA). Bant kayıt başlamadan önce doğru tespit ve zaman damgası, bu tür olaylar recoded olduğu zaman diliminde belgeleyen olayların belirlenmesini sağlar. </li><li> Gemilerin ilk onay kan damarlarında akan ise hazırlık kalitesini değerlendirmek için yapılan ve. Sonra, ölçülecek olan gemilerin seçimi yapılır ve değişik çaplarda venüller ve arterioller (fare pial hazırlıkları, en gemiler 20 ve 80μm arasında değişmektedir) ve pencere tarafından maruz kalan alan içinde farklı yerlerde kapsamalıdır. Arteriol ve venüller geminin etkileri kan akışı (dağıtan veya kan toplar olmadığını) yönünü kontrol ederek kolayca ayırt edilebilirler. Çalışmalarda, ölçümleri 12 damarlarında yapılır. Ölçülecek her noktanın tam yerini pial damarsal resim açıklamalı. </li><li> Her nokta için, bir görüntü kesme cihazı (Resim Kesme, Vista Electronics, San Diego, CA) 2 damar çapı ile ölçülür. Nokta seçildikten sonra, geminin görüntü dikey konumda uyumlu ve karşı aşırı hizalanır ve okuma belgelenmiştir kadar görüntü makaslanmış. Bu değer, Reticle Kalibrasyon Stage Mikrometre (Edmund Optik A.Ş., Barrington, NJ) kullanarak her bir spesifik büyütme önceki kalibrasyon mikrometre tercüme edilebilir. </li><li> Her nokta için en az 30 saniye boyunca eritrosit izleme kaydedilir. Izleme için kan örneği toplanır ve eritrositler floresan ile etiketlenmiş boya Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) ve kuyruk ven yoluyla aşılanan bir ~ 0,4-0,5% 3 in vivo konsantrasyonu elde etmek için carbocyanine. , Etiketli hiçbir infüzyon; Plasmodium berghei ANKA (PBA) yeşil flüoresan protein (CJ Janse ve AP Waters tarafından yatırılan PBA-GFP, Sıtma Araştırma ve Referans Reaktifi Kaynak Merkezi MR4, Manassas, VA bağış) ifade ile enfekte hayvanların hücre gerekli. Saniyede 150 kare hızında video görüntüleri kaydedilir. Bu oran 8 mm / sn &#39;ye kadar hızlarının belirlenmesi için bir video çerçeve üzerinde bir hücre 05:59 görüntüler elde etmek için Video görüntüleri Adobe Premier 4.0 yazılımı kullanarak bir kişisel bilgisayar ile sayısallaştırılmış ve her hücre görüntü için xy koordinat verileri SigmaScan Pro 4.0 yazılımı (SPSS, Chicago, IL) 4 kullanılarak elde edilir . Hücre pozisyonları göz eğitimli bir gözlemci, iyi bir tahmin, bir hücrenin merkezinde, yerini vermek gösterildi verilen elle yerine, görüntü analiz yöntemi ile belirlenirh genel olarak çoğu hücre yönelimleri için gözlenen maksimum floresans konuma karşılık gelir. Birden fazla pozisyon ve hız tespitler her hücre için yapılan ve ortalama eritrosit hızı elde etmek için ortalama. </li><li> RBC hız ölçümleri çevrimdışı yapıldığında, her bir fare için toplam gözlem süresi 10-15 dakika anestezi cardiodepressive etkilerinin en aza indirilmesi aşmamaktadır. </li><li> Damar çapı ve RBC hız ölçümleri sonra, her damarda kan akımının hesaplanmasında aşağıdaki formül kullanılarak yapılabilir: Q = V x π (D / 2) 2, Q = kan akımı, V = RBC hızı ve D = damar çapı. </li><li> Bu prosedürler zaman içinde tekrar edilebilir. Örneğin, fare modelinde serebral sıtma, enfeksiyon günde 4 günlük ölçümler gerçekleştirir. Her fare için her gün elde edilen değerler% 100 olarak kabul edilir ile ilgili günlük 0 (pre-enfeksiyon), normalize edilir. </li><li> Örneğin gelişmiş perfüzyon pial damarların lökosit ve / veya trombosit haddeleme ve bağlılığın değerlendirmesi ve analizi için, damar çapı ve kan akım ölçümleri yanı sıra, ek değerlendirmeler yapılabilir. Bu ölçümler floresan etiketli işaretleyicileri yardımıyla yapılmaktadır. Sıtma durumda, biz de GFP ifade PBA suşu kullanılarak yoluyla dolaşan veya yapışık parazitleri tespit edebilir. </li><li> Perfüzyon değerlendirmesi için bir çözüm FITC etiketli albumin (Sigma, St Louis, MO 50μg/mouse), ve Texas Kırmızı (TxR) etiketli pan-lökosit işaretleyici CD45 karşı antikor pial damarlara lökosit bağlılığı ölçmek için ( Invitrogen, Carlsbad, CA 4μg/mouse). Bunun için, 25μL Albumin-FITC (2mg/mL) ve anti-CD45-PE antikor 20μL (200μg/mL) karıştırılır ve önceden ısıtılmış kuyruk ven enjekte edilir. Daha sonra fare sızıntı ölçümleri albümin-FITC 15 dakika dolaşmasına izin alacağı ancak, hemen görüntülü olabilir. XF100-2 (Omega Optik, Brattleboro, VT) ve anti-CD45-TxR floresan (615nm) çıkıldı ve albümin-FITC ve GFP (GFP pRBC PBA-) tarafından yayılan Yeşil floresan (518nm) kullanarak ve ALPHA Canlı yakalanır XF42: Canlı Standardı ile ele geçirdi. </li><li> Floresan etiketli albumin damar ağı, delici damarları dahil olmak üzere gelişmiş görselleştirme sağlar ve non-perfüze veya altında-perfüze damarları kontrol etmek için serebral sıtma gibi hastalık durumlarında yararlıdır. Ayrıca vasküler sızıntı 5 ölçmek için kullanılabilir. </li><li> Floresan etiketli anti-CD45 antikorları pial damarlara lökosit yuvarlanma ve yapışma belirlemek ve ölçmek için kolaylaştırır. Nicelleştirmesinde önyargı önlemek için, aynı noktalar kan akışını ölçmek için önceden tanımlanmış bir yuvarlanma ve yapışma ölçmek. Lökosit adezyonu Niceleme 100μm damar uzunluğu lökosit sayısı sayım yapılır. Rolling kan hızı 30 saniye boyunca aynı 100μm uzunluğu göre çok daha yavaş bir hızda seyahat lökosit sayısı sayarak sayısal. </li></ol> 3. Temsilcisi sonuçları <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Kraniyal pencere üzerinden erişilebilir fare pial damar ağı (Adım 2.6) Resimler. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Fare pial mikrosirkülasyon intravital mikroskopi için set (Steps 3,1-3,5) Şematik gösterilecek. 1: intravital mikroskop, 2: 20X suya daldırma amacı; 3: ışık kaynağı; 4a: dijital düşük ışık yüksek hızlı kamera, 4b: analog kamera, 5: stereotaksik çerçeve fare, 6 bilgisayar monitörü, 7: Analog Shearer görüntü kesme (ok), damar çapı ölçmek için nasıl yapıldığını gösteren izler. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. (Adım 3,6-3,8), yüksek hızda floresan video kayıtları hücre takip ederek Mikrovasküler kırmızı kan hücre hız ölçümleri . F Resimleri bir kamera tarafından mikroskobik bir alan ayrılmış geçiş, tek bir hareket RBC gösteren bir pial damar dizisi görüntüleri. Alanında geçiş öncesi kalibre mesafe ile, 15 veya daha fazla hücre çerçevesi konumlarında kare Manuel belirlenmesi, bir Excel elektronik tablosu yardımı ile her bir geminin ortalama RBC hızının hesaplanması sağlar. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. (Adım 3.9) Veri Plasmodium berghei ANKA (PBA) enfekte olmuş fareler (n = 5) ve bulaşmamış kontrol farelerde zamanla pial kan akışındaki değişiklikleri gösteren bir temsilcisi deney (n = 5). Pial kan akışını kontrol farelerde zaman içinde nispeten sabit olduğunu dikkate alarak, PBA enfekte farelerde kan akışının belirgin bir azalma göstermektedirserebral sıtma geliştirme (Günde 6) zamanında. Veriler ortalama ± SEM. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5. Plasmodium berghei ANKA ile enfekte bir fare pial damarlara yapışık lökositlerin (Adım 4.3) büyük bir kısmı, anti-CD45-Texas Kırmızı floresan antikorlar ile boyanarak ortaya koyduğu gibi.

<ol>
	<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li><li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting.">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li><li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile.">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li><li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules.">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li><li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery.">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li><li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction,+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine.">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li></ol>

Burada açıklanan intravital mikroskopi yöntemi fare pial mikrosirkülasyon detaylı gözlem için benzersiz ve güçlü bir araç sağlar. Diğer bireysel arteriyollerin ve venüller singling ve damar çapları, RBC hızları, kan akımı, bağlılık ve lökosit, trombosit ve diğer kan elemanları, vasküler kaçak, doku pH ve pO2 haddeleme gibi parametreleri bir dizi değişiklikler ölçüm sağlar ve potansiyel olarak pek çok uygulamaları. In vivo vasküler yanıt ilaç idaresine gibi müdahaleler üzerine derhal değerlendirilir veya patolojik süreçleri sırasında olabilir. Ayrıca, mikrosirkulasyonu davranış zaman içinde dinamik olarak takip edilebilir. P. neden olduğu serebral sıtma sırasında pial mikrosirkulasyonu değişiklikleri incelemek için bu teknolojiyi kullandık berghei fare ANKA, ve bu modelde mikrosirkulasyonu disfonksiyonu azalmış serebral kan akışı, vazokonstriksiyon, bozulmuş perfüzyon ve sonuçta vasküler çöküşü 6 ile karakterize bir nörolojik sendrom ile ilişkili olduğunu göstermiştir.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Carbocyanine dye Dil </td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D306</td><td></td></tr><tr><td>Albumin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-TxR Ab</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4517</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. berghei&lt;/em&gt; ANKA-GFP</td><td>MR4</td><td>MRA-865</td><td></td></tr></tbody></table>

intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window

Bu deneysel model, in vivo floresan mikroskobu kullanarak, akut ve kronik, fizyolojik ve patofizyolojik hemodinamik, inflamatuvar ve metabolik koşullar sırasında fare pial mikrosirkülasyon değerlendirmek için tasarlanmıştır . Kapalı bir kafa penceresi farelerin sol parieto-oksipital kortekste üzerine yerleştirilir. Yerel mikrosirkülasyon epi ve floresan aydınlatma, ve damarların çapları ve kırmızı kan hücre (RBC) hızları yapılan ölçümleri kullanarak pencere üzerinden gerçek zamanlı olarak kaydedilir. RBC hızı gerçek zamanlı çapraz korelasyon ve / veya floresan etiketli eritrositler kullanılarak ölçülür. Perfüzyon ve vasküler sızıntı pial damarları ve değerlendirme Lökosit ve trombosit bağlılık Albumin-FITC ve anti-CD45-TxR antikorları gibi floresan etiketli işaretleyicileri yardımıyla yapılır. Mikrosirkülasyon birkaç gün içinde tekrar tekrar video kayıt olabilir. Biz ilk defa pial mikrosirkülasyon çalışmada farelerde Plasmodium berghei ANKA enfeksiyonu seyri sırasında dinamik değişiklikleri takip edebilecek ve CM ifade kan derin düşüş, vazokonstriksiyon ile karakterize mikrosirkulasyonu işlev bozuklukları ile ilişkili olduğunu göstermek için pencereyi kapat beyin intravital mikroskopi için kullanılan akış ve sonuçta vasküler çöküşü.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window at JoVE.com

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Intravital mikroskopi pial mikrosirkülasyon zamansal ve mekansal hemodinamik ve inflamatuar olayları takip etmek.

Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.3K Görüntüleme.  University of California, San Diego. Intravital mikroskopi pial mikrosirkülasyon zamansal ve mekansal hemodinamik ve inflamatuar olayları takip etmek.

Video: Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

Kranial Pencere üzerinden neokorteks Kan Akış 2-Foton Görüntüleme Bir Yöntem

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

Biyoloji

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Nörobilim

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of motor and cognitive disabilities. Its high prevalence poses a serious health burden, as stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1. Recovery of neuronal function is, in most cases, only partial. So far, treatment options are very limited, in particular due to the narrow time window for thrombolysis2,3. Determining methods to accelerate recovery from stroke remains a prime medical goal; however, this has been hampered by insufficient mechanistic insights into the recovery process. Experimental stroke researchers frequently employ rodent models of focal cerebral ischemia. Beyond the acute phase, stroke research is increasingly focused on the sub-acute and chronic phase following cerebral ischemia. Most stroke researchers apply permanent or transient occlusion of the MCA in mice or rats. In patients, occlusions of the MCA are among the most frequent causes of ischemic stroke4. Besides proximal occlusion of the MCA using the filament model, surgical occlusion of the distal MCA is probably the most frequently used model in experimental stroke research5. Occlusion of a distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA branch typically spares the striatum and primarily affects the neocortex. Vessel occlusion can be permanent or transient. High reproducibility of lesion volume and very low mortality rates with respect to the long-term outcome are the main advantages of this model. Here, we demonstrate how to perform a chronic cranial window (CW) preparation lateral to the sagittal sinus, and afterwards how to surgically induce a distal stroke underneath the window using a craniotomy approach. This approach can be applied for sequential imaging of acute and chronic changes following ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Surgical occlusion of a distal middle cerebral artery branch (MCAo) is a frequently used model in experimental stroke research. This manuscript describes the basic technique of permanent MCAo, combined with the insertion of a lateral cranial window, which offers the opportunity for longitudinal intravital microscopy in mice.

Yanal Kronik Kranial Pencere Hazırlık sağlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; Farelerde Distal Orta Serebral Arter Tıkanıklığı takiben Gözlem

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

uzunlamasına<em&gt; İn Vivo</em&gt; Cerebrovasculature Görüntüleme: MSS Hastalıkları uygunluk

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Tıp

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

İçinde vivo beyin omurilik akışkan taşınması floresan Makroskopisi kullanarak bozulmamış fare kafatası aracılığıyla görüntüleme

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

Uyanık Farelerde Tekrarlanan In Vivo Görüntüleme için Kraniyal Pencerenin İmplantasyonu

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell types of an animal's brain, upon exposure to exogenous stimuli. Here, the administration of a closed-skull traumatic brain injury (TBI) and simultaneous implantation of a cranial window for subsequent longitudinal intravital imaging in mice is shown. Mice are intracranially injected with an adeno-associated virus (AAV) expressing enhanced green fluorescent protein (EGFP) under a neuronal specific promoter. After 2 to 4 weeks, the mice are subjected to a repetitive TBI using a weight drop device over the AAV injection location. Within the same surgical session, the mice are implanted with a metal headpost and then a glass cranial window over the TBI impacting site. The expression and cellular localization of EGFP is examined using a two-photon microscope in the same brain region exposed to trauma over the course of months.

This study demonstrates delivery of a repetitive traumatic brain injury to mice and simultaneous implantation of a cranial window for subsequent intravital imaging of a neuron-expressed EGFP using two-photon microscopy.

Kapalı Kafatası Travmatik Beyin Hasarı ve Kraniyal Penceresi Olan Farelerde Floresan Protein Ekspresyonunun İki Foton Mikroskobu Kullanılarak İntravital Görüntülenmesi

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

Implantation of Cranial Imaging Window in Mouse Model: A Surgical Procedure to Implant Glass-based Coverslip for Stable Optical Access to Regions of Murine Brain

Source: Alieva, M. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/59278/longitudinal-intravital-imaging-brain-tumor-cell-behavior-response-to">Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2019)
This video presents a surgical procedure to implant cranial window in a mouse model for stable optical access to different regions of the brain.

Fare Modelinde Kranial Görüntüleme Penceresinin İmplantasyonu: Murin Beyninin Bölgelerine Stabil Optik Erişim için Cam Tabanlı Lamel İmplante Etmek İçin Cerrahi Bir Prosedür

Source: Alieva, M. et al. Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy.&#160;J. Vis. Exp.&#160; ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kanser Araştırmaları

Sinir Sistemi Kanserleri

İn vivo çalışmalar

Visualizing Cerebral Blood Flow During Ischemia in a Mouse Using a Fluorescent Tracer

Secure an anesthetized mouse in a supine position.
Make a neck incision to expose and loosely ligate the bilateral common carotid arteries.
Loosely close the incision and position the mouse in a prone position.
Shave the scalp, disinfect, and make an incision to expose the skull.
Remove the soft tissue and glue a metal frame to the skull over the region of interest.
Secure the mouse on a steel plate.
Drill to thin the skull until surface cerebral blood vessels become visible.
Inject fluorophore-tagged dextran into the tail vein.
Dextran circulates through the bloodstream and reaches the brain, labeling the cerebral blood vessels.
Using a fluorescence microscope, visualize cerebral blood flow through the thinned skull.
Position the mouse supine and tighten the carotid sutures to restrict cerebral blood flow, simulating ischemia.
Microscopically re-visualize through the thinned skull to identify ischemic areas with reduced blood flow and detect plasma leakage.

Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler