זיהוי גנים הקשורים לפרופטוזיס והיפוקסיה בתאי אוליגודנדרוציטים שמקורם ב-iPSC מחולי טרשת נפוצה

מחקר זה מספק תובנות חדשות לגבי האינטראקציות בין היפוקסיה, פרופטוזיס וחדירה חיסונית בפתוגנזה של טרשת נפוצה (MS) באמצעות ניתוח ביואינפורמטיקה. על ידי שימוש בניתוח רשת ביטוי גנים משוקלל (WGCNA) וניתוח אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI), זיהינו שלושה גנים מרכזיים מרכזיים (ITGB1, ITGB8 ו-VIM).

טרשת נפוצה (MS) היא הפרעה דלקתית כרונית המאופיינת בדמיאלינציה, כאשר רמיאלינציה כושלת מובילה לאובדן אקסון מתקדם בשלבים כרוניים. תאי מבשר אוליגודנדרוציטים (OPCs) הם קריטיים לרמיאלינציה. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שגם היפוקסיה וגם פרופטוזיס ממלאים תפקידים מכריעים בהתמיינות הלא מתפקדת של OPCs. מחקר זה מבקש לזהות גנים מרכזיים הקשורים להיפוקסיה ופרופטוזיס ומאפייני חדירה חיסונית ב-OPCs שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) של חולי טרשת נפוצה ולבנות מודל אבחנתי המתמקד בגנים מרכזיים אלה.

ניתחנו נתוני ביטוי גנים ממערכי הנתונים של GSE196575 ו-GSE147315 והשווינו חולי טרשת נפוצה עם אנשים בריאים. באמצעות ניתוח רשת ביטוי גנים משוקלל (WGCNA), איתרנו גנים ראשוניים של מודול וגנים חיוניים הקשורים להיפוקסיה, פרופטוזיס וטרשת נפוצה. ציון הפרופטוזיס Z וציון ההיפוקסיה Z שחושבו באמצעות ניתוח וריאציה של סט גנים (GSVA) היו גבוהים יותר ב-OPCs שמקורם ב-iPSC של חולי טרשת נפוצה מאשר בקבוצת הביקורת. הגנים המעורבים קשורים בעיקר למסלול PI3K/Akt/mTOR, כפי שזוהה באמצעות ניתוחי העשרה של אונטולוגיה גנטית (GO) ואנציקלופדיה של קיוטו לגנים וגנומים (KEGG).

רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) של גנים חיוניים חשפה 10 גנים מרכזיים (COL4A1, COL4A2, ITGB5, ITGB1, ITGB8, ITGAV, VIM, FLNA, VCL ו-SPARC). הביטוי החזק של ITGB1, ITGB8 ו-VIM אומת במערך הנתונים של GSE151306, ותמך בתפקידם כגנים מרכזיים. בנוסף, רשת אינטראקציה בין גורמי שעתוק (TFs) וגנים מרכזיים הוקמה באמצעות קשרי רגולציה של שעתוק שנפרמו על ידי טקסט מבוסס משפט (TRRUST), שזיהה חמישה TFs מרכזיים. תוצאות מחקר זה עשויות לסייע בהבהרת סמנים ביולוגיים חדשים או מטרות טיפוליות לטרשת נפוצה.

טרשת נפוצה (MS) היא מצב דלקתי כרוני המאופיין בדמיאלינציה, המשפיע על כ-2.5 מיליון אנשים ברחבי העולם. רוב המאובחנים עם טרשת נפוצה מציגים מהלך מחלה התקפי-הפוגתי (RR). במהלך שלב ההישנות, דלקת חריפה מובילה לאובדן בלתי נמנע של מיאלין ואקסונים. לעומת זאת, במהלך הפוגה, ניתן לתקן נגעי דה-מיאלינציה על ידי רמיאלינציה, מתן תמיכה טרופית לאקסונים ומניעת אובדן אקסון מתקדם¹. כשל ברמיאלינציה מתרחש בשלבים הכרוניים של טרשת נפוצה ומוביל לניוון אקסונלי מתקדם².

תהליך הרמיאלינציה נמצא בקורלציה קריטית עם תאי מבשר אוליגודנדרוציטים (OPCs), הכוללים התפשטות ונדידה של OPCs כדי להתמיין לאוליגודנדרוציטים בוגרים (OLs), שהם התאים יוצרי המיאלין במערכת העצבים המרכזית (CNS)³. בשלבי המחלה הראשוניים, מספר ה-OLs החדשים שנוצרו על ידי OPCs סביב הנגעים הדמיאליניים נשמר יחסית ויכול לקדם בהצלחה רמיאלינציה⁴. עם זאת, בשלבים מתקדמים של טרשת נפוצה, הגירה לא מספקת והתמיינות של OPCs מובילים להפחתה ב-OLs חדשים ולפגיעה ברמיאלינציה⁵, ובכך מובילים לניוון עצבי ולהצטברות נכות.

שתי השערות הוצעו כדי להסביר את הניוון העצבי בטרשת נפוצה. ההשערה החיצונית מציעה כי התגובה החיסונית המופעלת על ידי תאי T מופעלים גורמת לדמיאלינציה כמו גם לניוון עצבי⁶. המודל הפנימי, לעומת זאת, מציע כי החריגות הפנימיות ב-OPCs⁷, OLs⁸ ותאים אחרים במערכת העצבים המרכזית עשויות לתרום לניוון עצבי. המודל הפנימי נחשב בעבר ישים רק בשלבים מתקדמים יותר של טרשת נפוצה, כגון טרשת נפוצה מתקדמת ראשונית או משנית (PPMS ו-SPMS). עם זאת, ניוון עצבי ללא תלות בדלקת או הישנות נצפה לאחרונה ב-RRMS ^9,10, מה שמצביע על כך שחריגות תאיות מהותיות עשויות להיות מעורבות בכל שלבי המחלה, כולל RRMS.

יתר על כן, פרופטוזיס, מסלול מוות תאי ייחודי הקשור להפרעות מטבוליות של שומנים בתיווך ברזל, ממלא תפקיד מרכזי בניוון עצבי. מסלול זה כרוך בחוסר איזון של מצבי חמצון חיזור תוך תאיים המונעים על ידי עודף ברזל, מה שמוביל להצטברות מי חמצן וייצור מיני חמצן תגובתיים (ROS), מה שבסופו של דבר גורם למוות חמצוני של תאים¹¹. מחלות ניווניות כמו מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון ומחלת הנטינגטון מקורן לעתים קרובות בנזק חמצוני לתאי עצב, המופעל לעתים קרובות על ידי ריכוזי ברזל גבוהים במיוחד בתוך הנגעים. בטרשת נפוצה, פגיעות מוגברת לנזק חמצוני, בשילוב עם תפקוד לקוי של המיטוכונדריה עקב תכולת השומנים הגבוהה וצריכת החמצן של תאי מערכת העצבים המרכזית, מקדמת חמצון שומנים, גורם קריטי בפרופטוזיס. OLs רגישים לחמצון שומנים, מאפיין חיוני של פרופטוזיס¹². שקיעת ברזל ליד נגעים דלקתיים בעמוד השדרה¹³ והפגיעות של OLs לחמצון שומנים¹⁴ ורדיקלים חופשיים¹⁵ מדגישים את הרגישות של טרשת נפוצה לפרופטוזיס.

היפוקסיה היא גורם קריטי נוסף בפתוגנזה של טרשת נפוצה התורמת לאובדן אוליגודנדרוציטים. עדויות לנזק דמוי היפוקסיה ויצירת ROS ותחמוצת חנקן (NO) בנגעים חריפים של טרשת נפוצה מצביעות על כך שגורמי לחץ כאלה עלולים לזרז תפקוד לקוי של המיטוכונדריה וגירעונות אנרגיה לאחר מכן¹⁶. לחץ מטבולי זה לא רק משפיע על OLs אלא גם פוגע באקסונים שכנים באמצעות שיבוש העברת אנרגיה¹⁷, שכן ערוצים מיאליניים מעבירים אנרגיה בין מעטפת המיאלין לחללים פרי-אקסונליים.

קשה מאוד לגשת ל-OPCs אנושיים ראשוניים ו-OLs של מערכת העצבים המרכזית בחולי טרשת נפוצה. לפיכך, OPCs ו-OLs אנושיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) התגלו ככלים מבטיחים לחקר ההפרעות המהותיות של טרשת נפוצה. לאור התפקידים המכריעים של פרופטוזיס והיפוקסיה בפתוגנזה של טרשת נפוצה והשפעתם על שושלת האוליגודנדרוציטים, מחקר זה השתמש בניתוח רשת ביטוי גנים משוקלל (WGCNA) כדי לחלץ מידע מודול¹⁸ ולהבהיר דפוסי ביטוי גנים הקשורים לתופעות אלה בטרשת נפוצה. על ידי סינון מקדמי המתאם בין גנים, אנו מסוגלים לזהות רשתות או מודולים זהים או דומים, ולשפוך אור על סמנים ביולוגיים חדשים או מטרות טיפוליות פוטנציאליות לטרשת נפוצה. בנוסף, על ידי התמקדות בגורמי השעתוק (TFs) המווסתים גנים קריטיים, מחקר זה מספק בסיס לחקירה נוספת של המנגנונים ואסטרטגיות ההתערבות הפוטנציאליות לטרשת נפוצה.

1. הורדת נתונים ועיבוד מקדים

1. הורד את מערכי הנתונים GSE196575 ו-GSE147315 מ-Gene Expression Omnibus (GEO).
2. מזג את שני מערכי הנתונים והסר אפקטים של אצווה, באמצעות פלטפורמת ניתוח מקוונת (ראה טבלת חומרים).
   1. בחר את מודול הביטוי | מודול מיזוג נתונים. העלה את שני קבצי מטריצת הביטוי כקבצי קלט ולחץ על הפעל כדי להפיק אוטומטית את המטריצה הממוזגת.
   2. צור קובץ ביאורים לדוגמה כגיליון אלקטרוני.
   3. בחר את מודול הביטוי | הסר מודול אפקט אצווה. הזן את קובץ ההערות והמטריצה הממוזגת ולחץ על הפעל כדי ליצור את המטריצה הממוזגת עם אפקט אצווה שהוסר (מטריצה ממוזגת 2).
3. נרמל את נתוני הביטוי באמצעות ערכות הנתונים של המיזוג, אפקט האצווה ותכונות הנורמליזציה הזמינות בפלטפורמת ניתוח מקוונת. בחר מודול ביטוי ונרמל את המודול. קלט ממוזג מטריצה 2 נוצר בשלב 1.2.3. לחץ על לחצן הפעלה . (ראה טבלת החומרים).
4. פלט את קובץ מטריצת הביטוי לאחר הפעלת כל התהליך שתואר לעיל. חלץ את מידע הקיבוץ בהתאם להתערבות הניתנת באתר GEO. הזן את המידע לעיל במסמך בפורמט ".txt" כדי ליצור את קובץ מידע הקיבוץ עבור מערך הנתונים הממוזג.

2. אנליזה דיפרנציאלית של גנים מבוטאים

1. בצע ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי באמצעות חבילת limma ב-R. הזן את קובץ מטריצת הביטוי וקובץ המידע של הקיבוץ. הגדר את קריטריוני הסינון ל- |logFC| = 1 ו - p < 0.05 כדי לזהות גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) הקשורים לטרשת נפוצה.

3. ניתוח העשרה פונקציונלית (GO ו-KEGG)

1. בצע ניתוח העשרה פונקציונלית עבור DEGs באמצעות מודולי GO ו-KEGG בפלטפורמות מקוונות.
   1. הגדרת אורגניזם המודל הוגדרה להומו ספיינס, כאשר גרסת Ensemble_109 היא קובץ הגנים הרקע והגנים כסוג הנתונים.
   2. הימנע ממונחי GO רחבים; מקד את הניתוח באמצעות ToppFun. החל מסננים כדי להגביל מונחים ל- 500 ו- 1,000 גנים משויכים.
      הערה: התוצאות ממסנן 500 הגנים מוצגות בכתב היד הראשי. תוצאות ה-GO המלאות זמינות באיור משלים S2. פלטפורמת KEGG המקוונת מוצגת באיור משלים S3.

4. ניתוח וריאציות של סט גנים לפרופטוזיס והיפוקסיה (GSVA)

1. אחזר בסך הכל 538 גנים הקשורים לפרופטוזיס מ-FerrDb ו-200 גנים הקשורים להיפוקסיה מ-MsigDB.
2. צור קבצים בפורמט GMT עבור שתי ערכות הגנים.
3. השתמש במודול GSVA כדי לחשב את ציון הפרופטוזיס Z ואת ציון ההיפוקסיה Z עבור כל דגימה במערך הנתונים הממוזג, והשתמש בקובץ מטריצת הביטוי, קובץ מידע הקיבוץ וקבצי GMT כקלט.
4. השווה את ציוני Z של קבוצות שונות (איור משלים S4).

5. ניתוח רשת ביטוי משותף משוקלל של גנים (WGCNA)

1. חלץ את ציון Z של פרופטוזיס והיפוקסיה של כל דגימה המחושבת בשלב 4.4. השתמש בציוני Z לעיל של פרופטוזיס והיפוקסיה כקבצי תכונות לצד קבצי מטריצת הביטוי כדי לזהות מודולי גנים מרכזיים הקשורים לפרופטוזיס והיפוקסיה.
2. השתמש במודול WGCNA והגדר R² = 0.9 וסף רך β = 18 כדי לבנות רשת ביטוי גנים משוקללת. התמקדו במודולים הקשורים באופן משמעותי הן לפרופטוזיס והן להיפוקסיה (איור משלים S4).

6. זיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי הקשורים לפרופטוזיס והיפוקסיה בחולי טרשת נפוצה

1. הצלבו את ה-DEGs הקשורים למחלה עם פרופטוזיס ומודולי גנים הקשורים להיפוקסיה באמצעות כלי דיאגרמת ון בפלטפורמת ניתוח מקוונת (איור משלים S3). לזהות את הגנים הקשורים הן לפרופטוזיס והן להיפוקסיה בטרשת נפוצה.

7. ניתוח רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI)

1. הזן את הגנים המצטלבים למודול החלבונים המרובים של מסד הנתונים STRING.
2. הגדר את האורגניזם להומו ספיינס ולחץ על חיפוש.
3. השתמש באפשרות CONTINUE במרכז דף האינטרנט כדי ליצור את רשת ה-PPI.
4. ייצא את מידע רשת האינטראקציה בפורמט TSV וייבא אותו לתוכנת ניתוח רשת ביואינפורמטיקה (איור משלים S5).
5. השתמש בתוסף Cytohubba כדי לזהות את 10 הגנים המרכזיים המובילים על בסיס אלגוריתם MCC.

8. אימות עם מערך הנתונים של GSE151306

1. הורד את מערך הנתונים של GSE151306 מ-GEO.
2. השתמש בחבילת הלימה בתוכנת R studio (קודי שפת R מסופקים ב-GitHub: https://github.com/Drxiazhang/Identification-of-Ferroptosis--and-Hypoxia-Related-Genes-in-iPSC-Derived-OPCs-from-MS) כדי לאמת את הביטוי של גני הרכזת על פני קבוצות שונות, ולהזין את קובץ מטריצת הביטוי, את קובץ הקיבוץ של ערכת האימות ואת רשימת הגנים של הרכזת.

9. התוויית עקומת ROC עבור גנים מרכזיים

1. השתמש בחבילת pROC ב-R כדי לשרטט עקומות ROC עבור גני הרכזת המתבטאים באופן דיפרנציאלי.
2. אמת את ערך האבחון של גני רכזת אלה במערך נתוני האימות (קודי שפת R מסופקים ב- GitHub: https://github.com/Drxiazhang/Identification-of-Ferroptosis--and-Hypoxia-Related-Genes-in-iPSC-Derived-OPCs-from-MS).

10. חיזוי רשתות ויסות גנים של גורם שעתוק

1. גש למסד הנתונים TRRUST v2 בכתובת https://www.grnpedia.org/trrust/.
2. השתמש במודול מצא רגולטורים מרכזיים לשאילתות גנים כדי לזהות גורמי שעתוק המווסתים את 10 הגנים המרכזיים.
   1. הגדר אנושי למין. הזן את גורמי השעתוק וגני הרכזת למודול החלבונים המרובים של STRING, הגדר הומו ספיינס לאורגניזמים ולחץ על המשך כדי ליצור רשת רגולטורית.

מערך הנתונים הממוזג המורכב מארבעה אנשים בריאים כבקרות ותשעה אנשים עם טרשת נפוצה (PwMS), נותח ולאחר מכן אומת במערך נתונים אחר של ארבעה PwMS וארבעה בקרות בריאות. פרוטוקול הניתוח מוצג באיור 1, והמידע המפורט של כל הדגימות מופיע בטבלה משלימה S1. באמצעות הניתוח, זוהו 706 גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי (DEGs, p < 0.01), מתוכם 378 גנים היו מווסתים ו-328 גנים מתוכם היו מווסתים בחולי טרשת נפוצה בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 2). ניתוח העשרה פונקציונלית חשף את המעורבות המשמעותית של DEGs אלה בתהליכים ביולוגיים שונים. יש לציין כי מונחי ה-GO המועשרים ביותר ששוכללו על ידי 500 גנים כללו הידבקות מוקדית, צומת תא-מצע, מסלול איתות בתיווך אינטגרין, קשירת אינטגרין וקשירת קדרין (איור 3A-C). ניתוח מסלול KEGG גילה עוד כי גנים אלה מעורבים בעיקר במסלול האיתות PI3K-Akt ובמסלול האיתות של Hippo (איור 3D), שהם קריטיים בתהליכים תאיים הרלוונטיים לפתוגנזה של טרשת נפוצה.

ציוני פרופטוזיס והיפוקסיה Z, שחושבו באמצעות GSVA, היו גבוהים משמעותית בתאי אוליגודנדרוציטים שמקורם ב-iPSC (OPCs) מחולי טרשת נפוצה מאשר באלו מקבוצת ביקורת בריאה (p = 0.0028 ו-0.075, בהתאמה, איור 4), מה שמצביע על התפקיד המרכזי של מסלולים אלה במחלה זו. ממצא זה נתמך על ידי WGCNA, שזיהה שני מודולי גנים מרכזיים (איור 5A). מבין אלה, מודול הטורקיז, המורכב מ-3,671 גנים, היה קשור באופן מובהק הן לפרופטוזיס והן להיפוקסיה (איור 5B). חשוב לציין, 71 גנים זוהו בצומת של גנים הקשורים למחלה המתבטאים באופן דיפרנציאלי ואלה במודול WGCNA, מה שמרמז על מתאם חזק עם פרופטוזיס (בטא=0.94, p=2e-06) והיפוקסיה (בטא=0.92, p=7e-06) בטרשת נפוצה (איור 6).

חקירה נוספת של רשת ה-PPI חשפה 10 גנים מרכזיים, כלומר, COL4A1, COL4A2, ITGB5, ITGB1, ITGB8, ITGAV, VIM, FLNA, VCL ו-SPARC (איור 7). גנים מרכזיים אלה צוינו בתפקידם המכריע בתיווך תהליכים תאיים הקשורים הן לפרופטוזיס והן להיפוקסיה.

אימתנו עוד יותר את מערך נתוני האימות (GSE151306). התוצאות הצביעו על כך ששלושה גנים מרכזיים (ITGAV, ITGB8 ו-VIM) היו מווסתים ב-PwMS (איור 8), מה שהיה עקבי עם הממצאים במערך הנתונים הממוזג (איור משלים S1). ביניהם, ITGB8 היה הגן המווסת ביותר באופן משמעותי. ממצאים אלה מצביעים על כך ש-ITGB8, בן למשפחת האינטגרין, עשוי להיות מעורב באופן קריטי בפתוגנזה של טרשת נפוצה, במיוחד ביחס לפרופטוזיס ומנגנוני היפוקסיה. יתר על כן, ניתוח עקומת מאפיין הפעלה של מקלט (ROC) אישר כי ל-ITGAV, ITGB8 ו-VIM יש רגישות וסגוליות טובות לאבחון מחלה (AUC=58.3%, 100% ו-91.7%, בהתאמה; איור 9A-C), כאשר ITGB8 מציג AUC של 100%, מה שמדגים את הפוטנציאל שלו כסמן ביולוגי חזק לטרשת נפוצה.

לבסוף, הוקמה רשת ויסות גנים של גורם שעתוק, ושלושה גורמי שעתוק מרכזיים - HOXD3, SP1 ו- VHL - זוהו כמווסתים של הגנים המרכזיים (איור 10). גורמי שעתוק אלה עשויים למלא תפקידים חיוניים בוויסות ביטוי גנים בתגובה להיפוקסיה ופרופטוזיס, מה שמדגיש עוד יותר את מעורבותם הפוטנציאלית בהתקדמות טרשת נפוצה.

סרטון 1: מבט עטרתי המתקבל עם מתמר בתדר נמוך שבמרכזו המידיאפרגמה הימנית המראה חריגה סרעפתית תקינה מבחינה איכותית במהלך נשימת קיבולת חיונית. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

איור 1: תרשים זרימה המציג את תכנון המחקר. קיצורים: MS = טרשת נפוצה; GSVA = ניתוח וריאציות של סט גנים; WGCNA = ניתוח רשת ביטוי משותף משוקלל של גנים; KEGG = אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים; GO = אונטולוגיה של גנים; PPI = אינטראקציה בין חלבון לחלבון; ROC = מאפיין הפעלה של מקלט. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תרשים הר געש הממחיש את הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בין קבוצת הביקורת הבריאה לקבוצת הטרשת הנפוצה. קיצורים: FC = קריטריוני סינון; PEG3 = גן 3 המתבטא אבהית; NEBL = ערפילית; CRABP1 = חלבון קושר חומצה רטינואית תאית 1. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ניתוחי העשרה פונקציונלית של גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי. (א-ג) קטגוריות אונטולוגיה של גנים שוכללו על ידי סינון 500 גנים, כולל (א) תפקוד מולקולרי, (ב) תהליך ביולוגי ו-(ג) מרכיב תאי. (D) ניתוח העשרת מסלול KEGG המצביע על מסלולים מועשרים בין DEGs. קיצורים: DEGs = גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי; GO = אונטולוגיה של גנים; MF = תפקוד מולקולרי; BP = תהליך ביולוגי; CC = רכיב סלולרי; KEGG = אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תרשים קופסה המשווה ציוני פרופטוזיס והיפוקסיה Z בין קבוצת הביקורת הבריאה לקבוצת הטרשת הנפוצה. ציוני פרופטוזיס והיפוקסיה Z חושבו באמצעות GSVA. קבוצת הביקורת מוצגת בכחול, וקבוצת הטרשת הנפוצה מוצגת באדום. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות מבחן Wilcoxon. ** מציין ערכי p בין 0 ל-0.01. קיצורים: MS = טרשת נפוצה; HC = שליטה בריאה; GSVA = ניתוח וריאציות של מערך גנים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תוצאות ניתוח רשת ביטוי גנים משוקלל. (A) דנדרוגרמה של אשכול של גנים המסווגים למודולים. (B) מתאמים בין מודולים ותכונות שקשורות להיפוקסיה ולפרופטוזיס. קיצור: ADJ = מותאם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: דיאגרמת ון החושפת 71 גנים מצטלבים. התרשים ממחיש את החפיפה של DEGs מחולי טרשת נפוצה עם גנים מהמודולים הקשורים להיפוקסיה ופרופטוזיס. קיצורים: WGCNA = ניתוח רשת ביטוי משותף משוקלל של גנים; DEGs = גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: דיאגרמת רשת של אינטראקציות חלבון-חלבון בין 10 גני הרכזת שזוהו. קיצורים: VCL = vinculin; FLNA = פילמין A; ITGAV = תת-יחידת אינטגרין אלפא V; GOL4A2 = שרשרת קולגן מסוג IV אלפא 2; COL4A1 = שרשרת קולגן מסוג IV אלפא 1; ITGB5 = יחידת משנה של אינטגרין בטא 5; VIM = וימנטין; SPARC = חלבון מופרש חומצי ועשיר בציסטאין; ITGB8 = יחידת משנה של אינטגרין בטא 8; ITGB1 = יחידת משנה של אינטגרין בטא 1. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: תרשים עמודות המציג את רמות הביטוי של גני רכזת במערך נתוני האימות (GSE151306). * מציין ערכי p בין 0.01 ל-0.05, ו-# מציין ערכי P בין 0.05 ל-0.2. ns מציין ערכי p בין 0.2 ל-1. קיצורים: HC: בקרות בריאות; טרשת נפוצה: טרשת נפוצה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: עקומות ROC להערכת הרגישות והספציפיות האבחנתית של גנים מרכזיים המתבטאים באופן דיפרנציאלי ב-GSE151306. (A) עקומת ROC עבור ITGAV. (B) עקומת ROC עבור ITGB8. (C) עקומת ROC עבור VIM. קיצורים: ROC = מאפיין הפעלה של מקלט; ITGAV = תת-יחידה אינטגרין אלפא V; ITGB8 = תת-יחידת אינטגרין בטא 8; VIM = וימנטין. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: תרשים של רשת ויסות הגנים של גורם השעתוק -hub. משולשים מייצגים גורמי שעתוק; ריבועים מייצגים גנים מרכזיים. קיצורים: ITGB1 = תת-יחידה של אינטגרין בטא 1; ITGAV = תת-יחידה אינטגרין אלפא V; VIM = וימנטין; SPARC = חלבון מופרש, חומצי ועשיר בציסטאין; COL4A2 = שרשרת קולגן מסוג IV אלפא 2; HOXD3 = הומאובוקס D3; VHL = מדכא גידול פון היפל-לינדאו; SP1 = חלבון ספציפיות 1. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 11: ההשפעה של אינטגרין β1 על מסלול PI3K-Akt. צורת ההרחבה עם ראש פתוח (מצב פעיל, זיקה גבוהה) אינטגרין β1 יכולה ליצור "הידבקות מוקדית" ו"קומפלקסים מוקדיים" ולקיים אינטראקציה עם FAK ו-Scr קינאז. קומפלקס FAK/Src הפעיל ומגייס מולקולות מתאם להפעלת מסלול PI3K-Akt. דמות זו אומצה מיאן וצוי³⁷. קיצורים: PI3K = פוספטידילינוזיטיד-3-קינאז; FAK = קינאז הידבקות מוקדית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: מגמות הביטוי של הגנים העיקריים במערך הנתונים הממוזג. פונקציית Wilcox.test מחבילת "limma" R שימשה לבדיקות סטטיסטיות. "*" מציין ערכי p בין 0.01 ל-0.05, ו-"#" מציין ערכי p בין 0.05 ל-0.2. אנא לחץ כאן כדי להוריד איור זה.

איור משלים S2: פריסה מקורית מתוך ניתוח אונטולוגיה גנטית של גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי. אנא לחץ כאן להורדת איור זה.

איור משלים S3: דף הבית של פלטפורמת הניתוח המקוונת Omicshare. אתר זה הוא מרכז ביואינפורמטי סיני בו בוצעה KEGG. אנא לחץ כאן כדי להוריד איור זה.

איור משלים S4: דף הבית של פלטפורמת הניתוח המקוונת של Biowinford שבה בוצעה WGCNA. אנא לחץ כאן להורדת איור זה.

איור משלים S5: דף הבית של מסד הנתונים של STRING שבו בוצע PPI. אנא לחץ כאן להורדת איור זה.

טבלה משלימה S1: מאפיינים של דגימות ומערכי נתונים מאוגמים ומנותחים. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

בהתחשב בתפקידו המרכזי בתהליך הרמיאלינציה, הנדידה, ההתמיינות והמוות של OPCs נקבעו זה מכבר כגורמים מכריעים בפתוגנזה של טרשת נפוצה ומטרות טיפוליות של טרשת נפוצה. ניוון עצבי מתקדם שאינו תלוי בדלקת נצפה בכל שלושת הסוגים של טרשת נפוצה¹⁹, ואובדן בולט של אוליגודנדרוציטים נצפה במרכז הנגעים הדמיאליניים²⁰מה שמרמז על כך שהפרעות ראשוניות בתאי שושלת אוליגודנדרוציטים יכולות להאיץ את התקדמות הטרשת הנפוצה.,

במחקר זה, ביצענו ניתוח ביואינפורמטי של רצפי mRNA ממוקדים תוך התמקדות בגנים הקשורים לפרופטוזיס והיפוקסיה ב-OPCs המושרים על ידי iPSC מ-PwMS ובקרות בריאות באמצעות מערכי נתונים ממוזגים מארבעה בקרות בריאות ותשעה PwMS. גילינו 706 DEGs, מתוכם 378 היו מווסתים ו-328 היו מווסתים. זיהינו עוד גנים הקשורים לפרופטוזיס והיפוקסיה והשווינו את ביטוים ב-OPCs המושרים על ידי iPSC של חולי טרשת נפוצה ובקרות בריאות על ידי חישוב ציון Z של כל דגימה. ציוני Z של פרופטוזיס והיפוקסיה היו גבוהים משמעותית ב-PwMS מאשר בבקרות בריאות.

היפוקסיה ממלאת תפקיד משמעותי באוליגודנדרוגליופתיה בטרשת נפוצה. מחקרים פתולוגיים הדגימו אוליגודנדרוגליופתיה דיסטלית בנגעי טרשת נפוצה מסוג III הדומים לשבץ איסכמי של חומר לבן¹⁶ וכן פציעות דמויות היפוקסיות לצד רמות ROS ו-NO גבוהות בנגעים חריפים של טרשת נפוצה²¹. שיבוש של קומפלקס שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית IV פוגע בהיווצרות ובכדאיות של OPCs ואוליגודנדרוציטים בוגרים¹⁵, אם כי המנגנונים המדויקים העומדים בבסיס ליקוי זה עדיין לא ברורים.

בנוסף, פרופטוזיס, צורה תלויה בברזל של מוות תאי מתוכנת, נמצאה כמתווכת את אובדן האוליגודנדרוציטים ואת התקדמות הדמיאלינציה במודלים של בעלי חיים טרשת נפוצה המושרה על ידי קופריזון²². ריצוף של תא בודד חשף ירידה בביטוי הגנים של אנטי-פרופטוזיס ב-OPCs ו-OLs ברקמת המוח מ-PwMS²³. בשלב הכרוני של טרשת נפוצה, מחסור בברזל באוליגודנדרוציטים יכול לשבש את הרמיאלינציה ולפגוע בשלמות האקסונלית בחומר הלבן, וכתוצאה מכך להתקדמות המחלה²⁴. יתר על כן, snRNA-seq של נגעי טרשת נפוצה בחומר הלבן מצביע על כך שפרופטוזיס פעיל בעיקר בנגעי החומר הלבן של חולי טרשת נפוצה וקשור להפעלת מערכת הפגוציטים²⁵. בעכברי דלקת מוח אוטואימונית ניסיונית (EAE), רמות GPX4, מווסת חשוב של פרופטוזיס, מופחתות²⁶. ניתן להאיץ את התקדמות המחלה של EAE על ידי פרופטוזיס המושרה על ידי ACSL4, המשפר את איתות קולטני תאי T (TCR). חסימת פרופטוזיס ו-ACSL4 מאטה משמעותית את התקדמות הנכות ב-EAE²⁷.

פרופטוזיס מעורב בירידה הקוגניטיבית הנגרמת על ידי היפוקסיה במודלים של חולדות²⁸. היפוקסיה וגורם המעורר היפוקסיה-1α מקדמים את התפשטותם ונדידתם של גרעיני שורש הגב²⁹. לפיכך, פרופטוזיס והיפוקסיה עשויים לפעול באופן סינרגטי בפתוגנזה של טרשת נפוצה. באמצעות WGCNA, המחקר שלנו זיהה שני מודולים משמעותיים; מודול הטורקיז, במיוחד, נמצא בקורלציה חזקה עם מצב טרשת נפוצה, היפוקסיה ופרופטוזיס. בהתבסס על תוצאות ה-WGCNA וה-DEGs, זיהינו 71 גנים מרכזיים שהיו בקורלציה בו-זמנית עם פרופטוזיס, היפוקסיה וטרשת נפוצה.

ניתוחי העשרה פונקציונלית של GO ו-KEGG של 706 DEGs גילו כי מסלול האיתות PI3K-Akt הוא מסלול מכריע בהתפתחות טרשת נפוצה. העיכוב של CXCR2 משפר את התמיינות ה-OPC ומקדם רמיאלינציה במודלים של עכברי MS על ידי הפעלת איתות PI3K/AKT/mTOR³⁰. חוסר איזון באספקת החמצן עלול להשפיע על מסלולי האיתות MAPK/PI3K-Akt, ולהפעיל מנגנוני מפתח המעורבים בעקה חמצונית³¹.

ניתוח PPI גילה כי 10 גנים מרכזיים, כלומר, COL4A1, COL4A2, ITGB5, ITGB1, ITGB8, ITGAV, VIM, FLNA, VCL ו-SPARC, היו בקורלציה בו-זמנית עם היפוקסיה, פרופטוזיס וטרשת נפוצה, עם ביטוי יתר בולט בחולי טרשת נפוצה בהשוואה לביקורת. גנים אלה אומתו עוד ב-GSE151306, מסד נתונים של קווי OPC המושרים על ידי iPSC שמקורם בחולי SPMS. מצאנו ש-ITGAV, ITGB8 ו-VIM היו גם הם מווסתים בערכת האימות. בפרט, ITGB8 - חלק ממשפחת האינטגרין - התבטא יתר באופן משמעותי בטרשת נפוצה, מה שהיה עקבי עם ערכות הבדיקה המשולבות GSE147315 ו-GSE196575.

הגן ITGB8 הוא חבר במשפחת האינטגרין (ITG) ומקודד אינטגרין בטא 8, שדווח בעבר כמווסת צמיחת גידול וגרורות ^32,33. אינטגרין בטא 8 מתבטא חזק על ידי OPCs ואוליגודנדרוציטים בוגרים. מחקר אחד הראה כי אוסטאופונטין מגן על OPCs מפני אפופטוזיס המושרה על ידי H2O2 על ידי ויסות מוגבר של אינטגרינים, כולל ITGB8³⁴. ממצאים אלה מצביעים על כך ש-ITGB8 ממלא תפקיד בהישרדות התאים בתנאי עקה חמצונית. בטרשת נפוצה, שבה עקה חמצונית נפוצה, ITGB8 עשוי לעזור ל-OPCs לשרוד ולהתמיין לאוליגודנדרוציטים כדי להגביר את הרמיאלינציה.

ITGAV מקודד את תת-יחידת האינטגרין אלפא V, המווסתת אנגיוגנזה והתקדמות סרטן. ITGAV, בשילוב עם בטא 5 (היוצר אינטגרין αvβ5), מתווך את הפעלת המיקרוגליה בתגובה לשקיעת פיברונקטין וויטרונקטין, המוגברים בנגעי טרשת נפוצה. במודל חולדות MS של EAE, אינטגרין avβ5 הפעיל מיקרוגליה, מה שהוביל לביטוי מוגבר של מטריצת מטאלופרוטאינאז-9 (MMP-9), אנזים המפרק את המטריצה החוץ-תאית וחלבוני המיאלין, ותורם לדמיאלינציה³⁵.

יש לציין כי אחד הגנים המרכזיים שהתבטא באופן דיפרנציאלי בקבוצה הממוזגת שלנו, ITGB1, נמצא מווסת בתאי CD4+ T המופקים מנוזל המוח של חולי טרשת נפוצה³⁶. לאינטגרין β1 הייתה השפעה ניכרת על מסלול האיתות PI3K-Akt, מה שעולה בקנה אחד עם הממצאים שלנו (איור 11)³⁷. יתר על כן, ביטוי מוגבר של β1-אינטגרין זוהה על תאי Th17 בחולי טרשת נפוצה בהשוואה לביקורת בריאה. הפעלת β1-אינטגרין בתאי Th17 יכולה להעלות משמעותית את רמות הגלוטמט ולקדם דלקת עצבית³⁸.

ערכנו ניתוח עקומת ROC כדי להעריך את הפוטנציאל של ביטוי ITGAV, ITGB8 ו-VIM ב-OPCs כסמנים ביולוגיים לחיזוי סיכון לטרשת נפוצה. ה-AUC של ITGB8 היה 100%, ואחריו 91.7% עבור VIM ו-58.3% עבור ITGAV. נכון לעכשיו, אין מחקרים המדווחים על הקשר בין ביטוי ITGB8 באוליגודנדרוציטים לטרשת נפוצה. יש לערוך מחקרים נוספים כדי לחקור את השימוש ב-ITGB8 כסמן ביולוגי לחיזוי טרשת נפוצה.

לבסוף, בנינו רשת גנים של גורם שעתוק וזיהינו שלושה גורמי שעתוק מרכזיים: HOXD3, SP1 ו-VHL. SP1 הוא גורם שעתוק שנקשר למקדמים רבים. SP1, הידוע בקשירת המקדם הרחבה שלו, הוכח כמווסת את ביטוי Prdx6, מעכב ROS ומבטל פרופטוזיס בסביבות עתירות גלוקוז³⁹. הביטוי של SP1 נקשר גם לפעילות גורם נמק הגידול (TNF), הממלא תפקיד מכריע בהתפתחות RRMS⁴⁰. קולטן האנדרוגן (AR), גורם שעתוק מזוהה נוסף, מופעל על ידי הורמונים סטרואידים ומזוהה באסטרוציטים באזורי הרמיאלינציה, מה שמדגיש את מעורבותו הפוטנציאלית בתפקוד האוליגודנדרוציטים⁴¹.

מסלולים ותאים חיסוניים ממלאים תפקידים חשובים בפתוגנזה ובניוון עצבי של טרשת נפוצה וייתכן שהם קשורים לפרופטוזיס, היפוקסיה ו-OPCs. תצפיות מעכברים שיכורים מקופריזון כמו גם נגעים מתקדמים של טרשת נפוצה הראו שכיחות ושיעורי התפשטות גבוהים של תאי CD8⁺ T עם ביטוי יתר של גרגירים ציטוטוקסיים⁴². תאי T המופעלים מספיק מסוגלים לקיים אינטראקציה עם אוליגודנדרוציטים המציגים אנטיגן, מה שעלול להוביל להרס אוליגודנדרוציטים בתיווך תאי T CD8⁺ . במיקרו-סביבת הגידול, אינטרפרון-γ המופרש על ידי תאי CD8⁺ T מפחית את ביטוי מחליף ציסטאין גלוטמט (xCT), ומשפר את הפרופטוזיס⁴³. בנוסף, הוצע כי פרופטוזיס מפעיל תאי T באמצעות איתות קולטני תאי T במודלים של EAE²⁴.

המחקר הנוכחי על OPCs מוגבל משמעותית בשל המחסור בתאים אלה. ניתן לטפל במגבלה זו באופן חלקי על ידי שימוש ב-OPCs המושרים על ידי iPSC. עם זאת, רוב המחקרים על OPCs המושרים על ידי iPSC כוללים מדגם קטן, בדרך כלל פחות מ-10 תורמים, בשל התהליך הגוזל זמן ויקר של השראת תאים. המחקר שלנו מספק תוצאות חזקות יותר על ידי שילוב דגימות ממספר מחקרים.

חידדנו עוד יותר את צינור הביואינפורמטיקה על ידי חלוקת מערך הנתונים הזמין לערכות הדרכה ואימות. גישה זו ממזערת הטיות פוטנציאליות הנגרמות על ידי הבדלים בשיטות אינדוקציה של תאים וטכניקות ריצוף בין מעבדות. רוב המחקרים הקיימים על טרשת נפוצה מתמקדים בניוון עצבי מונע דלקת או משתמשים בניתוח מבודד של פרופטוזיס. ניתוחי ביטוי גנים מסורתיים שימושיים לזיהוי גנים בודדים המתבטאים באופן דיפרנציאלי, אך לעתים קרובות אינם מצליחים לחשוף את רשתות האינטראקציה המורכבות ודפוסי הביטוי המשותף הקשורים להתקדמות טרשת נפוצה. לעומת זאת, המתודולוגיה שלנו ממנפת את WGCNA כדי לבנות רשת ביטוי משותף של גנים, המאפשרת זיהוי של מודולי גנים בעלי קורלציה גבוהה הן עם פרופטוזיס והן עם היפוקסיה. זה מספק הבנה ברמת המערכת של האופן שבו מסלולים אלה מתקשרים בתוך פתולוגיה של טרשת נפוצה, דבר שאינו ניתן להשגה בשיטות ביטוי דיפרנציאליות סטנדרטיות בלבד.

ניתן ליישם שיטה זו על טיפולים חדשים לטרשת נפוצה על ידי זיהוי מטרות גנים לטיפולים שמטרתם להפחית ניוון עצבי. זה יכול לשמש גם במחלות נוירודגנרטיביות אחרות הכוללות פרופטוזיס והיפוקסיה, כגון פרקינסון או מחלת אלצהיימר, כדי לפתח התערבויות מותאמות ולחזות תגובות טיפוליות.

למחקר שלנו יש כמה מגבלות. ראשית, יש צורך באימות נוסף in vivo ו-in vitro . שנית, התוצאות שלנו מגיעות משני מאגרי מידע ואומתו במסד נתונים אחד המכסה מספר מצומצם של חולים. יש לאסוף קבוצות גדולות יותר למחקר נוסף. שלישית, בהתחשב בקושי בגישה ל-OPCs אנושיים, מסד הנתונים שאימצנו התבסס על OPCs המושרים על ידי iPSC, שאולי לא דומים לחלוטין לרקמה אנושית. מחקרים נוספים המתמקדים בחקירת ההשפעה של היפוקסיה ופרופטוזיס על התמיינות ומוות תאים של תאי שושלת אוליגודנדרוציטים בטרשת נפוצה צריכים להתבצע בעתיד.

מגבלה נוספת של מחקר זה היא חוסר היכולת לנתח אינטראקציות בין תאי חיסון עקב השימוש ב-OPCs שמקורם ב-iPSCs, שחסרים את תאי החיסון הקיימים בנגעי טרשת נפוצה. בעוד שתאי מערכת החיסון חיוניים בפתוגנזה של טרשת נפוצה, מגבלה זו משקפת את האתגרים בשימוש בתרביות שמקורן ב-iPSC. מחקרים עתידיים צריכים להתמקד בדיבור צולב בין תאי חיסון OPC באמצעות מערכות קוקולטורה או אורגנואידים, שיכולים לדגמן טוב יותר אינטראקציות תאיות בסביבת טרשת נפוצה.

למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר שהם רלוונטיים לתוכן מאמר זה.

מחקר זה נתמך ומומן על ידי מימון המחקר הקליני של בית החולים הלאומי ברמה גבוהה (2022-PUMCH-B-103). המחברים רוצים להודות לד"ר שואנג סונג, המחלקה לביוסטטיסטיקה, בית הספר לבריאות הציבור של הרווארד, אוניברסיטת הרווארד, על העצות וההדרכה החשובות שלה בשלב התיקון של מאמר זה.