הכנת ננו-חלקיקים של תחמוצת אבץ והערכת ההשפעות האנטיבקטריאליות שלהם

במחקר זה, ננו-חלקיקים של תחמוצת אבץ סונתזו בשיטת משקעים. ההשפעה האנטי-בקטריאלית של החלקיקים המסונתזים נבדקה כנגד זני חיידקים עמידים למתיצילין (MRSA) ו-Pseudomonas aeruginosa .

זיהומים חיידקיים Nosocomial הפכו מאתגרים יותר ויותר בשל עמידותם הטבועה לאנטיביוטיקה. הופעתם של זני חיידקים עמידים לתרופות מרובות בבתי חולים מיוחסת לשימוש נרחב ומגוון באנטיביוטיקה, מה שמחמיר עוד יותר את בעיית העמידות לאנטיביוטיקה. ננו-חומרים מתכתיים נחקרו רבות כפתרון חלופי לחיסול תאי חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה. ננו-חלקיקים מתכתיים תוקפים תאי חיידקים באמצעות מנגנונים שונים, כגון שחרור יונים אנטיבקטריאליים, יצירת מיני חמצן תגובתי או שיבוש פיזי, שכנגדו חיידקים אינם יכולים לפתח עמידות. בין חלקיקי המתכות האנטי-מיקרוביאליים שנחקרו באופן פעיל, ננו-חלקיקי תחמוצת אבץ, שאושרו על ידי ה-FDA, ידועים בתאימות הביולוגית שלהם ובתכונות האנטי-בקטריאליות שלהם. במחקר זה התמקדנו בפיתוח מוצלח של שיטת משקעים לסינתזה של ננו-חלקיקים של תחמוצת אבץ, ניתוח התכונות של ננו-חלקיקים אלה וביצוע בדיקות אנטי-מיקרוביאליות. ננו-חלקיקים של תחמוצת אבץ אופיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), פיזור אור דינמי (DLS), ספקטרוסקופיה אולטרה סגולה/נראית לעין ועקיפה של קרני רנטגן (XRD). בדיקות אנטיבקטריאליות נערכו באמצעות בדיקת מיקרודילוציה של מרק עם זנים עמידים לתרופות מרובות של Staphylococcus aureus עמיד למתיצילין (MRSA) ו - Pseudomonas aeruginosa. מחקר זה הדגים את הפוטנציאל של ננו-חלקיקי תחמוצת אבץ בעיכוב התרבות חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה.

זיהומים חיידקיים עמידים לתרופות מרובות (MDR) מהווים איום עולמי משמעותי על בריאות האדם¹. מכיוון שזיהומים אלה יכולים להיות קטלניים בחולים עם מחלות רקע, מחקר פעיל מנסה לטפל בבעיה זו². חיידקים התפתחו כדי להתחמק מפעולה של תרופות שונות. פניצילין, הידוע ברבים ונזקף לזכותו כמי שהציל מיליוני חיים ברחבי העולם, הוא אנטיביוטיקה β-לקטם המעכבת את הסינתזה של דופן תא החיידק³. עם זאת, חיידקים התפתחו כדי לנטרל את היעילות של תרופות באמצעות מנגנונים שונים כגון משאבות efflux, שינויים transpeptidase, או חדירות מופחתת⁴. בנוסף, תאי חיידקים יכולים להעביר את גני העמידות הללו לדור הבא, להגדיל את שיעורי ההישרדות של הדור הבא ולחזק את בעיית הזנים העמידים⁵.

העלייה במספר החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה הובילה להופעתם של חיידקי MDR, אשר בדרך כלל מפגינים עמידות לאנטיביוטיקה מרובה. זני MDR נתקלים בתדירות הגבוהה ביותר בבתי חולים, שם נחשפים זנים חיידקיים מרובים וכתוצאה מכך מפתחים עמידות לאנטיביוטיקה שונה⁶. סטפילוקוקוס זהוב, במיוחד S. aureus עמיד למתיצילין (MRSA), הוא חיידק קומנסלי גראם-חיובי היוצר אשכולות על העור של כ-30% מבני האדם ^7,8. MRSA, שזוהה לראשונה בשנות השישים, מציג רגישות מופחתת לאנטיביוטיקה β-לקטם, וכתוצאה מכך עלייה חדה בשיעורי הזיהום מאז שנות התשעים⁹. בקרב חיידקים גראם-שליליים, Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) הוא אחד הזנים הנפוצים ביותר הנרכשים בבתי חולים. מין זה, חיידק פקולטטיבי בצורת מוט, גורם לזיהומים אופורטוניסטיים בבני אדם¹⁰. בפרט, זני MDR המשפיעים ישירות על בריאות האדם אחראים ליותר מ-50% מהזיהומים הקשורים לשירותי בריאות¹¹. במחקר זה השתמשנו בזנים העמידים ביותר לתרופות בבתי חולים, MRSA ו-P. aeruginosa.

השימוש בננו-חלקיקים (NPs) למטרות אנטי-מיקרוביאליות נחקר בהרחבה כדי להתמודד עם נושא העמידות לאנטיביוטיקה. NPs מתכתיים, בפרט, גורמים למוות תאי חיידקים באמצעות מנגנונים שונים, ומציעים פתרון פוטנציאלי לבעיית העמידות לתרופות. NPs מתכתיים מפעילים פעילות אנטי-מיקרוביאלית באמצעות מנגנונים רבים, כולל שחרור יונים אנטי-מיקרוביאליים, יצירת מיני חמצן תגובתי (ROS) ושיבוש פיזי של תאים, בין אמצעים אחרים¹². NPs המורכבים מכסף, נחושת, תחמוצת אבץ (ZnO) ותחמוצת טיטניום הם בעלי יעילות אנטי-מיקרוביאלית גבוהה ולכן נחקרים באופן פעיל¹³.

ZnO NPs אושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) לשימוש בבני אדם. לעומת זאת, למרות יעילותם האנטי-מיקרוביאלית הגבוהה, השימוש בכסף ובנחושת NPs בבני אדם מוגבל על ידי ציטוטוקסיות גבוהה שלהם. עם זאת, ZnO NPs נמצאים בדרך כלל בחיי היומיום והם אפילו נוכחים בפורמולות מסנני קרינה בשימוש נרחב¹⁴. יש לציין כי יוני Zn²⁺ המשתחררים מ-ZnO NPs יעילים מאוד בטיפול בחיידקים, וגורמים למוות תאי חיידקי באמצעות יצירת ROS ומנגנוני נזק פיזיים אחרים¹⁵.

מחקר זה מתאר את הפרוטוקול לסינתזה של ננו-חלקיקי ZnO (NPs) באמצעות שיטת משקעים ומציג גישת בדיקה אנטי-מיקרוביאלית באמצעות שיטת דילול מיקרו-מרק עם דגימות קליניות של MRSA ו-P. aeruginosa. שיטת המשקעים עבור NPs ZnO כוללת סינתזה של NPs מוצקים בלתי מסיסים של ZnO על ידי התאמת pH וטמפרטורה באמצעות קודמנים מסיסים כגון אבץ אצטט או אבץ חנקתי¹⁶. יחד עם ייצור קל ומהיר יחסית, שיטה זו מבטיחה חזרתיות בסינתזה ומקלה על שליטה בגודל החלקיקים ובמורפולוגיה¹⁷. בפרוטוקול סינתזה זה, נתרן הידרוקסידי (NaOH), אחד מסוכני המשקעים הנפוצים ביותר, נוצל כדי לזרז אבץ אצטט, וכמות קטנה של הקסדצילטרימתילאמוניום ברומיד (CTAB) שימשה כדי לעכב את הסינתזה הבלתי מבוקרת של ננו-חלקיקים¹⁸. בין הבדיקות האנטי-מיקרוביאליות השונות, הפעילות האנטי-בקטריאלית של ננו-חלקיקי ZnO הוערכה בשיטת דילול מיקרו-מרק, המונעת הפרעות אופטיות מננו-חלקיקי תחמוצת מתכת ומאפשרת מדידת מושבה ישירה לקביעת מיקרופון¹⁹.

הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת ננו-חלקיקי תחמוצת אבץ

1. למדוד 200 מ"ל של אלכוהול אתילי מוחלט ולשפוך אותו לתוך בקבוק תחתון עגול זכוכית.
2. מניחים את הבקבוק התחתון העגול על מעטפת חימום וממשיכים לערבב בטמפרטורה של 25-40 מעלות צלזיוס.
3. למדוד 500 מ"ג של CTAB בבקבוקון 50 מ"ל ולהוסיף אותו אלכוהול אתילי בצלוחית. יש לערבב עד להמסה מוחלטת של CTAB.
4. מוסיפים 1.4 גרם אבץ אצטט לתמיסה ומערבבים עד שהיא מומסת לחלוטין.
5. העלה את טמפרטורת התמיסה על ידי הגדרת טמפרטורת מעטפת החימום ל -70 מעלות צלזיוס.
6. הוסף 25 מ"ל של תמיסת 0.5 M NaOH לתערובת ותן לה להגיב במשך שעה אחת עד שתמיסה ברורה הופכת בצבע לבן.
7. Aliquot את הפתרון 50 מ"ל צינורות חרוטיים, צנטריפוגה ב 15000 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להשליך את supernatant.
8. הוסף 10 מ"ל מים מזוקקים לאחד הצינורות החרוטיים והשהה מחדש את הננו-חלקיקים על ידי סוניקציה של התמיסה. מעבירים את התמיסה המרחפת לצינור חרוטי אחר המכיל את גלולת ZnO וחוזרים על הפעולה עד שכל תמיסות ZnO נאספות בצינור חרוטי אחד.
9. שטפו את הננו-חלקיקים באמצעות צנטריפוגה ב-15000 × גרם למשך 15 דקות (טמפרטורת החדר), הסירו את הסופר-נטנט והרחיפו מחדש במים מזוקקים. בדוק את ה- pH של תמיסת supernatant באמצעות נייר בדיקת pH וחזור על הפעולה עד שה- pH של התמיסה הופך ניטרלי.
   הערה: כאשר ה- pH של תמיסת הסופרנאטנט הופך לנייטרלי (pH = 7), השליכו את תמיסת הסופרנאטנט ואל תשעו מחדש עם מים מזוקקים.
10. יש לייבש בוואקום את משטח הדגימה בטמפרטורה של 60°C למשך 24 שעות ולקבל את אבקת ZnO NP.

2. בדיקות אנטיבקטריאליות באמצעות MRSA ו- P. aeruginosa

1. תרבית חיידקים
   הערה: זני חיידקי MDR קליניים התקבלו מבית החולים האוניברסיטאי צ'ונג-אנג, סיאול, דרום קוריאה.
   1. הוציאו מהמקפיא העמוק את זני החיידקים MRSA ו-P. aeruginosa המלאים בציר סויה טריפטי (TSB).
   2. לאחר הפשרת התמיסות החיידקיות, פזרו את התמיסה על צלחת אגר סויה טריפטית (TSA) באמצעות לולאת חיסון חד פעמית. מניחים את צלחות האגר המפוספסות באינקובטור ודגרים במשך 24 שעות.
      הערה: מושבה אחת שנבחרה מצלחת TSA נוספה למדיה של 10 מ"ל TSB בצינור חרוטי של 50 מ"ל באמצעות לולאת חיסון חיידקית. חיידקים גודלו בתרבית במשך 24 שעות. חיידקים גודלו בתרבית בתנאי תרבית אירובית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   3. כדי למדוד את ריכוז תמיסת החיידקים, מדללים את התמיסה המתורבת באמצעות דילול סדרתי פי 10 עד פי ^10-6 באמצעות מים מזוקקים. לאחר מכן, מניחים 50 μL של התמיסה המדוללת על לוחות TSA ומפזרים את התמיסה באמצעות מפזר בצורת L.
   4. לדגור על הצלחות באינקובטור במשך 24 שעות.
      הערה: מושבות נספרו אופטית, וריכוז התמיסה המתורבת חושב על ידי הכפלת גורמי הדילול במספר המושבות שנספרו.
2. דגימת חיידקים
   1. כדי לבדוק טווח רחב של ריכוזי ZnO, הכינו תמיסת ZnO NPs של 2 מ"ג/מ"ל באמצעות תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS) של Dulbecco ובצעו דילול טורי פי 2 כדי לבצע ריכוזים שונים.
      הערה: נבדקו 1000 מיקרוגרם/מ"ל, 500 מיקרוגרם/מ"ל, 250 מיקרוגרם/מ"ל, 125 מיקרוגרם/מ"ל ו-62.5 מיקרוגרם/מ"ל.
   2. הוסף 100 μL עבור כל אחד מהריכוזים שנבדקו של NPs ZnO לצלחת של 96 בארות.
      הערה: השתמש כפול (2x) מהריכוז הרצוי הסופי של ZnO NPs, מכיוון שכל דגימה בבאר תדולל בתוספת של 100 μL של תרבית חיידקים. השתמש בתמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית (A/A) 2% כבקרה חיובית וב- DPBS כבקרה שלילית. A/A הוא קומפלקס אנטיביוטי של פניצילין וסטרפטומיצין, היעיל נגד חיידקים גראם-חיוביים וגראם-שליליים, בהתאמה.
   3. לדלל את תרבית החיידקים ל 1 × 10⁶ CFU/mL באמצעות מדיה TSB ולהוסיף 100 μL לכל באר המכילה ריכוזים שונים של NPs ZnO.
      הערה: ריכוזי תמיסת התרבית הראשונית MRSA ו-P. aeruginosa היו 3 x 10⁹ CFU/mL. ריכוז תרבית חיידקים 1 x 10⁶ CFU/מ"ל נעשה על ידי דילול 1/20 ו 1/150 של תמיסת התרבית. לאחר ערבוב עם 100 μL של ZnO NPs, הריכוז הסופי של חיידקים יהיה 5 × 10⁵ CFU/mL.
   4. מניחים את הצלחת 96 בארות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ודגרים במשך 24 שעות.
3. התפשטות חיידקים
   1. פיפטה 100 μL מכל באר ולהכין דילולים טוריים שונים פי 10 עד ^10-6.
      הערה: הוסף 100 μL של NPs ZnO המכילים תמיסה חיידקית לתוך 900 μL של מים מזוקקים מעוקרים וחזור על הפעולה 6 פעמים.
   2. פיפטה 50 μL מארבע פתרונות מדוללים ולהוסיף לוחות מדיה TSA. השתמשו במפזר תאים בצורת L כדי לפזר את התרחיף החיידקי על צלחת האגר.
      הערה: השתמש בדילולים 10⁰, ^10-2, ^10-4 ו^{- 10-6} . לערוך את כל הניסויים משולש. מורחים עד שכל התמיסה החיידקית נספגת על צלחת האגר.
   3. הכניסו את צלחות האגר לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ודגרו במשך 24 שעות.
4. ספירת CFU חיידקית
   1. בחר גורם דילול שניתן לספור עבור כל קבוצה. סמן את כל המושבות בלוח הדילול הניתן לספירה, וחשב מחדש כך שהריכוז יהפוך ל- # של CFU/mL.
      הערה: גורם הדילול הניתן לספירה מציין לוחות שיש להם 20-100 CFU על צלחת בודדת. תוצאות הריכוז שנספרו בתחילה # של Counted CFU/50 μL. באמצעות צלחת ההתפשטות עם תמיסת החיידקים הלא מדוללת, קבעו את ריכוז החיידקים המינימלי הפוטנציאלי.
   2. השתמש בנתונים שהתקבלו כדי לייצג את אחוז החיידקים החיים ביחס לאלה שבבקרה השלילית.
      הערה: אחוז החיידקים החיים (%) =

הסינתזה המוצלחת של NPs ZnO אושרה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), כפי שמוצג באיור 1A. NPs ZnO שהתקבלו נצפו עגולים בצורתם, עם גודל חלקיקים ממוצע של 35.35 ננומטר וסטיית תקן של 6.81 ננומטר. המשקעים של ננו-חלקיקים אלה נצפו באמצעות תגובת תזוזה כפולה על ידי הוספת תמיסת NaOH לאבץ אצטט, שם יוני Zn²⁺ עברו הידרוליזה.

באמצעות פיזור אור דינמי (DLS), הגודל הממוצע ופוטנציאל הזטה של הננו-חלקיקים המסונתזים נקבעו כ-130.4 ננומטר ו-28.92 mV, בהתאמה, כפי שמוצג באיור 1B. הפער בגודל NPs ZnO שנמדד באמצעות DLS בהשוואה לזה שהתקבל מתמונת TEM יוחס לצבירה של ננו-חלקיקים חשופים. פוטנציאל הזטה החיובי אישר בעקיפין את רכישת NPs ZnO, אשר יכולים לתקשר אלקטרוסטטית עם משטחי תאים חיידקיים, מה שעלול לגרום נזק פיזי. גודל פוטנציאל הזטה מצביע על היציבות הפוטנציאלית של מערכת קולואידית. כאשר לכל החלקיקים בתרחיף יש פוטנציאלי זטה חיוביים או שליליים גדולים, יש להם נטייה לדחות זה את זה, ולמנוע צבירה. חלקיקים עם פוטנציאל zeta גדול מ +30 mV או פחות מ -30 mV נחשבים בדרך כלל יציבים. NPs ZnO המסונתזים הציגו פוטנציאל zeta של +28.92 mV, מה שמצביע על יציבות יחסית במים²⁰.

ספקטרום הבליעה של NPs ZnO נבדק באמצעות קורא מיקרו-לוחות, וחשף שיא ספיגה ספציפי עבור ZnO ב-360 ננומטר (איור 1C). לאבץ אצטט המקדים אין שיא ייחודי, בעוד של-ZnO NPs ידוע שיא ייחודי של 360-370 ננומטר. הסינתזה אושרה על ידי נוכחותו של שיא ייחודי של 360 ננומטר ב- ZnO NPs²¹ המסונתז. מאפייני ספיגת UV ספציפיים אלה אישרו את הסינתזה הישירה של NPs ZnO. יתר על כן, ניתוח עקיפה של קרני רנטגן (XRD) (איור 1D) חשף פסגות גבישיות ברורות האופייניות ל-ZnO. בהשוואה למבנה הוורציטים המייצג של ZnO NPs (JCPDS No. 36-1415), נצפה כי כל המישורים (1, 0, 0), (0, 0, 2), (1, 0, 1), (1, 0, 2), (1, 1, 1, 0), (1, 0, 3), (2, 0, 0), (1, 1, 2) ו- (2, 0, 1) היו מיושרים²².

היעילות האנטי-מיקרוביאלית של NPs ZnO המסונתז הוערכה באמצעות בדיקת דילול מיקרו-מרק מול דגימות קליניות של P. aeruginosa ו-MRSA שהתקבלו מבית החולים האוניברסיטאי Chung-Ang בסיאול, דרום קוריאה. תמונות של תרביות חיידקים נלכדו לניתוח. כדי להעריך באופן חזותי את היעילות האנטי-מיקרוביאלית של ננו-חלקיקים באמצעות אותו גורם דילול, השתמשו בצלחות מפוזרות עם תמיסה חיידקית לא מדוללת (איור 2A,B). צלחות מפוזרות עם התמיסה המקורית שימשו כדי לקבוע את ריכוז החיידקים המינימלי הפוטנציאלי. מכיוון שנצפתה מושבות חיידקים אפילו בריכוז הגבוה ביותר עבור שני הזנים, לא הושגה השפעה חיידקית מלאה. ריכוזי החיידקים בכל קבוצה חושבו באמצעות גורמי דילול הניתנים לספירה. כאשר השוו את שיעורי ההישרדות של כל קבוצת טיפול לקבוצת הביקורת השלילית, ההשפעות האנטי-מיקרוביאליות של ZnO NPs ניכרו הן בזני P. aeruginosa והן בזני MRSA. בהתחשב בטווח ציטוטוקסיות הנחקר של NPs ZnO, נבדקו ריכוזי ZnO שונים, החל מהריכוז הגבוה ביותר הידוע כגורם לרעילות, שהוא 1000 מיקרוגרם / מ"ל, ועד לטווח הלא רעיל של 62.5 מיקרוגרם / מ"ל, דרך דילול סדרתי^23,24. במקרה של P. aeruginosa, הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ZnO NPs הוגברה באופן תלוי ריכוז (איור 2A). עם זאת, לא ניכרה ירידה ניכרת במספר מושבות החיידקים P. aeruginosa מתרבית החיידקים הלא מדוללת (10⁰).

לעומת זאת, ZnO NPs הפגינו פעילות מיקרוביאלית גבוהה נגד החיידק הגראם חיובי MRSA, עם ירידה ניכרת ביחידות יוצרות מושבות חיידקים (CFU), כפי שאושר על ידי השוואת תמונות של תרביות חיידקים מדוללות לזו של תרבית החיידקים ההתחלתית הלא מדוללת (10⁰). תוצאה זו אישרה כי NPs ZnO מסונתז הציג פעילות מיקרוביאלית נגד שני זני החיידקים, במיוחד מראה יעילות מוגברת נגד זן MRSA.

איור 1: אפיון ננו-חלקיקים של תחמוצת אבץ. (A) העברת תמונות במיקרוסקופ אלקטרונים של NPs ZnO תחת הגדלות שונות. (B) גודל (משמאל) והתפלגות פוטנציאל zeta (מימין) על ידי ניתוח DLS. (C) ספקטרום ספיגה של NPs ZnO באמצעות קורא מיקרו-לוחות. (D) ניתוח XRD של NPs ZnO והפסגות הגבישיות שלהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תכונות אנטיבקטריאליות של ZnO NPs שנבדקו על 5 x 10 5 זני חיידקים CFU/mL. (A) בדיקה אנטיבקטריאלית נגד זן P. aeruginosa. (B) בדיקה אנטיבקטריאלית נגד זן MRSA. N = שליטה שלילית (DPBS), P = שליטה חיובית (A/A). כוכביות מציינות את ההבדל המובהק סטטיסטית בהשוואה לבקרות, ****p ≤ 0.0001. נתונים שהוצגו כממוצע ± SD של שלושה ניסויים עצמאיים שבוצעו בטריפליקטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הסינתזה של NPs ZnO באמצעות משקעים היא פשוטה יחסית ופשוטה. כדי לסנתז בהצלחה NPs ZnO בשיטה זו, ערבוב חיוני כדי להבטיח כי קודמן (אבץ אצטט) מומס במלואו בממס. יתר על כן, הגדלת הטמפרטורה מסייעת לגרום לתגובת עקירה כפולה מוצלחת. בסינתזה של NPs ZnO, ישנם גורמים רבים הקובעים את הגודל והצורה, כולל סוכן המשקעים, ריכוז סוכן המשקעים, ואת פעילי שטח. השימוש בסוכני משקעים שאינם NaOH יכול לשנות את צורת החלקיק. כפי שדווח על ידי Gharpure et ^al.25, כאשר אמוניום הידרוקסיד (NH₄OH) שימש כדי לזרז אבץ אצטט עם חומרים פעילי שטח שונים, חלקיקים היו מסונתזים בעיקר בצורת חרוט ומשולש. אפילו כאשר סונתז באמצעות אשלגן הידרוקסידי (KOH), היה קשה לראות חלקיקים כדוריים²⁶. תצפית זו אישרה כי משקעים עם NaOH אפשרו סינתזה של חלקיקי ZnO עם צורות מעוגלות.

במחקר זה, סינתזנו NPs ZnO באמצעות כמות קטנה של חומרים פעילי שטח ו- NaOH בשל היישום הפוטנציאלי שלהם ביישומים ביו-רפואיים ופיתוח שיטת סינתזה מהירה. כתוצאה מכך, אף על פי שהסינתזה של חלקיקים ננומטריים עגולים הייתה אפשרית, הסינתזה של חלקיקים כדוריים הומוגניים הייתה מוגבלת ללא שינויים נוספים²⁷. ידוע כי NPs ZnO מתפזרים היטב בממיסים לא קוטביים או בממיסים קוטביים ולא קוטביים מעורבים, מה שמוביל לבעיות יציבות וצבירה מוגבלות במים^28,29. מכיוון שה-NPs של ZnO פוזרו ב-DPBS, נצפו תופעות צבירה, דבר שניכר בהבדל בגודל בין תמונות TEM למדידות DLS. הכנסת סוכני מכסה וסוכני צימוד כגון 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) צפויה להגביר את הפיזור במים, אם כי במחקר זה לא נערכו שינויים כדי להעריך את התכונות האנטי-מיקרוביאליות המהותיות של ZnO NPs³⁰.

שיטת הסינתזה של ZnO NPs המוצגת במחקר זה שונה מטכניקות בסיוע מיקרוגל או סולוותרמיות בכך שהיא אינה דורשת לחץ גבוה או חום, ואינה מערבת שום מקשר מלבד כמות קטנה של חומרים פעילי שטח^31,32. עם זמן תגובת סינתזה של שעתיים בלבד, הוא נגיש בקלות לכל אחד. מנקודת מבט של יישום ביו-רפואי, מחקר זה העריך את התכונות האנטיבקטריאליות של NPs ZnO באמצעות דגימות קליניות MDR שהתקבלו מאוניברסיטת צ'ונג-אנג, ואיפשר לקבוע את הריכוז הדרוש של ZnO להשמדת חיידקים בסביבות בעולם האמיתי. בהשוואה למחקר של Khan et al., שבו רוב החיידקים הושמדו בטווח ריכוז של 60 מיקרוגרם / מ"ל נגד P. aeruginosa, נמצא כי הזנים הקליניים MDR ששימשו במחקר זה הציגו שיעורי הישרדות גבוהים יותר³³.

היעילות האנטי-מיקרוביאלית של הזנים המסונתזים ZnO NPs הוערכה כנגד הזנים P. aeruginosa ו-MRSA. בהתחשב בזמן ההכפלה הקצר של חיידקים במהלך הניסוי, תחילה הנחת תמיסת הננו-חלקיקים בצלחת של 96 בארות, ולאחר מכן הוספת התמיסה החיידקית באופן מיידי היא קריטית. יתר על כן, שימוש בדילולים שונים לתרבית הוא חיוני לקביעה מדויקת של הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ננו-חלקיקים. ערבוב יסודי של התמיסה החיידקית במהלך יצירת הדילולים הסדרתיים פי 10 הוא גם קריטי; לכן, יש צורך בפיפטינג ומערבולות זהירים. עם זאת, יש לציין כי הליך ניסיוני זה הוא זמן רב. לפיכך, הערכה ראשונית באמצעות מדידות ספיגה ב 600 ננומטר יכולה לספק הערכה משוערת של פעילות מיקרוביאלית לפני תרבית.

NPs ZnO המסונתז הפגינו פעילות אנטי-מיקרוביאלית גבוהה יותר נגד זן MRSA, ככל הנראה בשל הבדלים במבנה החיידקי. חיידקים גראם-שליליים, כגון P. aeruginosa, נבדלים מ-MRSA במבנה קרום התא שלהם, במיוחד בהיווצרות קרום כפול המכיל ליפופוליסכרידים, בניגוד לקרום פפטידוגליקן עבה חד-שכבתי של MRSA. מבנה דו-קרום זה עלול לעכב את חדירתם של יוני Zn²⁺ האנטי-מיקרוביאליים, ולהגדיל את שיעור ההישרדות של P. aeruginosa. ZnO NPs מנוצלים בזכות התכונות האנטי-מיקרוביאליות שלהם ומשמשים באופן פעיל גם במסנני קרינה ובהתחדשות העור. לפיכך, מחקרים מגוונים המשתמשים ב- ZnO NPs צפויים להימשך בעתיד.

ניתן ליישם NPs ZnO בתחומים שונים, באמצעות שינוי פני השטח והצמדות חומרים שונות. ZnO מחזיקה ביישומים פוטנציאליים במתן תרופות, ציפויים אנטיבקטריאליים, טיפול בסרטן וריפוי פצעים, בין היתר³⁴. ZnO NPs יכול להיות מיושם בהעברת תרופות על ידי הצמדת מולקולות מיקוד כגון נוגדנים, המאפשר העברה ממוקדת לתאים ספציפיים או רקמות³⁵. בנוסף, באמצעות יצירת מיני חמצן תגובתי, ZnO NPs יכול להתמקד לא רק בתאי חיידקים אלא גם בתאים סרטניים. יתר על כן, שחרור יוני Zn²⁺ מננו-חלקיקי ZnO ויצירת מי חמצן (H₂O₂) כתוצאה ממיני חמצן תגובתיים יכולים לקדם תהליכי ריפוי פצעים באתר הפצע³⁶. צפוי כי פוטנציאלים אלה יובילו למחקרים רבים הבוחנים את השימוש ב- ZnO NPs בתחומים שונים.

ד"ר ג'ונגהון צ'וי הוא המנכ"ל/מייסד, וד"ר יונג-היון צ'וי הוא ה-CTO של מכון פיינמן לטכנולוגיה בתאגיד הננו-רפואה.

מחקר זה נתמך על ידי מלגת המחקר לתארים מתקדמים של אוניברסיטת צ'ונג-אנג בשנת 2022 (גב 'גאהיון לי). עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) שמומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT) (מס '2020R1A5A1018052) ועל ידי התוכנית לפיתוח טכנולוגיה (RS202300261938) במימון משרד העסקים הקטנים והבינוניים (MSS, קוריאה).