Method Article
כאן, אנו מציגים שיטה לחקירת מורפוגנזה נויריט ברשתית לאחר הלידה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית לשגות זמן. אנו מתארים גישה לתיוג דליל ורכישה של סוגי תאי רשתית ותהליכים עדינים שלהם באמצעות וקטורים וירוס הקשורים אדנו רקומביננטי המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה באופן תלוי Cre.
גילוי מנגנונים שמעצבים ארבורים דנדריטיים דורש שיטות להמחשה, דימוי וניתוח דנדריטים במהלך הפיתוח. רשתית העכבר היא מערכת מודל רבת עוצמה לחקירה של מנגנונים ספציפיים לסוג התא של מורפוגנזה עצבית וקישוריות. הארגון וההרכב של תת-סוגים ברשתית מוגדרים היטב, וכלים גנטיים זמינים כדי לגשת לסוגים ספציפיים במהלך הפיתוח. סוגי תאי רשתית רבים מגבילים גם את הדנדריטים ו/או האקסונים שלהם לשכבות צרות, מה שמאפשר הדמיה בזמן לשגות. תרביות רשתית העכבר מתאימות היטב להדמיית תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או מולטיפוטונית, אך חסרות שיטות המותאמות לדינמיקת דנדריט הדמיה עם רזולוציה זמנית ומבנית. מוצג כאן היא שיטה לתייג ולדמיין בדלילות את ההתפתחות של אוכלוסיות רשתית ספציפיות המסומנות על ידי מערכת Cre-Lox. וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) הזמינים מסחרית המשמשים כאן מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה באופן תלוי Cre- תלוי. משלוח תוך עיני של AAVs בעכברים יילודים מייצר תיוג פלואורסצנטי של סוגי תאים ממוקדים על ידי 4-5 ימים לאחר ההזרקה (dpi). אותות פלואורסצנטיים ממברנה ניתנים לזיהוי על ידי הדמיה קונפוקלית ולפתור מבני ענף עדינים ודינמיקה. קטעי וידאו באיכות גבוהה המשתרעים על פני 2-4 שעות נרכשים מהדמיית רשתית שטוחה-תושבות עם נוזל שדרתי מלאכותי מחומצן (aCSF). כמו כן מסופק צינור לאחר עיבוד תמונה עבור deconvolution ותיקון סחיפה תלת מימדי (3D). פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללכוד כמה התנהגויות תאיות ברשתית שלמה ולזהות גורמים חדשניים השולטים מורפוגנזה neurite. אסטרטגיות התפתחותיות רבות הנלמדות ברשתית יהיו רלוונטיות להבנת היווצרות מעגלים עצביים במקומות אחרים במערכת העצבים המרכזית.
דנדריטים של נוירונים ברשתית יוצרים דפוסים מורכבים, אך ספציפיים, המשפיעים על תפקידם בתוך מעגלים עצביים. ברשתית החולייתנית, סוגים מגוונים של תאי גנגליון רשתית (RGCs) ואינטראורונים תא amacrine נושאים מורפולוגיות דנדריטיות ייחודיות השונות בגודל ארבור, מיקום, אורך ענף, וצפיפות1. במהלך התפתחות לאחר הלידה, RGCs ותאי amacrine להרחיב תהליכים דנדריטיים תוססים לתוך נוירופיל הנקרא שכבת plexiform הפנימית (IPL), שם הם מקבלים קלט תא דו קוטבי המשדר אותות photoreceptor2. כפי שנתפס על ידי הדמיה בזמן-לשגות של אוכלוסיות רשתית שכותרתו פלואורסצנטית בזחלי אפרוחים או דגי זברה, מורפוגנזה דנדריט הוא דינמי מאוד 3,4,5. בתוך ימים, arbors דנדריטי להרחיב, לשפץ, ו ramify כדי לצמצם את שכבות המשנה של IPL, שם הם סינפסה עם שותפים נבחרים. הארבורים מציגים דינמיקה מבנית שונה על פני ההתפתחות, עם שינויים בשיעורים היחסיים של תוספת ענף, נסיגה וייצוב. אמקרין ודנדריטים של RGC מפגינים גם התנהגויות שונות של צמיחה ושיפוץ שעשויות לשקף ארבוריזציה ספציפית לסוג. עם זאת, מחקרים אלה עקבו אחר אוכלוסיות אמקרין או RGC רחבות והתמקדו במיקוד למינארי, שהוא רק היבט אחד של המורפולוגיה.
המנגנונים המייצרים את המגוון המורפולוגי העצום שנצפו על פני תת-סוגים ברשתית אינם מובנים כהלכה. מטרתה של קבוצה זו הייתה לפתח שיטה ללכידת דינמיקה דנדריקית ושיפוץ ארבור של תת-סוגים מוגדרים של רשתית בעכברים. זיהוי מנגנונים ספציפיים לסוג התא של דפוסי דנדריט דורש שיטות כדי לדמיין ולמדוד התנהגויות דנדריט של תאים מעניינים. תרביות אורגנוטיפיות של רשתיות עכבר מתאימות היטב למחקרי הדמיה של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או רב-פוטונית. הרשתיות המתפתחות מנותחות ומורכבות לתוך גולה שטוח שניתן לצלם במשך מספר שעות בחדר הקלטות או לתרבות במשך כמה ימים עם השפעות מוגבלות על המעגלים 6,7. נוירוני רשתית חיים יכולים להיות מסומנים על ידי מגוון טכניקות, כולל מילוי צבע על ידי אלקטרודות, אלקטרופורציה, משלוח ביוליסטי של חלקיקים מצופים בצבעים ליפופיליים או פלסמידים קידוד חלבונים פלואורסצנטיים (למשל, Gene Gun), כמו גם תוויות תאים מקודדים גנטית7,8,9,10 . עם זאת, גישות אלה אינן יעילות עבור הדמיה דנדריט דינמיקה של תת סוגים ספציפיים ברשתית. לדוגמה, שיטות מילוי צבע הן בעלות תפוקה נמוכה ודורשות מנגנון אלקטרופיזיולוגי ותוויות גנטיות נוספות לתאי יעד אמינים של עניין. יתר על כן, אותות הפלואורסצנטיות החזקים בסומא יכולים לטשטש דנדריטים סמוכים.
שיטות העברת גנים ביוליסטיות יכולות לתייג בו זמנית עשרות תאים, אך צעדים הכוללים אספקת חלקיקים בלחץ גבוה ודגרה לילית של רשתית מבודדת עלולים לסכן את הפיזיולוגיה של התא ואת הצמיחה הדנדריטית. מאמר זה מציע כי כלים גנטיים אחרונים ניתן להשתמש כדי ללכוד דינמיקה דנדריט מוקדם עם סוג התא ורזולוציה מבנית, בהתחשב בקריטריונים הניסיוניים הבאים. ראשית, כדי לפתור את הענפים העדינים ואת הפילופודיה השולטים arbors המתפתחים, השיטה צריכה לתייג נוירונים עם חלבונים בהירים, פלואורסצנטיים הממלאים תהליכים בכל הארבור. תיוג הפלואורסצנטיות לא אמור לדעוך עקב הלבנת פוטואורסצנטיות במהלך תקופת ההדמיה. מגוון גרסאות חלבון פלואורסצנטיות נוצרו והושוו להתאמה להדמיית vivo/ex vivo/ex vivo11 המבוססת על בהירות ופוטוסטיות. שנית, החלבונים הפלואורסצנטיים (XFPs) חייבים לבוא לידי ביטוי ברמות גבוהות מספיק בשלב המוקדם ביותר של מורפוגנזה דנדריט, כך שהחלון ההתפתחותי הצר לא יוחמץ. בניתוחים של נקודות זמן סטטיות ברשתית העכבר, התפתחות דנדריט מתרחשת במהלך השבוע הראשון שלאחר הלידה וכוללת שלבים של צמיחה, שיפוץ וייצוב10,12,13,14,15. שלישית, השיטה צריכה להוביל תיוג סלקטיבי או להסתברות מוגברת של תיוג של תת האוכלוסייה העצבית של עניין. רביעית, תיוג של אוכלוסיית המשנה של היעד חייב להיות דליל מספיק, כך שניתן יהיה לזהות את הארבור העצבי כולו ולעקוב אחריו. למרות שתת-סוגים של משמרות המהפכה ואמקרין יכולים להיות מובחנים על ידי המאפיינים המורפולוגיים הבוגרים שלהם ודפוסי ריבוד IPL16,17,18,19,20, האתגר הוא לזהות תת-סוגים במהלך הפיתוח המבוססים על מבנים לא בוגרים. משימה זו מתאפשרת על ידי הרחבת כלים מהונדסים לתייג סוגי תאים ספציפיים ברשתית במהלך הפיתוח.
קווי עכבר מהונדסים ונוק-אין שבהם ביטוי תאי וטמפורלי של חלבונים פלואורסצנטיים או Cre נקבע על ידי אלמנטים רגולטוריים גנטיים נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור סוגי תאי רשתית13,21,22,23. תצפיות מפתח על דפוסים ספציפיים תת-סוג של התפתחות דנדריט הגיעו ממחקרים של רשתות עכבר מהונדסות בנקודות זמן סטטיות10,14,24,25. מערכת Cre-Lox, בפרט, מאפשרת מניפולציה וניטור גנים מעולים של תת-סוגים באמצעות מגוון כתבים, חיישנים ומפעילים אופטוגנטיים תלויי רקומבינאז. כלים אלה הובילו לתגליות של תוכניות מולקולריות ספציפיות לתת-סוג ומאפיינים פונקציונליים העומדים בבסיס הרכבת מעגל רשתית26,27,28,29,30. עם זאת, הם עדיין לא להיות ממונפים ללמוד דינמיקה דנדריט ספציפית תת סוג ברשתית העכבר. תיוג בצפיפות נמוכה ניתן להשיג על ידי שילוב קווי עכבר Cre עם טרנסג'נים שהוצגו על ידי אלקטרופורציה או על ידי AAVs רקומביננטי. אם זמין, טמוקסיפן-inducable Cre קווים או אסטרטגיות גנטיות הצטלבות ניתן להשתמש גם. לבסוף, התא צריך להיות מתויג באופן זעיר פולשני ותמונה באמצעות פרמטרי רכישה כדי לא לסכן את הרקמה או להפריע לתפקוד התאי הנדרש עבור מורפוגנזה דנדריט.
מוצגת כאן שיטה ליישם כלים מהונדסים ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לחקור את הדינמיקה של דנדריט ברשתית חיה. קווי עכבר מהונדסים Cre שולבו עם וקטורים AAV המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים על recombination Cre, המאפשר תיוג דליל של תאי רשתית של עניין. AAVs זמין מסחרית מועברים לרשתית היילוד על ידי זריקות intravitreal. מאמר זה מדגים כי AAVs לייצר ביטוי פלואורסצנטי גבוה באופן משמעותי סוג התא על ידי 4 dpi, המאפשר גישה לנקודות זמן לאחר הלידה. כדי להמחיש גישה זו, cholinergic "starburst" amacrine interneuron תויג על ידי מתן Brainbow AAV בעכברים יילודים המבטאים את כולין acetyltransferase (ChAT)-אתר הכניסה לריבוזום פנימי (IRES)-Cre transgene, אשר פעיל ברשתית שלאחר הלידה המוקדמת31,32. תאי amacrine Starburst לפתח מורפולוגיה ארבור סטריאוטיפית רדיאלית כי הוא מעוצב על ידי דנדריט הימנעות עצמית בתיווך protocadherins מקובצים33,34. מאמר זה מראה כי הרזולוציה של דנדריטים starburst ו filopodia משופרת באופן משמעותי על ידי XFPs לקרום הפלזמה עם תוספת של מוטיב CAAX אשר עובר farnesylation, כפי המשמש Brainbow AAVs31. לבסוף, נקבעו פרוטוקולי הדמיה ופוסט-עיבוד של זמן המייצרים תמונות באיכות גבוהה הניתנות לשחזור דנדריט וכימות מורפומטרי. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות גורמים השולטים מורפוגנזה דנדריט וכדי ללכוד כמה התנהגויות תאיות ברשתית שלמה.
הערה: פרוטוקול זה משתרע על פני יומיים עם פרק זמן מינימלי של 4-5 ימים להעברה ויראלית בין ימי ניסוי (איור 1A). ניסויים בבעלי חיים מבוצעים בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים לשימוש בבעלי חיים במחקר וטיפול בבעלי חיים במעבדה תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי המעבדה לשירותים לבעלי חיים שימוש וטיפול בבעלי חיים הוועדה בבית החולים לילדים חולים (טורונטו, קנדה).
1. הכנות לזריקות AAV יילודים וניסויי הדמיה
איור 1: סקירה ניסיונית. (A) פרוטוקול זה משתרע על פני יומיים של ניסויים עם תקופת זיהום מינימלית של 4-5 ימים בין ימי הניסוי. זריקות תוך עיניות מבוצעות על עכברים יילודים לא יותר מיום לאחר הלידה 3. לאחר מכן, הרשתיות מנותחות, מותקנות באופן שטוח ותמונות חיות כדי ללכוד את החלון ההתפתחותי הרצוי. תאים מסומנים בתווית ניתן לדמיין בכל עת לאחר 4-5 הימים הדרושים לביטוי ויראלי, שכן אין השפעות נראות לעין של ביטוי AAV ממושך על מורפולוגיה דנדריט. (B) וקטורים תלויי Crebow AAV (BBV) מוזרקים לבעלי חיים המבטאים את Cre31. במחקר זה, עכברי ChAT-Cre נוק-אין שימשו כדי לנהוג Cre recombination בתאי amacrine starburst. שני BBVs מקודדים eYFP שונה או tagBFP, או mCherry ו- mTFP, אשר מסתיימים במוטיב CAAX כי הוא ברצף farnesylated עבור לוקליזציה ממברנה. אתרי לקס מתוארים במשולשים. הווקטורים מבטאים XFPs מופרכים באופן סטוכסטי וקומבינטורי התלוי רקומבינציה בקרומבינציה. מקדם EF1α כולל אלמנטים רגולטוריים מהגן גורם התארכות 1α. W מייצג אלמנטים מן אלמנטים של וירוס הפטיטיס הפטיטיס woodchuck אלמנט רגולטורי posttranscriptional, ו- pA מציין את רצף polyadenylation. (ג) ספקטרום העירור והפליטה של mCherry ו- eYFP, פלואורופורים BBV בתמונה במחקר זה. כאשר הדמיה חיה חלבונים פלואורסצנטיים מרובים, הפרמטרים לזיהוי חייבים להיות מסודרים כדי להפריד כראוי ספקטרום פליטה לערוצים נפרדים. קיצורים: AAV = וירוס הקשור לאדנו; BBV = Brainbow AAV; ChAT = כולין acetyltransferase; iRES = אתר כניסה פנימי לריבוזום; eYFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר; iTR = חזרה הפוכה על המסוף; tagBP = חלבון פלואורסצנטי כחול תג; mCherry = דובדבן מונומרי; mTFP = חלבון פלואורסצנטי צהבהב; XFP = כל חלבון פלואורסצנטי; EF1α= גורם התארכות 1 אלפא. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
2. זריקות תוך-יומיות של AAVs בעכברים יילודים
איור 2: זריקות תוך עיניות של יילודים. (A) מיקרופיפט במילוי גב מראה את צורת קצה הפיפטה כאשר הוא אטום (למעלה) ולאחר פתיחת הקצה (למטה, משמאל). לחץ הזרקת פיקו של 6-8 פסאיי וזמן דופק של 600-800 מילישניות מייצר טיפה בקוטר 600 מיקרומטר (למטה, מימין). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ.(B) גור P0 מורדם תחת הגדלה של פי 16. צומת העפעפיים המותך (לבן) נחתך באמצעות מחט חדה של 30 גרם. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. (C) לחץ קל המופעל על העין חושף את הקרנית; סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. קטע מוגדל (אדום) מציג את החור הקטן בצומת הקרנית-סקלרה (צהוב) שנוצר עם מחט של 30 גרם; סרגל קנה מידה = 0.5 מ"מ. (D) נסיגה של קצה פיפטה לאחר הזרקה (משמאל). צבע ירוק מהיר בתמיסת AAV מופיע כחול-אפור דרך האישון (באמצע), בהשוואה לצבע האישון הקל לפני ההזרקה (מימין). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (E) לאחר 4 ימים, העפעף נרפא והתמזג סגור (משמאל); סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. עם עידוד, אתר ההזרקה נרפא גלוי (צהוב); סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. שימו לב למיקום אתר ההזרקה בגבול בין הקרנית לסקלרה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
3. ניתוחי רשתית לניסוי הדמיה
4. הכנת הרכבה שטוחה ברשתית
איור 3: כריתת רשתית והתקנה שטוחה על קרומי מסנן אסתר תאית מעורבים. (A) משמאל, עין מוערכת מתייצבת על ידי אחיזה בעצב הראייה עם מלקחיים של דומונט #5 (משמאל). חור קטן נוצר במרכז הקרנית באמצעות מחט 30 גרם (במרכז). מספריים מיקרו-חתך משמשים לחיתוך הקרנית ל -4 מדפים שווים (מימין). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (B) רשתית ניתחה עם הסקלרה קלופה באמצעות שני מלקחיים דומונט #5 (משמאל) ועם העדשה הוסרה (במרכז). רשתית עם 4 חתכים שווים באמצע הרשתית (מימין). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (ג) טיפול ברשתית עם שתי מברשות צבע עדינות (גודל 3/0, משמאל). רשתית התהפכה עם תאי גנגליון רשתית בצד למטה על מברשת צבע (במרכז) והרימה מתוך ACSF, מוודא מתח המים לא לקרוע את הרשתית (מימין). סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. (D) דיסק קרום MCE אפור ממוקם על נייר סינון לבן (משמאל). טיפה של ACSF בדיסק MCE (מימין). סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (E) לאחר הצפת הרשתיות לתוך טיפה ומיצוב אותם, ליצור גשר מים עם נייר המסנן הלבן כדי לפתיל את aCSF, מושך את הרשתית על נייר MCE טעון (משמאל); סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. תמונה מוגדלת של קרום MCE (אדום) מראה 2 רשתות המותקנות עם תאי גנגליון רשתית בצד למעלה (מימין); סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. רשתית אחת מסומנת בלבן. קיצורים: MCE = אסתר תאית מעורבת; aCSF = נוזל שדרתי מלאכותי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
5. הדמיה קונפוקלית לשגות זמן של תכשירי רשתית שלמים חיים
איור 4: הגדרת תאי הדגירה של הדמיה של תאים חיים. (A) מנגנון דגירה בהדמיה חיה המציג רכיבי חימום, פתרון והדמיה. תנור חימום כפול כולל פלטפורמת תא דגירה מחוממת (עיגול אחורי עם אלקטרודות מחבר כחולות) ותנור פתרון בשורה. (ב) דיאגרמה סכמטית של 4A. רשתית שטוחה הרכבה (אדום) על קרום MCE (אפור) ממוקם בתא הדגירה. מחמם התמיסה בשורה מחובר למשאבת פתרון (לא בתמונה ב- 4A). מידות תא ההדמיה מאפשרות אזור עבודה טוב לאף המטרה של הטבילה. (C) 25x להציג explant רשתית מוזרק עם 0.23-0.45 μL של 4 × 1012 GC / mL של דילול AAV; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. תיוג צפוף של תאים מקיף לעתים קרובות את ראש עצב הראייה (קו מקווקו, מימין למטה); סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: MCE = אסתר תאית מעורבת; GC = עותקי גנום; mCherry = דובדבן מונומרי; eYFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
6. פירוק התמונה ופוסט-עיבוד ב- ImageJ
באמצעות הפרוטוקול לעיל, וידאו 3D ברזולוציה גבוהה של דנדריטים תאים starburst פיתוח נרכש, פירוק, ותיקן עבור סחיפה 3D. הקרנות מקסימליות של מטוס Z הופקו כדי ליצור סרטוני דו-ממד לניתוח (סרטון משלים 1, איור 5A). פירוק תלת-ממדי של כל נקודת זמן הגביר את הרזולוציה של תחזיות פילופודיה עדינות (איור 5B, C). בליטות פילופודיה עדינות הן תכונה של פיתוח דנדריטים רשתית36 , צריך להיות גלוי במהלך הדמיה. טרנספקטיה AAV תיצור שונות בצפיפות תיוג התאים ובעוצמת הפלואורסצנטיות. לכן, לסנן את הרקמה המסומנת כדי לבחור תאים עם אותות פלואורסצנטיים גבוהים להדמיה והפקת קטעי וידאו באיכות גבוהה. הגדלת כוח הלייזר כדי לזהות תאים המסומנים במעומעם אינה מומלצת, שכן היא יכולה להוביל להלבנת פוטולוג מהירה ולהציג רעש גבוה בהשוואה לאות. תאים בהירים מספיק נראים בתוך 5 dpi. ב-12 dpi ומעלה, תקופות זיהום ממושכות של AAV אינן מובילות בהכרח לפלואורסצנטיות מוגברת של תאים מסומנים בתווית (איור 5D).
פלואורסצנטיות מוגזמת וצפיפות נויריט מתיוג תאים צפופים משפיעים על איכות התמונה ועלולים לעכב שחזורים של תאים חד-תאיים. אופטימיזציה של דילול AAV ונפח נדרש כדי להשיג את המידה הרצויה של arbors מבודדים ומסומנים פלואורסצנטית כי הם נפרדים משאר אוכלוסיית תאי היעד. כאן, 9.2 × 108-1.8 × 109 GCs ויראלי הוזרקו לכל עין כדי למקד תאי amacrine starburst (0.23-0.45 μL של AAV עם 4 × 1012 GC / mL titer). היעדר אות פלואורסצנטי עשוי לשקף טכניקת הזרקה לא יעילה. בעת הזרקה, דליפה של פתרון AAV הכחול מאתר ההזרקה מצביעה על כך שהנגיף אינו מועבר לרשתית, או שנפח ההזרקה או הלחץ גבוהים מדי. נפח הזרקה עודף או לחץ יכול לגרום ניתוק רשתית ו/או אובדן לחץ עיני, פגיעה בתאי הרשתית והפחתת יעילות תיוג התא. שתי הבעיות ניתן לפתור עם תרגול ואופטימיזציה של טכניקת ההזרקה. סיבות פוטנציאליות אחרות לחוסר האות כוללות השפלה של AAVs מאחסון לא תקין או ביטוי Cre לא מספיק מכיוון שהטרנסג'ן Cre אינו פעיל במהלך תקופת טרנספקטו של AAV.
לאחר פירוק הסרטונים, ניתן לבצע ניתוחים דינמיים, כגון חישוב שיעורי חישוב של תוספת ענף, נסיגה או ייצוב. בנוסף, ניתן לבצע ניתוח סטטי קונבנציונלי בכל מסגרת זמן, כולל שחזור נוירונים וכימות מורפוטומטרי כגון אורך הסתעפות כולל, זוויות הסתעפות, סדר הסתעפות או מספר נקודות ענף מסוף. התוצאה של פרוטוקול זה היא סדרת זמן של ערימות תמונות תלת-ממדיות ברזולוציה גבוהה. רוב סרטוני הווידאו הדינמיים של נוריט בתלת-ממד מכמתים ידנית כהקרנה מרבית באמצעות תוכנת תצוגה חזותית של תמונה בקוד פתוח, כגון ImageJ37. כלי קוד פתוח נוסף, Vaa3D38, פותח במיוחד להדמיה של כרכים גדולים. אם יש לנתח סרטונים בתלת-ממד, מומלץ להשתמש במצג חזותי תלת-ממדי + זמן כגון Vaa3D. ImageJ ו-Vaa3D מאפשרים גישה ישירה לפיקסלים או לווקסלים בתמונה, אך לעתים קרובות שחזורי נוירונים נוצרים על-ידי המרת נתוני פיקסלים לשחזורי עצים בעלי שלד. שחזורי נוירון אוטומטיים או חצי אוטומטיים עבור נקודות זמן בודדות יכולים להתבצע עם קוד פתוח39,40,41 ותוכנה קניינית. כדי לנתח שחזורים של זמן לשגות, כל נקודה בשחזור חייבת להיות מקושרת לנקודות הזמן הקודמות והבאות לאחר מכן. יישור מורפולוגיות דנדריטיות מורכבות לאורך זמן, אשר ניתן לקודד על ידי למעלה מ -500 נקודות נתונים, נשאר בעיה מאתגרת. כלים רבים זמינים, עם עוצמות ומגבלות שונות, ויש לבחור אותם כך שיתאימו לניתוחים הדרושים למחקר.
איור 5: תוצאות מייצגות לאחר הזרקה תוך עינית של יילודים, הדמיה בזמן לשגות ודה-מפכלול. (A) תחזיות מרביות של סדרת הדמיה מפורקת של זמן לשגות (h:min) של תא אמקרין כוכב P6 5 ימים לאחר הזרקת PostAAV. כעת ניתן לנתח דינמיקת פילופודיה עדינה באמצעות כלי ImageJ קונבנציונליים. אזור של עידון דנדריטי (קופסה אדומה) ואזור של צמיחה דנדריטית (קופסה ירוקה) מודגשים. (ב, ג) יחיד P6 starburst amacrine תא שכותרתו עם eYFP מתויג קרום 5 ימים הזרקת postAAV (dpi) מראה תיוג תא חד-תאי בהיר. סרגלי קנה מידה עבור לוחות עליונים = 50 מיקרומטר; סרגלי קנה מידה עבור לוחות נמוכים יותר = 25 מיקרומטר. לפני (A) ואחרי (B) דה-פיתול עם ImageJ. Insets (אדום) להראות deblurring כתוצאה של deconvolution מוצלח. (D) P6 starburst amacrine תא 5dpi (משמאל) לעומת P12 starburst תא 11 dpi מראה רמות דומות של ביטוי חלבון פלואורסצנטי. הגדלת זמני הדגירה של AAV אינה מגבירה את האות הפלואורסצנטי. האותות הפלואורסצנטיים אינם יורדים עם תקופות זיהום AAV ארוכות יותר. פרמטרי רכישה ופוסט-עיבוד זהים הוחלו על שתי התמונות. עובי ענף מוגבר ושונות שנצפו ב- P12 הם תכונות רגילות של התבגרות תאי התפרצות כוכבים ולא חפץ תיוג או הדמיה. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: AAV = וירוס הקשור לאדנו; eYFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר; dpi = ימים לאחר ההדבקה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: שיקולים לבחירת Cre line ולוקליזציה של חלבון פלואורסצנטי.
(א-ד) תאי גנגליון רשתית P11 חיים בתמונה ב 9 dpi של BBV מוזרק לתוך Vglut2-iRES-Cre לדפוק-in עכברים, שבו Cre מתבטא באופן סלקטיבי באוכלוסיית RGC. (א) JAM-B RGC מזוהה על ידי המורפולוגיה האסימטרית האופיינית לו24. (B-D) תת-סוגים נפרדים של RGC השונים בדפוסי הריבוד הדנדריט שלהם. (E) תמונה של תא amacrine כוכב P11 חי שעבר באופן ביולוגי עם mCherry ציטוסולי ונלכד עם confocal דיסק מסתובב ב 512 x 512 פיקסלים. XFP הציטוסולי מוביל לאות פלואורסצנטי גבוה בסומא ביחס לבליטות הדנדריטיות העדינות. אור מחוץ למיקוד מהסומא גורם לפלואורסצנטיות גבוהה ברקע כאשר מדמים תחזיות פרוקסימליות קטנות (כניסה בתיבה אדומה למעלה מוצגת להלן). (F) תמונה של תא amacrine p11 כוכב חי שהושפע עם eYFP ממוקד ממברנה ונלכד על ידי סריקת לייזר קונפוקלית ב 1024 x 1024 פיקסלים. שימו לב לטבעת הממברנה הפלואורסצנטית סביב הסומה, ליחס האות-לרעש המשופר ולאיכות ההקרנות העדינות הפרוקסימליות לסומה המיוצרות על ידי חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה (inset). סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר ולוחות נמוכים יותר של E ו- F = 5 מיקרומטר. קיצורים: IRES = אתר כניסה פנימי לריבוזום; BBV = וירוס הקשור לאדנו Brainbow; Vglut2 = משגר גלוטמט שלפוחית 2; XFP = כל חלבון פלואורסצנטי; eYFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר; mCherry = דובדבן מונומרי; RGC = תאי גנגליון רשתית; JAM-B = מולקולת הידבקות צומת B. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו משלים 1: וידאו לשגות זמן של P6 פיתוח כוכב amacrine דנדריטים, 5 ימים לאחר ההזנקה. שלב הזמן של הווידאו הוא 2 דקות. Deconvolution ותיקון סחיפה 3D הוחלו באמצעות ImageJ. תיבות צהובות עליונות מדגישות אזורים של תולדה, והקופסה התחתונה מתארת אזור של צמיחת פילופודיה חולפת, מגע עצמי ונסיגה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
קובץ משלים 1: מאקרו ImageJ עבור אצווה פירוק איטרטיבי מקבילי. המאקרו מפעיל 25 איטראציות של אלגוריתם האיטרטיבי Landweber (WPL) של מסנן הווינר. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
וידאו זה מדגים צינור ניסיוני המשתמש בכלים גנטיים קיימים כדי לדמיין דינמיקה של דנדריט של פיתוח נוירונים ברשתית עם הדמיה חיה קונפוקלית. כמו כן הוכחו זריקות תוך עיניות של AAVs תלויי Cre קידוד חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה לעכברים יילודים. תאים בודדים של אוכלוסיות ממוקדות גנטית מסומנים בבהירות כבר 4-5 dpi. הרכבות שטוחות ברשתית הוכנו לתאי הדמיה סטנדרטיים כדי לבצע הדמיה קונפוקלית של תאים חיים. שיטה זו מייצרת קטעי וידאו ברזולוציה גבוהה של זמן לשגות של תאים בודדים ואת התחזיות העדינות שלהם. תחזיות קטנות נפתרות ומכמתות באמצעות אלגוריתמים של דה-מפכונלציה ופוסט-עיבוד הזמינים באמצעות תוכנת קוד פתוח, כולל ImageJ, Vaa3D ו- ShuTu, כמו גם תוכנה מורשית הזמינה מ- Imaris ו- MBF Bioscience. כמו צינור זה הוא מודולרי, כל סעיף פרוטוקול ניתן לשנות כדי להתאים את המטרות של המחקר. אלמנטים מודולריים אלה נדונים להלן וכוללים: 1) בחירת Cre-line, 2) בחירה של חלבון פלואורסצנטי ומבנה ויראלי, 3) שיטות אספקת גנים, ו 4) שיטת הדמיה.
טכניקה זו משתמשת בקווים מהונדסים Cre לגישה גנטית לתת-אוכלוסיות של תאי רשתית. Cre חייב להיות פעיל לאחר הלידה ובא לידי ביטוי על פני אוכלוסיית התאים בזמן ההזרקה כדי להגדיל את ההסתברות של זיהום ויראלי ותיוג תאים. בדו"ח זה, ChAT-Cre שימש למקד תאי amacrine starburst, ואת קו Vglut2-Cre שימש כדי למקד פיתוח RGCs42,43(איור 6). הזרקת AAV תלוית Cre לעכברי Vglut2-IRES-Cre המסומנים במגוון RGCs, כולל מולקולת הידבקות הצומת B (איור 6A) ו-RGCs דו-שכבתיים (איור 6B, C). לחלופין, עיצובים חדשים של AAVs עם מקדמים סינתטיים המניעים ביטוי ספציפי לסוג התא יכולים לבטל את הצורך בקווים מהונדסים Cre44. שיקול נוסף עבור תיוג יעיל ובהיר המתאים להדמיה חיה הוא הזמן המינימלי הנדרש עבור transfection וביטוי, אשר יכול להשתנות בהתאם לסרוטיפ AAV, טרופיזם, ו titer45. במחקרים אלה, כמו תיוג בתיווך AAV דורש מינימום של 4-5 dpi עבור ביטוי XFP, שיטה זו אינה מתאימה לגישה לנקודות זמן מוקדמות לאחר הלידה. כדי ללכוד נקודות זמן מוקדמות (למשל, P0-P4), זריקות תוך עיניות ניתן לבצע ברחם בבעלי חיים עובריים, כפי שנעשה עבור אלקטרופורציה הרחם46. במחקרים של קבוצה זו על התפתחות דנדריט starburst, דפוס רקומבינציה דלילה ראשונית של ChAT-Cre נוצל כדי לתייג תאי amacrine כוכב יחיד ב P0-P4 באמצעות כתב Cre מהונדס עכבר, רוזה-mTmG27. לבסוף, פרוטוקול הזרקת רשתית AAV זה יכול לשמש כדי לתייג אוכלוסיות תאים בוגרים, בהתבסס על האישור של ההתמדה של תיוג פלואורסצנטי 3 חודשים לאחר הזרקה ללא השפעות מזיקות על מורפולוגיה של תאי starburst34.
צינור זה מאפשר גם גמישות בבחירת מבנים ויראליים. כדי ללכוד את הדינמיקה של דנדריט, ניתן להשתמש במגוון חלבונים פלואורסצנטיים בכתב, כולל חלבונים המותאמים למבנים תת-תאיים ספציפיים, חלבונים בעלי עניין, או מדווחים על שינויים פונקציונליים כגון דינמיקת אקטין (למשל, LifeAct) ואותות סידן (למשל, GCaMP). כל וקטור AAV זמין מסחרית או משוכפל יכול להיות מועסק, וכלים מקוונים כגון fpbase.org יש להפנות עבור בהירות ו phototability. כאן, וקטורים ויראליים Brainbow קידוד חלבונים פלואורסצנטיים עם מוטיב H-Ras farnesylation CAAX שימשו לוקליזציה ממברנה. בשלב מוקדם של פיתוח הפרוטוקול, לוקליזציה ציטוטוסולית של XPFs נמצאה כלא אידיאלית ללימוד מורפולוגיה של נויריטים משובחים, עם רוויית יתר של אותות מהסומא ותיוג לקוי של ענפים עדינים (איור 6E). לשם השוואה, חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה הוצגו כמתייגים ומוכרים בליטות דנדריטיות עדינות (איור 6E, F). שיקול נוסף הוא הגודל, העיצוב והמורכבות של המבנה הנגיפי, שיכולים להשפיע על זמן הביטוי. לדוגמה, נוצר AAV-CAG-FLEx-mClover3-CAAX, המבטא XFP אחד באופן תלוי-Cre. מבנה זה כולל עיצוב פשוט יותר, והתוצאה היא ביטוי יעיל על ידי 4 dpi. יחד, האפשרויות המגוונות עבור קווי Cre, עיצובי AAV, וכתבי חלבון פלואורסצנטיים הזמינים באופן נרחב ממאגרים (למשל, JAX, Addgene, ו- Viral Vector Cores) הופכות את הצינור הזה להתאמה למגוון מחקרים של סוגי תאים ותופעות התפתחותיות ברשתית.
למרות פרוטוקול זה מפרט זריקות AAV תוך עיניות, שיטות אחרות להעברת גנים זמינים כגון electroporation plasmid46 ואספקת גנים ביוליסטית (למשל, Gene Gun)7. אלקטרופורציה דורשת יישום פעימה חשמלית, ואספקת גנים ביוליסטית דורשת דגירה אקס ויוו של explants רשתית. תיוג AAV הוא פחות פולשני משתי שיטות אלה ומאפשר הכנות חריפות של explants רשתית רק לפני הדמיה. בהשוואה למסירת גנים ביוליסטית (איור 6E, F), זריקות AAV הביאו ליכולת רקמות משופרת שהתאימה יותר לרכישה רציפה הדרושה למעקב אחר דינמיקת הנוירייט. עם טכניקה נכונה, תיוג AAV מהווה מעט מאוד נזק לרשתית, כפי שנשפט על ידי בריאות הרקמה בזמן הניתוח. זריקות intravitreal בעיקר להדביק תאים בתוך שכבת תא גנגליון ואת השכבה הגרעינית הפנימית, כגון RGCs ותאי amacrine. עשרות רבות של תאי אמקרין של כוכב-כוכבים מסומנים בדרך כלל בתווית, עם צפיפות מוגברת של תאים מתויגים סביב ראש עצב הראייה (איור 4C). עם זאת, עם כל שלוש שיטות transfection, ניתוק עצב הראייה הוא בלתי נמנע כדי להשיג explants ברשתית ויוביל ניוון RGC. למרות ניתוק עצב הראייה, מחקרים מדווחים explants רשתית קיימא ממגוון של מודלים בעלי חוליות במשך 36 שעות ועד 6 ימים לאחר הניתוח5,6,6,7,47,48.
לבסוף, התועלת של מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי ללכוד דינמיקה דנדריט הוכח. בדרך כלל, מפגש הדמיה משתרע על פני 2-4 שעות, והוא הסתיים לפני השפלת רקמות או blebbing neurite הוא ציין. מפגשי הדמיה עד 6 שעות נערכו; עם זאת, הגבול העליון לא נבדק באופן שיטתי. אזורים עשויים לעבור צילום עקב הדמיה ממושכת, אך תאים בתחומי ראייה אחרים בגרש נשארים ברי קיימא להדמיה חיה. ניתן להרחיב שיטה זו גם למיקרוסקופיה מרובת פוטון או גליון אור כדי לדמות מורפולוגיה עצבית בשכבות עמוקות יותר ובנפחים גדולים יותר. הדמיה רב-פוטונית בוצעה כדי לחקור את הדינמיקה של נויריט ברשתית העכבר והיא מתאימה יותר לחקר תאים בלמינה רשתית עמוקה יותר (למשל, תאים אופקיים או קולטני אור)49. לאחרונה, מיקרוסקופיה של גליון אור חי שימשה ללכידת אנגיוגנזה רשתית50, המציעה שדרה חדשה להדמיה חיה של מורפוגנזה ברשתית שלמה. מיקרוסקופיית גליון אור של תאים חיים יכולה לשמש לחקר הרכבה של מעגלים עצביים בקנה מידה גדול יותר, כגון מיקוד אקסון-דנדריט. הדמיה חיה צבעונית היא יישום נוסף של צינור זה שניתן להשתמש בו כדי לחקור אינטראקציות בין תאים לתאים, כגון השפעת תאים שכנים על התפתחות דנדריט או תופעות התפתחותיות אחרות כגון ריצוף של תאי רשתית כולל תת-סוגים RGC1, מיקרוגליה ואסטרוציטים.
לסיכום, היבט מאתגר של מחקרים התפתחותיים הוא קבלת גישה בנקודות זמן קריטיות אלה. פרוטוקול זה מספק שיטה להדמיה מורפוגנזה המתרחשת במהלך חלון זמני מסוים. הצינור משלב כלים וטכניקות קיימות כדי למקד גנטית אוכלוסיות תאים ולבטא חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה. תכשירי הרכבה שטוחה רשתית חריפה לשמור על הכדאיות ואותות פלואורסצנטיים להדמיה קונפוקלית של תאים חיים במשך מספר שעות. היבטים ארעיים ודינמיים של פיתוח דנדריט נלכדים בסרטוני תלת-ממד ומעובדים לאחר עיבוד באמצעות תוכנת קוד פתוח. היכולת ללכוד סרטוני תלת-ממד ברזולוציה גבוהה חיונית בחקירת תהליכים התפתחותיים דינמיים.
למחברים אין מה לחשוף.
אנו מודים למדיסון גריי על שעזרה לי כשלא היה לי. מחקר זה נתמך על ידי מענק גילוי NSERC (RGPIN-2016-06128), מלגת סלואן במדעי המוח ויו"ר מחקר קנדה רובד 2 (ל- J.L.L. ). ס. אינג-אסטבס נתמך על ידי תוכנית המחקר למדעי הראייה ומלגות לתואר שני של NSERC- דוקטורט.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Addgene viral prep #45185-AAV9 | |||
Addgene viral prep #45186-AAV9 | |||
Dissection tools | |||
Cellulose filter paper | Whatman | 1001-070 | |
Dumont #5 fine forceps | FST | 11252-20 | Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection |
Dumont forceps | VWR | 82027-426 | |
Fine Scissors | FST | 14058-09 | |
Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size | Millipore | HABG01 300 | |
Petri Dish, 50 × 15 mm | VWR | 470313-352 | |
Polyethylene disposable transfer pipette | VWR | 470225-034 | |
Round tip paint brush, size 3/0 | Conventional art supply store | Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting | |
Surgical Scissors | FST | 14007-14 | |
Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
Live-imaging incubation system | |||
Chamber polyethylene tubing, PE-160 10' | Warner Instruments | 64-0755 | |
Dual channel heater controller, Model TC-344C | Warner Instruments | 64-2401 | |
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective | Leica | 15506374 | |
Heater controller cable | Warner Instruments | CC-28 | |
Large bath incubation chamber with slice support | Warner Instruments | RC-27L | |
MPII Mini-Peristaltic Pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater) | Warner Instruments | PM-6D | |
Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
Sample anchor (Harps) | Warner Instruments | 64-0260 | Sample anchor must be compatible with incubation chamber |
Sloflo In-line Solution Heater | Warner Instruments | SF-28 | |
Neonatal Injections | |||
10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle | Hamilton Company | 80314 | |
30 G Hypodermic Needles (0.5 inch) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm) | WPI World Precision Instruments | TW100-4 | |
Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O]) | Sigma-Aldrich | V001229 | |
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF | Penn Vector Core | AV-9-PV2453 | Addgene Plasmid #45185 |
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF | Penn Vector Core | AV-9-PV2454 | Addgene Plasmid #45186 |
ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line | The Jackson Laboratory | 6410 | |
Fast Green FCF Dye content ≥85 % | Sigma-Aldrich | F7252-25G | |
Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Green tattoo paste | Ketchum MFG Co | 329A | |
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | 806552 | |
Pneumatic PicoPump | WPI World Precision Instruments | PV-820 | |
Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents | |||
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Carbogen (5% CO2, 95% O2) | AirGas | X02OX95C2003102 | Supplier may vary depending on region |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
HEPES, Free Acid | Bio Basic | HB0264 | |
Hydrochloric acid solution, 1 N | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
pH-Test strips (6.0-7.7) | VWR | BDH35317.604 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Sodium chloride (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
Software | |||
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | Open source |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved