ריצוף rRNA 16S: טכניקה מבוססת PCR לזיהוי מינים חיידקיים

Overview

מקור: אווה בוקובסקה-פאניבנד¹, עדדה אנדרסון¹, רולף לוד¹
¹ המחלקה למדעים קליניים לונד, החטיבה לרפואת זיהומים, המרכז הביו-רפואי, אוניברסיטת לונד, 221 00 לונד, שוודיה

כדור הארץ הוא בית גידול למיליוני מינים חיידקיים, שלכל אחד מהם מאפיינים ספציפיים. זיהוי של מינים חיידקיים נמצא בשימוש נרחב באקולוגיה מיקרוביאלית כדי לקבוע את המגוון הביולוגי של דגימות סביבתיות ומיקרוביולוגיה רפואית לאבחון חולים נגועים. חיידקים יכולים להיות מסווגים בשיטות מיקרוביולוגיות קונבנציונליות, כגון מיקרוסקופיה, צמיחה על מדיה ספציפית, בדיקות ביוכימיות וסרולוגיות, ובדיקות רגישות לאנטיביוטיקה. בעשורים האחרונים, שיטות מיקרוביולוגיה מולקולרית חוללו מהפכה בזיהוי חיידקים. שיטה פופולרית היא ריצוף גנים RNA ריבוזומלי (rRNA) 16S. שיטה זו היא לא רק מהירה ומדויקת יותר מאשר שיטות קונבנציונליות, אלא גם מאפשר זיהוי של זנים שקשה לגדול בתנאי מעבדה. יתר על כן, הבחנה של זנים ברמה המולקולרית מאפשרת אפליה בין חיידקים זהים פנוטיפיים (1-4).

16S rRNA מצטרף לתסביך של 19 חלבונים ליצירת תת-unit של ריבוזום חיידקי (5). הוא מקודד על ידי הגן 16S rRNA, אשר קיים ושמובטח מאוד בכל החיידקים בשל תפקידו החיוני בהרכבת ריבוזום; עם זאת, הוא מכיל גם אזורים משתנים אשר עשוי לשמש טביעות אצבעות עבור מינים מסוימים. תכונות אלה הפכו את גן 16S rRNA לשבר גנטי אידיאלי לשימוש בזיהוי, השוואה וסיווג פילוגנטי של חיידקים (6).

ריצוף גנים rRNA 16S מבוסס על תגובת שרשרת פולימראז (PCR) (7-8) ואחריו ריצוף DNA (9). PCR היא שיטת ביולוגיה מולקולרית המשמשת להגברת שברי DNA ספציפיים באמצעות סדרה של מחזורים הכוללים:

i) דנטורציה של תבנית DNA כפולה תקועה
ii) חישול פריימרים (אוליגונוקלאוטידים קצרים) המשלימים לתבנית
iii) הרחבת פריימרים על ידי אנזים פולימראז DNA, אשר סינתזה גדיל DNA חדש

מבט כולל סכמטי על פעולת השירות מוצג באיור 1.

איור 1: מבט כולל סכמטי על תגובת ה- PCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ישנם מספר גורמים החשובים לתגובת PCR מוצלחת, שאחד מהם הוא איכות תבנית ה- DNA. בידוד של DNA כרומוזומלי מחיידקים יכול להתבצע באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים או ערכות מסחריות. יש לנקוט בזהירות מיוחדת כדי להשיג DNA כי הוא ללא מזהמים שיכולים לעכב את תגובת PCR.

אזורים שמורים בגן 16S rRNA מאפשרים תכנון של זוגות פריימר אוניברסליים (אחד קדימה ואחד הפוך) שיכולים להיקשר ולהגביר את אזור היעד בכל מין חיידקי. אזור היעד עשוי להשתנות בגודלו. בעוד שזוגות פריימר מסוימים יכולים להגביר את רוב הגן 16S rRNA, אחרים מגבירים רק חלקים ממנו. דוגמאות של פריימרים נפוצים מוצגות בטבלה 1 ואתרי האיגוד שלהם מתוארים באיור 2.

שם פריימר	רצף (5'→3')	קדימה/הפוך	הפניה
8F ^b)	AGAGTTTGATCCTGGCTCAG	קדימה	-1
27F	AGAGTTTGATCMTGGCTCAG	קדימה	-10
515F	GTGCCAGCMGCCGCGGTAA	קדימה	-11
911R	GCCCCCGTCAATTCMTTTGA	הפוך	-12
1391R	GACGGGCGGTGTGTRCA	הפוך	-11
1492R	GGTTACCTTGTTACGACTT	הפוך	-11

טבלה 1: דוגמאות של אוליגונוקלאוטידים סטנדרטיים המשמשים להגברה של 16S rRNA גנים ^a).
^א) ניתן להעריך את האורכים הצפויים של מוצר ה- PCR שנוצר באמצעות שילובי פריימר שונים על-ידי חישוב המרחק בין אתרי האיגוד עבור הפוריימר קדימה לבין הפריימר ההפוך (ראה איור 2), למשל גודל מוצר ה- PCR באמצעות זוג פריימר 8F-1492R הוא ~ 1500 bp, ולזוג פריימר 27F-911R ~ 900 bp.
^ב) הידוע גם בשם fD1

איור 2: דמות מייצגת של רצף rRNA 16S ואתרי איגוד הפריימר. אזורים שמורים נצבעים באפור ואזורים משתנים מלאים בקווים אלכסוניים. כדי לאפשר את הרזולוציה הגבוהה ביותר, פריימר 8F ו- 1492R (שם המבוסס על מיקום על רצף rRNA) משמשים להגברת הרצף כולו, ומאפשרים רצף של מספר אזורים משתנים של הגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תנאי הרכיבה על אופניים עבור PCR (כלומר הטמפרטורה והזמן הנדרשים עבור ה- DNA להיות denatured, חישול עם פריימרים, מסונתז) תלויים בסוג של פולימראז המשמש ואת המאפיינים של פריימרים. מומלץ לעקוב אחר הנחיות היצרן עבור פולימראז מסוים.

לאחר השלמת תוכנית ה- PCR, המוצרים מנותחים על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז. PCR מוצלח מניב רצועה אחת בגודל הצפוי. יש לטהר את המוצר לפני הרצף כדי להסיר פריימרים שיורית, deoxyribonucleotides, פולימראז, חוצץ אשר היו נוכחים בתגובת PCR. שברי הדנ"א המטוהרים נשלחים בדרך כלל לרצף לשירותי רצף מסחריים; עם זאת, מוסדות מסוימים מבצעים ריצוף DNA במתקני הליבה שלהם.

רצף הדנ"א נוצר באופן אוטומטי מכרומטוגרמה DNA על ידי מחשב ויש לבדוק אותו בקפידה לאיכות, שכן לעתים יש צורך בעריכה ידנית. לאחר שלב זה, רצף הגנים מושווה לרצפים שהופקדו במסד הנתונים של 16S rRNA. אזורי הדמיון מזוהים, והרצפים הדומים ביותר מועברים.

Procedure

1. ערוך

בעת טיפול במיקרואורגניזמים, יש לעקוב אחר פרקטיקה מיקרוביולוגית טובה. כל המיקרואורגניזמים, במיוחד דגימות לא ידועות, צריכים להיות מטופלים כאל פתוגנים פוטנציאליים. בצע טכניקה אספטית כדי למנוע זיהום הדגימות, החוקרים, או המעבדה. יש לשטוף ידיים לפני ואחרי הטיפול בחיידקים, להשתמש בכפפות וללבוש ביגוד מגן.
בצע הערכת סיכונים עבור הפרוטוקול הניסיוני לבידוד DNA גנומי וטיהור מוצר PCR. ריאגנטים מסוימים עלולים להזיק!
תרבות טהורה חיונית לרצף 16S rRNA. לפני שתמשיכו לבידוד הדנ"א הגנומי, ודאו שהחומר ההתחלתי טהור לחלוטין. זה יכול להיעשות על ידי ציפוי פסים כדי לבודד מושבות בודדות. אלה יכולים לגדול עוד יותר פסים על צלחות בנפרד, או מרק, במידת הצורך.
ציוד מעבדה נדרש:
1. רוכב אופניים תרמי עבור פי.סי.אר. הפונקציה של רוכב האופניים התרמי היא להעלות ולהוריד את הטמפרטורה על פי תוכנית מוגדרת. בעת יצירת התוכנית תתבקש להזין את ערכי הטמפרטורה והשעה עבור כל שלב PCR, כמו גם מספר מחזורים כולל.
2. מערכת אלקטרופורזה ג'ל אגרוז. הוא משמש להפרדת שברי DNA בהתבסס על גודלם ומטעןם. בפרוטוקול זה, אלקטרופורזה ג'ל אגרוז ישמש כדי לדמיין את האיכות של DNA גנומי מבודד ומוצרי PCR.

2. פרוטוקול

הערה: הפרוטוקול המודגם חל על ריצוף גנים 16S rRNA מתרבית חיידקים טהורה. זה לא חל על מחקרים מטגנומיים.

פולחן חיידקים לבידוד של DNA גנומי (gDNA).
1. הגדל את המיקרואורגניזם שלך במדיום מתאים. ניתן להשתמש הן במדיה נוזלית והן במדיה מוצקה בשלב זה. בחר תנאים שמניבים את הצמיחה הטובה ביותר. בעת תכנון הניסוי, יש לזכור כי חיידקים הגדלים באיטיות עשויים להזדקק למספר ימים כדי להגיע לשלב הצמיחה המאוחרת/ נייחת. בפרוטוקול זה, Bacillus subtilis 168 גדל מרק ליסוגניה (LB) לילה בחממה רועדת להגדיר ב 200 סל"ד, 37 °C.
בידוד של GDNA.
1. אם חיידקים גדלו על מדיום מוצק, לגרד כמה תאים באמצעות לולאה סטרילית resuspend אותם 1 מ"ל של מים מזוקקים
2. אם חיידקים גדלו במדיום נוזלי, השתמש כ 1.5 מ"ל של תרבות לילה.
3. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה (דקה אחת, 12,000 - 16,000 × גרם), להסיר את supernatant, ולהשתמש בתאים לבידוד gDNA באמצעות ערכה מסחרית או פרוטוקולים סטנדרטיים [למשל CTAB הכולל הכנת DNA (13) או מיצוי פנול-כלורופורם (14)]. כאן, ערכה מסחרית שימשה כדי לבודד gDNA מ 1.5 מ"ל של B. subtilis 168 תרבות לילה, OD₆₀₀ = 1.5.
  הערה 1: עבור חיידקים גרם שליליים מסוימים ניתן להשמיט שלב זה ולהחליף על ידי שחרור פשוט של DNA מהתאים על ידי רותחים. כדור חיידקי resuspend במים מזוקקים ודגרה בבלוק חימום להגדיר על 100 °C (10 דקות).
  הערה 2: קשה לשבש תאי חיידקים חיוביים גרם. לכן מומלץ לבחור שיטת בידוד gDNA או ערכה המוקדשת לבידוד מקבוצת חיידקים זו.
בדיקת איכות gDNA.
1. בדוק את האיכות של gDNA מבודד על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז. ראשית, לערבב 5 μL של gDNA מבודד עם 1 μL של צבע הטעינה (6x), לטעון את המדגם על ג'ל אגרוז 0.8% המכיל ריאגנט מכתים DNA.
2. לטעון תקן מסה מולקולרית ולהפעיל את האלקטרופורזה עד חזית הצבע מגיע לתחתית הג'ל.
3. לאחר השלמת האלקטרופורזה, דמיינו את הג'ל על טרנסילומינטור מתאים (אור UV או כחול). gDNA מופיע כפס מולקולרי גבוה ועבה (מעל 10 kb). דוגמה לבדיקת האיכות של gDNA מוצגת באיור 3.
4. אם ה- gDNA עובר את בקרת האיכות (כלומר,הרצועה המולקולרית הגבוהה קיימת ויש מעט מאוד מריחה של ה- gDNA), לדלל את ה- gDNA שלך באופן סדרתי על ידי תיוג ראשון 3 צינורות microcentrifuge כדלקמן: "10x", "100x" ו -"1000x".
5. פיפטה 90 μL של מים מזוקקים סטריליים לתוך כל אחד 3 צינורות.
6. קח 10 μL של פתרון gDNA ולהוסיף אותו לצינור מסומן "10x".
7. הזרימו את כל הנפח(כלומר 100 μL) למעלה ולמטה ביסודיות כדי להבטיח שהפתרון מעורבב באופן אחיד. לאחר מכן, לקחת 10 μL של הפתרון מן הצינור הזה ולהעביר אותו לצינור מסומן "100x".
8. לערבב כמתואר לפני ולחזור על אותו הליך על ידי העברת 10 μL של הפתרון מצינור "100x" לצינור "1000x". דילולים אלה ישמשו כתבנית בתגובת ה- PCR.

איור 3: אלקטרופורזה ג'ל אגרוז של gDNA מבודד Bacillus subtilis. נתיב 1: M - סמן מסה מולקולרית (מלמעלה למטה: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp). נתיב 2: gDNA - DNA גנומי מבודד מבצילוס סובטיליס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הגברה של גן 16S rRNA על ידי PCR.
הערה: פרוטוקול PCR להלן מותאם לפולימראז DNA מסוים וזוג פריימר 8F - 1492R (ראה טבלה 1). אופטימיזציה של הפרוטוקול נדרשת עבור כל זוג פולימראז ופריימר.
1. להפשיר את כל הריאגנטים על קרח.
2. הכן את תערובת המאסטר של PCR כפי שמוצג בטבלה 2. מאז פולימראז DNA פעיל בטמפרטורת החדר, הגדרת התגובה חייבת להתבצע על קרח, כלומר צינורות PCR ואת רכיבי התגובה צריך להישמר על קרח כל הזמן. הכן תגובה אחת לכל דגימת gDNA ותגובה אחת לשליטה שלילית. שליטה שלילית היא תערובת PCR ללא תבנית gDNA ומשמשת כדי להבטיח כי הרכיבים האחרים של התגובה אינם מזוהמים.
  הערה: במקרה של דגימות מרובות, תערובת מאסטר מוכנה בדרך כלל. תמהיל ראשי הוא פתרון המכיל את כל רכיבי התגובה למעט התבנית. זה עוזר להשמיט צנרת חוזרת, למנוע שגיאת pipetting, ומבטיח עקביות גבוהה בין הדגימות. כדי להכין תערובת ראשית, הכפל את עוצמת הקול של כל רכיב (למעט תבנית ה- DNA) במספר הדגימות שנבדקו. מערבבים את כל הרכיבים בצינור microcentrifuge וצינור את כל הנפח למעלה ולמטה מספר פעמים.
3. Aliquot 49 μL של תערובת מאסטר לתוך צינורות PCR בודדים.
4. הוסף תבנית μL אחת לצינורות עם תערובת ראשית. לשליטה שלילית להוסיף 1 μL של מים סטריליים. כדי להבטיח כי הרכיבים מעורבים היטב, בעדינות pipet את התערובת למעלה ולמטה ~ 10 פעמים עם pipette להגדיר 30-50μL.
5. הגדר את מחשב ה- PCR עם התוכנית המוצגת בטבלה 3.
6. שים את הצינורות במכונת PCR ולהתחיל את התוכנית.
7. לאחר השלמת התוכנית, לבחון את איכות המוצר PCR שלך על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז.
8. תגובת PCR מוצלחת באמצעות צמד פריימר 8F-1492R מניבה רצועה אחת של כ- 1.5 kb (איור 4). אם קיימים רצועות אחרות (כלומר מוצרים לא מוגדרים), מיטוב תוכנית ה- PCR על-ידי התאמת טמפרטורת ה- annealing. אם קיימת רצועה אחת בגודל צפוי, המשך לשלב הבא. כאן, תגובת PCR עם תבנית gDNA מדוללת פי 100 הניבה את המוצר הטוב ביותר מכיוון שהיה לה רצועה חדה בגודל הצפוי וחסרה מוצרים לא יפים. לפיכך הוא נבחר להיות מטוהר ונשלח לרצף.
9. לפני הרצף, יש לנקות את המוצר משיורי פריימרים, deoxyribonucleotides, פולימראז, חוצץ אשר היו נוכחים בתגובת PCR. ניתן לבודד את מוצרי ה- PCR באמצעות ערכת טיהור PCR מסחרית. תגובת ה- PCR נטענת בעמודה המכילה מטריצת איגוד DNA. מוצר ה- PCR מאוגד לעמודה, בעוד שרכיבים אחרים זורמים דרך העמודה. לאחר מכן, העמוד נשטף באמצעות חיץ כביסה, ולבסוף, הדנ"א נחוץ במאגר הבחירה. ודא שמאגר ההבעה בתוספת הערכה תואם לרצף.
10. שלח את מוצר ה- PCR המטוהר לרצף דנ"א. פעל בהתאם להנחיות להגשת דגימות ריצוף במתקן הרצף שנבחר. לקבלת כיסוי הרצף הטוב ביותר, השתמש בפריימרים להגברת PCR (זהים לנעשה בהם שימוש בסעיף 2.4.1) כפריימרים רצפים. כאן, פריימרים 8F ו 1492R שימשו לרצף את מוצר PCR.

רכיב	ריכוז סופי	עוצמת קול לכל תגובה	עוצמת קול לתגובות x (עירוב ראשי)
מאגר תגובה 5x	1x	10 μL	10 μL × x
10 mM dNTPs	200 מיקרומטר	1 μL	1 μL × x
10 מיקרומטר פריימר 8F	0.5 מיקרומטר	2.5 μL	2.5 μL × x
10 מיקרומטר פריימר 1492R	0.5 מיקרומטר	2.5 μL	2.5 μL × x
פוציון פולימראז	יחידה אחת	0.5 μL	0.5 μL × x
DNA של תבנית *	-	1 μL	-
ddH₂O	-	32.5 μL	32.5 μL × x
סה"כ אמצעי אחסון		50 μL	49 μL × x

טבלה 2: רכיבי תגובת פי.סי.אר. * השתמש ב-gDNA 10x, 100x או 1000x מדולל מהשלב 2.3.

צעד	טמפרטורה	זמן	מחזורים
denaturation ראשונית	98°C	30 שניות
דנטורציה	98°C	10 שניות	25-30
חישול	60°C	30 שניות
סיומת	72°C	45 שניות
הארכה סופית	72°C	7 דקות
אחז	4°C	∞

טבלה 3: תוכנית PCR להגברת הגן 16S rRNA.

איור 4: אלקטרופורזה ג'ל אגרוז של מוצרי PCR מוגבר באמצעות פריימרים 8F ו 1492R ו- gDNA כתבנית. דגימת ה-gDNA מ-B. subtilis (ראו איור 3) דולדה 10, 100 ו-1000 פעמים כדי לבדוק את התוצאה הטובה ביותר. נתיב 1: M - סמן מסה מולקולרית (מלמעלה למטה: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp). נתיב 2: תגובת PCR עם תבנית מדוללת פי 10. נתיב 3: תגובת PCR עם תבנית מדוללת 100x. נתיב 4: תגובת PCR עם תבנית מדוללת 1000x. נתיב 5: (C-) - שליטה שלילית (תגובה ללא תבנית ה- DNA). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. ניתוח נתונים ותוצאות

הערה: מוצר PCR הוא רצף באמצעות קדימה (כאן 8F) ואת הפריימרים ההפוכים (כאן 1492R). לכן, נוצרות שתי קבוצות של רצף נתונים, אחת עבור הפורוורד ואחת עבור פריימר הפוך. עבור כל רצף נוצרים לפחות שני סוגים של קובץ: i) קובץ טקסט המכיל את רצף ה- DNA ו- ii) כרומטוגרמה של DNA, המציגה את איכות ריצת הרצף.

עבור הפריימר הקדמי, פתח את הכרומטוגרמה, ובחן בקפידה את הרצף. כרומטוגרמה אידיאלית לרצף איכות צריכה להיות פסגות מרווחות באופן שווה ואותות רקע מעטים או ללא אותות רקע (איור 5A).
אם הכרומטוגרמה אינה באיכות גבוהה, יש למחוק את הרצף, או לשנות את קובץ טקסט הרצף בהתאם לאפשרויות הבאות:
1. נוכחות של פסגות כפולות ברחבי הכרומטוגרמה מצביעה על נוכחות של תבניות DNA מרובות. זה יכול להיות המקרה אם התרבות החיידקית לא הייתה טהורה. יש לבטל רצף כזה (איור 5B).
2. כרומטוגרמה מעורפלת עשויה לנבוע מנוכחות של פסגות צבעוניות שונות באותו מיקום. אחת השגיאות הנפוצות ביותר היא נוכחות של שתי פסגות צבעוניות שונות באותו מיקום והקצאה לא נכונה של הבסיסים על ידי תוכנת הרצף (איור 5C). תקן באופן ידני את כל הנוקלאוטידים שהוקצו באופן שגוי וערוך אותם בקובץ הטקסט.
3. כרומטוגרמה ברזולוציה נמוכה עלולה לגרום ל"פסגות רחבות" שלעתים קרובות גורמות לספירה שגויה של הנוקלאוטידים באזורים אלה (איור 5D). שגיאה זו קשה לתיקון, ולכן אין להתייחס לאי-התאמות אפשריות בשלב היישור הנוסף כאמינים.
4. איכות קריאה ירודה של כרומטוגרמה ונוכחות של פסגות מרובות נראית בדרך כלל בקצוות של 5 ' ו -3 'של הרצף. תוכנות רצפים מסוימות מסירות קטעים באיכות נמוכה אלה באופן אוטומטי (איור 5E), והנוקלאוטידים אינם כלולים בקובץ הטקסט. אם הרצף שלך לא נחתך באופן אוטומטי, קבע את הקטעים באיכות נמוכה (למשל אות חלש, פסגות חופפות, אובדן רזולוציה) בקצוות והסר את הבסיסים המתאימים מקובץ הטקסט.

איור 5: דוגמאות לפתרון בעיות ברצף דנ"א. A) דוגמה לרצף כרומטוגרמה איכותי (פסגות חד-משמעיות בעלות מרווחים שווים). B) רצף איכות ירודה המתרחש בדרך כלל בתחילת הכרומטוגרמה. אזור האזור האפור נחשב לאיכות נמוכה והוסר באופן אוטומטי על-ידי תוכנת הרצף. ניתן לקצץ בסיסים נוספים באופן ידני. ג) נוכחות של פסגות כפולות (המצוינות על ידי חצים). נוקלאוטיד המצוין על ידי החץ האדום נקרא על ידי הרצף כ- "T" (פסגה אדומה), אך הפסגה הכחולה חזקה יותר, והיא יכולה להתפרש גם כ- "C". ד) פסגות חופפות מצביעות על זיהום DNA (כלומר יותר מתבנית אחת). ה) אובדן רזולוציה ומכונה "פסגות רחבות" (המסומנות במלבן) המונעות שיחות בסיס אמינות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

חזור על 3.1 ו-3.2 עבור הפריימר ההפוך.
לבסוף, להרכיב את הרצפים קדימה והפוך לתוך רצף רציף אחד. ריצת רצף טובה מניבה רצף של עד 1100 bp. בהתחשב בכך שמוצר ה- PCR הוא באורך ~ 1500 bp, הרצפים המתקבלים באמצעות פריימרים קדמיים והופוכים צריכים לחפוף חלקית.
1. מזג את שני הרצפים באמצעות תוכנית ההרכבה של רצף ה- DNA, למשל כלי חופשי כגון CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) (15).
2. הוסף את שני הרצפים בתבנית FASTA לתיבה שצוינה. לחץ על לחצן "שלח" והמתן לחזרת התוצאות.
3. כדי להציג את הרצף המורכב הקש "Contigs" בכרטיסיית התוצאה. כדי להציג את פרטי היישור, הקש על "פרטי ההרכבה".
  הערה 1: אם תוכנת CAP3 משמשת להרכבה contig אין צורך להמיר את רצף פריימר הפוך לתוך הפוך משלים; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בשלב זה אם נעשה שימוש בתוכנית אחרת.
  הערה 2: תבנית FASTA היא תבנית מבוססת טקסט המייצגת את רצף הנוקלאוטידים. השורה הראשונה (שורת התיאור) בקובץ FASTA מתחילה בסימן ">" ואחריו השם או המזהה הייחודי של הרצף. לאחר שורת התיאור נמצא רצף הנוקלאוטידים. הדבק את הרצפים בתבנית הבאה:
  
  >sequence_frw_primer
  הדבק את הרצף מקובץ הטקסט כאן
  >sequence_rvs_primer
  הדבק את הרצף מקובץ הטקסט כאן
ערוך חיפוש במסד נתונים על-ידי ביקור באתר האינטרנט עבור כלי חיפוש היישור המקומי הבסיסי (BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
1. בחר בכלי "Nucleotide BLAST" כדי להשוות את הרצף למסד הנתונים.
2. הזן את הרצף שלך (הרצף שהורכב ב- 3.5) בתיבת הטקסט "רצף שאילתות", ולאחר מכן בחר את מסד הנתונים "רצפי rRNA 16S (חיידקים וארצ'יה)" בתפריט הגלילה למטה.
3. לחץ על לחצן "BLAST" בתחתית העמוד. הרצפים הדומים ביותר יוחזרו. תוצאת BLAST לדוגמה מוצגת באיור 6. בניסוי שהוצג הלהיט העליון הוא B. subtilis זן 168, מראה 100% זהות עם הרצף זמין במסד הנתונים BLAST.
4. אם הלהיט העליון אינו מציג 100% זהות, עבור ליישור ובדוק אם יש אי-התאמות. בעת לחיצה על הלהיט העליון, תופנה לפרטי היישור. נוקלאוטידים מיושרים יצטרפו לקווים אנכיים קצרים בעוד לנוקלאוטידים לא תואמים יש פער ביניהם. חזור לכרומטוגרמה שקיבלת מחברת הרצף ושנה את הרצף שוב תוך התמקדות באזור שאינו תואם. תקן את הרצף אם נמצאו שגיאות נוספות. הפעל שוב את BLAST באמצעות הרצף המתוקן.

איור 6: דוגמה לתוצאה של נוקלאוטיד BLAST. רצף גנים rRNA 16S מתרבות טהורה של B. subtilis 168 שימש כרצף שאילתות. הלהיט העליון מראה 100% זהות (הדגיש) לזן B. subtilis 168, כצפוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Application and Summary

זיהוי מינים חיידקיים חשוב לחוקרים שונים, כמו גם עבור אלה בתחום הבריאות. רצף rRNA 16S שימש בתחילה על ידי החוקרים כדי לקבוע יחסים פילוגנטיים בין חיידקים. עם הזמן, זה יושם במחקרים metagenomic כדי לקבוע את המגוון הביולוגי של דגימות סביבתיות במעבדות קליניות כשיטה לזהות פתוגנים פוטנציאליים. היא מאפשרת זיהוי מהיר ומדויק של חיידקים הנמצאים בדגימות קליניות, מקלה על אבחון מוקדם יותר וטיפול מהיר יותר בחולים.

References

Weisburg, W.G., Barns, S.M., Pelletier, D.A. and Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J Bacteriol. 173 (2): 697-703. (1991)
Drancourt, M., Bollet, C., Carlioz, A., Martelin, R., Gayral, J.P., Raoult D. 16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates. J Clin Microbiol. 38 (10):3623-3630. (2000)
Woo, P.C., Lau, S.K., Teng, J.L., Tse, H., Yuen, K.Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clin Microbiol Infect. 14 (10):908-934. (2008)
Tang, Y.W., Ellis, N.M., Hopkins, M.K., Smith, D.H., Dodge, D.E., Persing, D.H. Comparison of phenotypic and genotypic techniques for identification of unusual aerobic pathogenic gram-negative bacilli. J Clin Microbiol. 36 (12):3674-3679. (1998)
Tsiboli, P., Herfurth, E., Choli, T. Purification and characterization of the 30S ribosomal proteins from the bacterium Thermus thermophilus. Eur J Biochem. 226 (1):169-177. (1994)
Woese, C.R. Bacterial evolution. Microbiol Rev. 51 (2):221-271. (1987)
Bartlett, J.M., Stirling, D. A short history of the polymerase chain reaction. Methods Mol Biol. 226:3-6. (2003)
Wilson, K.H., Blitchington, R.B., Greene, R.C. Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chain reaction. J Clin Microbiol. 28 (9):1942-1946. (1990)
Shendure, J., Balasubramanian, S., Church, G.M., Gilbert, W., Rogers, J., Schloss, J.A., Waterston, R.H. (2017) DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature. 550:345-353.
Lane, D.J. 16S/23S rRNA sequencing. (1991) In Nucleic acid techniques in bacterial systematics. (Goodfellow, M. and Stackebrandt, E., eds.) p.115-175. Wiley and Sons, Chichester, United Kingdom.
Turner, S., Pryer, K.M., Miao, V.P., Palmer, J.D. (1999) Investigating deep phylogenetic relationships among cyanobacteria and plastids by small subunit rRNA sequence analysis. J Eukaryot Microbiol. 46:327-338.
Fredricks, D.N., Relman, D.A. (1998) Improved amplification of microbial DNA from blood cultures by removal of the PCR inhibitor sodium polyanetholesulfonate. J Clin Microbiol. 36:2810-2816.
Wilson, K. Preparation of genomic DNA from bacteria. (2001) Curr Protoc Mol Biol. Chapter 2:Unit 2.4.
Wright, M. H., Adelskov, J., Greene, A.C. (2017) Bacterial DNA extraction using individual enzymes and phenol/chloroform separation. J Microbiol Biol Educ. 18:18.2.48.
Huang, X., Madan, A. (1999). CAP3: A DNA sequence assembly program. Genome Res. 9:868-877.

Tags

1. ערוך

בעת טיפול במיקרואורגניזמים, יש לעקוב אחר פרקטיקה מיקרוביולוגית טובה. כל המיקרואורגניזמים, במיוחד דגימות לא ידועות, צריכים להיות מטופלים כאל פתוגנים פוטנציאליים. בצע טכניקה אספטית כדי למנוע זיהום הדגימות, החוקרים, או המעבדה. יש לשטוף ידיים לפני ואחרי הטיפול בחיידקים, להשתמש בכפפות וללבוש ביגוד מגן.
בצע הערכת סיכונים עבור הפרוטוקול הניסיוני לבידוד DNA גנומי וטיהור מוצר PCR. ריאגנטים מסוימים עלולים להזיק!
תרבות טהורה חיונית לרצף 16S rRNA. לפני שתמשיכו לבידוד הדנ"א הגנומי, ודאו שהחומר ההתחלתי טהור לחלוטין. זה יכול להיעשות על ידי ציפוי פסים כדי לבודד מושבות בודדות. אלה יכולים לגדול עוד יותר פסים על צלחות בנפרד, או מרק, במידת הצורך.
ציוד מעבדה נדרש:
1. רוכב אופניים תרמי עבור פי.סי.אר. הפונקציה של רוכב האופניים התרמי היא להעלות ולהוריד את הטמפרטורה על פי תוכנית מוגדרת. בעת יצירת התוכנית תתבקש להזין את ערכי הטמפרטורה והשעה עבור כל שלב PCR, כמו גם מספר מחזורים כולל.
2. מערכת אלקטרופורזה ג'ל אגרוז. הוא משמש להפרדת שברי DNA בהתבסס על גודלם ומטעןם. בפרוטוקול זה, אלקטרופורזה ג'ל אגרוז ישמש כדי לדמיין את האיכות של DNA גנומי מבודד ומוצרי PCR.

2. פרוטוקול

הערה: הפרוטוקול המודגם חל על ריצוף גנים 16S rRNA מתרבית חיידקים טהורה. זה לא חל על מחקרים מטגנומיים.

פולחן חיידקים לבידוד של DNA גנומי (gDNA).
1. הגדל את המיקרואורגניזם שלך במדיום מתאים. ניתן להשתמש הן במדיה נוזלית והן במדיה מוצקה בשלב זה. בחר תנאים שמניבים את הצמיחה הטובה ביותר. בעת תכנון הניסוי, יש לזכור כי חיידקים הגדלים באיטיות עשויים להזדקק למספר ימים כדי להגיע לשלב הצמיחה המאוחרת/ נייחת. בפרוטוקול זה, Bacillus subtilis 168 גדל מרק ליסוגניה (LB) לילה בחממה רועדת להגדיר ב 200 סל"ד, 37 °C.
בידוד של GDNA.
1. אם חיידקים גדלו על מדיום מוצק, לגרד כמה תאים באמצעות לולאה סטרילית resuspend אותם 1 מ"ל של מים מזוקקים
2. אם חיידקים גדלו במדיום נוזלי, השתמש כ 1.5 מ"ל של תרבות לילה.
3. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה (דקה אחת, 12,000 - 16,000 × גרם), להסיר את supernatant, ולהשתמש בתאים לבידוד gDNA באמצעות ערכה מסחרית או פרוטוקולים סטנדרטיים [למשל CTAB הכולל הכנת DNA (13) או מיצוי פנול-כלורופורם (14)]. כאן, ערכה מסחרית שימשה כדי לבודד gDNA מ 1.5 מ"ל של B. subtilis 168 תרבות לילה, OD₆₀₀ = 1.5.
  הערה 1: עבור חיידקים גרם שליליים מסוימים ניתן להשמיט שלב זה ולהחליף על ידי שחרור פשוט של DNA מהתאים על ידי רותחים. כדור חיידקי resuspend במים מזוקקים ודגרה בבלוק חימום להגדיר על 100 °C (10 דקות).
  הערה 2: קשה לשבש תאי חיידקים חיוביים גרם. לכן מומלץ לבחור שיטת בידוד gDNA או ערכה המוקדשת לבידוד מקבוצת חיידקים זו.
בדיקת איכות gDNA.
1. בדוק את האיכות של gDNA מבודד על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז. ראשית, לערבב 5 μL של gDNA מבודד עם 1 μL של צבע הטעינה (6x), לטעון את המדגם על ג'ל אגרוז 0.8% המכיל ריאגנט מכתים DNA.
2. לטעון תקן מסה מולקולרית ולהפעיל את האלקטרופורזה עד חזית הצבע מגיע לתחתית הג'ל.
3. לאחר השלמת האלקטרופורזה, דמיינו את הג'ל על טרנסילומינטור מתאים (אור UV או כחול). gDNA מופיע כפס מולקולרי גבוה ועבה (מעל 10 kb). דוגמה לבדיקת האיכות של gDNA מוצגת באיור 3.
4. אם ה- gDNA עובר את בקרת האיכות (כלומר,הרצועה המולקולרית הגבוהה קיימת ויש מעט מאוד מריחה של ה- gDNA), לדלל את ה- gDNA שלך באופן סדרתי על ידי תיוג ראשון 3 צינורות microcentrifuge כדלקמן: "10x", "100x" ו -"1000x".
5. פיפטה 90 μL של מים מזוקקים סטריליים לתוך כל אחד 3 צינורות.
6. קח 10 μL של פתרון gDNA ולהוסיף אותו לצינור מסומן "10x".
7. הזרימו את כל הנפח(כלומר 100 μL) למעלה ולמטה ביסודיות כדי להבטיח שהפתרון מעורבב באופן אחיד. לאחר מכן, לקחת 10 μL של הפתרון מן הצינור הזה ולהעביר אותו לצינור מסומן "100x".
8. לערבב כמתואר לפני ולחזור על אותו הליך על ידי העברת 10 μL של הפתרון מצינור "100x" לצינור "1000x". דילולים אלה ישמשו כתבנית בתגובת ה- PCR.

איור 3: אלקטרופורזה ג'ל אגרוז של gDNA מבודד Bacillus subtilis. נתיב 1: M - סמן מסה מולקולרית (מלמעלה למטה: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp). נתיב 2: gDNA - DNA גנומי מבודד מבצילוס סובטיליס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הגברה של גן 16S rRNA על ידי PCR.
הערה: פרוטוקול PCR להלן מותאם לפולימראז DNA מסוים וזוג פריימר 8F - 1492R (ראה טבלה 1). אופטימיזציה של הפרוטוקול נדרשת עבור כל זוג פולימראז ופריימר.
1. להפשיר את כל הריאגנטים על קרח.
2. הכן את תערובת המאסטר של PCR כפי שמוצג בטבלה 2. מאז פולימראז DNA פעיל בטמפרטורת החדר, הגדרת התגובה חייבת להתבצע על קרח, כלומר צינורות PCR ואת רכיבי התגובה צריך להישמר על קרח כל הזמן. הכן תגובה אחת לכל דגימת gDNA ותגובה אחת לשליטה שלילית. שליטה שלילית היא תערובת PCR ללא תבנית gDNA ומשמשת כדי להבטיח כי הרכיבים האחרים של התגובה אינם מזוהמים.
  הערה: במקרה של דגימות מרובות, תערובת מאסטר מוכנה בדרך כלל. תמהיל ראשי הוא פתרון המכיל את כל רכיבי התגובה למעט התבנית. זה עוזר להשמיט צנרת חוזרת, למנוע שגיאת pipetting, ומבטיח עקביות גבוהה בין הדגימות. כדי להכין תערובת ראשית, הכפל את עוצמת הקול של כל רכיב (למעט תבנית ה- DNA) במספר הדגימות שנבדקו. מערבבים את כל הרכיבים בצינור microcentrifuge וצינור את כל הנפח למעלה ולמטה מספר פעמים.
3. Aliquot 49 μL של תערובת מאסטר לתוך צינורות PCR בודדים.
4. הוסף תבנית μL אחת לצינורות עם תערובת ראשית. לשליטה שלילית להוסיף 1 μL של מים סטריליים. כדי להבטיח כי הרכיבים מעורבים היטב, בעדינות pipet את התערובת למעלה ולמטה ~ 10 פעמים עם pipette להגדיר 30-50μL.
5. הגדר את מחשב ה- PCR עם התוכנית המוצגת בטבלה 3.
6. שים את הצינורות במכונת PCR ולהתחיל את התוכנית.
7. לאחר השלמת התוכנית, לבחון את איכות המוצר PCR שלך על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז.
8. תגובת PCR מוצלחת באמצעות צמד פריימר 8F-1492R מניבה רצועה אחת של כ- 1.5 kb (איור 4). אם קיימים רצועות אחרות (כלומר מוצרים לא מוגדרים), מיטוב תוכנית ה- PCR על-ידי התאמת טמפרטורת ה- annealing. אם קיימת רצועה אחת בגודל צפוי, המשך לשלב הבא. כאן, תגובת PCR עם תבנית gDNA מדוללת פי 100 הניבה את המוצר הטוב ביותר מכיוון שהיה לה רצועה חדה בגודל הצפוי וחסרה מוצרים לא יפים. לפיכך הוא נבחר להיות מטוהר ונשלח לרצף.
9. לפני הרצף, יש לנקות את המוצר משיורי פריימרים, deoxyribonucleotides, פולימראז, חוצץ אשר היו נוכחים בתגובת PCR. ניתן לבודד את מוצרי ה- PCR באמצעות ערכת טיהור PCR מסחרית. תגובת ה- PCR נטענת בעמודה המכילה מטריצת איגוד DNA. מוצר ה- PCR מאוגד לעמודה, בעוד שרכיבים אחרים זורמים דרך העמודה. לאחר מכן, העמוד נשטף באמצעות חיץ כביסה, ולבסוף, הדנ"א נחוץ במאגר הבחירה. ודא שמאגר ההבעה בתוספת הערכה תואם לרצף.
10. שלח את מוצר ה- PCR המטוהר לרצף דנ"א. פעל בהתאם להנחיות להגשת דגימות ריצוף במתקן הרצף שנבחר. לקבלת כיסוי הרצף הטוב ביותר, השתמש בפריימרים להגברת PCR (זהים לנעשה בהם שימוש בסעיף 2.4.1) כפריימרים רצפים. כאן, פריימרים 8F ו 1492R שימשו לרצף את מוצר PCR.

רכיב	ריכוז סופי	עוצמת קול לכל תגובה	עוצמת קול לתגובות x (עירוב ראשי)
מאגר תגובה 5x	1x	10 μL	10 μL × x
10 mM dNTPs	200 מיקרומטר	1 μL	1 μL × x
10 מיקרומטר פריימר 8F	0.5 מיקרומטר	2.5 μL	2.5 μL × x
10 מיקרומטר פריימר 1492R	0.5 מיקרומטר	2.5 μL	2.5 μL × x
פוציון פולימראז	יחידה אחת	0.5 μL	0.5 μL × x
DNA של תבנית *	-	1 μL	-
ddH₂O	-	32.5 μL	32.5 μL × x
סה"כ אמצעי אחסון		50 μL	49 μL × x

טבלה 2: רכיבי תגובת פי.סי.אר. * השתמש ב-gDNA 10x, 100x או 1000x מדולל מהשלב 2.3.

צעד	טמפרטורה	זמן	מחזורים
denaturation ראשונית	98°C	30 שניות
דנטורציה	98°C	10 שניות	25-30
חישול	60°C	30 שניות
סיומת	72°C	45 שניות
הארכה סופית	72°C	7 דקות
אחז	4°C	∞

טבלה 3: תוכנית PCR להגברת הגן 16S rRNA.

איור 4: אלקטרופורזה ג'ל אגרוז של מוצרי PCR מוגבר באמצעות פריימרים 8F ו 1492R ו- gDNA כתבנית. דגימת ה-gDNA מ-B. subtilis (ראו איור 3) דולדה 10, 100 ו-1000 פעמים כדי לבדוק את התוצאה הטובה ביותר. נתיב 1: M - סמן מסה מולקולרית (מלמעלה למטה: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp). נתיב 2: תגובת PCR עם תבנית מדוללת פי 10. נתיב 3: תגובת PCR עם תבנית מדוללת 100x. נתיב 4: תגובת PCR עם תבנית מדוללת 1000x. נתיב 5: (C-) - שליטה שלילית (תגובה ללא תבנית ה- DNA). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. ניתוח נתונים ותוצאות

הערה: מוצר PCR הוא רצף באמצעות קדימה (כאן 8F) ואת הפריימרים ההפוכים (כאן 1492R). לכן, נוצרות שתי קבוצות של רצף נתונים, אחת עבור הפורוורד ואחת עבור פריימר הפוך. עבור כל רצף נוצרים לפחות שני סוגים של קובץ: i) קובץ טקסט המכיל את רצף ה- DNA ו- ii) כרומטוגרמה של DNA, המציגה את איכות ריצת הרצף.

עבור הפריימר הקדמי, פתח את הכרומטוגרמה, ובחן בקפידה את הרצף. כרומטוגרמה אידיאלית לרצף איכות צריכה להיות פסגות מרווחות באופן שווה ואותות רקע מעטים או ללא אותות רקע (איור 5A).
אם הכרומטוגרמה אינה באיכות גבוהה, יש למחוק את הרצף, או לשנות את קובץ טקסט הרצף בהתאם לאפשרויות הבאות:
1. נוכחות של פסגות כפולות ברחבי הכרומטוגרמה מצביעה על נוכחות של תבניות DNA מרובות. זה יכול להיות המקרה אם התרבות החיידקית לא הייתה טהורה. יש לבטל רצף כזה (איור 5B).
2. כרומטוגרמה מעורפלת עשויה לנבוע מנוכחות של פסגות צבעוניות שונות באותו מיקום. אחת השגיאות הנפוצות ביותר היא נוכחות של שתי פסגות צבעוניות שונות באותו מיקום והקצאה לא נכונה של הבסיסים על ידי תוכנת הרצף (איור 5C). תקן באופן ידני את כל הנוקלאוטידים שהוקצו באופן שגוי וערוך אותם בקובץ הטקסט.
3. כרומטוגרמה ברזולוציה נמוכה עלולה לגרום ל"פסגות רחבות" שלעתים קרובות גורמות לספירה שגויה של הנוקלאוטידים באזורים אלה (איור 5D). שגיאה זו קשה לתיקון, ולכן אין להתייחס לאי-התאמות אפשריות בשלב היישור הנוסף כאמינים.
4. איכות קריאה ירודה של כרומטוגרמה ונוכחות של פסגות מרובות נראית בדרך כלל בקצוות של 5 ' ו -3 'של הרצף. תוכנות רצפים מסוימות מסירות קטעים באיכות נמוכה אלה באופן אוטומטי (איור 5E), והנוקלאוטידים אינם כלולים בקובץ הטקסט. אם הרצף שלך לא נחתך באופן אוטומטי, קבע את הקטעים באיכות נמוכה (למשל אות חלש, פסגות חופפות, אובדן רזולוציה) בקצוות והסר את הבסיסים המתאימים מקובץ הטקסט.

איור 5: דוגמאות לפתרון בעיות ברצף דנ"א. A) דוגמה לרצף כרומטוגרמה איכותי (פסגות חד-משמעיות בעלות מרווחים שווים). B) רצף איכות ירודה המתרחש בדרך כלל בתחילת הכרומטוגרמה. אזור האזור האפור נחשב לאיכות נמוכה והוסר באופן אוטומטי על-ידי תוכנת הרצף. ניתן לקצץ בסיסים נוספים באופן ידני. ג) נוכחות של פסגות כפולות (המצוינות על ידי חצים). נוקלאוטיד המצוין על ידי החץ האדום נקרא על ידי הרצף כ- "T" (פסגה אדומה), אך הפסגה הכחולה חזקה יותר, והיא יכולה להתפרש גם כ- "C". ד) פסגות חופפות מצביעות על זיהום DNA (כלומר יותר מתבנית אחת). ה) אובדן רזולוציה ומכונה "פסגות רחבות" (המסומנות במלבן) המונעות שיחות בסיס אמינות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

חזור על 3.1 ו-3.2 עבור הפריימר ההפוך.
לבסוף, להרכיב את הרצפים קדימה והפוך לתוך רצף רציף אחד. ריצת רצף טובה מניבה רצף של עד 1100 bp. בהתחשב בכך שמוצר ה- PCR הוא באורך ~ 1500 bp, הרצפים המתקבלים באמצעות פריימרים קדמיים והופוכים צריכים לחפוף חלקית.
1. מזג את שני הרצפים באמצעות תוכנית ההרכבה של רצף ה- DNA, למשל כלי חופשי כגון CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) (15).
2. הוסף את שני הרצפים בתבנית FASTA לתיבה שצוינה. לחץ על לחצן "שלח" והמתן לחזרת התוצאות.
3. כדי להציג את הרצף המורכב הקש "Contigs" בכרטיסיית התוצאה. כדי להציג את פרטי היישור, הקש על "פרטי ההרכבה".
  הערה 1: אם תוכנת CAP3 משמשת להרכבה contig אין צורך להמיר את רצף פריימר הפוך לתוך הפוך משלים; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בשלב זה אם נעשה שימוש בתוכנית אחרת.
  הערה 2: תבנית FASTA היא תבנית מבוססת טקסט המייצגת את רצף הנוקלאוטידים. השורה הראשונה (שורת התיאור) בקובץ FASTA מתחילה בסימן ">" ואחריו השם או המזהה הייחודי של הרצף. לאחר שורת התיאור נמצא רצף הנוקלאוטידים. הדבק את הרצפים בתבנית הבאה:
  
  >sequence_frw_primer
  הדבק את הרצף מקובץ הטקסט כאן
  >sequence_rvs_primer
  הדבק את הרצף מקובץ הטקסט כאן
ערוך חיפוש במסד נתונים על-ידי ביקור באתר האינטרנט עבור כלי חיפוש היישור המקומי הבסיסי (BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
1. בחר בכלי "Nucleotide BLAST" כדי להשוות את הרצף למסד הנתונים.
2. הזן את הרצף שלך (הרצף שהורכב ב- 3.5) בתיבת הטקסט "רצף שאילתות", ולאחר מכן בחר את מסד הנתונים "רצפי rRNA 16S (חיידקים וארצ'יה)" בתפריט הגלילה למטה.
3. לחץ על לחצן "BLAST" בתחתית העמוד. הרצפים הדומים ביותר יוחזרו. תוצאת BLAST לדוגמה מוצגת באיור 6. בניסוי שהוצג הלהיט העליון הוא B. subtilis זן 168, מראה 100% זהות עם הרצף זמין במסד הנתונים BLAST.
4. אם הלהיט העליון אינו מציג 100% זהות, עבור ליישור ובדוק אם יש אי-התאמות. בעת לחיצה על הלהיט העליון, תופנה לפרטי היישור. נוקלאוטידים מיושרים יצטרפו לקווים אנכיים קצרים בעוד לנוקלאוטידים לא תואמים יש פער ביניהם. חזור לכרומטוגרמה שקיבלת מחברת הרצף ושנה את הרצף שוב תוך התמקדות באזור שאינו תואם. תקן את הרצף אם נמצאו שגיאות נוספות. הפעל שוב את BLAST באמצעות הרצף המתוקן.

איור 6: דוגמה לתוצאה של נוקלאוטיד BLAST. רצף גנים rRNA 16S מתרבות טהורה של B. subtilis 168 שימש כרצף שאילתות. הלהיט העליון מראה 100% זהות (הדגיש) לזן B. subtilis 168, כצפוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Skip to...

0:01

Concepts

3:13

gDNA Isolation and Quality Check

3:43

Isolation of gDNA and gDNA Quality Check

5:52

Amplification and Purification of 16S rRNA Gene by PCR

7:20

Analysis of the DNA Sequences

9:02

Sequence Assembly and Database Search

Videos from this collection:

article

Now Playing

ריצוף rRNA 16S: טכניקה מבוססת PCR לזיהוי מינים חיידקיים

Microbiology

188.0K Views

article

יצירת טור וינוגרדסקי: שיטה להעשרת המינים המיקרוביאליים בדוגמת משקעים

Microbiology

128.2K Views

article

דילול סדרתי ו ציפוי: ספירה מיקרוביאלית

Microbiology

314.0K Views

article

תרביות העשרה: מיקרואורובים אירוביים ואנאירוביים פולחניים על מדיות סלקטיביות ודיפרנציאליות

Microbiology

131.7K Views

article

תרביות טהורות ו ציפוי פסים: בידוד מושבות חיידקיות בודדות מדגם מעורב

Microbiology

165.7K Views

article

עקומות צמיחה: יצירת עקומות צמיחה באמצעות יחידות יוצרות מושבה ומדידות צפיפות אופטית

Microbiology

293.1K Views

article

בדיקת רגישות אנטיביוטית: בדיקות אפסילומטר לקביעת ערכי המיקרופון של שתי אנטיביוטיקות והערכה של סינרגיה אנטיביוטית

Microbiology

93.4K Views

article

מיקרוסקופיה וכתמים: גרם, כמוסה וכתמים אנדוספור

Microbiology

362.5K Views

article

פלאק אסאי: שיטה לקביעת טיטר ויראלי כיחידות יוצרות פלאק (PFU)

Microbiology

185.7K Views

article

טרנספורמציה של תאי E. coli באמצעות הליך סידן כלוריד מותאם

Microbiology

86.3K Views

article

הטיות: שיטה להעברת עמידות אמפיצ'ין מתורם לנמען E. coli

Microbiology

38.1K Views

article

טרנסדוקציה של פאג': שיטה להעברת עמידות לאמפיצ'ילין מתורם לנמען E. coli

Microbiology

28.9K Views

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved