עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות מענק, R01 AG033620 (BG) ועל ידי רוברט דרייפר טכנולוגיה חדשנות מימון (דאו).

1. בנייה של מכשיר HIT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את האביב ללוח באמצעות שני מלחציים וארבעה ברגים (איור 1 א). מרכז את מהדק ביחס לרוחב הלוח ונוגח אותם אחד נגד השני עם סומק המהדק החיצוני עם הקצה של הלוח. לפני מצרף את מהדק, לכופף אותם באמצעות צבת שיתאים היטב על האביב. הערה: ראה טבלת 1 לתיאורים של החומרים הנדרשים לבניית מכשיר HIT. הסוף מהודק של האביב צריך להיות 1/8 אינץ &#39;(3.2 מ&quot;מ) מקצה הלוח, ואת הקצה החופשי צריך להרחיב על הלוח על ידי 3/4 אינץ&#39; (19 מ&quot;מ). התאם את האביב, כך שהוא נמצא במקביל לאורכו של הלוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עטוף את הקצה החופשי של הקפיץ פעם אחת סביב עם רצועת הדבק של לולאות סקוטש. הקצה החיצוני של סקוטש צריך להיות מיושר עם סוף האביב. סקוטש הוא חשוב משום שהוא משמש כדי לאבטח את הבקבוקון למעיין על ידי creating הולם דחיסה חזק. סקוטש גם מאפשר חיבור קל וההסרה של בקבוקונים, המאפשר בקבוקונים רבים להיות מעובד בתקופה קצרה של זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את כיסוי דלי הקרח הפוך, מרוכז, חזק נגד לוח העץ. כוון את האזור המורם של כיסוי דלי הקרח כך שהקצה הארוך מקביל לרוחב של הלוח. שים לב שהאזור שהועלה של דלי הקרח הוא 1/2 אינץ &#39;(13 מ&quot;מ) גבוה יותר מאשר לוח העץ, כך שכאשר בקבוקון מחובר לאביב האביב לא לשכב על הלוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק את כל המכשיר נגד אובייקט קבוע כגון קיר, כך שכיסוי דלי הקרח תקוע בין הלוח והאובייקט ולא זז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת מד זווית נייר לתחתית קרטון לטוס מגש בקבוקון ולסבול את זה על קצה נגד האורך של הלוח כך שהסימן 90 ° מיושר עם האביב כאשר הוא נסוג למצב אנכי בצורה מושלמת. </li></ol> 2.מבצע של מכשיר HIT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בין CO 1 ו -60 2 -anesthetized זבובים בבקבוקון ריק ופקק הבקבוקון באמצעות כדור צמר גפן הדוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביל את הזבובים לאינץ &#39;התחתון 1 (2.5 סנטימטרים) של הבקבוקון על ידי לחיצה על כדור צמר גפן לתוך הבקבוקון עד שהוא 1 אינץ&#39; (2.5 סנטימטרים) מהתחתית. זה מועיל למתוח קו על הבקבוקון בסימן 1 אינץ &#39;(2.5 סנטימטרים). שים לב שמגביל זבובים לאזורים גדולים יותר או קטנים יותר של הבקבוקון יכול להשפיע על החומרה של פנוטיפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 5 דקות לזבובים להתאושש ניידות מCO 2. שים לב שזה לא ידוע אם 5 דקות מספיקות כדי להסיר את ההשפעות של CO 2 לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הקצה של האביב לתוך הבקבוקון עד הקצה הפנימי של סקוטש הוא מיושר עם החלק העליון של הבקבוקון (איור 1). כאשר באביב הוא שוכב, 1 אינץ &#39;(2.5 סנטימטרים) של הבקבוקון צריך לחפוף את האזור המורם של כיסוי דלי קרח. ניתן לעשות שימוש חוזר בקבוקי מ &#39;כל זמנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת שישב, להחזיק את הבקבוקון באזור סקוטש באמצעות האגודל והאצבע של יד שמאל. החזק את הלוח הדוק לbenchtop ביד הימין שלך. לחלופין, להשתמש C-מהדק להחזיק את הלוח ההדוק לbenchtop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את האביב בצורה מושלמת ישר בחזרה לזווית הרצויה. שחרר את האביב. לאפשר האביב להגיע לעצירה מוחלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבקבוקון מהמעיין ולאפשר הזבובים להתאושש במשך ≥5 דקות. להכפיף את הזבובים לשביתה נוספת או להעביר את הזבובים לבקבוקון עם אוכל לטוס. הערה: מגוון רחב של מבחני יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות פנוטיפי של שביתות ממכשיר HIT. לדוגמא, השפעות על תוחלת חיים יכולות להיקבע על ידי ניתוח אחוזים מזבובים שלשרוד בזמנים לאחר פציעה, השפעות על מורפולוגיה המוח יכולות להיקבע על ידי ניתוח היסטולוגית של הראש, והשפעות על ביטוי גנים יכולות להיקבע על ידי ניתוח כמותי של רמות ה- mRNA 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Determinהשפעות אלקטרוניים של ההליך שאינן בשל שביתות על ידי זהה טיפול זבובי שליטה שאינם נתון לשביתות. ללבוש שמיעת הגנה מפני ההשפעה של הבקבוקון נגד כיסוי דלי הקרח מייצרת רעש חזק. </li></ol>

<ol>
	<li>Harrison-Felix, C. L., Whiteneck, G. G., Jha, A., DeVivo, M. J., Hammond, F. M., Hart, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+over+four+decades+after+traumatic+brain+injury+rehabilitation:+A+retrospective+cohort+study.">Mortality over four decades after traumatic brain injury rehabilitation: A retrospective cohort study.</a> Arch Phys Med Rehabil. 90, 1506-1513 (2009).</li><li>Coronado, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+for+traumatic+brain+injury-related+deaths+&#8211;+United+States.">Surveillance for traumatic brain injury-related deaths &#8211; United States.</a> MMWR Surveill Summ. 60, 1-32 (1997).</li><li>Masel, B., DeWitt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury:+A+disease+process,+not+an+event.">Traumatic brain injury: A disease process, not an event.</a> J. Neurotrauma. 27, 1529-1540 (2010).</li><li>Blennow, K., Hardy, J., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropathology+and+neurobiology+of+traumatic+brain+injury.">The neuropathology and neurobiology of traumatic brain injury.</a> Neuron. 76, 886-899 (2012).</li><li>Prins, M., Greco, T., Alexander, D., Giza, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+of+traumatic+brain+injury+at+a+glance.">The pathophysiology of traumatic brain injury at a glance.</a> Disease Models Mech. 6, 1307-1315 (2013).</li><li>Menon, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+challenges+in+clinical+trails+in+traumatic+brain+injury.">Unique challenges in clinical trails in traumatic brain injury.</a> Crit Care Med. 37, S129-S135 (2009).</li><li>Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+traumatic+brain+injury.">Animal models of traumatic brain injury.</a> Nature Rev Neurosci. 14, 128-142 (2013).</li><li>Balsiger, Z., Leudkte, J., Mawer, S., Willey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> HIT device high speed analysis. , (2014).</li><li>Davceva, N., Janevska, V., Illevski, B., Petrushevska, G., Popeska, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occurrence+of+acute+subdural+haematoma+and+diffuse+axonal+injury+as+two+typical+acceleration+injuries.">The occurrence of acute subdural haematoma and diffuse axonal injury as two typical acceleration injuries.</a> J Forensic Leg Med. 19, 480-484 (2012).</li><li>Katzenberger, R. J., Loewen, C. A., Wassarman, D. R., Petersen, A. J., Ganetzky, B., Wassarman , D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila.+model+of+closed+head+traumatic+brain+injury.">A Drosophila. model of closed head traumatic brain injury.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, E4152-E4159 (2013).</li><li>Fang, Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+degeneration+and+regeneration:+insights+from+Drosophila+.models+of+nerve+injury.">Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila .models of nerve injury.</a> Annu Rev Cell Biol. 28, 575-597 (2012).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila.">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J Vis Exp. (84), e51223 (2014).</li><li>Tully, T., Preat, T., Boynton, S. C., Vecchio, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+consolidated+memory+in+Drosophila.">Genetic dissection of consolidated memory in Drosophila.</a> Cell. 79, 35-47 (1994).</li><li>Andretic, R., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+sleep+recordings+in+Drosophila.:+moving+beyond+sleep+time.">Essentials of sleep recordings in Drosophila.: moving beyond sleep time.</a> Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).</li></ol>

אין לנו ניגוד עניינים לחשוף.

שיטת מכשיר HIT נבדל משיטות אחרות שתגרומנה לפגיעה טראומטית בזבובים על ידי כך שהיא גורמת לראש סגור ולא חודר 11 TBI. יתר על כן, שיטת מכשיר HIT לוקחת פחות זמן, מאמץ, מיומנות ולגרום TBI בזבובים רבים, ולכן השיטה היא נוחה יותר מאשר בשיטות אחרות למסכים גנטיים בקנה מידה גדולה. לבסוף, העובדה שהפציעות עיקריות שנגרמו על ידי מכשיר HIT אינן מוגבלות למוח הוא גם מגבלה ויתרון. זה הגבלה כי מחקרים נוספים נדרשים להעריך האם פנוטיפים הם עקב פציעה טראומטית למוח או לחלקים אחרים בגוף. מצד השני, polytrauma (פגיעה טראומטית לחלקי גוף שונים) לעתים קרובות מלווה TBI, והוא חשב לווסת פנוטיפים TBI, ולכן שיטת מכשיר HIT ניתן להשתמש כדי לחקור את התרומה של polytrauma לפנוטיפים TBI. מודל TBI הזבוב יש גם יתרונות על פני מכרסמים ודגמי TBI קופים שאינם בני אדם <sעד&gt; 10. מספר גדול של בעלי חיים יכול להיבחן בגלל זבובים מתרבים במהירות (הנקבות מטיל ביצים ~ 100 / יום), יש לי מחזור חיים קצרים (10 ימים מביצה להבשיל בוגר של 25 מעלות צלזיוס), ונשמר בבקבוקונים קטנים ולהאכיל על מדיום זול (~ 20 ¢ / חודש / 100 זבובים). בנוסף, יכולות בקלות להעריך תוצאות TBI על כל תוחלת החיים כי יש לי זבובים בוגרים תוחלת חיים קצרות יחסית (50-100 ימים של 25 מעלות צלזיוס). לבסוף, ארסנל עצום של כלים ניסיוניים וטכניקות שפותחו מתוך למעלה מ -100 שנים של מחקר הקודם על זבובים מספק מידה חסרת תקדים של שליטה ניסיונית לרגולציה של זמן ומרחב מדויק של ביטוי גנים; ניתוחי התנהגות, התפתחותי, ואלקטרו; in vivo הדמיה וכו &#39;. פרוטוקול זה מתאר את ההקמה והפעלה של מכשיר HIT, שנועד לגרום TBI הראש הסגור בזבובים. אנחנו השתמשנו במכשיר HIT בשיתוף עם 24 MI &lt;/ Sub&gt; assay ללמוד מות האורגניזם הבא 7 TBI. עם זאת, מודל TBI זבוב ניתן להשתמש בדרכים רבות אחרות כדי להבין מוות, כמו גם השלכות אחרות של TBI. לדוגמא, תוצאות פיזיות של TBI ניתן למדוד באמצעות מבחני לפרמטרים כגון טיפוס או טיסה, והשלכות התנהגות של TBI ניתן למדוד באמצעות מבחני לפרמטרים כגון שינה ולמידה וזיכרון 10,12-14. השפעות מבניות במוח ניתן לקבוע באמצעות שיטות הדמיה כגון מיקרוסקופיה immunofluorescence ומיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. תופעות מולקולריות במוח ניתן לקבוע באמצעות מבחני הגנומי כגון RNA-seq או מבחני proteomic כגון ספקטרומטר מסה. השפעות גנטיות על המוח ניתן לקבוע באמצעות גישות כגון מציאה גן מותנית וביטוי יתר. השפעות סביבתיות על ההשלכות של TBI יכולות להיקבע על ידי פרמטרים מראש או לאחר פציעה שונה כגון טמפרטורת דגירה ודיאטה או פרמטרים שלמכשיר HIT כגון זווית ההטיה האביב או הזמן בין שביתות חוזרות ונשנות. לבסוף, מכשיר HIT יכול לשמש למסכים גנטיים בקנה מידה גדולה כדי לענות על שאלות בסיסיות כגון מדוע ההשלכות של TBI הן גרועות באנשים מבוגרים יותר מאנשים צעירים, כמו גם למסכי סמים בקנה מידה גדולה שיכול לשמש לזיהוי טיפולים ל ההשלכות של TBI. כאשר משתמש באופן עקבי, מצאנו כי מכשיר HIT מייצר פנוטיפים לשחזור בין ניסויים ומשתמשים עצמאיים. פרמטרים שיכולים להשפיע על שחזור הם ההגדרה והפעלה של מכשיר HIT. פנוטיפים יכולים להיות מושפעים באופן משמעותי על ידי שינויים קטנים בעמדה של דלי קרח הכיסוי ביחס ללוח, את עמדתו של כדור צמר גפן בבקבוקון הזבוב, ואת עמדתו של בקבוקון ביחס לרצועת סקוטש. יתר על כן, כפי שמוצג באיור 2, פנוטיפים יכולים להיות מושפעים באופן משמעותי על ידי שינויים קטנים בזווית של סטיית האביב. כך, משתמשים חדשים של מכשיר HIT צריכים להיות במעקב כדי לוודא שההגדרה והתפעול זהות לזה של משתמשים אחרים. אנחנו באופן שיגרתי לכייל משתמשים חדשים על ידי שיש להם לקבוע את MI 24 של 0-7 יום ישן w 1,118 זבובים. לבסוף, מכשיר HIT לא צריך להיות זהה לזה שתואר בפרוטוקול. אנו מצפים שרוב חלקי מכשיר HIT ניתן לשנות תוך שמירה על היכולת לגרום TBI בזבובים.

An author's name was corrected in the publication of <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/52905">A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila</a>. The second to last author's was spelled incorrectly. It has been updated from:
Barry Ganetky
to:
Barry Ganetzky

An author's name was corrected in the publication of <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/52905">A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila</a>.

Erratum: A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) מוגדרת כפגיעה במוח מכוח מכאני חיצוני. הנפוץ ביותר, תוצאות TBI מכוחות הראש סגורים כגון כוחות בוטים והאצת אינרציה וכוחות ההאטה שגורמים למוח להכות את החלק הפנימי של הגולגולת. בארצות הברית, ההערכה היא כי 50,000 אנשים מתים בכל שנה מTBI ו2.5-6,500,000 אנשים חיים עם ההשלכות של TBI, כוללים מתישים פיזי, קוגניטיבית, ובעיות התנהגות 1,2. ההשלכות של TBI הן לא רק עקב פציעות מכאניות עיקריות למוח, אלא גם לפציעות המשניות תאיות ומולקולריות למוח, כמו גם רקמות אחרות המתרחשות לאורך זמן 3-5. הפיתוח של גישות לאבחון וטיפול TBI הוכיח להיות קשה כי TBI הוא תהליך מחלה מורכב. הטבע המשתנה של פציעות עיקריות, פיזיולוגיה אנושית, וגורמים סביבתיים גורם לi המשנית הטרוגניתnjuries ופתולוגיות. גורמים משתנים בסיסי כוללים את חומרת הפגיעה הראשונית, זמן בין פציעות עיקריות החוזרות ונשנות, וגיל וגנוטיפ של הפרט. הבנה כיצד כל גורם משתנה תורם להשלכות של TBI עשויה לסייע בפיתוח של גישות לאבחון וטיפול TBI 6,7. כאן אנו מתארים שיטה לגרימת TBI הראש הסגור בmelanogaster דרוזופילה (זבובי פירות), שניתן להשתמש כדי לשרטט את תרומתם של גורמים משתנים להשלכות של TBI. השיטה מבוססת על תצפית ראשונית שמאוד להכות את הצד של בקבוקון תרבות זבוב על כף יד שנגרמה פרא-סוג טס להופכים באופן זמני נכה, תוצאה סבירה של TBI. לפיכך, אנו נבנו מכשיר הטראומה (HIT), השפעה הגבוה לשחזר כוחות התאוצה וההאטה מהפעולה ביד להכות. סרט במהירות גבוהה מראה כי שביתה אחת מHIT מכשיר גורם זבובים ליצור קשר עם קיר הבקבוקון מספר פעמים עם הראש וגופם 8. במידה מסוימת, את כל אנשי הקשר עלולים לגרום למוח הזבוב ליתיר ולעוות נגד הקפסולה הראש, דומה למה שקורה לבני אדם בנפילות ותאונות דרכים 9. בהתאם לכך, זבובים שטופל בפנוטיפים תצוגת מכשיר HIT בקנה אחד עם פגיעה מוחית, כולל נבצרות זמניות ואחריו אטקסיה, התאוששות הדרגתית של ניידות, שינויי ביטוי גנים בראש, וניוון של מערכת עצבים מתקדמות במוח 10. לפיכך, מכשיר HIT מאפשר ללמוד TBI באמצעות הארסנל העצום של כלים וטכניקות שפותחו לזבובים ניסיוניים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zinc plated compression spring</td>
			<td>The Hillman&#160; Group</td>
			<td>540189</td>
			<td>9 7/8 in (length), 15/16 in (outer diameter), 0.12 in (wire size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>9 in (length), 6.5 in (width), 0.75 in (height)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Sigma Electrical Manufacturing Corporation</td>
			<td>49822</td>
			<td>3.10 in (length), 0.68 in (width), 1.11 in (height), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch steel EMT conduit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loop half of self-adhesive velcro</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 in (length), (3/4 in width)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane ice bucket cover</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-591-45</td>
			<td>9 1/8 in (length), 9 1/8 in (width), 1 1/4 in (height)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic fly vials</td>
			<td>Applied Scientific</td>
			<td>AS-510</td>
			<td>3 11/16 in (height), 1 1/16 in (inner diameter), 1 1/8 in (outer diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large cotton balls</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-456-883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper protractor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 in (diameter)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to inflict closed head traumatic brain injury in drosophila

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) משפיעה על מיליוני אנשים בכל שנה, גורמת לירידת ערך של פיזי, קוגניטיבית, ופונקציות התנהגותיות ומוות. מחקרים באמצעות תסיסנית תרמו פריצות דרך חשובות בהבנת תהליכי נוירולוגיות. לפיכך, במטרה להבין את הבסיס התאי ומולקולרי של מחלות TBI בבני אדם, שפיתחנו מכשיר הגבוה השפעת הטראומה (HIT) להסב את הראש סגור TBI בזבובים. זבובים נתון לפנוטיפים תצוגת מכשיר HIT בקנה אחד עם TBI אדם כגון נבצרות זמניות וניוון מוחיה מתקדם. מכשיר HIT משתמש במנגנון המבוסס על קפיץ כדי להניע את הזבובים על הקיר של בקבוקון, וגרם לנזק מכאני למוח הזבוב. המכשיר הוא זול וקל לבנייה, הפעלתו היא פשוטה ומהירה, והיא מייצרת תוצאות לשחזור. כתוצאה מכך, מכשיר HIT יכול להיות משולב עם כלים ניסיוניים קיימים וטכניקות לזבובים כדי לטפל בבסיסייםשאלות על TBI שיכול להוביל לפיתוח של כלי אבחון וטיפולים לTBI. בפרט, מכשיר HIT ניתן להשתמש כדי לבצע מסכי גנטיים בקנה מידה גדולה כדי להבין את הבסיס הגנטי של מחלות TBI.

אנחנו מעוניינים להבין מדוע זבובים מתים זמן קצר לאחר פגיעה ראשונית. כדי לכמת מוות, קבענו מדד התמותה ב 24 שעות (MI 24), המהווה את האחוז של זבובים שמת בתוך 24 שעות של הפגיעה העיקרית. זבובים נתון לשביתות ממכשיר HIT הודגרו של 25 מעלות צלזיוס בבקבוקון עם אוכל לטוס, ומספר הזבובים המתים נספר לאחר 24 שעות. אנחנו השתמשנו בגישה זו כדי לזהות גורמים המשפיעים על 24 MI ומצאנו כי 24 MI אינו מושפע ממספר הזבובים בבקבוקון (10 עד 60 זבובים נבדקו), את הזמן בין שביתות חוזרות ונשנות (1 עד 60 דקות נבדקו ), או המין של הזבוב 10. לעומת זאת, מצאנו שגיל בעת הפגיעה הראשונית וגנוטיפ עשה משפיע על 24 MI. היו זבובים בוגרים 24 MI גבוה מזבובים צעירים, והיו לי זבובים של גנוטיפים שונים MI 24 זה שונה באופן משמעותי. באיור 2, בדקנו אם חומרת הפגיעה העיקרית משפיעה על 24 MI. כדי לשנות את חומרת הפגיעה הראשונית, שהסטנו את האביב לזוויות שונות. עבור כל זווית, בקבוקונים של שני היום הישן w 1,118 זבובים (זן מעבדה סטנדרטי) או 0-7 20-27 נחשפו לארבע שביתות עם 5 דקות בין שביתות. שלושה בקבוקונים של 60 זבובים נבדקו לכל זווית. זבובים הועברו לצלוחיות עם מזון מולסה, טופחו על 25 מעלות צלזיוס, ואת מספר הזבובים המתים נספר לאחר 24 שעות. השגיאה הממוצעת 24 MI ותקן של הממוצע חושבה עבור כל זווית. נתונים אלה מראים כי זוויות גדולות יותר של סטייה, כלומר., פציעות עיקריות חמורות יותר, לגרום 24 MI גבוה מזוויות קטנות יותר של סטייה, כלומר., פציעות חמורות פחות. זה נצפה לשני זבובים הישנים 0-7 ו20-27 היום. יתר על כן, בהסכם עם אל Katzenberger et. 10 fl ישן 20-27 יום,היה לי ies ישנים זבובי MI הגבוה באופן משמעותי מאשר 24 יום 0-7 בזוויות ≥50 מעלות. לפיכך, נתונים אלה מצביעים על כך שבגילים מרובים 24 MI בקורלציה עם חומרת הפגיעה הראשונית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52905/52905fig1.jpg" /> איור תרשים של מכשיר HIT (א) לצפייה בחלק העליונה של המכשיר נפגע במצב המנוחה: איור 1.. איור (ב) למבט מהצד של מכשיר HIT. האביב מוצג במצב המנוחה (אדום כהה) והסיט עד 90 מעלות (אור אדום). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52905/52905fig2.jpg" /> איור 2:. חומרת פציעה העיקרית בקורלציה עם 24 MI קבענו 24 MI ל0-7 יום ישן w <eמ &#39;&gt; 1,118 זבובים (פסים אפורים בהירים) ו1,118 זבובי w ישנים 20-27 היום (פסים אפורים כהים) שהיו נתונים לארבע שביתות ממכשיר HIT עם האביב הסיטו לזוויות שצוינו במעלות. נתונים התואר 0 הם ל זבובים לא נתון למכשיר HIT. מוצגים הם MI הממוצע 24 וסטיית ההתקן של הממוצע. MI 24 של זבובים ישנים 0-7 ו20-27 יום היה שונה באופן משמעותי ל -50 מעלות (P &lt;0.05, מבחן t זנב אחד) וזוויות&gt; 50 מעלות (P &lt;0.001, אחד מבחן t זנב) אבל לא לזוויות &lt; 50 מעלות (P&gt; 0.1, אחד מבחן t זנב).

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila at JoVE.com

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

כאן אנו מתארים שיטה לגרום פגיעת ראש סגור מוח הטראומתי (TBI) בדרוזופילה. שיטה זו מספקת שער לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים העומדים בבסיס פתולוגיות TBI באמצעות המגוון הרחב של כלים וטכניקות ניסיוניים זמינים לזבובים.

שיטה לגרום סגור ראש הפגיעה מוחית טראומטית ב<em&gt; דרוזופילה</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

a-method-to-inflict-closed-head-traumatic-brain-injury-in-drosophila

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

11.4K Views.  University of Wisconsin-Madison.  כאן אנו מתארים שיטה לגרום פגיעת ראש סגור מוח הטראומתי (TBI) בדרוזופילה. שיטה זו מספקת שער לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים העומדים בבסיס פתולוגיות TBI באמצעות המגוון הרחב של כלים וטכניקות ניסיוניים זמינים לזבובים. 

Video: A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

נוזל הקשה Lateral: דגם של פגיעה מוחית טראומטית של עכברים

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological impairments 1. Two pervasive and disabling symptoms experienced by TBI survivors, memory deficits and a reduction in seizure threshold, are thought to be mediated by TBI-induced hippocampal dysfunction 2,3. In order to demonstrate how altered hippocampal circuit function adversely affects behavior after TBI in mice, we employ lateral fluid percussion injury, a commonly used animal model of TBI that recreates many features of human TBI including neuronal cell loss, gliosis, and ionic perturbation 4-6.
	Here we demonstrate a combinatorial method for investigating TBI-induced hippocampal dysfunction. Our approach incorporates multiple ex vivo physiological techniques together with animal behavior and biochemical analysis, in order to analyze post-TBI changes in the hippocampus. We begin with the experimental injury paradigm along with behavioral analysis to assess cognitive disability following TBI. Next, we feature three distinct ex vivo recording techniques: extracellular field potential recording, visualized whole-cell patch-clamping, and voltage sensitive dye recording. Finally, we demonstrate a method for regionally dissecting subregions of the hippocampus that can be useful for detailed analysis of neurochemical and metabolic alterations post-TBI.
	These methods have been used to examine the alterations in hippocampal circuitry following TBI and to probe the opposing changes in network circuit function that occur in the dentate gyrus and CA1 subregions of the hippocampus (see Figure 1). The ability to analyze the post-TBI changes in each subregion is essential to understanding the underlying mechanisms contributing to TBI-induced behavioral and cognitive deficits. 
	The multi-faceted system outlined here allows investigators to push past characterization of phenomenology induced by a disease state (in this case TBI) and determine the mechanisms responsible for the observed pathology associated with TBI.

A multi-faceted approach to investigating functional changes to hippocampal circuitry is explained. Electrophysiological techniques are described along with the injury protocol, behavioral testing and regional dissection method. The combination of these techniques can be applied in similar fashion for other brain regions and scientific questions.

חקירות על שינויים בתפקוד המעגל היפוקמפוס בעקבות פגיעה מוחית טראומטית קלה

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila

Chronic Traumatic Encephalopathy (CTE) is an established neurodegenerative disease that is closely associated with exposure to repetitive mild Traumatic Brain Injury (mTBI). The mechanisms responsible for its complex pathological changes remain largely elusive, despite a recent consensus to define the neuropathological criteria. Here, we describe a novel method to develop a model of CTE in Drosophila melanogaster&#160;(Drosophila&#160;)&#160;in an attempt to identify the key genes and pathways that lead to the characteristic hyperphosphorylated tau accumulation and neuronal death in the brain. Adjustable-strength impacts to inflict mild closed injury are delivered directly to the fly head, subjecting the head to rapid acceleration and deceleration. Our method eliminates the potential problems inherent with other Drosophila mTBI models (e.g.,animal death might be induced by damage to other parts of the body or to internal organs). The less labor- and cost-intensive animal care, short life span, and extensive genetic tools make the fruit fly ideal to study CTE pathogenesis and make it possible to perform large-scale, genome-wide forward genetic and pharmacological screens. We anticipate that the ongoing characterization of the model will generate important mechanistic insights on disease prevention and therapeutic approaches.

A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila

Here, we describe a new approach to inflict closed-head traumatic brain injury in Drosophila melanogaster. Our method has the advantage of directly delivering repetitive impacts with adjustable strength to the head alone. Further exploration of the invertebrate system will help to illuminate the pathogenesis of chronic traumatic encephalopathy.

שיטה חדשנית מודל אנצפלופתיה כרונית טראומטית ב<em&gt; תסיסנית</em

Chronic Traumatic Encephalopathy (CTE) is an established neurodegenerative disease that is closely associated with exposure to repetitive mild Traumatic ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

לייזר מונחה אטלס סטיאוטטי ללכוד את Microdissection של אזורים במוח מושפע פציעה טראומטית

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the detonation of explosive devices, however, the mechanisms that underlie the brain damage resulting from blast overpressure exposure are not entirely understood and are believed to be unique to this type of brain injury. Preclinical models are crucial tools that contribute to better understand blast-induced brain injury. A novel in vitro blast TBI model was developed using an open-ended shock tube to simulate real-life open-field blast waves modelled by the Friedlander waveform. C57BL/6N mouse organotypic hippocampal slice cultures were exposed to single shock waves and the development of injury was characterized up to 72 h using propidium iodide, a well-established fluorescent marker of cell damage that only penetrates cells with compromised cellular membranes. Propidium iodide fluorescence was significantly higher in the slices exposed to a blast wave when compared with sham slices throughout the duration of the protocol. The brain tissue injury is very reproducible and proportional to the peak overpressure of the shock wave applied.

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

This paper describes a novel model of primary blast traumatic brain injury. A compressed-air driven shock tube is used to expose in vitro mouse hippocampal slice cultures to a single shock wave. This is a simple and rapid protocol generating a reproducible brain tissue injury with a high throughput.

מודל הרומן במבחנה של פגיעה מוחית טראומטית הפיצוץ

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

השפעות הפיצוץ-induced Neurotrauma על מכרסם מווסת המזרח התיכון העורקים המוחיים

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Investigating Alterations in Caecum Microbiota After Traumatic Brain Injury in Mice

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also demonstrate that traumatic brain injuries cause changes to the gut microbiota. However, mechanisms underlying the bidirectional regulation of the brain-gut axis remain unknown. Currently, few models exist for studying the changes in gut microbiota after traumatic brain injury. Therefore, the presented study combines protocols for inducing traumatic brain injury using a lateral fluid percussion device and analysis of caecum samples following injury for investigating alterations in the gut microbiome. Alterations of the gut microbiota composition after traumatic brain injury are determined using 16S-rDNA sequencing. This protocol provides an effective method for studying the relationships between enteric microorganisms and traumatic brain injury.

Presented here is a protocol to induce diffuse traumatic brain injury using a lateral fluid percussion device followed by the collection of the caecum content for gut microbiome analysis.

חקירת שינויים Caecum Microbiota לאחר פציעה טראומטית במוח עכברים

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also ...

Low-intensity Blast Wave Model for Preclinical Assessment of Closed-head Mild Traumatic Brain Injury in Rodents

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of medical visits in the United States. There are currently no FDA-approved treatments available for TBI. The increased incidence of military-related, blast-induced TBI further accentuates the urgent need for effective TBI treatments. Therefore, new preclinical TBI animal models that recapitulate aspects of human blast-related TBI will greatly advance the research efforts into the neurobiological and pathophysiological processes underlying mild to moderate TBI as well as the development of novel therapeutic strategies for TBI.
Here we present a reliable, reproducible model for the investigation of the molecular, cellular, and behavioral effects of mild to moderate blast-induced TBI. We describe a step-by-step protocol for closed-head, blast-induced mild TBI in rodents using a bench-top setup consisting of a gas-driven shock tube equipped with piezoelectric pressure sensors to ensure consistent test conditions. The benefits of the setup that we have established are its relative low-cost, ease of installation, ease of use and high-throughput capacity. Further advantages of this non-invasive TBI model include the scalability of the blast peak overpressure and the generation of controlled reproducible outcomes. The reproducibility and relevance of this TBI model has been evaluated in a number of downstream applications, including neurobiological, neuropathological, neurophysiological and behavioral analyses, supporting the use of this model for the characterization of processes underlying the etiology of mild to moderate TBI.

We present here a protocol of a blast wave model for rodents to investigate neurobiological and pathophysiological effects of mild to moderate traumatic brain injury. We established a gas-driven, bench-top setup equipped with pressure sensors allowing for reliable and reproducible generation of blast-induced mild to moderate traumatic brain injury.

מודל גל פיצוץ בעצימות נמוכה להערכה פרה-קלינית של פגיעה מוחית טראומטית קלה בראש סגור במכרסמים

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of ...

Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional deficits. Numerous studies by our group and others have shown that mTBI stimulates cytokine expression and activates microglia, decreases cerebral blood flow and metabolism, and impairs cerebrovascular reactivity. Moreover, several works have reported an association between derangements in these neuroinflammatory and hemodynamic markers and cognitive impairments. Herein we detail methods to characterize the neuroinflammatory and hemodynamic tissue response to mTBI in mice. Specifically, we describe how to perform a weight-drop model of mTBI, how to longitudinally measure cerebral blood flow using a non-invasive optical technique called diffuse correlation spectroscopy, and how to perform a Luminex multiplexed immunoassay on brain tissue samples to quantify cytokines and immunomodulatory phospho-proteins (e.g., within the MAPK and NF&#954;B pathways) that respond to and regulate activity of microglia and other neural immune cells. Finally, we detail how to integrate these data using a multivariate systems analysis approach to understand the relationships between all of these variables. Understanding the relationships between these physiologic and molecular variables will ultimately enable us to identify mechanisms responsible for mTBI.

This protocol presents methods to characterize the neuroinflammatory and hemodynamic response to mild traumatic brain injury and to integrate these data as part of a multivariate systems analysis using partial least squares regression.

ניתוח מערכות של התגובה הנוירו-דלקתית וההמודינמית לפגיעה מוחית טראומטית

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

מודל ראש סגור מבוקר אלקטרומגנטי של פגיעה מוחית טראומטית קלה בעכברים

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...