עקומות צמיחה: יצירת עקומות צמיחה באמצעות יחידות יוצרות מושבה ומדידות צפיפות אופטית

מקור: אנדרו ג'יי ואן אלסט¹, ריאנון מ. לה-ווק¹, נטליה מרטין¹, וויקטור ג'יי דיריטה^1
1 המחלקה למיקרוביולוגיה וגנטיקה מולקולרית, אוניברסיטת מדינת מישיגן, מזרח לנסינג, מישיגן, ארצות הברית

עקומות גדילה מספקות מידע רב ערך על קינטיקה של גדילה חיידקית ופיזיולוגיה של תאים. הם מאפשרים לנו לקבוע כיצד חיידקים מגיבים בתנאי גדילה משתנים, כמו גם להגדיר פרמטרי צמיחה אופטימליים עבור חיידק נתון. עקומת צמיחה ארכיטיפית מתקדמת דרך ארבעה שלבים של צמיחה: פיגור, מעריכי, נייח ומוות (1).

איור 1: עקומת גדילה חיידקית. חיידקים הגדלים בתרבות האצווה מתקדמים בארבעה שלבים של צמיחה: עיכוב, מעריכי, נייח ומוות. שלב ההשהיה הוא פרק הזמן שלוקח לחיידקים להגיע למצב פיזיולוגי המסוגל לצמיחה וחלוקה מהירה של תאים. שלב מעריכי הוא השלב של צמיחת תאים וחלוקה המהירים ביותר שבמהלכו שכפול DNA, שעתוק RNA וייצור חלבונים מתרחשים כולם בקצב קבוע ומהיר. שלב נייח מאופיין בהאטה ורמה של צמיחה חיידקית עקב מגבלה תזונתית ו/או הצטברות ביניים רעילה. שלב המוות הוא השלב שבו מתרחשת תמה של תאים כתוצאה ממגבלות תזונתיות חמורות.

שלב ההשהיה הוא פרק הזמן שלוקח לחיידקים להגיע למצב פיזיולוגי המסוגל לצמיחה וחלוקה מהירה של תאים. עיכוב זה מתרחש מכיוון שלוקח זמן לחיידקים להסתגל לסביבה החדשה שלהם. לאחר שהרכיבים התאיים הדרושים נוצרים בשלב ההשהיה, החיידקים נכנסים לשלב המעריכי של הצמיחה שבו שכפול DNA, שעתוק RNA וייצור חלבונים מתרחשים כולם בקצב קבוע ומהיר (2). קצב צמיחת התאים המהירים וחלוקתם במהלך השלב המעריכי מחושב כזמן ייצור, או זמן הכפלה, והוא הקצב המהיר ביותר שבו החיידקים יכולים לשכפל בתנאים הנתונים (1). זמן ההכפלה יכול לשמש כדי להשוות תנאי גדילה שונים כדי לקבוע מי נוח יותר עבור צמיחה חיידקית. שלב הגידול המעריכי הוא מצב הגידול הרב ביותר לשחזור, שכן פיזיולוגיה של תאי חיידקים עקבית בכל האוכלוסייה (3). שלב נייח עוקב אחר השלב המעריכי שבו רמות צמיחת התאים. שלב נייח מובא עקב דלדול מתזונה ו/או הצטברות של מתווכים רעילים. תאים חיידקיים ממשיכים לשרוד בשלב זה, אם כי קצב השכפול וחלוקת התאים מצטמצם באופן דרסטי. השלב האחרון הוא מוות, שבו דלדול מתזונה חמור מוביל לתדלוק של תאים. התכונות של עקומת הצמיחה המספקות את המידע הרב ביותר כוללות את משך שלב ההשהיה, זמן ההכפלה וצפיפות התא המרבית אליה הגיעה.

כימות של חיידקים בתרבית אצווה ניתן לקבוע באמצעות יחידות יוצרות מושבה ומדידות צפיפות אופטית. ספירה לפי יחידות יוצרות מושבה (CFU) מספקת מדידה ישירה של ספירת תאים חיידקיים. יחידת המדידה הסטנדרטית עבור CFU היא מספר החיידקים הניתנים לתחנות הקיימים לכל 1 מ"ל של תרבות (CFU / mL) שנקבעו על ידי דילול סדרתי וטכניקות ציפוי מתפשטות. עבור כל נקודת זמן, מבוצעת סדרת דילול של 1:10 של תרבות האצווה ו- 100 מיקרול של כל דילול מפוזרים באמצעות מפזר תאים.

איור 2. שרטוט ציפוי דילול סדרתי. זרימה כללית ל ציפוי דילול מתרבות האצווה. תרבות האצווה מדוללת באופן סדרתי 1:10 על-ידי העברת 1 מ"ל של הדילול הקודם לצינור הבא המכיל 9 מ"ל PBS. מכל צינור דילול, 100 μl הוא מפוזר מצופה באמצעות מפיץ צלחת שהוא דילול נוסף של 1:10 כפי שהוא 1/10^את הנפח של נפח 1 מ"ל בעת חישוב CFU / mL. צלחות הם דגירה והספירה פעם מושבות כלנית לגדול על הצלחות.

לאחר מכן הלוחות דוגרים בן לילה ומושבות כלונסאות נפרמות. לוח הדילול שצמח 30-300 מושבות משמש לחישוב CFU / mL עבור נקודת הזמן הנתונה (4, 5). וריאציה סטוכסטית בספירת המושבות מתחת לגיל 30 כפופה לשגיאה גדולה יותר בחישוב של CFU / mL וספירת מושבות הגדולות מ -300 ניתן להמעיט בערכן עקב צפיפות וחפיפה במושבה. באמצעות גורם הדילול עבור הצלחת הנתונה, ניתן לחשב את ה- CFU של תרבות האצווה עבור כל נקודת זמן.

צפיפות אופטית נותנת קירוב מיידי של ספירת תאים חיידקיים נמדד באמצעות ספקטרופוטומטר. הצפיפות האופטית היא מדד לספיגה של חלקיקי אור העוברים דרך 1 ס"מ של תרבות ומזוהים על ידי חיישן פוטודיודה (6). הצפיפות האופטית של תרבית נמדדת ביחס לתקשורת ריקה ומתגברת ככל שצפיפות החיידקים גדלה. עבור תאים חיידקיים, אורך גל של 600 ננומטר (OD600) משמש בדרך כלל בעת מדידת צפיפות אופטית (4). על ידי יצירת עקומה סטנדרטית הנוגעת ליחידות יצירת מושבה וצפיפות אופטית, ניתן להשתמש במדידת הצפיפות האופטית כדי להעריך בקלות את ספירת תאי החיידקים של תרבית אצווה. עם זאת, מערכת יחסים זו מתחילה להידרדר כבר 0.3 OD600 כמו תאים מתחילים לשנות צורה לצבור מוצרים חוץ תאיים במדיה, המשפיעים על קריאת הצפיפות האופטית כפי שהוא מתייחס CFU (7). שגיאה זו הופכת בולטת יותר במהלך שלבי נייח ומוות.

כאן, Escherichia coli גדל מרק לוריא-ברטאני (LB) ב 37 מעלות צלזיוס במהלך 30 שעות (7). הן עקומות צמיחה CFU / mL והן עקומות צמיחה בצפיפות אופטית נוצרו, כמו גם העקומה הסטנדרטית הנוגעת לצפיפות אופטית ל- CFU.

איור 3. Escherichia coli צפיפות אופטית באורך גל 600 ננומטר (OD600) עקומת גדילה. ערכי צפיפות אופטית נלקחו ישירות מהספקטרופוטומטר לאחר ריקון עם מדיית LB סטרילית. ערכי OD600 הגדולים מ- 1.0 דוללו 1:10 על-ידי שילוב של תרבות 100 מיקרול עם 900 μl LB טרי, נמדד שוב ולאחר מכן הוכפל ב- 10 כדי להשיג את הערך OD600. שלב זה נלקח כמו הדיוק במדידה של ספקטרופוטומטר מופחת בצפיפות תאים גבוהה. מהעיקול, שלב ההשהיה משתרע על 1h של צמיחה, מעברים לשלב מעריכי מ 2h ל 7h, ואז מתחיל לרמה, נכנס לשלב נייח. שלב המוות אינו מעבר מוחלט, עם זאת, כמו צפיפות אופטית בהדרגה מתחיל לרדת לאחר 15h.

איור 4. עקומת הצמיחה של מושבת Escherichia coli ליצירת יחידה למיליליטר (CFU/mL). ערכי CFU/mL עבור כל נקודת זמן חושבו מתוך לוח הדילול שהכיל 30-300 מושבות. מהעיקול, שלב ההשהיה משתרע על פני כ-2h של צמיחה, מעברים לשלב מעריכי מ-2h ל-7h, ואז מתחילים לרמה, נכנסים לשלב נייח. שלב המוות אינו מעבר מוחלט, עם זאת, כמו CFU / mL בהדרגה מתחיל לרדת לאחר 15 שעות משיא של 2 x 10⁹ לכ 5 x 10⁸ ב 30 שעות.

איור 5. עקומת תקינה עבור CFU/mL לעומת OD600. רגרסיה ליניארית יכולה לשמש כדי לקשר יחידות אלה, כך צפיפות אופטית עשויה לשמש צפיפות תאים חיידקי משוער. ניתן להשתמש בצפיפות אופטית כדי לספק קירוב מיידי של CFU / mL של תרבות האצווה. כאן, רק שש נקודות הזמן הראשונות מותוותות מכיוון שהקשר בין OD600 ל- CFU/mL פחות מדויק מעבר ל- 1.0 OD600 כאשר צורת התא ומוצרים חוץ-תאיים מתחילים להצטבר כאשר החיידקים נכנסים לשלב נייח, המתרחש זמן קצר לאחר שהגיעו ל- 1.0 OD600. שינויים בצורת התא ובמוצרים חוץ תאיים במדיה משפיעים על קריאת הצפיפות האופטית ולכן הקשר בין צפיפות אופטית למספר החיידקים בתרבות מושפע גם הוא.

זמן ההכפלה נקבע גם הוא להיות 15 דקות ו -19 שניות. מנתונים אלה, ניתן לדמיין את יכולת הצמיחה ב- LB עבור E. coli ולהשתמש בה להשוואה בין מדיה או חיידקים שונים.