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* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Dans cette étude, des nanoparticules d’oxyde de zinc ont été synthétisées à l’aide d’une méthode de précipitation. L’effet antibactérien des particules synthétisées a été testé contre des souches bactériennes de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline multirésistante (SARM) et de souches bactériennes Pseudomonas aeruginosa .
Les infections bactériennes nosocomiales sont devenues de plus en plus difficiles en raison de leur résistance inhérente aux antibiotiques. L’émergence de souches bactériennes multirésistantes dans les hôpitaux a été attribuée à l’utilisation extensive et variée des antibiotiques, ce qui a encore exacerbé le problème de la résistance aux antibiotiques. Les nanomatériaux métalliques ont été largement étudiés comme solution alternative pour éradiquer les cellules bactériennes résistantes aux antibiotiques. Les nanoparticules métalliques attaquent les cellules bactériennes par divers mécanismes, tels que la libération d’ions antibactériens, la génération d’espèces réactives de l’oxygène ou la perturbation physique, contre laquelle les bactéries ne peuvent pas développer de résistance. Parmi les nanoparticules métalliques antimicrobiennes faisant l’objet d’une recherche active, les nanoparticules d’oxyde de zinc, qui sont approuvées par la FDA, sont connues pour leur biocompatibilité et leurs propriétés antibactériennes. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur le développement d’une méthode de précipitation pour synthétiser des nanoparticules d’oxyde de zinc, analyser les propriétés de ces nanoparticules et effectuer des tests antimicrobiens. Les nanoparticules d’oxyde de zinc ont été caractérisées à l’aide de la microscopie électronique à transmission (MET), de la diffusion dynamique de la lumière (DLS), de la spectroscopie ultraviolette/visible et de la diffraction des rayons X (DRX). Des tests antibactériens ont été effectués à l’aide du test de microdilution en bouillon avec des souches multirésistantes de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) et de Pseudomonas aeruginosa. Cette étude a démontré le potentiel des nanoparticules d’oxyde de zinc dans l’inhibition de la prolifération des bactéries résistantes aux antibiotiques.
Les infections bactériennes multirésistantes (MR) constituent une menace mondiale importante pour la santé humaine1. Comme ces infections peuvent être mortelles chez les patients atteints de maladies sous-jacentes, des recherches actives tentent de résoudre ce problème2. Les bactéries ont évolué pour échapper à l’action de divers médicaments. La pénicilline, largement connue et créditée d’avoir sauvé des millions de vies dans le monde, est un antibiotique à β-lactamines qui inhibe la synthèse de la paroi cellulaire bactérienne3. Cependant, les bactéries ont évolué pour neutraliser l’efficacité des médicaments par divers mécanismes tels que les pompes à efflux, les altérations de la transpeptidase ou la diminution de la perméabilité4. De plus, les cellules bactériennes peuvent transmettre ces gènes de résistance à la génération suivante, augmentant ainsi les taux de survie de la génération suivante et renforçant le problème des souches résistantes5.
L’augmentation des bactéries résistantes aux antibiotiques a conduit à l’émergence de bactéries multirésistantes, qui présentent généralement une résistance à plusieurs antibiotiques. Les souches multirésistantes sont le plus souvent rencontrées en milieu hospitalier, où plusieurs souches bactériennes sont exposées à différents antibiotiques et développent par conséquent une résistance à ceux-ci6. Staphylococcus aureus, en particulier S. aureus résistant à la méthicilline (SARM), est une bactérie commensale à Gram positif qui forme des grappes sur la peau d’environ 30 % des humains 7,8. Le SARM, qui a été identifié pour la première fois dans les années 1960, présente une sensibilité réduite aux antibiotiques à β-lactamines, ce qui a entraîné une forte augmentation des taux d’infection depuisles années 19909. Parmi les bactéries à Gram négatif, Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) est l’une des souches les plus répandues acquises dans les hôpitaux. Cette espèce, une bactérie facultative en forme de bâtonnet, provoque des infections opportunistes chez l’homme10. En particulier, les souches multirésistantes qui affectent directement la santé humaine sont responsables de plus de 50 % des infections associées aux soins de santé11. Dans cette étude, nous avons utilisé les souches multirésistantes les plus couramment rencontrées dans les hôpitaux, le SARM et P. aeruginosa.
L’utilisation de nanoparticules (NP) à des fins antimicrobiennes a fait l’objet d’études approfondies pour s’attaquer au problème de la résistance aux antibiotiques. Les NP métalliques, en particulier, induisent la mort cellulaire bactérienne par divers mécanismes, offrant une solution potentielle au problème de la résistance aux médicaments. Les NP métalliques exercent une activité antimicrobienne par le biais de multiples mécanismes, notamment la libération d’ions antimicrobiens, la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et la perturbation physique des cellules, entre autres moyens12. Les NP composés d’argent, de cuivre, d’oxyde de zinc (ZnO) et d’oxyde de titane possèdent une efficacité antimicrobienne élevée et font donc l’objet de recherches actives13.
Les NP ZnO ont été approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour une utilisation chez l’homme. À l’inverse, malgré leur grande efficacité antimicrobienne, l’utilisation des nanoparticules d’argent et de cuivre chez l’homme est limitée par leur cytotoxicité élevée. Cependant, les NP ZnO sont couramment trouvés dans la vie quotidienne et sont même présents dans les formulations de protection solaire largement utilisées14. Il convient de noter que les ions Zn2+ libérés par les NP ZnO sont très efficaces dans le traitement bactérien, induisant la mort cellulaire bactérienne par la génération de ROS et d’autres mécanismes de dommages physiques15.
Cette étude décrit le protocole de synthèse des nanoparticules de ZnO (NP) à l’aide d’une méthode de précipitation et présente une approche d’essai antimicrobienne utilisant une méthode de dilution de microbouillon avec des échantillons cliniques de SARM et de P. aeruginosa. La méthode de précipitation des NP de ZnO consiste à synthétiser des NP de ZnO solides insolubles en ajustant le pH et la température à l’aide de précurseurs solubles tels que l’acétate de zinc ou le nitratede zinc 16. Associée à une production relativement facile et rapide, cette méthode assure la répétabilité de la synthèse et facilite le contrôle de la taille et de la morphologie des particules17. Dans ce protocole de synthèse, l’hydroxyde de sodium (NaOH), l’un des agents de précipitation les plus couramment utilisés, a été utilisé pour précipiter l’acétate de zinc, et une petite quantité de bromure d’hexadécyltriméthylammonium (CTAB) a été utilisée pour inhiber la synthèse incontrôlée des nanoparticules18. Parmi divers tests antimicrobiens, l’activité antibactérienne des nanoparticules de ZnO a été évaluée à l’aide de la méthode de dilution par microbouillon, qui évite les interférences optiques des nanoparticules d’oxyde métallique et permet de mesurer directement les colonies pour déterminer la CMI19.
Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.
1. Préparation de nanoparticules d’oxyde de zinc
2. Tests antibactériens à l’aide de SARM et de P. aeruginosa
La synthèse réussie des NPs de ZnO a été confirmée par microscopie électronique à transmission (MET), comme le montre la figure 1A. On a observé que les NP de ZnO obtenus étaient de forme ronde, avec une taille moyenne de particules de 35,35 nm et un écart-type de 6,81 nm. La précipitation de ces nanoparticules a été observée par une réaction de double déplacement par ajout d’une solution de NaOH à de l’acétate de zinc, où les ions Zn2+ ont subi une hydrolyse.
À l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS), la taille moyenne et le potentiel zêta des nanoparticules synthétisées ont été déterminés à 130,4 nm et 28,92 mV, respectivement, comme le montre la figure 1B. L’écart entre la taille des NP de ZnO mesurée à l’aide de la DLS et celle obtenue à partir de l’image TEM a été attribuée à l’agrégation de nanoparticules nues. Le potentiel zêta positif a indirectement confirmé l’acquisition de NP de ZnO, qui peuvent interagir électrostatiquement avec les surfaces cellulaires bactériennes, causant potentiellement des dommages physiques. L’amplitude du potentiel zêta indique la stabilité potentielle d’un système colloïdal. Lorsque toutes les particules en suspension ont de grands potentiels zêta positifs ou négatifs, elles ont tendance à se repousser, empêchant ainsi l’agrégation. Les particules dont le potentiel zêta est supérieur à +30 mV ou inférieur à -30 mV sont généralement considérées comme stables. Les NP de ZnO synthétisés ont montré un potentiel zêta de +28,92 mV, indiquant une stabilité relative dans l’eau20.
Les spectres d’absorption des NP de ZnO ont été examinés à l’aide d’un lecteur de microplaques, révélant un pic d’absorption spécifique pour le ZnO à 360 nm (Figure 1C). Le précurseur de l’acétate de zinc n’a pas de pic unique, alors que les NP de ZnO sont connus pour avoir un pic unique à 360-370 nm. La synthèse a été confirmée par la présence du pic unique de 360 nm dans les NPs21 de ZnO synthétisés. Ces caractéristiques spécifiques d’absorption des UV ont confirmé la synthèse directe des NPs de ZnO. De plus, l’analyse par diffraction des rayons X (XRD) (Figure 1D) a révélé des pics cristallins distincts caractéristiques du ZnO. En comparant la structure wurtzite représentative des NP de ZnO (JCPDS n° 36-1415), il a été observé que tous les plans (1, 0, 0), (0, 0, 2), (1, 0, 1), (1, 0, 2), (1, 1, 0), (1, 0, 3), (2, 0, 0), (1, 1, 2) et (2, 0, 1) étaient alignés22.
L’efficacité antimicrobienne des NP de ZnO synthétisées a été évaluée à l’aide d’un test de dilution dans un microbouillon par rapport à des échantillons cliniques de P. aeruginosa et de SARM obtenus à l’hôpital universitaire Chung-Ang de Séoul, en Corée du Sud. Des images de cultures bactériennes ont été capturées pour analyse. Pour évaluer visuellement l’efficacité antimicrobienne des nanoparticules à l’aide du même facteur de dilution, des plaques épandues avec une solution bactérienne non diluée ont été utilisées (figures 2A, B). Des plaques d’épandage contenant la solution d’origine ont été utilisées pour déterminer la concentration bactéricide minimale potentielle. Étant donné que des colonies bactériennes ont été observées même à la concentration la plus élevée pour les deux souches, un effet bactéricide complet n’a pas été obtenu. Les concentrations bactériennes dans chaque groupe ont été calculées à l’aide de facteurs de dilution dénombrables. En comparant les taux de survie de chaque groupe de traitement à ceux du groupe témoin négatif, les effets antimicrobiens des NP de ZnO étaient évidents chez les souches de P. aeruginosa et de SARM. Compte tenu de la plage de cytotoxicité des NP de ZnO étudiée, différentes concentrations de ZnO ont été testées, en commençant par la concentration la plus élevée connue pour induire une toxicité, qui est de 1000 μg/mL, jusqu’à la plage non toxique de 62,5 μg/mL, par dilution en série23,24. Dans le cas de P. aeruginosa, l’activité antimicrobienne des NP de ZnO a été augmentée en fonction de la concentration (figure 2A). Cependant, une diminution visible du nombre de colonies bactériennes de P. aeruginosa à partir de la culture bactérienne non diluée (100) n’était pas évidente.
À l’inverse, les NP de ZnO ont montré une activité antimicrobienne élevée contre la bactérie à Gram positif SARM, avec une diminution notable des unités formant des colonies bactériennes (UFC), comme le confirme la comparaison des images des cultures bactériennes diluées à celles de la culture bactérienne non diluée initiale (100). Ce résultat a confirmé que les NP de ZnO synthétisées présentaient une activité antimicrobienne contre les deux souches bactériennes, en particulier une efficacité accrue contre lasouche de SARM.
Figure 1 : Caractérisation des nanoparticules d’oxyde de zinc. (A) Images de microscopie électronique à transmission de NP de ZnO sous différents grossissements. (B) Taille (à gauche) et distribution du potentiel zêta (à droite) par analyse DLS. (C) Spectre d’absorbance des NP de ZnO à l’aide d’un lecteur de microplaques. (D) Analyse XRD des NP de ZnO et de leurs pics cristallins. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Propriétés antibactériennes des NP de ZnO testées sur 5 x 10 5 UFC/mL (A) Test antibactérien contre la souche P. aeruginosa. (B) Test antibactérien contre la souche SARM. N = témoin négatif (DPBS), P = témoin positif (A/A). Les astérisques indiquent la différence statistiquement significative par rapport aux témoins, ****p ≤ 0,0001. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type de trois expériences indépendantes réalisées en trois exemplaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La synthèse des NP de ZnO par précipitation est relativement simple et directe. Pour réussir à synthétiser les NP de ZnO à l’aide de cette méthode, il est essentiel de remuer pour s’assurer que le précurseur (acétate de zinc) est complètement dissous dans le solvant. De plus, l’augmentation de la température aide à induire une réaction réussie de double déplacement. Dans la synthèse des NP de ZnO, de nombreux facteurs déterminent la taille et la forme, notamment l’agent de précipitation, la concentration de l’agent de précipitation et le tensioactif. L’utilisation d’agents de précipitation autres que le NaOH peut modifier la forme des particules. Comme l’ont rapporté Gharpure et coll.25, lorsque de l’hydroxyde d’ammonium (NH4OH) a été utilisé pour précipiter l’acétate de zinc avec différents tensioactifs, les particules ont été principalement synthétisées en forme de cône et de triangle. Même lorsqu’ils étaient synthétisés à l’aide d’hydroxyde de potassium (KOH), il était difficile de voir les particules sphériques26. Cette observation a confirmé que la précipitation avec du NaOH facilitait la synthèse de nanoparticules de ZnO aux formes arrondies.
Dans cette étude, nous avons synthétisé des NP de ZnO à l’aide d’une petite quantité de tensioactif et de NaOH en raison de leur application potentielle dans des applications biomédicales et du développement d’une méthode de synthèse rapide. En conséquence, même si la synthèse de particules nanométriques de forme ronde était possible, la synthèse de particules sphériques homogènes était limitée sans modifications supplémentaires27. Les NP de ZnO sont connus pour bien se disperser dans les solvants non polaires ou les solvants mixtes polaires et non polaires, ce qui entraîne des problèmes de stabilité et d’agrégation limités dans l’eau28,29. Comme les NP de ZnO étaient dispersés dans le DPBS, des phénomènes d’agrégation ont été observés, ce qui était évident à partir de la différence de taille entre les images TEM et les mesures DLS. L’introduction d’agents de coiffage et d’agents de couplage tels que le 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES) devrait améliorer la dispersion dans l’eau, bien qu’aucune modification n’ait été apportée dans cette étude pour évaluer les propriétés antimicrobiennes intrinsèques des NPs30 de ZnO.
La méthode de synthèse des NP de ZnO présentée dans cette étude diffère des techniques assistées par micro-ondes ou solvothermiques en ce qu’elle ne nécessite pas de pression ou de chaleur élevée, et n’implique aucun agent de liaison autre qu’une petite quantité de tensioactif31,32. Avec un temps de réaction de synthèse de seulement 2 h, il est facilement accessible à tous. Du point de vue de l’application biomédicale, cette étude a évalué les propriétés antibactériennes des NP de ZnO à l’aide d’échantillons cliniques MDR obtenus de l’Université Chung-Ang, ce qui a permis de déterminer la concentration nécessaire de ZnO pour éradiquer les bactéries dans des environnements réels. Par rapport à l’étude de Khan et coll., où la plupart des bactéries ont été éradiquées à une concentration de 60 μg/mL contre P. aeruginosa, il a été constaté que les souches cliniques multirésistantes utilisées dans cette étude présentaient des taux de survie plus élevés33.
L’efficacité antimicrobienne des NP de ZnO synthétisées a été évaluée contre P . aeruginosa et les souches de SARM. Étant donné le court temps de doublement des bactéries au cours de l’expérience, il est crucial de placer d’abord la solution de nanoparticules dans une plaque de 96 puits, puis d’ajouter rapidement la solution bactérienne. De plus, l’utilisation de diverses dilutions pour la culture est cruciale pour déterminer avec précision l’activité antimicrobienne des nanoparticules. Un mélange complet de la solution bactérienne lors de la génération des dilutions en série de 10 fois est également crucial ; Par conséquent, un pipetage et un vortex soigneux sont nécessaires. Cependant, il faut noter que cette procédure expérimentale prend beaucoup de temps. Ainsi, une évaluation préliminaire à l’aide de mesures d’absorbance à 600 nm peut fournir une estimation approximative de l’activité antimicrobienne avant la culture.
Les NP de ZnO synthétisées ont montré une activité antimicrobienne plus élevée contre la souche de SARM, probablement en raison de différences dans la structure bactérienne. Les bactéries à Gram négatif, telles que P. aeruginosa, diffèrent du SARM par la structure de leur membrane cellulaire, en particulier par la formation d’une double membrane contenant des lipopolysaccharides, par opposition à une membrane épaisse de peptidoglycane monocouche de SARM. Cette structure à double membrane entrave potentiellement la pénétration des ions antimicrobiens Zn2+ , augmentant ainsi le taux de survie de P. aeruginosa. Les NP de ZnO sont utilisés pour leurs propriétés antimicrobiennes et sont également activement utilisés dans les écrans solaires et la régénération de la peau. Par conséquent, diverses études utilisant des NP de ZnO devraient se poursuivre à l’avenir.
Les NP ZnO peuvent être appliqués dans divers domaines, par modification de surface et diverses conjugaisons de matériaux. Le ZnO a des applications potentielles dans l’administration de médicaments, les revêtements antibactériens, le traitement du cancer et la cicatrisation des plaies, entre autres34. Les NP de ZnO peuvent être appliquées dans l’administration de médicaments en conjuguant des molécules ciblées telles que les anticorps, ce qui permet une administration ciblée à des cellules ou des tissus spécifiques35. De plus, grâce à la génération d’espèces réactives de l’oxygène, les NP de ZnO peuvent cibler non seulement les cellules bactériennes, mais aussi les cellules cancéreuses. De plus, la libération d’ions Zn2+ à partir de nanoparticules de ZnO et la génération de peroxyde d’hydrogène (H2O2) due à des espèces réactives de l’oxygène peuvent favoriser les processus de cicatrisation des plaies au site de la plaie36. On s’attend à ce que ces potentiels mènent à de nombreuses recherches explorant l’utilisation des NP de ZnO dans différents domaines.
Le Dr Jonghoon Choi est le PDG/fondateur, et le Dr Yonghyun Choi est le directeur technique de l’Institut de technologie Feynman de la Nanomedicine Corporation.
Cette recherche a été soutenue par la bourse de recherche supérieure de l’Université Chung-Ang en 2022 (Mme Gahyun Lee). Ces travaux ont également été soutenus par la subvention de la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (n° 2020R1A5A1018052) et par le Programme de développement technologique (RS202300261938) financé par le ministère des PME et des startups (MSS, Corée).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DLS | Zetasizer Pro | ||
Ethyl alcohol, absolute | DAEJUNG | 4023-2304 | |
Microplate reader | BioTeck | ||
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
TEM | JEOL JEM-F200 | ||
TSA | DB difco | 236950 | |
TSB | DB difco | 211825 | |
XRD | NEW D8-Advance | ||
Zinc acetate | Sigma-Aldrich | 383317 |
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