التصوير بالفاصل الزمني للتشجير العصبي باستخدام وضع العلامات على الفيروسات المرتبطة بالأدينو المتناثرة لمجموعات خلايا الشبكية المستهدفة وراثيا

هنا ، نقدم طريقة للتحقيق في مورفوجينيا العصب في شبكية العين بعد الولادة بواسطة المجهر البؤري بفاصل زمني. نحن نصف نهجا لوضع العلامات المتناثرة واكتساب أنواع خلايا الشبكية وعملياتها الدقيقة باستخدام ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدية المؤتلفة التي تعبر عن البروتينات الفلورية المستهدفة بالغشاء بطريقة تعتمد على Cre.

يتطلب اكتشاف الآليات التي تنميط العرش التغصني طرقا لتصور التشعبات وتصويرها وتحليلها أثناء التطوير. شبكية العين الفأر هو نظام نموذجي قوي للتحقيق في الآليات الخاصة بنوع الخلية لتكوين الخلايا العصبية والاتصال. تنظيم وتكوين الأنواع الفرعية للشبكية محددة جيدا، والأدوات الجينية متاحة للوصول إلى أنواع محددة أثناء النمو. كما أن العديد من أنواع خلايا الشبكية تقيد التشعبات و / أو المحاور العصبية الخاصة بها إلى طبقات ضيقة ، مما يسهل التصوير بفاصل زمني. تعتبر مزارع استئصال شبكية العين للفئران مناسبة تماما لتصوير الخلايا الحية باستخدام المجهر البؤري أو متعدد الفوتونات ، ولكن الطرق المحسنة لتصوير ديناميكيات التشعبات ذات الدقة الزمنية والهيكلية غير موجودة. تظهر هنا طريقة لتسمية وتصوير تطور مجموعات شبكية محددة تتميز بنظام Cre-Lox بشكل ضئيل. الفيروسات المرتبطة بالغدية المتاحة تجاريا (AAVs) المستخدمة هنا عبرت عن البروتينات الفلورية المستهدفة بالغشاء بطريقة تعتمد على Cre. ينتج عن الولادة داخل العين ل AAVs في الفئران حديثي الولادة وضع علامات الفلورسنت على أنواع الخلايا المستهدفة قبل 4-5 أيام بعد الحقن (dpi). يمكن اكتشاف إشارات الفلورسنت الغشائية عن طريق التصوير البؤري وحل هياكل الفروع الدقيقة والديناميكيات. يتم الحصول على مقاطع فيديو عالية الجودة تمتد من 2 إلى 4 ساعات من تصوير الحوامل المسطحة للشبكية التي يتم دمجها مع السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي المؤكسج (aCSF). كما يتم توفير خط أنابيب ما بعد معالجة الصور لإزالة الالتفاف وتصحيح الانجراف ثلاثي الأبعاد (3D). يمكن استخدام هذا البروتوكول لالتقاط العديد من السلوكيات الخلوية في شبكية العين السليمة وتحديد العوامل الجديدة التي تتحكم في تكوين الخلايا العصبية. ستكون العديد من الاستراتيجيات التنموية التي تم تعلمها في شبكية العين ذات صلة بفهم تكوين الدوائر العصبية في أماكن أخرى من الجهاز العصبي المركزي.

تشكل تشعبات الخلايا العصبية الشبكية أنماطا معقدة، ولكنها محددة، تؤثر على وظيفتها داخل الدوائر العصبية. في شبكية العين الفقارية، تحمل أنواع متنوعة من الخلايا العقدية الشبكية (RGCs) والخلايا العصبية الداخلية لخلايا أماكرين مورفولوجيا تغصنية فريدة تختلف في حجم الشجرة وموقعها وطول فرعها وكثافتها1. أثناء تطور ما بعد الولادة، تقوم RGCs وخلايا أماكرين بتوسيع العمليات الشجيرية الوفيرة إلى عصبية تسمى الطبقة الضفيرية الداخلية (IPL)، حيث تتلقى مدخلات الخلايا ثنائية القطب التي تنقل إشارات المستقبلات ^{الضوئية2}. وكما تم التقاطه من خلال التصوير بفاصل زمني لمجموعات شبكية العين الموصوفة بالفلورسنت في يرقات الكتاكيت أو الزرد، فإن التشكل التشعبي ديناميكي ^{للغاية3}،^4،5. في غضون أيام ، تتوسع العرش الشجيرية ، وتعيد تشكيلها ، وتتشعب إلى طبقات فرعية ضيقة من IPL ، حيث تتشابك مع شركاء مختارين. تظهر العرش ديناميكيات هيكلية مختلفة على التنمية ، مع تغيرات في المعدلات النسبية لإضافة الفرع والتراجع والاستقرار. تظهر التشعبات Amacrine و RGC أيضا سلوكيات مختلفة للنمو وإعادة التشكيل قد تعكس التشجير الخاص بالنوع. ومع ذلك ، تتبعت هذه الدراسات مجموعات واسعة من الأماكرين أو RGC وركزت على الاستهداف الرقائقي ، وهو مجرد جانب واحد من جوانب المورفولوجيا.

الآليات التي تنتج التنوع المورفولوجي الهائل الذي لوحظ عبر الأنواع الفرعية للشبكية غير مفهومة بشكل جيد. كان الهدف من هذه المجموعة هو تطوير طريقة لالتقاط ديناميكيات التشعبات وإعادة تشكيل الشجرة لأنواع فرعية محددة من الشبكية في الفئران. يتطلب تحديد الآليات الخاصة بنوع الخلية لنمط التشعبات طرقا لتصور وقياس سلوكيات التشعبات للخلايا ذات الاهتمام. تعتبر الثقافات العضوية لشبكية العين الفئران مناسبة تماما لدراسات تصوير الخلايا الحية باستخدام المجهر البؤري أو متعدد الفوتونات. يتم تشريح الشبكية النامية وتركيبها في إكسبوات مسطحة يمكن تصويرها لعدة ساعات في غرفة التسجيل أو استزراعها على مدى بضعة أيام مع تأثيرات محدودة على ^{الدوائر6,7}. يمكن تصنيف الخلايا العصبية الحية في شبكية العين من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات، بما في ذلك ملء الصبغة بواسطة الأقطاب الكهربائية، والمعالجة الكهربائية، والتسليم الحيوي للجسيمات المغلفة بالأصباغ المحبة للدهون أو البلازميدات التي تشفر البروتينات الفلورية (على سبيل المثال، Gene Gun)، بالإضافة إلى ملصقات الخلايا المشفرة وراثيا7،⁸،^9،10 . ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب غير فعالة لتصوير ديناميكيات التشعبات لأنواع فرعية محددة من الشبكية. على سبيل المثال ، طرق ملء الأصباغ منخفضة الإنتاجية وتتطلب جهاز الفيزيولوجيا الكهربية وملصقات جينية إضافية لاستهداف الخلايا ذات الأهمية بشكل موثوق. علاوة على ذلك ، يمكن لإشارات التألق القوية في السوما أن تحجب التشعبات القريبة.

يمكن لطرق توصيل الجينات الحيوية تسمية عشرات الخلايا في وقت واحد ، ولكن الخطوات التي تنطوي على توصيل الجسيمات عالية الضغط وحضانة الشبكية المعزولة بين عشية وضحاها يمكن أن تضر بفسيولوجيا الخلايا والنمو الشجيري. تقترح هذه الورقة أنه يمكن استخدام الأدوات الجينية الحديثة لالتقاط ديناميكيات التشعبات المبكرة مع نوع الخلية والدقة الهيكلية ، بالنظر إلى المعايير التجريبية التالية. أولا ، لحل الفروع الدقيقة والفيلوبوديا التي تهيمن على العرش النامي ، يجب أن تقوم الطريقة بتسمية الخلايا العصبية بالبروتينات الفلورية الساطعة التي تملأ العمليات في الشجرة بأكملها. يجب ألا تتلاشى العلامات الفلورية بسبب التبييض الضوئي خلال فترة التصوير. تم إنشاء مجموعة متنوعة من متغيرات البروتين الفلوري ومقارنتها من أجل ملاءمتها للتصوير في الجسم الحي / خارج الجسم ^الحي11 بناء على السطوع والاستقرار الضوئي. ثانيا ، يجب التعبير عن البروتينات الفلورية (XFPs) بمستويات عالية بما فيه الكفاية بحلول المرحلة المبكرة من تكوين أشكال التشعبات ، بحيث لا يتم تفويت نافذة النمو الضيقة. في تحليلات النقاط الزمنية الثابتة في شبكية العين الفأرية، يحدث تطور التشعبات خلال الأسبوع الأول بعد الولادة ويشمل مراحل النمو وإعادة التشكيل ^{والاستقرار10،12}،^13،14،15. ثالثا ، يجب أن تؤدي الطريقة إلى وضع علامات انتقائية أو إلى زيادة احتمال وضع العلامات على السكان الفرعيين للخلايا العصبية ذات الاهتمام. رابعا ، يجب أن يكون وضع العلامات على السكان الفرعيين المستهدفين متناثرا بما فيه الكفاية بحيث يمكن تحديد الشجرة العصبية بأكملها وتتبعها. على الرغم من أنه يمكن تمييز الأنواع الفرعية RGC و amacrine من خلال خصائصها المورفولوجية الناضجة وأنماط التقسيم الطبقي ^IPL16،¹⁷،^18،19،^{20 ،} فإن التحدي هو تحديد الأنواع الفرعية أثناء التطوير بناء على هياكل غير ناضجة. يتم تسهيل هذه المهمة من خلال توسيع الأدوات المعدلة وراثيا لتسمية أنواع محددة من خلايا الشبكية أثناء التطوير.

تستخدم خطوط الفئران المعدلة وراثيا والطرق السريعة التي يتم فيها تحديد التعبير الخلوي والزمني للبروتينات الفلورية أو Cre بواسطة العناصر التنظيمية الجينية على نطاق واسع لدراسة أنواع خلايا الشبكية13،²¹،^22،23. وقد جاءت الملاحظات الرئيسية حول أنماط محددة من النوع الفرعي لتطور التشعبات من دراسات شبكية العين الفئران المعدلة وراثيا في نقاط زمنية ^ثابتة10،^14،24،25. يتيح نظام Cre-Lox ، على وجه الخصوص ، معالجة الجينات الرائعة ومراقبة الأنواع الفرعية باستخدام مجموعة متنوعة من المراسلين المعتمدين على المؤتلف وأجهزة الاستشعار والمنشطات البصرية الوراثية. وقد أدت هذه الأدوات إلى اكتشاف برامج جزيئية خاصة بنوع فرعي وخصائص وظيفية تكمن وراء تجميع دائرة الشبكية26،^27،28،^29،30. ومع ذلك ، لم يتم الاستفادة منها بعد لدراسة ديناميكيات التشعبات الخاصة بالنوع الفرعي في شبكية العين الفأرية. يمكن تحقيق وضع العلامات منخفضة الكثافة من خلال الجمع بين خطوط الماوس Cre والجينات المحورة التي يتم إدخالها بواسطة الكهربية أو بواسطة AAVs المؤتلفة. إذا كان ذلك متاحا، يمكن أيضا استخدام خطوط كري المستحثة بالتاموكسيفين أو الاستراتيجيات الجينية المتقاطعة. وأخيرا، ينبغي وضع علامة على الخلية بطريقة طفيفة التوغل وتصويرها باستخدام معلمات الاكتساب حتى لا تتعرض الأنسجة للخطر أو تتداخل مع الوظيفة الخلوية اللازمة لتكوين التشعبات.

تظهر هنا طريقة لتطبيق الأدوات المعدلة وراثيا والمجهر البؤري للتحقيق في ديناميكيات التشعبات في عمليات استئصال شبكية العين الحية للفئران. تم دمج خطوط الفئران المعدلة وراثيا Cre مع ناقلات AAV التي تعبر عن البروتينات الفلورية عند إعادة تركيب Cre ، مما يسمح بوضع علامات متفرقة على خلايا الشبكية ذات الاهتمام. يتم تسليم AAVs المتاحة تجاريا إلى شبكية العين حديثي الولادة عن طريق الحقن داخل الجسم الزجاجي. توضح هذه الورقة أن AAVs تنتج تعبيرا فلوريا عاليا وخاصا بنوع الخلية بنسبة 4 نقاط في البوصة ، مما يسمح بالوصول إلى نقاط زمنية بعد الولادة. ولتوضيح هذا النهج، تم تصنيف الإنترنورون الأماكرين "الانفجار النجمي" الكوليني عن طريق توصيل Brainbow AAV في الفئران حديثي الولادة التي تعبر عن أستيل ترانسفيراز الكولين (ChAT) - موقع دخول الريبوسوم الداخلي (IRES)-Cre transgene ، والذي ينشط في شبكية العين المبكرة بعد ^{الولادة31,32}. تطور خلايا الأماكرين النجمية مورفولوجيا شجرية نمطية وشعاعية تتشكل من خلال تجنب التعفن الذاتي بوساطة البروتوكادهيرينات ^{المتجمعة33,34}. تظهر هذه الورقة أن دقة التشعبات النجمية والفيلوبوديا قد تحسنت بشكل كبير بواسطة XFPs إلى غشاء البلازما مع إضافة زخارف CAAX التي تخضع للفارنيزيل ، كما هو مستخدم في Brainbow ^AAVs31. وأخيرا، تم تحديد بروتوكولات التصوير بالفاصل الزمني وما بعد المعالجة التي تنتج صورا عالية الجودة قابلة لإعادة بناء التشعبات والقياس الكمي المورفومتري. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد العوامل التي تتحكم في تشكل التشعبات والتقاط العديد من السلوكيات الخلوية في شبكية العين السليمة.

ملاحظة: يمتد هذا البروتوكول لمدة يومين مع فترة لا تقل عن 4-5 أيام للنقل الفيروسي بين الأيام التجريبية (الشكل 1A). يتم إجراء التجارب على الحيوانات وفقا للمجلس الكندي للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات لاستخدام الحيوانات في البحوث ورعاية الحيوانات المختبرية بموجب البروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة استخدام ورعاية الحيوانات في مستشفى الأطفال المرضى (تورونتو ، كندا).

1. الاستعدادات لحقن AAV حديثي الولادة وتجارب التصوير

1. حدد خط ماوس Cre لتسمية مجموعات خلايا الشبكية ذات الاهتمام. تأكد من التعبير عن Cre recombinase في وقت حقن AAV عن طريق العبور إلى مراسل Cre المعدل وراثيا أو من خلال تلطيخ المناعة بجسم مضاد Cre.
2. تولد الفئران Cre المعدلة وراثيا (8-16 أسبوعا) لتوليد الحيوانات الوليدية الإيجابية Cre.
   ملاحظة: في هذا العرض التوضيحي ، تم استخدام الفئران ChAT-IRES-Cre لاستهداف خلايا الأمكرين Starburst الكولينية.
3. الحصول على فيروس AAV المعتمد على المؤتلف الذي يشفر بروتين (بروتينات) الفلورسنت. للحصول على أفضل وسم للعمليات الدقيقة ، حدد المتجهات التي تعبر عن XFPs المعدلة التي تستهدف غشاء البلازما.
   ملاحظة: استخدمت هذه الدراسة فيروس قوس قزح (BBV) و AAV-EF1a-BbTagBY و AAV9-EF1a-BbChT (انظر جدول المواد) ، والتي توفر خيار وضع العلامات متعددة الألوان (الشكل 1B). أنتج بروتين الفلورسنت الأصفر المحسن (eYFP) وتعبير الكرز الأحادي (mCherry) أقوى إشارات الفلورسنت للتصوير الحي. يمكن استخدام BBV واحد لتصوير العرش الفردي ، في حين يمكن استخدام الحقن المشترك ل BBVs لتسمية المزيد من الخلايا أو العرش المجاور مع الفلوروفورات المتميزة. في حالة استخدام بروتينات فلورية متعددة، تأكد من الحد الأدنى من تداخل طيف الانبعاثات (الشكل 1C). يجب تعديل معلمات اكتساب المجهر لالتقاط إشارات XFP المتميزة.
4. قم بإعداد ∼3-5 ميكرولتر من AAVs في أنابيب فردية منخفضة الربط للمخزونات ذات الاستخدام الواحد لتجنب دورات التجميد / الذوبان. يخزن على درجة حرارة -80 درجة مئوية.
5. تحضير ماصات زجاجية من البورسليكات مع نصائح دقيقة جدا باستخدام مجتذب ماصة دقيقة.
   ملاحظة: تختلف إعدادات المجتذب تبعا للخيوط والمستقطبات المستخدمة؛ انظر الشكل 2A لمعرفة حجم الطرف النهائي وشكله. أقطار القطيرات النموذجية هي 600 ميكرومتر.
6. الحصول على نظام الحقن المجهري والأنابيب المرتبطة به. قم بتوصيل الحاقن الدقيق بمنفذ هواء مضغوط.

الشكل 1: نظرة عامة تجريبية . (أ) يمتد هذا البروتوكول على مدار يومين من التجارب مع فترة عدوى لا تقل عن 4-5 أيام بين الأيام التجريبية. يتم إجراء الحقن داخل العين على الفئران حديثي الولادة التي لا يزيد عمرها عن يوم ما بعد الولادة 3. ثم يتم تشريح شبكية العين، وتركيبها بشكل مسطح، وتصويرها مباشرة لالتقاط النافذة التنموية المطلوبة. يمكن تصوير الخلايا المصنفة في أي وقت بعد 4-5 أيام المطلوبة اللازمة للتعبير الفيروسي ، حيث لا توجد آثار واضحة لتعبير AAV المطول على مورفولوجيا التشعبات. (ب) يتم حقن ناقلات Brainbow AAV المعتمدة على Cre (BBV) في الحيوانات التي تعبر عن ^Cre31. في هذه الدراسة ، تم استخدام الفئران ChAT-Cre في دفع إعادة تركيب Cre في خلايا amacrine starburst. يقوم اثنان من BBVs بتشفير eYFP أو tagBFP المعدل ، أو mCherry و mTFP ، والتي تنتهي بزخارف CAAX التي يتم تجميعها بالتتابع لتوطين الغشاء. يتم تصوير مواقع Lox بمثلثات. تعبر المتجهات إما عن XFPs البعيدة بطريقة عشوائية وتوافقية تعتمد على إعادة تركيب Cre. يتضمن مروج EF1α عناصر تنظيمية من جين عامل الاستطالة 1α. يمثل W عناصر من العنصر التنظيمي التالي للنسخ من فيروس التهاب الكبد الوبائي woodchuck ، ويشير pA إلى تسلسل polyadenylation. (ج) أطياف الإثارة والانبعاثات ل mCherry و eYFP ، فلوروفورات BBV المصورة في هذه الدراسة. عند التصوير الحي لبروتينات الفلورسنت المتعددة ، يجب ترتيب معلمات الكشف لفصل أطياف الانبعاثات بشكل كاف إلى قنوات متميزة. الاختصارات: AAV = الفيروس المرتبط بالغدية; BBV = قوس قزح AAV; ChAT = الكولين أستيل ترانسفيراز; iRES = موقع إدخال الريبوسوم الداخلي ؛ eYFP = بروتين الفلورسنت الأصفر المحسن. iTR = تكرار المحطة المقلوبة ؛ tagBP = بروتين الفلورسنت الأزرق Tag ؛ mCherry = الكرز الأحادي ؛ mTFP = بروتين الفلورسنت البط البري ؛ XFP = أي بروتين فلورسنت. EF1α = عامل الاستطالة 1 ألفا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. الحقن داخل الجسم الزجاجي من AAVs في الفئران حديثي الولادة

1. إذابة أليكوت AAV على الجليد. تحضير ~ 1: 4 AAV تخفيف باستخدام محلول ملحي معقم أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات. تحضير ~ 0.5 ميكرولتر من تخفيف AAV لكل (~ 0.25 ميكرولتر لكل عين) في حالة كسر الماصة الدقيقة ، ويجب ملء ماصة جديدة. تخزين AAV المتبقية غير المخففة في 4 درجة مئوية، واستخدامها في غضون 2 أسابيع.
   ملاحظة: في هذه التجربة، كان تركيز AAV المورد ~ 1-2 × 1013 محتوى الجينوم (GC)/mL وتم تخفيفه إلى تركيز نهائي قدره 4 × ¹⁰¹² GC/mL. تحسين التركيز الفيروسي للحصول على كثافة وضع العلامات المطلوبة.
2. لتصور الحقن ، أضف ما يقرب من 1 ميكرولتر من محلول صبغة FCF الأخضر السريع بنسبة 0.02٪ لكل 15 ميكرولتر من تخفيف AAV لتلوين المحلول باللون الأزرق.
3. انقل قفص فأر مع سدس وفضلات حديثي الولادة (يوم ما بعد الولادة (P) 0.5-3) إلى غرفة إجراء مع معدات الحقن المجهري. احتفظ بالحيوانات في نفس القفص مع الأعشاش والفراش لتقليل إجهاد الأمهات ورفض الجراء.
4. قم بتعقيم منطقة الحقن بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وضع وسادات حفاضات معقمة على أسطح المقاعد. قم بإعداد منصة دافئة (على سبيل المثال ، وسادة تدفئة) للتعافي من التخدير الناجم عن انخفاض حرارة الجسم.
5. ردم الماصة الدقيقة بتخفيف AAV باستخدام حقنة دقيقة. تحت المجهر المجسم، قم بكسر طرف الماصة الدقيقة بإبرة 30 جم لفك الحافة.
   ملاحظة: يوضح الشكل 2A الطرف المردوم - مختوما (في الأعلى) وغير مختوم (في الوسط).
6. تخدير الفئران حديثي الولادة عن طريق انخفاض حرارة الجسم عن طريق وضع 1-2 الحيوانات على الجليد. ضع الحيوانات على قفاز لاتكس لحماية البشرة من التلامس المباشر مع الجليد. بمجرد أن يتوقف الحيوان عن التحرك استجابة لقرصة مخلب (~ 2 دقيقة) ، ضع الحيوان تحت مجهر ستيريو. إذا رغبت في ذلك ، منصات مخلب الوشم مع حبر الوشم وإبرة 30 G ، وجمع قصاصات الذيل لعزل الحمض النوويلتحديد الحيوانات عن طريق التنميط الجيني.
   ملاحظة: يجب أن تحدث المراقبة المناسبة لعمق التخدير طوال الإجراء.
7. مسحة الجلد فوق العينين مع 70٪ من الإيثانول. استخدم إبرة 30 جم لفتح الجفن المنصهر (الشكل 2B). ضع ضغطا خفيفا بالأصابع لفتح العين ، وقم بكز ثقب صغير عبر القرنية عند تقاطع القرنية الصلبة (الشكل 2C).
8. أدخل الماصة الدقيقة الزجاجية في الحفرة ، واضغط على دواسة القدم الحاقن الدقيق 2-4 مرات لحقن AAV في الفضاء داخل الجسم الزجاجي. قم بإزالة الماصة الدقيقة ببطء ، وتأكد من حقن AAV عن طريق تصور صبغة زرقاء من خلال التلميذ (الشكل 2D).
   ملاحظة: مع ضغط طرد يتراوح بين 6-8 رطل لكل بوصة مربعة وزمن نبض يتراوح بين 600 و800 مللي ثانية، يتم إخراج قطرة قطرها 600 ميكرومتر (الشكل 2A، أسفل). يتم حقن ما يقرب من 0.23-0.45 ميكرولتر من محلول AAV لكل عين. يشير المحلول الأزرق خارج العين إلى أن AAV لم يتم حقنه في العين. يشير المحلول الأزرق المتسرب من موقع الحقن إلى أن AAV ربما يكون قد تسرب ، مما يقلل من كفاءة النقل.
9. اضغط برفق على الجفون معا لإعادة الإغلاق ، وضع الجرو على وسادة ساخنة. بمجرد أن تستعيد الحيوانات لونا ورديا وتستجيب ، انقلها بلطف إلى قفص الإسكان.
   ملاحظة: تأكد من اتخاذ الاحتياطات المناسبة لتجنب إعادة تسخين الجراء بسرعة كبيرة.
10. كرر إجراء الحقن للحيوانات المتبقية في القمامة. اسمح بفترة لا تقل عن 4-5 أيام للنقل الفيروسي قبل تصوير شبكية العين.

الشكل 2: الحقن داخل العين لحديثي الولادة. (أ) تظهر الماصة الدقيقة المبللة شكل طرف الماصة عند إغلاقها (أعلى) وبعد فك الطرف (أسفل ، يسار). ينتج ضغط حقن بيكو من 6-8 رطل لكل بوصة مربعة ووقت النبض من 600-800 مللي ثانية قطرة قطرها 600 ميكرومتر (أسفل ، يمين). شريط المقياس = 1 مم (B) جرو P0 مخدر تحت تكبير 16x. يتم فتح تقاطع الجفن المنصهر (الأبيض) باستخدام إبرة حادة 30 جم. شريط المقياس = 2 مم (C) الضغط الخفيف المطبق على العين يكشف القرنية. شريط المقياس = 2 مم. يظهر القسم المكبر (الأحمر) الثقب الصغير عند تقاطع القرنية الصلبة (الأصفر) الذي تم إنشاؤه باستخدام إبرة 30 جم ؛ شريط المقياس = 0.5 مم (D) سحب طرف الماصة بعد الحقن (يسار). تظهر الصبغة الخضراء السريعة في محلول AAV باللون الأزرق والرمادي من خلال التلميذ (الأوسط) ، مقارنة بلون بؤبؤ العين الفاتح قبل الحقن (يمين). شريط المقياس = 1 مم (E) بعد 4 أيام ، التئم الجفن واندمج مغلقا (يسار) ؛ شريط المقياس = 2 مم. عند الاستئصال ، يكون موقع الحقن الملتئم مرئيا (أصفر) ؛ شريط المقياس = 1 مم. لاحظ موقع الحقن على الحدود بين القرنية والصلبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تشريح الشبكية لتجربة التصوير

1. تحضير aCSF الشبكية (119 mM NaCl ، 2.5 mM KCl ، 1.3 mM MgCl2 ·6H2O ، 2.5 mM CaCl2 ·_2H2O ، 1 mM NaH2PO4 ، 11 mM الجلوكوز ، و 20 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (حمض HEPES الحر)³⁵. إذا رغبت في ذلك ، قم بإعداد وتجميد محلول 10x ؛ تذوب وتخفف إلى 1x حسب الحاجة.
2. أكسجين الشبكية aCSF عن طريق الفقاعات مع الكاربوجين (95٪ O2، 5٪ _CO2) لمدة لا تقل عن 15 دقيقة. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. يحفظ في وعاء مغلق حتى الاستخدام لضمان بقاء aCSF مؤكسجا.
   ملاحظة: تتطلب شبكية العين تركيزا عاليا من _O2. من المهم الحفاظ على أكسجة aCSF طوال التجربة.
3. قم بتضمين طبق بتري قطره 60 مم في صينية ثلج (قم بتصميم صينية ثلج من بلاستيك المختبر ، على سبيل المثال ، غطاء صندوق ماصة) ، وضعه تحت المجهر المجسم. املأ طبق بتري بالسائل الدماغي الشوكي المؤكسج.
4. القتل الرحيم للفئران P9 والأصغر سنا عن طريق قطع الرأس. القتل الرحيم للفئران P10 وكبار السن عن طريق تحريض الأيزوفلوران ، أو طريقة بديلة معتمدة بموجب البروتوكول الحيواني ، تليها قطع الرأس.
5. إذا كانت الجفون مغلقة ، فقم بقطع رفرف الجفن لفضح العين. استخدم الملقط لاستئصال العينين ، ونقلهما إلى aCSF الشبكية الباردة من الخطوة 3.3.
6. لتشريح كوب الشبكية ، تحت المجهر المجسم (التكبير 25x) ، قم بتثبيت العين عن طريق ربط العصب البصري باستخدام ملقط Dumont # 5 (الشكل 3A).
7. قم بكز ثقب في وسط القرنية بإبرة 30 جم ، ثم أدخل طرفا واحدا من المقص المجهري في الثقب لإجراء شق من الثقب إلى نهاية القرنية. كرر ذلك لعمل 4 شرائح في الاتجاهات الأساسية ، وإنشاء 4 "لوحات" (الشكل 3A).
8. باستخدام ملقطين من Dumont #5 ، أمسك واسحب اللفافتين المجاورتين بعيدا عن بعضهما البعض ، وقم بتقشير الصلبة بلطف من شبكية العين. كرر ذلك مع اللوحات القرنية المتبقية ، وإزالة الصلبة من شبكية العين (الشكل 3B).
9. قم بإزالة العدسة من كوب الشبكية باستخدام الملقط. باستخدام المقص المجهري ، قم بعمل 4 شقوق شعاعية من حافة شبكية العين نحو العصب البصري ، مما يخلق 4 بتلات متساوية (الشكل 3B). كرر الخطوات من 3.4 إلى 3.7 للعين الثانية.

4. إعداد الشبكية مسطحة جبل

1. تحضير أقراص مرشح غشاء السليلوز المختلط الرمادي (MCE) للتركيب. في حالة استخدام مرشحات غشاء MCE ذات القطر الكبير ، قم بقطع القرص إلى أرباع (بعرض 1 سم تقريبا). ضع قرص MCE في وسط ورقة تصفية بيضاء أكبر (الشكل 3D).
   ملاحظة: تتوفر مرشحات MCE أيضا في أقراص قطرها 1 سم. يجب أن يكون قرص مرشح MCE كبيرا بما يكفي ليناسب 1-2 شبكية العين ، ولكنه صغير بما يكفي ليتناسب مع غرفة التصوير. نظرا لأن أغشية MCE تحمل شحنة ثابتة ، قلل من ملامسة غشاء MCE والتعامل معه.
2. التعامل مع شبكية العين باستخدام فرشتي طلاء بحجم 3/0 ، اقلب كوبا واحدا من الشبكية على فرشاة طلاء مع جانب خلية العقدة الشبكية لأسفل. ارفع الشبكية بلطف من السائل الدماغي الشوكي ، مع التأكد من أن توتر الماء لا يمزق الشبكية (الشكل 3C).
3. أثناء الاستمرار في حمل فرشاة الطلاء مع شبكية العين ، استخدم ماصة نقل لوضع قطرة من aCSF في وسط ورقة ترشيح MCE (الشكل 3C ، على اليمين). تطفو شبكية العين في قطرة من aCSF الناتجة عن التوتر السطحي. استخدم فرش الطلاء لوضع جانب شبكية العين RGC لأعلى داخل القطرة ولكشف بتلات الأربعة.
4. بمجرد وضعه ، قم بإنشاء جسر مائي بين فرشاة الطلاء وورق الترشيح الأبيض لكسر التوتر السطحي للقطرة.
   ملاحظة: عندما يكون aCSF شريرا بعيدا ، سوف تلتصق شبكية العين بورقة ترشيح MCE (الشكل 3D ، E). يمكن التعامل مع شبكية العين المثبتة بشكل مسطح عن طريق الإمساك بقرص MCE باستخدام الملقط. إذا كانت قطرة aCSF تبتعد بسرعة قبل تشكيل جسر مائي ، فقد يشير ذلك إلى أن غشاء MCE غير مشحون. استخدم غشاء MCE جديدا ، وقلل من الوقت بين الاستئصال والتصوير عن طريق تشريح الشبكية وتركيبها بشكل مسطح مباشرة قبل نقل الشبكية إلى غرفة التصوير.

الشكل 3: تشريح الشبكية والتركيب المسطح على أغشية مرشح استر السليلوز المختلطة. (أ) على اليسار ، يتم تثبيت العين المنوية عن طريق الإمساك بالعصب البصري باستخدام ملقط Dumont # 5 (يسار). يتم إنشاء ثقب صغير في وسط القرنية باستخدام إبرة 30 G (في الوسط). يستخدم مقص التشريح الدقيق لقطع القرنية إلى 4 لوحات متساوية (يمين). شريط المقياس = 1 مم (B) تشريح شبكية العين مع تقشير الصلبة باستخدام ملقطين Dumont # 5 (يسار) ومع إزالة العدسة (في الوسط). شبكية العين مع 4 جروح متساوية في منتصف الطريق إلى شبكية العين (يمين). شريط المقياس = 1 مم (C) التعامل مع شبكية العين باستخدام فرشتي طلاء دقيقتين (مقاس 3/0 ، يسار). انقلبت الشبكية مع خلايا العقدة الشبكية جنبا إلى جنب على فرشاة الطلاء (في الوسط) ورفعت من aCSF ، مع التأكد من أن توتر الماء لا يمزق شبكية العين (يمين). شريط المقياس = 2 مم (D) قرص غشاء MCE رمادي يوضع على ورقة تصفية بيضاء (يسار). قطرة من aCSF على قرص MCE (يمين). شريط المقياس = 1 سم (E) بعد تعويم الشبكية في القطرة ووضعها ، قم بإنشاء جسر مائي باستخدام ورقة الترشيح البيضاء لفتيل aCSF ، وسحب شبكية العين على ورقة MCE المشحونة (يسار) ؛ شريط المقياس = 1 سم. تظهر الصورة المكبرة لغشاء MCE (الأحمر) 2 شبكية العين المثبتة مع خلايا العقدة الشبكية جنبا إلى جنب (يمين) ؛ شريط المقياس = 2 مم. يتم تحديد شبكية العين باللون الأبيض. الاختصارات: MCE = استر السليلوز المختلط. aCSF = السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. التصوير البؤري بفاصل زمني لمستحضرات شبكية العين الحية الكاملة

1. قم بتجميع غرفة حضانة التصوير الحي للحصول على مجهر بؤري مستقيم كما هو موضح في الشكل 4.
   ملاحظة: بالنسبة للأنظمة متحدة البؤرة المقلوبة، يتم وضع حوامل RGC المسطحة جانبا لأسفل مباشرة على الغطاء السفلي الزجاجي لغرفة الحضانة. بمجرد أن تتلامس الشبكية مع الغطاء ، لا يمكن تحريكها.
2. املأ الغرفة ب aCSF المؤكسج ، وقم بتشغيل المضخة ووحدة التحكم في درجة الحرارة (درجة الحرارة 32-34 درجة مئوية ، معدل التدفق 1 مل / دقيقة). لا تسمح لدرجة الحرارة بالارتفاع فوق 34 درجة مئوية.
3. لنقل حامل الشبكية المسطح إلى غرفة التروية، أوقف المضخة، وأزل aCSF الموجود في الغرفة. ضع قرص MCE مع حامل الشبكية المسطح في غرفة الحضانة (الفارغة).
4. ضع وزن عينة على الحامل المسطح ؛ قبل ترطيب الوزن لكسر التوتر السطحي. أعد ملء الغرفة ب aCSF الدافئ ، وقم بتعميم aCSF عند ~ 1 مل / دقيقة.
5. ضع قطعة الأنف مع هدف غمس الماء 25x (فتحة العددية 0.95) في غرفة التصوير. شاشة للخلايا ذات الأهمية المصنفة باستخدام الضوء فوق الفلورسنت (الشكل 4C).
6. اضبط حجم التصوير لالتقاط الميزات الشجيرية المثيرة للاهتمام.
   ملاحظة: التقطت هذه الدراسة الشجرة المتغصنة الكاملة بدقة 1024 × 1024 بكسل لكل إطار ، والخطوة z 1 ميكرومتر ، ومعدل إطارات قدره 2 دقيقة بين كل مكدس z. أحجام الصور النهائية هي ~ 100 ميكرومتر × 100 ميكرومتر × 20 ميكرومتر.
7. لضبط طاقة الليزر إلى إعداد مثالي، استخدم جدول بحث يحدد كلا من وحدات البكسل المشبعة وغير المشبعة. أثناء المسح الضوئي ، اضبط طاقة الليزر بحيث لا تكون وحدات البكسل مشبعة (أي بكثافة 255 أو أعلى). استمر في التصوير طالما كان ذلك مطلوبا ، أو حتى يكون هناك انخفاض كبير ويمكن اكتشافه في إشارة الفلورسنت وزيادة في الضوضاء (عادة 2-4 ساعات).
   ملاحظة: يوصى بتقليل طاقة الليزر لأن خوارزميات فك الالتفاف تعمل على النحو الأمثل عند توزيع وحدات البكسل على النطاق الديناميكي الكامل. يجب ألا تتجاوز كثافة البكسل 254 ؛ كشفت التحليلات التجريبية للخلايا العصبية أن قيم البكسل أقل من 170 مثالية لإزالة الالتفاف. سرعات المسح الضوئي السريعة (400-600 هرتز) مع متوسط الخط (2-3) أفضل من عمليات المسح الضوئي الفردية الأبطأ من نفس إجمالي وقت بقاء البكسل. غالبا ما تبيض منطقة التصوير المطول ضوئيا ، لكن الأقسام الخارجية الأخرى تظل قابلة للحياة. يمكن تصوير مناطق متعددة في حامل مسطح ، كل منها لمدة 2-4 ساعات ، مع وقت حضانة إجمالي قدره 6 ساعات. لم يتم اختبار جلسات التصوير بعد 6 ساعات بشكل منهجي. تدهور العصبون والنبيب هي علامات على أن صلاحية الزرع آخذة في الانخفاض.
8. بعد التصوير ، قم بإصلاح حوامل الشبكية المسطحة وفلتر الغشاء مع بارافورمالديهايد بارد بنسبة 4٪ لمدة 1-2 ساعة عند 4 درجات مئوية. تضخيم ملصقات الفلورسنت في شبكية العين الثابتة بواسطة الكيمياء النسيجية المناعية لمزيد من التحليلات.
   ملاحظة: التثبيت بعد التصوير غير ممكن عند استخدام خلط مقلوب. شبكية العين ليست قابلة للإزالة دون تدمير الأنسجة.

الشكل 4: إعداد غرفة حضانة التصوير بالخلايا الحية. (أ) جهاز حضانة التصوير الحي الذي يعرض مكونات التدفئة والمحلول والتصوير. يشتمل السخان المزدوج على منصة غرفة حضانة ساخنة (دائرة خلفية مع أقطاب كهربائية موصل زرقاء) وسخان محلول في الخط. (ب) رسم تخطيطي ل 4A. يتم وضع الشبكية المسطحة (الحمراء) على غشاء MCE (رمادي) في غرفة الحضانة. يتم توصيل سخان المحلول المضمن بمضخة محلول (غير مصورة في 4A). تسمح أبعاد غرفة التصوير بمنطقة عمل جيدة للأنف الهدف الغمس. (ج) عرض 25x لاستئصال الشبكية الذي تم حقنه ب 0.23-0.45 ميكرولتر من 4 × ¹⁰¹² GC/mL من تخفيف AAV ؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. غالبا ما يحيط وضع العلامات الكثيفة للخلايا برأس العصب البصري (خط متقطع ، أسفل اليمين) ؛ شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: MCE = استر السليلوز المختلط. GC = نسخ الجينوم; mCherry = الكرز الأحادي ؛ eYFP = بروتين الفلورسنت الأصفر المحسن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. إزالة التفاف الصورة وما بعد المعالجة في ImageJ

1. قم باستيراد سلسلة الصور، وقسم السلسلة حسب الوقت، وقم بتلوينها إذا كانت صورة متعددة الألوان. تأكد من تضمين جميع النقاط الزمنية للون واحد في نفس المجلد.
   ملاحظة: استيراد التنسيقات الحيوية إذا كنت تستخدم ImageJ (يتم تضمين التنسيقات الحيوية تلقائيا في FIJI).
2. قم بإنشاء دالة انتشار نقطة نظرية (PSF) باستخدام المكون الإضافي ImageJ ، Diffraction PSF 3D.
   ملاحظة: تتطلب كل قناة تصوير PSF خاصة بها حيث يؤثر الطول الموجي لانبعاث البروتين الفلوري على PSF.
3. استخدام المكونات الإضافية | | وحدات الماكرو قم بتشغيل لتنفيذ الالتفاف التكراري المتوازي الدفعي لجميع النقاط الزمنية باستخدام الماكرو المتوفر (الملف التكميلي 1).
   ملاحظة: يقوم هذا الماكرو بتشغيل 25 تكرارا لخوارزمية Landweber (WPL) التكرارية لمرشح Wiener المشروط مسبقا. يجب فك تعقيد كل قناة لون بشكل منفصل.
4. دمج قنوات اللون، وتجميع كل النقاط الزمنية في مكدس تشعبي (صورة | | المكدسات الفائقة مكدسات إلى Hyperstack). تصحيح الانجراف 3D باستخدام الإضافات | | التسجيل تصحيح الانجراف 3D.
5. إرجاع الصورة إلى مكدس عادي (الصورة | | المكدسات الفائقة Hyperstack to Stack)، وقم بتقسيم النقاط الزمنية (الصورة | مكدسات | أدوات | مكدس الفاصل ). استخدم معالجة الدفعات لإنشاء أقصى قدر من الإسقاط لجميع النقاط الزمنية (| العملية | الدفعات الماكرو | run("Z Project...", "projection=[Max Intensity]"); ).
6. استيراد تسلسل الصور بفاصل زمني (ملف | | الاستيراد تسلسل الصور). استخدم أدوات ImageJ التقليدية للتحليل المطلوب للفيديو ثنائي الأبعاد (2D) غير المعقد والمعالج بعد المعالجة.
   ملاحظة: يمكن عرض مقاطع الفيديو رباعية الأبعاد (3D + time) غير المعقدة والمصححة للانحراف على أنها مكدس فائق. حذف الخطوة السابقة للحفاظ على النقاط الزمنية 3D.

باستخدام البروتوكول أعلاه ، تم الحصول على فيديو 3D عالي الدقة لتطوير تشعبات خلايا الانفجار النجمي ، وتفكيكها ، وتصحيحها للانجراف 3D. تم إنتاج إسقاطات قصوى على مستوى Z لإنشاء مقاطع فيديو ثنائية الأبعاد للتحليل (الفيديو التكميلي 1 ، الشكل 5A). زاد الالتفاف ثلاثي الأبعاد لكل نقطة زمنية من دقة إسقاطات الفيلوبوديا الدقيقة (الشكل 5B ، C). نتوءات الفيلوبوديا الدقيقة هي سمة من سمات تطوير تشعبات ^{الشبكية36} ويجب أن تكون مرئية أثناء التصوير. سيؤدي نقل AAV إلى حدوث تباين في كثافة وضع العلامات على الخلايا وشدة التألق. وبالتالي ، قم بفحص الأنسجة المصنفة لتحديد الخلايا ذات الإشارات الفلورية العالية للتصوير وإنتاج مقاطع فيديو عالية الجودة. لا ينصح بزيادة قوة الليزر للكشف عن الخلايا ذات العلامات الخافتة ، لأنها يمكن أن تؤدي إلى تبييض ضوئي سريع وإدخال ضوضاء عالية مقارنة بالإشارة. الخلايا الساطعة بما فيه الكفاية مرئية في حدود 5 نقاط في البوصة. بحلول 12 نقطة في البوصة وما بعدها ، لا تؤدي فترات عدوى AAV المطولة بالضرورة إلى زيادة تألق الخلايا المصنفة (الشكل 5D).

يؤثر التألق المفرط وازدحام الخلايا العصبية الناتجة عن وضع العلامات على الخلايا الكثيفة على جودة الصورة ويمكن أن يعيق إعادة بناء الخلية الواحدة. مطلوب تحسين تخفيف AAV وحجمه لتحقيق الدرجة المطلوبة من العرش المعزول والمصنف بالفلورسنت والذي يمكن فصله عن بقية سكان الخلايا المستهدفة. هنا ، تم حقن 9.2 × 108-1.8 × ¹⁰⁹ GCs الفيروسية لكل عين لاستهداف خلايا amacrine الانفجار النجمي (0.23-0.45 ميكرولتر من AAV مع عيار 4 × ¹⁰¹² GC / mL). قد يعكس عدم وجود إشارة فلورسنت تقنية حقن غير فعالة. أثناء الحقن ، يشير تسرب محلول AAV الأزرق من موقع الحقن إلى أن الفيروس لا يتم تسليمه إلى شبكية العين ، أو أن حجم الحقن أو الضغط مرتفع للغاية. يمكن أن يسبب حجم الحقن الزائد أو الضغط الزائد انفصال الشبكية و / أو فقدان ضغط العين ، مما يؤدي إلى إتلاف خلايا الشبكية وتقليل كفاءة وضع العلامات على الخلايا. يمكن حل كلتا المشكلتين من خلال الممارسة وتحسين تقنية الحقن. تشمل الأسباب المحتملة الأخرى لعدم وجود إشارة تدهور AAVs من التخزين غير السليم أو تعبير Cre غير الكافي لأن الجين الجيني Cre غير نشط خلال فترة نقل AAV.

بمجرد فك تعقيد مقاطع الفيديو ، يمكن إجراء تحليلات ديناميكية ، مثل حساب معدلات إضافة الفرع أو التراجع أو التثبيت. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء التحليل الثابت التقليدي في كل إطار زمني ، بما في ذلك إعادة بناء الخلايا العصبية والكميات المورفومترية مثل إجمالي طول الفرع أو زوايا الفرع أو ترتيب الفرع أو عدد نقاط الفرع الطرفية. نتيجة هذا البروتوكول هي سلسلة زمنية من مكدسات الصور 3D عالية الدقة. يتم تحديد معظم مقاطع الفيديو الديناميكية العصبية ثلاثية الأبعاد يدويا كإسقاط أقصى باستخدام برنامج تصور صور مفتوح المصدر مثل ^ImageJ37. تم تطوير أداة أخرى مفتوحة المصدر ، ^Vaa3D38 ، خصيصا لتصور الكميات الكبيرة. إذا كان من المقرر تحليل مقاطع الفيديو في 3D ، فمن المستحسن استخدام مصور 3D + time مثل Vaa3D. تسمح ImageJ و Vaa3D بالوصول المباشر إلى وحدات البكسل أو voxels في الصورة ، ولكن غالبا ما يتم إنشاء عمليات إعادة بناء الخلايا العصبية عن طريق تحويل بيانات البكسل إلى عمليات إعادة بناء شجرة هيكلية. يمكن إجراء عمليات إعادة بناء الخلايا العصبية التلقائية أو شبه الآلية للنقاط الزمنية الفردية باستخدام برامج مفتوحة ^{المصدر39}،^40،41 وبرامج احتكارية. لتحليل عمليات إعادة الإعمار بالفاصل الزمني ، يجب ربط كل نقطة في إعادة الإعمار بالنقاط الزمنية السابقة واللاحقة. ولا تزال محاذاة المورفولوجيات المتغصنة المعقدة بمرور الوقت، والتي يمكن ترميزها بأكثر من 500 نقطة بيانات، تمثل مشكلة صعبة. تتوفر العديد من الأدوات ، مع نقاط قوة وقيود مختلفة ، ويجب اختيارها لتناسب التحليلات اللازمة للدراسة.

الشكل 5: النتائج التمثيلية بعد الحقن داخل العين لحديثي الولادة، والتصوير بالفاصل الزمني، وإزالة الالتفاف. (أ) الإسقاطات القصوى لسلسلة التصوير بالفاصل الزمني غير المعقدة (h:min) لخلية أماكرين P6 النجمية بعد 5 أيام من حقن AAV. يمكن الآن تحليل ديناميكيات الفيلوبوديا الدقيقة باستخدام أدوات ImageJ التقليدية. يتم تمييز منطقة من الصقل الشجيري (الصندوق الأحمر) ومنطقة من النمو الشجيري (الصندوق الأخضر). (ب، ج) تظهر خلية أماكرين أحادية الانفجار النجمي P6 موسومة بغشاء eYFP بعد 5 أيام من حقن AAV (dpi) وضع علامات أحادية الخلية ساطعة. أشرطة المقياس للألواح العلوية = 50 ميكرومتر ؛ أشرطة المقياس للألواح السفلية = 25 ميكرومتر. قبل (A) وبعد (B) إزالة الالتفاف مع ImageJ. تظهر الإعدادات الداخلية (الحمراء) إزالة الضبابية نتيجة لإزالة الالتفاف الناجحة. (D) P6 starburst amacrine cell 5dpi (يسار) مقارنة ب P12 starburst cell 11 dpi تظهر مستويات مماثلة من التعبير عن البروتين الفلورسنت. زيادة أوقات حضانة AAV لا تزيد من إشارة الفلورسنت. لا تنخفض إشارات الفلورسنت مع فترات عدوى AAV أطول. تم تطبيق معلمات الاكتساب والمعالجة اللاحقة المتطابقة على كلتا الصورتين. زيادة سمك الفرع والدوالي التي لوحظت في P12 هي سمات طبيعية لخلايا الانفجار النجمي الناضجة وليست قطعة أثرية لوضع العلامات أو التصوير. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: AAV = الفيروس المرتبط بالغدية; eYFP = بروتين الفلورسنت الأصفر المحسن. نقطة في البوصة = أيام ما بعد الإصابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: اعتبارات اختيار خط كري وتوطين البروتين الفلورسنت.

(أ-دال) خلايا العقدة الشبكية الحية P11 التي تم تصويرها عند 9 نقاط في البوصة من BBV تم حقنها في الفئران Vglut2-iRES-Cre ، حيث يتم التعبير عن Cre بشكل انتقائي في مجموعة RGC. (أ) JAM-B RGC الذي تم تحديده من خلال مورفولوجيته غير المتماثلة المميزة ²⁴. (ب-د) أنواع فرعية RGC متميزة تختلف في أنماط التقسيم الطبقي للتشعبات. (ه) صورة لخلية أماكرين الحية P11 النجمية المنقولة بيولوجيا باستخدام mCherry الخلوي والتقاطها باستخدام قرص دوار متحد البؤرة عند 512 × 512 بكسل. يؤدي XFP الخلوي إلى إشارة فلورية عالية في السوما بالنسبة للنتوءات الشجيرية الدقيقة. يتسبب الضوء خارج نطاق التركيز البؤري الصادر عن السوما في تألق عالي الخلفية عند تصوير الإسقاطات القريبة الصغيرة (يظهر في المربع الأحمر أعلاه أدناه). (F) صورة لخلية أماكرين P11 النجمية الحية المنقولة باستخدام eYFP المستهدفة بالغشاء والتي تم التقاطها بواسطة المسح الضوئي بالليزر البؤري بدقة 1024 × 1024 بكسل. لاحظ حلقة الغشاء الفلوري حول السوما ، وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، وجودة الإسقاطات الدقيقة القريبة من السوما التي تنتجها البروتينات الفلورية المستهدفة بالغشاء (inset). أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر وبالنسبة للألواح السفلية من E و F = 5 ميكرومتر. الاختصارات: IRES = موقع إدخال الريبوسوم الداخلي; BBV = فيروس قوس قزح الغدي المرتبط ب Brainbow ؛ Vglut2 = ناقل الغلوتامات الحويصلي 2 ؛ XFP = أي بروتين فلورسنت. eYFP = بروتين الفلورسنت الأصفر المحسن. mCherry = الكرز الأحادي ؛ RGC = خلايا العقدة الشبكية; JAM-B = جزيء التصاق الوصلة B. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

فيديو تكميلي 1: فيديو بفاصل زمني ل P6 يطور تشعبات أماكرين نجمية ، بعد 5 أيام من الحقن. الخطوة الزمنية للفيديو هي 2 دقيقة. تم تطبيق Deconvolution وتصحيح الانجراف 3D باستخدام ImageJ. تسلط المربعات الصفراء العلوية الضوء على مناطق النمو ، ويحدد المربع السفلي منطقة نمو الفيلوبوديا العابرة ، والاتصال الذاتي ، والتراجع. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الملف التكميلي 1: ImageJ الماكرو لدفعة الالتفاف التكراري المتوازية. يقوم الماكرو بتشغيل 25 تكرارا لخوارزمية Wiener Filter Landweber (WPL) التكرارية المشروطة مسبقا. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

يوضح هذا الفيديو خط أنابيب تجريبي يستخدم الأدوات الجينية الحالية لتصوير ديناميكيات التشعبات لتطوير الخلايا العصبية الشبكية مع التصوير الحي البؤري. كما أظهرت الحقن داخل العين من AAVs المعتمدة على Cre التي تشفر البروتينات الفلورية المستهدفة بالغشاء في الفئران حديثي الولادة. يتم تصنيف الخلايا المفردة من السكان المستهدفين وراثيا بشكل مشرق في وقت مبكر من 4-5 نقطة في البوصة. تم إعداد حوامل مسطحة شبكية العين لغرف التصوير القياسية لإجراء التصوير البؤري للخلايا الحية. تنتج هذه الطريقة مقاطع فيديو عالية الدقة بفاصل زمني للخلايا المفردة وإسقاطاتها الدقيقة. يتم حل الإسقاطات الصغيرة وتحديدها كميا باستخدام خوارزميات إزالة الالتفاف وما بعد المعالجة المتاحة من خلال برامج مفتوحة المصدر ، بما في ذلك ImageJ و Vaa3D و ShuTu ، بالإضافة إلى البرامج المرخصة المتاحة من Imaris و MBF Bioscience. نظرا لأن خط الأنابيب هذا معياري ، يمكن تغيير كل قسم من أقسام البروتوكول ليناسب أهداف الدراسة. تتم مناقشة هذه العناصر المعيارية أدناه وتشمل: 1) اختيار خط كري ، 2) اختيار البروتين الفلوري والبناء الفيروسي ، 3) طرق توصيل الجينات ، و 4) طريقة التصوير.

تستخدم هذه التقنية خطوط كري المعدلة وراثيا للوصول الجيني إلى المجموعات الفرعية لخلايا الشبكية. يجب أن يكون Cre نشطا بعد الولادة ويتم التعبير عنه عبر مجموعة الخلايا في وقت الحقن لزيادة احتمال العدوى الفيروسية ووضع العلامات على الخلايا. في هذا التقرير ، تم استخدام ChAT-Cre لاستهداف خلايا amacrine النجمية ، وتم استخدام خط Vglut2-Cre لاستهداف RGCs ^{النامية42,43} (الشكل 6). حقن AAV المعتمد على Cre في Vglut2-IRES-Cre الفئران التي تم تصنيفها على مجموعة متنوعة من RGCs ، بما في ذلك جزيء الالتصاق الوصلة B الخلية (الشكل 6A) و RGCs ثنائية الطبقات (الشكل 6B ، C). وبدلا من ذلك، يمكن للتصميمات الجديدة ل AAVs مع المروجين الاصطناعية التي تدفع التعبير الخاص بنوع الخلية أن يلغي الحاجة إلى خطوط كري المعدلة ^{وراثيا44}. هناك اعتبار آخر لوضع العلامات الفعالة والساطعة المناسبة للتصوير الحي وهو الحد الأدنى من الوقت اللازم للنقل والتعبير ، والذي يمكن أن يختلف اعتمادا على النمط المصلي AAV ، والاستوائية ، و ^titer45. في هذه الدراسات ، نظرا لأن وضع العلامات بوساطة AAV يتطلب ما لا يقل عن 4-5 نقطة في البوصة لتعبير XFP ، فإن هذه الطريقة ليست مناسبة للوصول إلى النقاط الزمنية المبكرة بعد الولادة. لالتقاط النقاط الزمنية المبكرة (على سبيل المثال، P0-P4)، يمكن إجراء الحقن داخل العين في الرحم في الحيوانات الجنينية، كما هو الحال في الرحم الكهربائي ⁴⁶. في دراسات هذه المجموعة حول تطور تغصنات الانفجار النجمي ، تم استغلال نمط إعادة التركيب الأولي المتناثر ل ChAT-Cre لتسمية خلايا أماكرين أحادية الانفجار النجمي في P0-P4 باستخدام مراسل Cre المعدل وراثيا للفأر ، Rosa-mTmG27. وأخيرا، يمكن استخدام بروتوكول حقن الشبكية AAV هذا لتصنيف مجموعات الخلايا البالغة، استنادا إلى تأكيد استمرار وضع العلامات الفلورية بعد 3 أشهر من الحقن دون آثار ضارة على مورفولوجيا خلايا الانفجار ^{النجمي34}.

يسمح خط الأنابيب هذا أيضا بالمرونة في اختيار البنية الفيروسية. لالتقاط ديناميكيات التشعبات ، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من بروتينات المراسل الفلورسنت ، بما في ذلك البروتينات التي تتمركز في هياكل دون خلوية محددة ، أو البروتينات ذات الأهمية ، أو الإبلاغ عن التغيرات الوظيفية مثل ديناميكيات الأكتين (على سبيل المثال ، LifeAct) وإشارات الكالسيوم (على سبيل المثال ، GCaMP). يمكن استخدام أي متجه AAV متاح تجاريا أو مستنسخ ، ويجب الرجوع إلى الأدوات عبر الإنترنت مثل fpbase.org من أجل السطوع والاستقرار الضوئي. هنا ، تم استخدام ناقلات فيروس Brainbow التي تشفر البروتينات الفلورية بزخارف H-Ras farnesylation CAAX لتوطين الغشاء. في وقت مبكر من تطوير البروتوكول ، وجد أن التوطين الخلوي ل XPFs ليس مثاليا لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية الدقيقة ، مع تشبع مفرط للإشارات من السوما ووضع علامات سيئة على الفروع الدقيقة (الشكل 6E). وبالمقارنة، تبين أن البروتينات الفلورية المستهدفة بالأغشية تقوم بتسمية وحل النتوءات الشجيرية الدقيقة (الشكل 6E، F). هناك اعتبار آخر هو حجم وتصميم وتعقيد البنية الفيروسية ، والتي يمكن أن تؤثر على وقت التعبير. على سبيل المثال ، تم إنشاء AAV-CAG-FLEx-mClover3-CAAX ، والذي يعبر عن XFP واحد بطريقة تعتمد على Cre. يتميز هذا التصميم بتصميم أبسط ، وينتج عنه تعبير فعال بمقدار 4 نقاط في البوصة. معا ، فإن الخيارات المتنوعة لخطوط Cre ، وتصميمات AAV ، ومراسلي البروتين الفلوري المتاحين على نطاق واسع من المستودعات (على سبيل المثال ، JAX و Addgene و Viral Vector Cores) تجعل خط الأنابيب هذا قابلا للتكيف مع مجموعة متنوعة من الدراسات حول أنواع الخلايا والظواهر التنموية في شبكية العين.

على الرغم من أن هذا البروتوكول يفصل حقن AAV داخل العين، إلا أن طرق توصيل الجينات الأخرى متوفرة مثل الكهربية البلازميدية46 وتوصيل الجينات الحيوية (على سبيل المثال، Gene Gun)⁷. يتطلب الفحص الكهربائي تطبيق نبضة كهربائية ، ويتطلب توصيل الجينات الحيوية حضانة خارج الجسم الحي لخلايا شبكية العين. وضع علامات AAV أقل توغلا من هاتين الطريقتين ويسمح بالاستعدادات الحادة لخلايا الشبكية قبل التصوير مباشرة. بالمقارنة مع توصيل الجينات الحيوية (الشكل 6E ، F) ، أدت حقن AAV إلى تعزيز صلاحية الأنسجة التي كانت أكثر ملاءمة للاكتساب المستمر اللازم لتتبع ديناميكيات الأعصاب. باستخدام التقنية المناسبة ، لا يشكل وضع علامات AAV سوى القليل من الضرر أو لا يشكل أي ضرر على شبكية العين ، كما هو موضح في صحة الأنسجة في وقت التشريح. تصيب الحقن داخل الجسم الزجاجي في المقام الأول الخلايا داخل طبقة الخلايا العقدية والطبقة النووية الداخلية ، مثل RGCs وخلايا أماكرين. عادة ما يتم تصنيف العديد من العشرات من خلايا أماكرين الانفجار النجمي ، مع زيادة كثافة الخلايا المصنفة حول رأس العصب البصري (الشكل 4C). ومع ذلك ، مع جميع طرق النقل الثلاث ، لا مفر من قطع العصب البصري للحصول على عمليات استئصال الشبكية وسيؤدي إلى تنكس RGC. على الرغم من قطع العصب البصري ، تشير الدراسات إلى أن الشبكية قابلة للحياة تخرج من مجموعة متنوعة من نماذج الفقاريات لمدة 36 ساعة وما يصل إلى 6 أيام بعد النوى ⁵،⁶،^7،47،48.

وأخيرا، تم إثبات فائدة المجهر البؤري في التقاط ديناميات التشعبات. عادة ، تمتد جلسة التصوير على مدار 2-4 ساعات ، ويتم الانتهاء منها قبل ملاحظة تدهور الأنسجة أو الخفقان العصبي. تم إجراء جلسات تصوير تصل إلى 6 ساعات ؛ ومع ذلك ، لم يتم اختبار الحد الأعلى بشكل منهجي. قد تخضع المناطق للتبييض الضوئي بسبب التصوير لفترات طويلة ، لكن الخلايا في مجالات الرؤية الأخرى في الزرع تظل قابلة للحياة للتصوير الحي. يمكن أيضا توسيع هذه الطريقة لتشمل الفحص المجهري متعدد الفوتونات أو الصفائح الضوئية لتصوير مورفولوجيا الخلايا العصبية في طبقات أعمق وأحجام أكبر. تم إجراء التصوير متعدد الفوتونات لدراسة ديناميكيات الخلايا العصبية في شبكية العين الفأرية وهو أكثر ملاءمة لدراسة الخلايا في الصفيحة الشبكية العميقة (على سبيل المثال، الخلايا الأفقية أو المستقبلة للضوء)⁴⁹. في الآونة الأخيرة، تم استخدام المجهر الضوئي للخلايا الحية لالتقاط تولد الأوعية الدموية في ^{الشبكية50}، مما يوفر وسيلة جديدة للتصوير الحي للتشكل في شبكية العين بأكملها. يمكن استخدام المجهر الضوئي للخلايا الحية لدراسة تجميع الدوائر العصبية على نطاقات أكبر، مثل استهداف المحور العصبي. التصوير الحي متعدد الألوان هو تطبيق آخر لهذا الخط الذي يمكن استخدامه للتحقيق في التفاعلات بين الخلايا والخلايا ، مثل تأثير الخلايا المجاورة على تطور التشعبات أو الظواهر التنموية الأخرى مثل تبليط خلايا الشبكية بما في ذلك الأنواع الفرعية RGC ¹ ، الخلايا الدبقية الصغيرة ، والخلايا النجمية.

في الختام ، هناك جانب صعب من الدراسات التنموية هو الوصول إلى هذه النقاط الزمنية الحرجة. يوفر هذا البروتوكول طريقة لتصور التشكل الذي يحدث خلال نافذة زمنية محددة. يجمع خط الأنابيب بين الأدوات والتقنيات الحالية لاستهداف مجموعات الخلايا وراثيا والتعبير عن البروتينات الفلورية المستهدفة بالغشاء. تحافظ المستحضرات المسطحة الشبكية الحادة على الجدوى وإشارات الفلورسنت للتصوير البؤري للخلايا الحية على مدار عدة ساعات. يتم التقاط الجوانب العابرة والديناميكية لتطوير التشعبات في مقاطع فيديو 3D ويتم معالجتها لاحقا باستخدام برامج مفتوحة المصدر. تعد القدرة على التقاط مقاطع فيديو 3D عالية الدقة أمرا ضروريا في التحقيق في عمليات التطوير الديناميكية.

ليس لدى المؤلفين أي شيء للإفصاح عنه.

نشكر ماديسون غراي على إعطائي يد العون عندما لم يكن لدي أي يد. تم دعم هذا البحث من قبل منحة NSERC Discovery (RGPIN-2016-06128) ، وزمالة سلون في علم الأعصاب وكرسي أبحاث كندي من المستوى 2 (إلى J.L.L). تم دعم S. Ing-Esteves من قبل برنامج أبحاث علوم الرؤية ومنح NSERC للدراسات العليا - الدكتوراه.