הדמיה בזמן לשגות של arborization עצבי באמצעות תיוג וירוסים דליל אדנו הקשורים של אוכלוסיות תאי רשתית ממוקדים גנטית

כאן, אנו מציגים שיטה לחקירת מורפוגנזה נויריט ברשתית לאחר הלידה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית לשגות זמן. אנו מתארים גישה לתיוג דליל ורכישה של סוגי תאי רשתית ותהליכים עדינים שלהם באמצעות וקטורים וירוס הקשורים אדנו רקומביננטי המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה באופן תלוי Cre.

גילוי מנגנונים שמעצבים ארבורים דנדריטיים דורש שיטות להמחשה, דימוי וניתוח דנדריטים במהלך הפיתוח. רשתית העכבר היא מערכת מודל רבת עוצמה לחקירה של מנגנונים ספציפיים לסוג התא של מורפוגנזה עצבית וקישוריות. הארגון וההרכב של תת-סוגים ברשתית מוגדרים היטב, וכלים גנטיים זמינים כדי לגשת לסוגים ספציפיים במהלך הפיתוח. סוגי תאי רשתית רבים מגבילים גם את הדנדריטים ו/או האקסונים שלהם לשכבות צרות, מה שמאפשר הדמיה בזמן לשגות. תרביות רשתית העכבר מתאימות היטב להדמיית תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או מולטיפוטונית, אך חסרות שיטות המותאמות לדינמיקת דנדריט הדמיה עם רזולוציה זמנית ומבנית. מוצג כאן היא שיטה לתייג ולדמיין בדלילות את ההתפתחות של אוכלוסיות רשתית ספציפיות המסומנות על ידי מערכת Cre-Lox. וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) הזמינים מסחרית המשמשים כאן מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה באופן תלוי Cre- תלוי. משלוח תוך עיני של AAVs בעכברים יילודים מייצר תיוג פלואורסצנטי של סוגי תאים ממוקדים על ידי 4-5 ימים לאחר ההזרקה (dpi). אותות פלואורסצנטיים ממברנה ניתנים לזיהוי על ידי הדמיה קונפוקלית ולפתור מבני ענף עדינים ודינמיקה. קטעי וידאו באיכות גבוהה המשתרעים על פני 2-4 שעות נרכשים מהדמיית רשתית שטוחה-תושבות עם נוזל שדרתי מלאכותי מחומצן (aCSF). כמו כן מסופק צינור לאחר עיבוד תמונה עבור deconvolution ותיקון סחיפה תלת מימדי (3D). פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללכוד כמה התנהגויות תאיות ברשתית שלמה ולזהות גורמים חדשניים השולטים מורפוגנזה neurite. אסטרטגיות התפתחותיות רבות הנלמדות ברשתית יהיו רלוונטיות להבנת היווצרות מעגלים עצביים במקומות אחרים במערכת העצבים המרכזית.

דנדריטים של נוירונים ברשתית יוצרים דפוסים מורכבים, אך ספציפיים, המשפיעים על תפקידם בתוך מעגלים עצביים. ברשתית החולייתנית, סוגים מגוונים של תאי גנגליון רשתית (RGCs) ואינטראורונים תא amacrine נושאים מורפולוגיות דנדריטיות ייחודיות השונות בגודל ארבור, מיקום, אורך ענף, ^{וצפיפות1}. במהלך התפתחות לאחר הלידה, RGCs ותאי amacrine להרחיב תהליכים דנדריטיים תוססים לתוך נוירופיל הנקרא שכבת plexiform הפנימית (IPL), שם הם מקבלים קלט תא דו קוטבי המשדר אותות photoreceptor2. כפי שנתפס על ידי הדמיה בזמן-לשגות של אוכלוסיות רשתית שכותרתו פלואורסצנטית בזחלי אפרוחים או דגי זברה, מורפוגנזה דנדריט הוא דינמי מאוד ^3,4,5. בתוך ימים, arbors דנדריטי להרחיב, לשפץ, ו ramify כדי לצמצם את שכבות המשנה של IPL, שם הם סינפסה עם שותפים נבחרים. הארבורים מציגים דינמיקה מבנית שונה על פני ההתפתחות, עם שינויים בשיעורים היחסיים של תוספת ענף, נסיגה וייצוב. אמקרין ודנדריטים של RGC מפגינים גם התנהגויות שונות של צמיחה ושיפוץ שעשויות לשקף ארבוריזציה ספציפית לסוג. עם זאת, מחקרים אלה עקבו אחר אוכלוסיות אמקרין או RGC רחבות והתמקדו במיקוד למינארי, שהוא רק היבט אחד של המורפולוגיה.

המנגנונים המייצרים את המגוון המורפולוגי העצום שנצפו על פני תת-סוגים ברשתית אינם מובנים כהלכה. מטרתה של קבוצה זו הייתה לפתח שיטה ללכידת דינמיקה דנדריקית ושיפוץ ארבור של תת-סוגים מוגדרים של רשתית בעכברים. זיהוי מנגנונים ספציפיים לסוג התא של דפוסי דנדריט דורש שיטות כדי לדמיין ולמדוד התנהגויות דנדריט של תאים מעניינים. תרביות אורגנוטיפיות של רשתיות עכבר מתאימות היטב למחקרי הדמיה של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או רב-פוטונית. הרשתיות המתפתחות מנותחות ומורכבות לתוך גולה שטוח שניתן לצלם במשך מספר שעות בחדר הקלטות או לתרבות במשך כמה ימים עם השפעות מוגבלות על המעגלים ^6,7. נוירוני רשתית חיים יכולים להיות מסומנים על ידי מגוון טכניקות, כולל מילוי צבע על ידי אלקטרודות, אלקטרופורציה, משלוח ביוליסטי של חלקיקים מצופים בצבעים ליפופיליים או פלסמידים קידוד חלבונים פלואורסצנטיים (למשל, Gene Gun), כמו גם תוויות תאים מקודדים ^{גנטית7,8,9,10} . עם זאת, גישות אלה אינן יעילות עבור הדמיה דנדריט דינמיקה של תת סוגים ספציפיים ברשתית. לדוגמה, שיטות מילוי צבע הן בעלות תפוקה נמוכה ודורשות מנגנון אלקטרופיזיולוגי ותוויות גנטיות נוספות לתאי יעד אמינים של עניין. יתר על כן, אותות הפלואורסצנטיות החזקים בסומא יכולים לטשטש דנדריטים סמוכים.

שיטות העברת גנים ביוליסטיות יכולות לתייג בו זמנית עשרות תאים, אך צעדים הכוללים אספקת חלקיקים בלחץ גבוה ודגרה לילית של רשתית מבודדת עלולים לסכן את הפיזיולוגיה של התא ואת הצמיחה הדנדריטית. מאמר זה מציע כי כלים גנטיים אחרונים ניתן להשתמש כדי ללכוד דינמיקה דנדריט מוקדם עם סוג התא ורזולוציה מבנית, בהתחשב בקריטריונים הניסיוניים הבאים. ראשית, כדי לפתור את הענפים העדינים ואת הפילופודיה השולטים arbors המתפתחים, השיטה צריכה לתייג נוירונים עם חלבונים בהירים, פלואורסצנטיים הממלאים תהליכים בכל הארבור. תיוג הפלואורסצנטיות לא אמור לדעוך עקב הלבנת פוטואורסצנטיות במהלך תקופת ההדמיה. מגוון גרסאות חלבון פלואורסצנטיות נוצרו והושוו להתאמה להדמיית vivo/ex vivo/ex ^vivo11 המבוססת על בהירות ופוטוסטיות. שנית, החלבונים הפלואורסצנטיים (XFPs) חייבים לבוא לידי ביטוי ברמות גבוהות מספיק בשלב המוקדם ביותר של מורפוגנזה דנדריט, כך שהחלון ההתפתחותי הצר לא יוחמץ. בניתוחים של נקודות זמן סטטיות ברשתית העכבר, התפתחות דנדריט מתרחשת במהלך השבוע הראשון שלאחר הלידה וכוללת שלבים של צמיחה, שיפוץ וייצוב10,12,13,14,15. שלישית, השיטה צריכה להוביל תיוג סלקטיבי או להסתברות מוגברת של תיוג של תת האוכלוסייה העצבית של עניין. רביעית, תיוג של אוכלוסיית המשנה של היעד חייב להיות דליל מספיק, כך שניתן יהיה לזהות את הארבור העצבי כולו ולעקוב אחריו. למרות שתת-סוגים של משמרות המהפכה ואמקרין יכולים להיות מובחנים על ידי המאפיינים המורפולוגיים הבוגרים שלהם ודפוסי ריבוד IPL16,17,18,19,20, האתגר הוא לזהות תת-סוגים במהלך הפיתוח המבוססים על מבנים לא בוגרים. משימה זו מתאפשרת על ידי הרחבת כלים מהונדסים לתייג סוגי תאים ספציפיים ברשתית במהלך הפיתוח.

קווי עכבר מהונדסים ונוק-אין שבהם ביטוי תאי וטמפורלי של חלבונים פלואורסצנטיים או Cre נקבע על ידי אלמנטים רגולטוריים גנטיים נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור סוגי תאי רשתית13,21,22,23. תצפיות מפתח על דפוסים ספציפיים תת-סוג של התפתחות דנדריט הגיעו ממחקרים של רשתות עכבר מהונדסות בנקודות זמן סטטיות10,14,24,25. מערכת Cre-Lox, בפרט, מאפשרת מניפולציה וניטור גנים מעולים של תת-סוגים באמצעות מגוון כתבים, חיישנים ומפעילים אופטוגנטיים תלויי רקומבינאז. כלים אלה הובילו לתגליות של תוכניות מולקולריות ספציפיות לתת-סוג ומאפיינים פונקציונליים העומדים בבסיס הרכבת מעגל רשתית26,27,28,29,30. עם זאת, הם עדיין לא להיות ממונפים ללמוד דינמיקה דנדריט ספציפית תת סוג ברשתית העכבר. תיוג בצפיפות נמוכה ניתן להשיג על ידי שילוב קווי עכבר Cre עם טרנסג'נים שהוצגו על ידי אלקטרופורציה או על ידי AAVs רקומביננטי. אם זמין, טמוקסיפן-inducable Cre קווים או אסטרטגיות גנטיות הצטלבות ניתן להשתמש גם. לבסוף, התא צריך להיות מתויג באופן זעיר פולשני ותמונה באמצעות פרמטרי רכישה כדי לא לסכן את הרקמה או להפריע לתפקוד התאי הנדרש עבור מורפוגנזה דנדריט.

מוצגת כאן שיטה ליישם כלים מהונדסים ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לחקור את הדינמיקה של דנדריט ברשתית חיה. קווי עכבר מהונדסים Cre שולבו עם וקטורים AAV המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים על recombination Cre, המאפשר תיוג דליל של תאי רשתית של עניין. AAVs זמין מסחרית מועברים לרשתית היילוד על ידי זריקות intravitreal. מאמר זה מדגים כי AAVs לייצר ביטוי פלואורסצנטי גבוה באופן משמעותי סוג התא על ידי 4 dpi, המאפשר גישה לנקודות זמן לאחר הלידה. כדי להמחיש גישה זו, cholinergic "starburst" amacrine interneuron תויג על ידי מתן Brainbow AAV בעכברים יילודים המבטאים את כולין acetyltransferase (ChAT)-אתר הכניסה לריבוזום פנימי (IRES)-Cre transgene, אשר פעיל ברשתית שלאחר הלידה ^{המוקדמת31,32}. תאי amacrine Starburst לפתח מורפולוגיה ארבור סטריאוטיפית רדיאלית כי הוא מעוצב על ידי דנדריט הימנעות עצמית בתיווך protocadherins מקובצים33,34. מאמר זה מראה כי הרזולוציה של דנדריטים starburst ו filopodia משופרת באופן משמעותי על ידי XFPs לקרום הפלזמה עם תוספת של מוטיב CAAX אשר עובר farnesylation, כפי המשמש Brainbow AAVs31. לבסוף, נקבעו פרוטוקולי הדמיה ופוסט-עיבוד של זמן המייצרים תמונות באיכות גבוהה הניתנות לשחזור דנדריט וכימות מורפומטרי. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות גורמים השולטים מורפוגנזה דנדריט וכדי ללכוד כמה התנהגויות תאיות ברשתית שלמה.

הערה: פרוטוקול זה משתרע על פני יומיים עם פרק זמן מינימלי של 4-5 ימים להעברה ויראלית בין ימי ניסוי (איור 1A). ניסויים בבעלי חיים מבוצעים בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים לשימוש בבעלי חיים במחקר וטיפול בבעלי חיים במעבדה תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי המעבדה לשירותים לבעלי חיים שימוש וטיפול בבעלי חיים הוועדה בבית החולים לילדים חולים (טורונטו, קנדה).

1. הכנות לזריקות AAV יילודים וניסויי הדמיה

1. בחר קו עכבר Cre כדי לתייג את אוכלוסיות תאי הרשתית של עניין. אשר ביטוי רקומבינאז Cre בזמן זריקות AAV על ידי מעבר לכתב מהונדס Cre או באמצעות חיסונים עם נוגדן Cre.
2. לגדל עכברי Cre מהונדסים (בני 8-16 שבועות) כדי ליצור חיות יילודים חיוביות Cre.
   הערה: עבור הדגמה זו, עכברי ChAT-IRES-Cre נוק-אין שימשו כדי למקד את תאי amacrine Starburst השימושיים.
3. להשיג רקומבינאז תלוי AAV וירוס קידוד חלבונים פלואורסצנטיים(ים). לקבלת תיוג אופטימלי של תהליכים עדינים, בחר וקטורים המבטאים XFPs שונה מיקוד קרום הפלזמה.
   הערה: מחקר זה השתמש בווירוס Brainbow (BBV), AAV-EF1a-BbTagBY ו- AAV9-EF1a-BbChT (ראה טבלת חומרים), המספקים את האפשרות לתיוג בצבעים מרובים (איור 1B). חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר (eYFP) וביטוי דובדבן מונומרי (mCherry) יצרו את האותות הפלואורסצנטיים החזקים ביותר להדמיה חיה. BBV יחיד יכול לשמש כדי לדמיין arbors בודדים, בעוד הזרקה משותפת של BBVs יכול לשמש כדי לתייג תאים נוספים או arbors שכנים עם פלואורופורים ברורים. אם אתם משתמשים בחלבונים פלואורסצנטיים מרובים, ודאו חפיפה מינימלית בספקטרום הפליטה (איור 1C). יש להתאים פרמטרי רכישת מיקרוסקופ כדי ללכוד אותות XFP נפרדים.
4. הכן ∼3-5 μL aliquots של AAVs בצינורות מחייבים נמוכים בודדים עבור מניות חד פעמיות כדי למנוע הקפאה / הפשרה מחזורים. יש לאחסן בטמפרטורה של עד 80 מעלות צלזיוס.
5. הכן micropipettes זכוכית borosilicate עם טיפים עדינים מאוד באמצעות משיכת micropipette.
   הערה: הגדרות Puller משתנות בהתאם לתפירה ולמשיכה הנמצאות בשימוש; ראו איור 2A לקבלת גודל וצורה סופיים של קצה. קוטר טיפה טיפוסי הם 600 מיקרומטר.
6. להשיג מערכת microinjection וצינורות הקשורים. חבר את המיקרו-מקרן ליציאת אוויר בלחץ.

איור 1: סקירה ניסיונית. (A) פרוטוקול זה משתרע על פני יומיים של ניסויים עם תקופת זיהום מינימלית של 4-5 ימים בין ימי הניסוי. זריקות תוך עיניות מבוצעות על עכברים יילודים לא יותר מיום לאחר הלידה 3. לאחר מכן, הרשתיות מנותחות, מותקנות באופן שטוח ותמונות חיות כדי ללכוד את החלון ההתפתחותי הרצוי. תאים מסומנים בתווית ניתן לדמיין בכל עת לאחר 4-5 הימים הדרושים לביטוי ויראלי, שכן אין השפעות נראות לעין של ביטוי AAV ממושך על מורפולוגיה דנדריט. (B) וקטורים תלויי Crebow AAV (BBV) מוזרקים לבעלי חיים המבטאים את ^Cre31. במחקר זה, עכברי ChAT-Cre נוק-אין שימשו כדי לנהוג Cre recombination בתאי amacrine starburst. שני BBVs מקודדים eYFP שונה או tagBFP, או mCherry ו- mTFP, אשר מסתיימים במוטיב CAAX כי הוא ברצף farnesylated עבור לוקליזציה ממברנה. אתרי לקס מתוארים במשולשים. הווקטורים מבטאים XFPs מופרכים באופן סטוכסטי וקומבינטורי התלוי רקומבינציה בקרומבינציה. מקדם EF1α כולל אלמנטים רגולטוריים מהגן גורם התארכות 1α. W מייצג אלמנטים מן אלמנטים של וירוס הפטיטיס הפטיטיס woodchuck אלמנט רגולטורי posttranscriptional, ו- pA מציין את רצף polyadenylation. (ג) ספקטרום העירור והפליטה של mCherry ו- eYFP, פלואורופורים BBV בתמונה במחקר זה. כאשר הדמיה חיה חלבונים פלואורסצנטיים מרובים, הפרמטרים לזיהוי חייבים להיות מסודרים כדי להפריד כראוי ספקטרום פליטה לערוצים נפרדים. קיצורים: AAV = וירוס הקשור לאדנו; BBV = Brainbow AAV; ChAT = כולין acetyltransferase; iRES = אתר כניסה פנימי לריבוזום; eYFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר; iTR = חזרה הפוכה על המסוף; tagBP = חלבון פלואורסצנטי כחול תג; mCherry = דובדבן מונומרי; mTFP = חלבון פלואורסצנטי צהבהב; XFP = כל חלבון פלואורסצנטי; EF1α= גורם התארכות 1 אלפא. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. זריקות תוך-יומיות של AAVs בעכברים יילודים

1. להפשיר aliquot AAV על קרח. הכן ~1:4 דילול AAV באמצעות מלוחים סטריליים או מלוחים חוצצי פוספט. הכן ~ 0.5 μL של דילול AAV לכל בעל חיים (~ 0.25 μL לכל עין) במקרה המיקרופיפט נשבר, ופיפטה חדשה צריכה להיות מלאה. יש לאחסן את ה-AAV הנותר ב-4 °C °C (4 °F), ולהשתמש תוך שבועיים.
   הערה: בניסוי זה, ריכוז AAV הספק היה ~ 1-2 × ¹⁰¹³ תוכן הגנום (GC)/ mL ומדולל לריכוז סופי של 4 × ¹⁰¹² GC / mL. מטב את הריכוז הנגיפי כדי להשיג את צפיפות התיוג הרצויה.
2. כדי לדמיין את הזריקות, להוסיף כ 1 μL של 0.02% פתרון צבע FCF ירוק מהיר עבור כל 15 μL של דילול AAV לצבוע את הפתרון כחול.
3. העבר כלוב עכברים עם סכר ופסולת שזה עתה נולדה (יום לאחר הלידה (P) 0.5-3) לחדר ניתוח עם ציוד microinjection. שמור את בעלי החיים באותו כלוב עם קינים ומצעים כדי למזער את הלחץ האימהי ודחייה של גורים.
4. לחטא את אזור ההזרקה עם 70% אתנול, ולהניח רפידות חיתולים סטריליות על משטחי ספסל. הכן פלטפורמה חמה (למשל, כרית חימום) להתאוששות מהרדמה הנגרמת על ידי היפותרמיה.
5. מלאו את המיקרופיפט בדילול AAV באמצעות מיקרו-מזרק. תחת סטריאומיקרוסקופ, לשבור את קצה micropipette עם מחט 30 G כדי לפתוח את הקצה.
   הערה: איור 2A מציג את הקצה הממולא בגב - הן אטום (עליון) והן חתום (אמצע).
6. מרדים עכברים יילודים על ידי היפותרמיה על ידי הצבת 1-2 בעלי חיים על קרח. מניחים בעלי חיים על כפפת לטקס כדי להגן על העור מפני מגע ישיר עם קרח. ברגע שהחיה כבר לא זזה בתגובה לצביטת כף הרגל (~ 2 דקות), מניחים את החיה תחת סטריאומיקרוסקופ. אם תרצה, רפידות כף רגל קעקוע עם דיו קעקוע ומחט 30 G, ולאסוף גזירי זנב עבור בידוד DNA כדי לזהות בעלי חיים על ידי genotyping.
   הערה: ניטור מתאים של עומק ההרדמה חייב להתרחש לאורך כל ההליך.
7. ספוגית העור מעל העיניים עם 70% אתנול. השתמשו במחט של 30 גר' כדי לפתוח את העפעף המותך (איור 2B). הפעילו לחץ קל עם האצבעות כדי לפתוח את העין, ותקעו חור קטן בקרנית בצומת הקרנית-סקלרה (איור 2C).
8. הכנס את מיקרופיפט הזכוכית לתוך החור, ולחץ על דוושת כף הרגל microinjector 2-4 פעמים כדי להזריק את AAV לתוך החלל התוך כיווני. הסירו באיטיות את המיקרופיפט, ואשרו הזרקת AAV על-ידי הדמיית הצבע הכחול דרך האישון (איור 2D).
   הערה: עם לחץ פליטה של 6-8 פסאיי וזמן פעימה של 600-800 אלפיות השנייה, טיפה בקוטר 600 מיקרומטר הוצאה (איור 2A, למטה). כ 0.23-0.45 μL של פתרון AAV מוזרק לכל עין. פתרון כחול מחוץ לעין מציין כי AAV לא הוזרק לתוך העין. פתרון כחול דולף מאתר ההזרקה מציין כי AAV אולי דלף החוצה, הפחתת יעילות transfection.
9. לחץ בעדינות על העפעפיים יחד כדי לאטום מחדש, ומניחים את הגור על כרית מחוממת. ברגע שבעלי החיים משחזרים צבע ורדרד ומגיבים, מעבירים אותם בעדינות בחזרה לכלוב הדיור.
   הערה: ודאו שננקטים אמצעי זהירות מתאימים כדי למנוע התחממות מהירה מדי של הגורים.
10. חזור על הליך ההזרקה עבור בעלי החיים הנותרים במלטה. אפשר מינימום של 4-5 ימים עבור transduction ויראלי לפני הדמיית הרשתית.

איור 2: זריקות תוך עיניות של יילודים. (A) מיקרופיפט במילוי גב מראה את צורת קצה הפיפטה כאשר הוא אטום (למעלה) ולאחר פתיחת הקצה (למטה, משמאל). לחץ הזרקת פיקו של 6-8 פסאיי וזמן דופק של 600-800 מילישניות מייצר טיפה בקוטר 600 מיקרומטר (למטה, מימין). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ.(B) גור P0 מורדם תחת הגדלה של פי 16. צומת העפעפיים המותך (לבן) נחתך באמצעות מחט חדה של 30 גרם. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. (C) לחץ קל המופעל על העין חושף את הקרנית; סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. קטע מוגדל (אדום) מציג את החור הקטן בצומת הקרנית-סקלרה (צהוב) שנוצר עם מחט של 30 גרם; סרגל קנה מידה = 0.5 מ"מ. (D) נסיגה של קצה פיפטה לאחר הזרקה (משמאל). צבע ירוק מהיר בתמיסת AAV מופיע כחול-אפור דרך האישון (באמצע), בהשוואה לצבע האישון הקל לפני ההזרקה (מימין). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (E) לאחר 4 ימים, העפעף נרפא והתמזג סגור (משמאל); סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. עם עידוד, אתר ההזרקה נרפא גלוי (צהוב); סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. שימו לב למיקום אתר ההזרקה בגבול בין הקרנית לסקלרה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. ניתוחי רשתית לניסוי הדמיה

1. הכן רשתית aCSF (119 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.3 mM _MgCl2·_6H2O, 2.5 מ"מ _CaCl2·_2H2O, 1 מ"מ _NaH2PO4, 11 מ"מ גלוקוז, ו 20 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-חומצה piperazineethanesulfonic (חומצה ללא HEPES)³⁵. אם תרצה, להכין ולהקפיא פתרון 10x; להפשיר ולדלל ל 1x לפי הצורך.
2. לחמצן את רשתית aCSF על ידי מבעבע עם קרבוגן (95% _O2, 5% _CO2) במשך מינימום של 15 דקות. כוונן את רמת החומציות ל-7.4. יש לשמור במיכל אטום עד לשימוש כדי לוודא שה-ACSF נשאר מחומצן.
   הערה: רשתיות דורשות ריכוז גבוה של _O2. חשוב לשמור על ACSF מחומצן לאורך כל הניסוי.
3. הטמע צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ לתוך מגש קרח (לעצב מגש קרח מתוך פלסטיק מעבדה, למשל, מכסה תיבת פיפטה), ומניחים אותו תחת סטריאומיקרוסקופ. מלאו את צלחת הפטרי ברשתית מחומצנת ACSF.
4. המתת חסד עכברים P9 ומטה על ידי עריפת ראש. המתת חסד של עכברים P10 ומעלה על ידי אינדוקציה איזופלוריין, או שיטה חלופית שאושרה על פי פרוטוקול בעלי החיים, ואחריה עריפת ראש.
5. אם העפעפיים אטומים, חותכים את דש העפעף כדי לחשוף את העין. השתמש מלקחיים כדי לעטוף את העיניים, ולהעביר אותם לתוך רשתית קרה ACSF משלב 3.3.
6. כדי לנתח את הרשתית, תחת סטריאומיקרוסקופ (הגדלה פי 25), לייצב את העין על ידי הידוק עצב הראייה באמצעות מלקחיים של דומונט מס' 5 (איור 3A).
7. לתקוע חור במרכז הקרנית עם מחט 30 גרם, ולאחר מכן להכניס קצה אחד של microscissors לתוך החור כדי לבצע חתך מהחור עד סוף הקרנית. חוזרים על הפעולה כדי ליצור 4 פרוסות בכיוונים הקרדינליים, ויוצרים 4 "מדפים" (איור 3A).
8. עם שני מלקחיים של דומונט מס' 5, אוחזים ומפרקים את שני המדפים הסמוכים, מקלפים בעדינות את הסקלרה מהרשתית. חוזרים על הפעולה עם מדפים הקרנית הנותרים, ומסירים את הסקלרה מהרשתית (איור 3B).
9. הסר את העדשה מכוס הרשתית באמצעות מלקחיים. בעזרת מיקרו-חתכים, בצעו 4 חתכים רדיאליים מקצה הרשתית לכיוון עצב הראייה, ויצרו 4 עלי כותרת שווים (איור 3B). חזור על שלבים 3.4-3.7 עבור העין השנייה.

4. הכנת הרכבה שטוחה ברשתית

1. הכן דיסקי מסנן מסנן קרום אסתר תאית מעורבת אפורה (MCE) להרכבה. אם משתמשים במסנני קרום MCE בקוטר גדול, חותכים את הדיסק לרבעים (בערך 1 ס"מ לרוחב). מקם את דיסק MCE במרכז נייר סינון לבן גדול יותר (איור 3D).
   הערה: מסנני MCE זמינים גם בדיסקים בקוטר 1 ס"מ. דיסק המסנן של MCE חייב להיות גדול מספיק כדי להתאים לרשתיות 1-2, אך קטן מספיק כדי להתאים לתא ההדמיה. כמו ממברנות MCE להחזיק מטען סטטי, למזער מגע וטיפול של קרום MCE.
2. טיפול ברשתיות באמצעות שתי מברשות צבע בגודל 3/0, להפוך רשתית אחת על מברשת צבע עם צד תא גנגליון רשתית למטה. הרימו בעדינות את הרשתית מה-ACSF, וודאו שמתח המים לא יקרע את הרשתית (איור 3C).
3. בעודכם מחזיקים את המכחול עם הרשתית, השתמשו בפיפטת העברה כדי למקם טיפה של aCSF במרכז נייר הסינון של MCE (איור 3C, מימין). לצוף את הרשתית לתוך טיפה של ACSF שנוצר על ידי מתח פני השטח. השתמש במברשות צבע כדי למקם את הרשתית RGC בצד למעלה בתוך טיפה ולפתוח את ארבעת עלי הכותרת.
4. לאחר מיקום, ליצור גשר מים בין מברשת צבע ונייר סינון לבן כדי לשבור את מתח פני השטח של טיפה.
   הערה: כאשר ACSF הוא רשע משם, הרשתית תדבק נייר מסנן MCE (איור 3D,E). ניתן לטפל ברשתיות שטוחות על-ידי אחיזת דיסק MCE במלקחיים. אם טיפת ACSF מתפתלת במהירות לפני יצירת גשר מים, הדבר עשוי להצביע על כך שקרום ה- MCE אינו טעון. השתמש קרום MCE טרי, ולמזער את הזמן בין enucleation והדמיה על ידי ניתוח רשתיות הרכבה שטוחה מיד לפני העברת רשתיות לתוך תא ההדמיה.

איור 3: כריתת רשתית והתקנה שטוחה על קרומי מסנן אסתר תאית מעורבים. (A) משמאל, עין מוערכת מתייצבת על ידי אחיזה בעצב הראייה עם מלקחיים של דומונט #5 (משמאל). חור קטן נוצר במרכז הקרנית באמצעות מחט 30 גרם (במרכז). מספריים מיקרו-חתך משמשים לחיתוך הקרנית ל -4 מדפים שווים (מימין). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (B) רשתית ניתחה עם הסקלרה קלופה באמצעות שני מלקחיים דומונט #5 (משמאל) ועם העדשה הוסרה (במרכז). רשתית עם 4 חתכים שווים באמצע הרשתית (מימין). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (ג) טיפול ברשתית עם שתי מברשות צבע עדינות (גודל 3/0, משמאל). רשתית התהפכה עם תאי גנגליון רשתית בצד למטה על מברשת צבע (במרכז) והרימה מתוך ACSF, מוודא מתח המים לא לקרוע את הרשתית (מימין). סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. (D) דיסק קרום MCE אפור ממוקם על נייר סינון לבן (משמאל). טיפה של ACSF בדיסק MCE (מימין). סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (E) לאחר הצפת הרשתיות לתוך טיפה ומיצוב אותם, ליצור גשר מים עם נייר המסנן הלבן כדי לפתיל את aCSF, מושך את הרשתית על נייר MCE טעון (משמאל); סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. תמונה מוגדלת של קרום MCE (אדום) מראה 2 רשתות המותקנות עם תאי גנגליון רשתית בצד למעלה (מימין); סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. רשתית אחת מסומנת בלבן. קיצורים: MCE = אסתר תאית מעורבת; aCSF = נוזל שדרתי מלאכותי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

5. הדמיה קונפוקלית לשגות זמן של תכשירי רשתית שלמים חיים

1. הרכיבו את תא הדגירה של הדמיה חיה למיקרוסקופ קונפוקלי זקוף כפי שניתן לראות באיור 4.
   הערה: עבור מערכות קונפוקליות הפוכות, הרכבות שטוחות ממוקמות בצד RGC כלפי מטה ישירות על מכסה תחתית הזכוכית של תא הדגירה. ברגע שהרשתיות יוצרות קשר עם כיסוי הכיסוי, לא ניתן להזיז אותן.
2. מלאו את התא ב-ACSF מחומצן, והפעילו את המשאבה ואת בקר הטמפרטורה (טמפרטורה 32-34 מעלות צלזיוס, קצב זרימה 1 מ"ל/דקה). אין לאפשר לטמפרטורה לעלות מעל 34 °C (65 °F).
3. כדי להעביר את הרשתית שטוחה להרכבה שטוחה לתא הזלוף, לעצור את המשאבה, ולהסיר את aCSF כי הוא בתא. הנח את דיסק MCE עם הרשתית שטוחה להרכבה שטוחה לתוך תא הדגירה (הריק).
4. מניחים משקל מדגם על ההרכבה השטוחה; להרטיב מראש את המשקל כדי לשבור את מתח פני השטח. מלאו מחדש את התא ב-ACSF המחומם, והפיצו את ה-ACSF במהירות של כ-1 מ"ל/דקה.
5. מקם את האף עם המטרה 25x מים טבילה (צמצם מספרי 0.95) לתוך חדר ההדמיה. מסך לתאים בעלי תווית של עניין באמצעות אור אפיפלואורסצנטי (איור 4C).
6. התאם את עוצמת ההדמיה כדי ללכוד תכונות דנדריטיות של עניין.
   הערה: מחקר זה לכד את הארבור הדנדריטי המלא ב- 1024 x 1024 פיקסלים למסגרת, z-step 1 מיקרומטר וקצב פריימים של 2 דקות בין כל מחסנית z. גדלי תמונה סופיים הם ~ 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר x 20 מיקרומטר.
7. כדי להתאים את עוצמת הלייזר להגדרה אופטימלית, השתמש בטבלת חיפוש המזהה פיקסלים רוויים ולא רוויים. בעת הסריקה, התאם את עוצמת הלייזר כך שלא יהיו פיקסלים רוויים יתר על המידה (כלומר, בעוצמה של 255 ומעלה). המשך הדמיה כל עוד יש צורך, או עד שיש ירידה משמעותית וניתן לגילוי באות פלואורסצנטי ולהגביר את הרעש (בדרך כלל 2-4 שעות).
   הערה: עוצמת לייזר מופחתת מומלצת מכיוון שאלגוריתמים של דה-מפכות פועלים בצורה אופטימלית כאשר פיקסלים מופצים על פני הטווח הדינמי המלא. עוצמת הפיקסלים לא תעלה על 254; ניתוחים אמפיריים של נוריטים גילו שערכי פיקסלים מתחת ל-170 אידיאליים לדה-פיתולציה. מהירויות סריקה גבוהות (400-600 הרץ) עם ממוצע קווים (2-3) עדיפות על סריקות בודדות ואיטיות יותר של אותו זמן השתהות פיקסלים כולל. האזור של הדמיה ממושכת לעתים קרובות photobleaches, אבל קטעים explant אחרים נשארים קיימא. ניתן לצלם אזורים מרובים בהרכבה שטוחה, כל אחד למשך 2-4 שעות, עם זמן דגירה כולל של 6 שעות. מפגשי הדמיה מעבר ל-6 שעות לא נבדקו באופן שיטתי. התדרדרות נויריט ופעימות הם סימנים לכך שהכדאיות המהוללת הולכת ופוחתת.
8. לאחר הדמיה, לתקן את הרשתית שטוחה הרכבות ומסנן ממברנה עם קר 4% paraformaldehyde עבור 1-2 שעות ב 4 °C (60 °F). הגבר את התוויות הפלואורסצנטיות ברשתיות הקבועות על ידי אימונוהיסטוכימיה לניתוחים נוספים.
   הערה: קיבעון לאחר הדמיה אינו אפשרי בעת שימוש בקונפוקל הפוך; רשתיות אינן ניתנות להסרה מבלי להרוס את הרקמה.

איור 4: הגדרת תאי הדגירה של הדמיה של תאים חיים. (A) מנגנון דגירה בהדמיה חיה המציג רכיבי חימום, פתרון והדמיה. תנור חימום כפול כולל פלטפורמת תא דגירה מחוממת (עיגול אחורי עם אלקטרודות מחבר כחולות) ותנור פתרון בשורה. (ב) דיאגרמה סכמטית של 4A. רשתית שטוחה הרכבה (אדום) על קרום MCE (אפור) ממוקם בתא הדגירה. מחמם התמיסה בשורה מחובר למשאבת פתרון (לא בתמונה ב- 4A). מידות תא ההדמיה מאפשרות אזור עבודה טוב לאף המטרה של הטבילה. (C) 25x להציג explant רשתית מוזרק עם 0.23-0.45 μL של 4 × ¹⁰¹² GC / mL של דילול AAV; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. תיוג צפוף של תאים מקיף לעתים קרובות את ראש עצב הראייה (קו מקווקו, מימין למטה); סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: MCE = אסתר תאית מעורבת; GC = עותקי גנום; mCherry = דובדבן מונומרי; eYFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

6. פירוק התמונה ופוסט-עיבוד ב- ImageJ

1. יבא את סידרת התמונה, פצל את הסידרה לפי שעה וצבע אם מדובר בתמונה מרובת צבעים. ודא שכל נקודות הזמן עבור צבע אחד כלולות באותה תיקיה.
   הערה: יבא תבניות ביו אם אתה משתמש ב- ImageJ (תבניות ביולוגיות כלולות באופן אוטומטי ב- FIJI).
2. צרו פונקציית פיזור נקודות תיאורטית (PSF) באמצעות התוסף ImageJ, Dspraction PSF 3D.
   הערה: כל ערוץ הדמיה דורש PSF משלו, שכן אורך הגל של פליטת חלבונים פלואורסצנטיים משפיע על ה-PSF.
3. שימוש בתוספים | פקודות מאקרו | הפעל כדי לבצע פירוק איטרטיבי מקבילי של אצווה עבור כל נקודות הזמן באמצעות המאקרו שסופק (קובץ משלים 1).
   הערה: מאקרו זה מפעיל 25 איטראציות של אלגוריתם האיטרטיבי Landweber (WPL) של מסנן הווינר. יש לנתק כל ערוץ צבע בנפרד.
4. מזג את ערוצי הצבע והידור כל נקודות הזמן לערימת יתר (תמונה | ערימות יתר | ערימות לערימת יתר). תיקון הסחף התלת-ממדי באמצעות תוספים | | רישום תקן 3D דריפט.
5. החזרת התמונה לערימה רגילה (תמונה | ערימות יתר | הסטת יתר לערימה) ופיצול נקודות הזמן (תמונה | ערימות | כלים | מפצל מחסנית). השתמש בעיבוד אצווה כדי ליצור הקרנה מרבית עבור כל נקודות הזמן (תהליך | | אצווה | מאקרו run("Z Project...", "הקרנה=[עוצמה מרבית]"); ).
6. יבא את רצף התמונה לשגות זמן (קובץ | | ייבוא רצף תמונות). השתמש בכלים קונבנציונליים של ImageJ לניתוח הרצוי של וידאו דו-ממדי (דו-ממדי) מנותק ופוסט-מעובד.
   הערה: ניתן להציג סרטונים ארבעה-ממדיים (תלת-ממדיים + זמן) מפורקים ומתוקנים על-ידי הסחף כערימת-על. השמט את השלב הקודם כדי לשמור על נקודות זמן תלת-ממדיות.

באמצעות הפרוטוקול לעיל, וידאו 3D ברזולוציה גבוהה של דנדריטים תאים starburst פיתוח נרכש, פירוק, ותיקן עבור סחיפה 3D. הקרנות מקסימליות של מטוס Z הופקו כדי ליצור סרטוני דו-ממד לניתוח (סרטון משלים 1, איור 5A). פירוק תלת-ממדי של כל נקודת זמן הגביר את הרזולוציה של תחזיות פילופודיה עדינות (איור 5B, C). בליטות פילופודיה עדינות הן תכונה של פיתוח דנדריטים ^רשתית36 , צריך להיות גלוי במהלך הדמיה. טרנספקטיה AAV תיצור שונות בצפיפות תיוג התאים ובעוצמת הפלואורסצנטיות. לכן, לסנן את הרקמה המסומנת כדי לבחור תאים עם אותות פלואורסצנטיים גבוהים להדמיה והפקת קטעי וידאו באיכות גבוהה. הגדלת כוח הלייזר כדי לזהות תאים המסומנים במעומעם אינה מומלצת, שכן היא יכולה להוביל להלבנת פוטולוג מהירה ולהציג רעש גבוה בהשוואה לאות. תאים בהירים מספיק נראים בתוך 5 dpi. ב-12 dpi ומעלה, תקופות זיהום ממושכות של AAV אינן מובילות בהכרח לפלואורסצנטיות מוגברת של תאים מסומנים בתווית (איור 5D).

פלואורסצנטיות מוגזמת וצפיפות נויריט מתיוג תאים צפופים משפיעים על איכות התמונה ועלולים לעכב שחזורים של תאים חד-תאיים. אופטימיזציה של דילול AAV ונפח נדרש כדי להשיג את המידה הרצויה של arbors מבודדים ומסומנים פלואורסצנטית כי הם נפרדים משאר אוכלוסיית תאי היעד. כאן, 9.2 × 108-1.8 × ¹⁰⁹ GCs ויראלי הוזרקו לכל עין כדי למקד תאי amacrine starburst (0.23-0.45 μL של AAV עם 4 × ¹⁰¹² GC / mL titer). היעדר אות פלואורסצנטי עשוי לשקף טכניקת הזרקה לא יעילה. בעת הזרקה, דליפה של פתרון AAV הכחול מאתר ההזרקה מצביעה על כך שהנגיף אינו מועבר לרשתית, או שנפח ההזרקה או הלחץ גבוהים מדי. נפח הזרקה עודף או לחץ יכול לגרום ניתוק רשתית ו/או אובדן לחץ עיני, פגיעה בתאי הרשתית והפחתת יעילות תיוג התא. שתי הבעיות ניתן לפתור עם תרגול ואופטימיזציה של טכניקת ההזרקה. סיבות פוטנציאליות אחרות לחוסר האות כוללות השפלה של AAVs מאחסון לא תקין או ביטוי Cre לא מספיק מכיוון שהטרנסג'ן Cre אינו פעיל במהלך תקופת טרנספקטו של AAV.

לאחר פירוק הסרטונים, ניתן לבצע ניתוחים דינמיים, כגון חישוב שיעורי חישוב של תוספת ענף, נסיגה או ייצוב. בנוסף, ניתן לבצע ניתוח סטטי קונבנציונלי בכל מסגרת זמן, כולל שחזור נוירונים וכימות מורפוטומטרי כגון אורך הסתעפות כולל, זוויות הסתעפות, סדר הסתעפות או מספר נקודות ענף מסוף. התוצאה של פרוטוקול זה היא סדרת זמן של ערימות תמונות תלת-ממדיות ברזולוציה גבוהה. רוב סרטוני הווידאו הדינמיים של נוריט בתלת-ממד מכמתים ידנית כהקרנה מרבית באמצעות תוכנת תצוגה חזותית של תמונה בקוד פתוח, כגון ^ImageJ37. כלי קוד פתוח נוסף, ^Vaa3D38, פותח במיוחד להדמיה של כרכים גדולים. אם יש לנתח סרטונים בתלת-ממד, מומלץ להשתמש במצג חזותי תלת-ממדי + זמן כגון Vaa3D. ImageJ ו-Vaa3D מאפשרים גישה ישירה לפיקסלים או לווקסלים בתמונה, אך לעתים קרובות שחזורי נוירונים נוצרים על-ידי המרת נתוני פיקסלים לשחזורי עצים בעלי שלד. שחזורי נוירון אוטומטיים או חצי אוטומטיים עבור נקודות זמן בודדות יכולים להתבצע עם קוד פתוח39,40,41 ותוכנה קניינית. כדי לנתח שחזורים של זמן לשגות, כל נקודה בשחזור חייבת להיות מקושרת לנקודות הזמן הקודמות והבאות לאחר מכן. יישור מורפולוגיות דנדריטיות מורכבות לאורך זמן, אשר ניתן לקודד על ידי למעלה מ -500 נקודות נתונים, נשאר בעיה מאתגרת. כלים רבים זמינים, עם עוצמות ומגבלות שונות, ויש לבחור אותם כך שיתאימו לניתוחים הדרושים למחקר.

איור 5: תוצאות מייצגות לאחר הזרקה תוך עינית של יילודים, הדמיה בזמן לשגות ודה-מפכלול. (A) תחזיות מרביות של סדרת הדמיה מפורקת של זמן לשגות (h:min) של תא אמקרין כוכב P6 5 ימים לאחר הזרקת PostAAV. כעת ניתן לנתח דינמיקת פילופודיה עדינה באמצעות כלי ImageJ קונבנציונליים. אזור של עידון דנדריטי (קופסה אדומה) ואזור של צמיחה דנדריטית (קופסה ירוקה) מודגשים. (ב, ג) יחיד P6 starburst amacrine תא שכותרתו עם eYFP מתויג קרום 5 ימים הזרקת postAAV (dpi) מראה תיוג תא חד-תאי בהיר. סרגלי קנה מידה עבור לוחות עליונים = 50 מיקרומטר; סרגלי קנה מידה עבור לוחות נמוכים יותר = 25 מיקרומטר. לפני (A) ואחרי (B) דה-פיתול עם ImageJ. Insets (אדום) להראות deblurring כתוצאה של deconvolution מוצלח. (D) P6 starburst amacrine תא 5dpi (משמאל) לעומת P12 starburst תא 11 dpi מראה רמות דומות של ביטוי חלבון פלואורסצנטי. הגדלת זמני הדגירה של AAV אינה מגבירה את האות הפלואורסצנטי. האותות הפלואורסצנטיים אינם יורדים עם תקופות זיהום AAV ארוכות יותר. פרמטרי רכישה ופוסט-עיבוד זהים הוחלו על שתי התמונות. עובי ענף מוגבר ושונות שנצפו ב- P12 הם תכונות רגילות של התבגרות תאי התפרצות כוכבים ולא חפץ תיוג או הדמיה. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: AAV = וירוס הקשור לאדנו; eYFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר; dpi = ימים לאחר ההדבקה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: שיקולים לבחירת Cre line ולוקליזציה של חלבון פלואורסצנטי.

(א-ד) תאי גנגליון רשתית P11 חיים בתמונה ב 9 dpi של BBV מוזרק לתוך Vglut2-iRES-Cre לדפוק-in עכברים, שבו Cre מתבטא באופן סלקטיבי באוכלוסיית RGC. (א) JAM-B RGC מזוהה על ידי המורפולוגיה האסימטרית האופיינית ^לו24. (B-D) תת-סוגים נפרדים של RGC השונים בדפוסי הריבוד הדנדריט שלהם. (E) תמונה של תא amacrine כוכב P11 חי שעבר באופן ביולוגי עם mCherry ציטוסולי ונלכד עם confocal דיסק מסתובב ב 512 x 512 פיקסלים. XFP הציטוסולי מוביל לאות פלואורסצנטי גבוה בסומא ביחס לבליטות הדנדריטיות העדינות. אור מחוץ למיקוד מהסומא גורם לפלואורסצנטיות גבוהה ברקע כאשר מדמים תחזיות פרוקסימליות קטנות (כניסה בתיבה אדומה למעלה מוצגת להלן). (F) תמונה של תא amacrine p11 כוכב חי שהושפע עם eYFP ממוקד ממברנה ונלכד על ידי סריקת לייזר קונפוקלית ב 1024 x 1024 פיקסלים. שימו לב לטבעת הממברנה הפלואורסצנטית סביב הסומה, ליחס האות-לרעש המשופר ולאיכות ההקרנות העדינות הפרוקסימליות לסומה המיוצרות על ידי חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה (inset). סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר ולוחות נמוכים יותר של E ו- F = 5 מיקרומטר. קיצורים: IRES = אתר כניסה פנימי לריבוזום; BBV = וירוס הקשור לאדנו Brainbow; Vglut2 = משגר גלוטמט שלפוחית 2; XFP = כל חלבון פלואורסצנטי; eYFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר; mCherry = דובדבן מונומרי; RGC = תאי גנגליון רשתית; JAM-B = מולקולת הידבקות צומת B. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו משלים 1: וידאו לשגות זמן של P6 פיתוח כוכב amacrine דנדריטים, 5 ימים לאחר ההזנקה. שלב הזמן של הווידאו הוא 2 דקות. Deconvolution ותיקון סחיפה 3D הוחלו באמצעות ImageJ. תיבות צהובות עליונות מדגישות אזורים של תולדה, והקופסה התחתונה מתארת אזור של צמיחת פילופודיה חולפת, מגע עצמי ונסיגה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

קובץ משלים 1: מאקרו ImageJ עבור אצווה פירוק איטרטיבי מקבילי. המאקרו מפעיל 25 איטראציות של אלגוריתם האיטרטיבי Landweber (WPL) של מסנן הווינר. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו זה מדגים צינור ניסיוני המשתמש בכלים גנטיים קיימים כדי לדמיין דינמיקה של דנדריט של פיתוח נוירונים ברשתית עם הדמיה חיה קונפוקלית. כמו כן הוכחו זריקות תוך עיניות של AAVs תלויי Cre קידוד חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה לעכברים יילודים. תאים בודדים של אוכלוסיות ממוקדות גנטית מסומנים בבהירות כבר 4-5 dpi. הרכבות שטוחות ברשתית הוכנו לתאי הדמיה סטנדרטיים כדי לבצע הדמיה קונפוקלית של תאים חיים. שיטה זו מייצרת קטעי וידאו ברזולוציה גבוהה של זמן לשגות של תאים בודדים ואת התחזיות העדינות שלהם. תחזיות קטנות נפתרות ומכמתות באמצעות אלגוריתמים של דה-מפכונלציה ופוסט-עיבוד הזמינים באמצעות תוכנת קוד פתוח, כולל ImageJ, Vaa3D ו- ShuTu, כמו גם תוכנה מורשית הזמינה מ- Imaris ו- MBF Bioscience. כמו צינור זה הוא מודולרי, כל סעיף פרוטוקול ניתן לשנות כדי להתאים את המטרות של המחקר. אלמנטים מודולריים אלה נדונים להלן וכוללים: 1) בחירת Cre-line, 2) בחירה של חלבון פלואורסצנטי ומבנה ויראלי, 3) שיטות אספקת גנים, ו 4) שיטת הדמיה.

טכניקה זו משתמשת בקווים מהונדסים Cre לגישה גנטית לתת-אוכלוסיות של תאי רשתית. Cre חייב להיות פעיל לאחר הלידה ובא לידי ביטוי על פני אוכלוסיית התאים בזמן ההזרקה כדי להגדיל את ההסתברות של זיהום ויראלי ותיוג תאים. בדו"ח זה, ChAT-Cre שימש למקד תאי amacrine starburst, ואת קו Vglut2-Cre שימש כדי למקד פיתוח ^RGCs42,43(איור 6). הזרקת AAV תלוית Cre לעכברי Vglut2-IRES-Cre המסומנים במגוון RGCs, כולל מולקולת הידבקות הצומת B (איור 6A) ו-RGCs דו-שכבתיים (איור 6B, C). לחלופין, עיצובים חדשים של AAVs עם מקדמים סינתטיים המניעים ביטוי ספציפי לסוג התא יכולים לבטל את הצורך בקווים מהונדסים ^Cre44. שיקול נוסף עבור תיוג יעיל ובהיר המתאים להדמיה חיה הוא הזמן המינימלי הנדרש עבור transfection וביטוי, אשר יכול להשתנות בהתאם לסרוטיפ AAV, טרופיזם, ו ^titer45. במחקרים אלה, כמו תיוג בתיווך AAV דורש מינימום של 4-5 dpi עבור ביטוי XFP, שיטה זו אינה מתאימה לגישה לנקודות זמן מוקדמות לאחר הלידה. כדי ללכוד נקודות זמן מוקדמות (למשל, P0-P4), זריקות תוך עיניות ניתן לבצע ברחם בבעלי חיים עובריים, כפי שנעשה עבור אלקטרופורציה ^הרחם46. במחקרים של קבוצה זו על התפתחות דנדריט starburst, דפוס רקומבינציה דלילה ראשונית של ChAT-Cre נוצל כדי לתייג תאי amacrine כוכב יחיד ב P0-P4 באמצעות כתב Cre מהונדס עכבר, רוזה-mTmG27. לבסוף, פרוטוקול הזרקת רשתית AAV זה יכול לשמש כדי לתייג אוכלוסיות תאים בוגרים, בהתבסס על האישור של ההתמדה של תיוג פלואורסצנטי 3 חודשים לאחר הזרקה ללא השפעות מזיקות על מורפולוגיה של תאי starburst34.

צינור זה מאפשר גם גמישות בבחירת מבנים ויראליים. כדי ללכוד את הדינמיקה של דנדריט, ניתן להשתמש במגוון חלבונים פלואורסצנטיים בכתב, כולל חלבונים המותאמים למבנים תת-תאיים ספציפיים, חלבונים בעלי עניין, או מדווחים על שינויים פונקציונליים כגון דינמיקת אקטין (למשל, LifeAct) ואותות סידן (למשל, GCaMP). כל וקטור AAV זמין מסחרית או משוכפל יכול להיות מועסק, וכלים מקוונים כגון fpbase.org יש להפנות עבור בהירות ו phototability. כאן, וקטורים ויראליים Brainbow קידוד חלבונים פלואורסצנטיים עם מוטיב H-Ras farnesylation CAAX שימשו לוקליזציה ממברנה. בשלב מוקדם של פיתוח הפרוטוקול, לוקליזציה ציטוטוסולית של XPFs נמצאה כלא אידיאלית ללימוד מורפולוגיה של נויריטים משובחים, עם רוויית יתר של אותות מהסומא ותיוג לקוי של ענפים עדינים (איור 6E). לשם השוואה, חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה הוצגו כמתייגים ומוכרים בליטות דנדריטיות עדינות (איור 6E, F). שיקול נוסף הוא הגודל, העיצוב והמורכבות של המבנה הנגיפי, שיכולים להשפיע על זמן הביטוי. לדוגמה, נוצר AAV-CAG-FLEx-mClover3-CAAX, המבטא XFP אחד באופן תלוי-Cre. מבנה זה כולל עיצוב פשוט יותר, והתוצאה היא ביטוי יעיל על ידי 4 dpi. יחד, האפשרויות המגוונות עבור קווי Cre, עיצובי AAV, וכתבי חלבון פלואורסצנטיים הזמינים באופן נרחב ממאגרים (למשל, JAX, Addgene, ו- Viral Vector Cores) הופכות את הצינור הזה להתאמה למגוון מחקרים של סוגי תאים ותופעות התפתחותיות ברשתית.

למרות פרוטוקול זה מפרט זריקות AAV תוך עיניות, שיטות אחרות להעברת גנים זמינים כגון electroporation plasmid46 ואספקת גנים ביוליסטית (למשל, Gene Gun)⁷. אלקטרופורציה דורשת יישום פעימה חשמלית, ואספקת גנים ביוליסטית דורשת דגירה אקס ויוו של explants רשתית. תיוג AAV הוא פחות פולשני משתי שיטות אלה ומאפשר הכנות חריפות של explants רשתית רק לפני הדמיה. בהשוואה למסירת גנים ביוליסטית (איור 6E, F), זריקות AAV הביאו ליכולת רקמות משופרת שהתאימה יותר לרכישה רציפה הדרושה למעקב אחר דינמיקת הנוירייט. עם טכניקה נכונה, תיוג AAV מהווה מעט מאוד נזק לרשתית, כפי שנשפט על ידי בריאות הרקמה בזמן הניתוח. זריקות intravitreal בעיקר להדביק תאים בתוך שכבת תא גנגליון ואת השכבה הגרעינית הפנימית, כגון RGCs ותאי amacrine. עשרות רבות של תאי אמקרין של כוכב-כוכבים מסומנים בדרך כלל בתווית, עם צפיפות מוגברת של תאים מתויגים סביב ראש עצב הראייה (איור 4C). עם זאת, עם כל שלוש שיטות transfection, ניתוק עצב הראייה הוא בלתי נמנע כדי להשיג explants ברשתית ויוביל ניוון RGC. למרות ניתוק עצב הראייה, מחקרים מדווחים explants רשתית קיימא ממגוון של מודלים בעלי חוליות במשך 36 שעות ועד 6 ימים לאחר ^{הניתוח5,6,6,7,47,48}.

לבסוף, התועלת של מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי ללכוד דינמיקה דנדריט הוכח. בדרך כלל, מפגש הדמיה משתרע על פני 2-4 שעות, והוא הסתיים לפני השפלת רקמות או blebbing neurite הוא ציין. מפגשי הדמיה עד 6 שעות נערכו; עם זאת, הגבול העליון לא נבדק באופן שיטתי. אזורים עשויים לעבור צילום עקב הדמיה ממושכת, אך תאים בתחומי ראייה אחרים בגרש נשארים ברי קיימא להדמיה חיה. ניתן להרחיב שיטה זו גם למיקרוסקופיה מרובת פוטון או גליון אור כדי לדמות מורפולוגיה עצבית בשכבות עמוקות יותר ובנפחים גדולים יותר. הדמיה רב-פוטונית בוצעה כדי לחקור את הדינמיקה של נויריט ברשתית העכבר והיא מתאימה יותר לחקר תאים בלמינה רשתית עמוקה יותר (למשל, תאים אופקיים או קולטני אור)⁴⁹. לאחרונה, מיקרוסקופיה של גליון אור חי שימשה ללכידת אנגיוגנזה ^רשתית50, המציעה שדרה חדשה להדמיה חיה של מורפוגנזה ברשתית שלמה. מיקרוסקופיית גליון אור של תאים חיים יכולה לשמש לחקר הרכבה של מעגלים עצביים בקנה מידה גדול יותר, כגון מיקוד אקסון-דנדריט. הדמיה חיה צבעונית היא יישום נוסף של צינור זה שניתן להשתמש בו כדי לחקור אינטראקציות בין תאים לתאים, כגון השפעת תאים שכנים על התפתחות דנדריט או תופעות התפתחותיות אחרות כגון ריצוף של תאי רשתית כולל תת-סוגים ^RGC1, מיקרוגליה ואסטרוציטים.

לסיכום, היבט מאתגר של מחקרים התפתחותיים הוא קבלת גישה בנקודות זמן קריטיות אלה. פרוטוקול זה מספק שיטה להדמיה מורפוגנזה המתרחשת במהלך חלון זמני מסוים. הצינור משלב כלים וטכניקות קיימות כדי למקד גנטית אוכלוסיות תאים ולבטא חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה. תכשירי הרכבה שטוחה רשתית חריפה לשמור על הכדאיות ואותות פלואורסצנטיים להדמיה קונפוקלית של תאים חיים במשך מספר שעות. היבטים ארעיים ודינמיים של פיתוח דנדריט נלכדים בסרטוני תלת-ממד ומעובדים לאחר עיבוד באמצעות תוכנת קוד פתוח. היכולת ללכוד סרטוני תלת-ממד ברזולוציה גבוהה חיונית בחקירת תהליכים התפתחותיים דינמיים.

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מודים למדיסון גריי על שעזרה לי כשלא היה לי. מחקר זה נתמך על ידי מענק גילוי NSERC (RGPIN-2016-06128), מלגת סלואן במדעי המוח ויו"ר מחקר קנדה רובד 2 (ל- J.L.L. ). ס. אינג-אסטבס נתמך על ידי תוכנית המחקר למדעי הראייה ומלגות לתואר שני של NSERC- דוקטורט.