JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש מבוסס טרנספורמציה מעוקל, קוד פתוח MATLAB תוכנה כלי לכימות ארגון קולגן fibrillar במטריצה חוץ תאית של רקמות נורמליות ומחלות כאחד. ניתן להחיל כלי זה על תמונות עם סיבי קולגן או סוגים אחרים של מבנים דמויי קו.

Abstract

קולגנים Fibrillar הם מרכיבים בולטים מטריצה חוץ תאית (ECM), ושינויים בטופולוגיה שלהם הוכחו להיות קשורים עם התקדמות של מגוון רחב של מחלות כולל השד, השחלות, הכליות, סרטן הלבלב. כלי תוכנה לכימות סיבים הזמינים באופן חופשי מתמקדים בעיקר בחישוב יישור סיבים או אוריינטציה, והם כפופים למגבלות כגון דרישה של צעדים ידניים, אי דיוק בזיהוי קצה הסיבים ברקע רועש, או חוסר אפיון תכונות מקומי. הכלי לכמות סיבי קולגן המתואר בפרוטוקול זה מאופיין בשימוש בייצוג תמונה רב-גווני אופטימלי המופעל על-ידי המרה מעוגלת (CT). גישה אלגוריתמית זו מאפשרת הסרת רעש מתמונות קולגן פיברילאר ושיפור קצוות הסיבים כדי לספק מידע מיקום והתמצאות ישירות מסיבים, במקום להשתמש במידע העקיף מבחינת פיקסלים או מבחינת חלונות המתקבל מכלים אחרים. מסגרת מבוססת CT זו מכילה שתי חבילות נפרדות, אך מקושרות, בשם "CT-FIRE" ו- "CurveAlign" שיכולות לכמת את ארגון הסיבים על בסיס גלובלי, אזור עניין (ROI) או סיבים בודדים. מסגרת כימות זו פותחה במשך יותר מעשר שנים וכעת התפתחה לפלטפורמת כימות קולגן מקיפה ומונעת על ידי משתמשים. באמצעות פלטפורמה זו, ניתן למדוד עד כשלושים תכונות סיבים כולל תכונות סיבים בודדים כגון אורך, זווית, רוחב וישירות, כמו גם מדידות בצובר כגון צפיפות ויישור. בנוסף, המשתמש יכול למדוד זווית סיבים יחסית לגבולות מחולקים באופן ידני או אוטומטי. פלטפורמה זו מספקת גם מספר מודולים נוספים, כולל מודולים לניתוח החזר על ההשקעה, יצירת גבולות אוטומטית ולאחר עיבוד. שימוש בפלטפורמה זו אינו דורש ניסיון קודם בתכנות או בעיבוד תמונה, והוא יכול להתמודד עם ערכות נתונים גדולות כולל מאות או אלפי תמונות, המאפשר כימות יעיל של ארגון סיבי קולגן עבור יישומים ביולוגיים או ביו-רפואיים.

Introduction

קולגני פיברילאר בולטים, מרכיבי ECM מבניים. הארגון שלהם משנה את תפקוד רקמת ההשפעה והם קשורים ככל הנראה עם התקדמות של מחלות רבות החל osteogenesis imperfecta1, תפקוד לקוי של הלב2, ואת הפצע ריפוי3 סוגים שונים של סרטן כולל השד4,5,6, השחלות7,8, כליות9, וסרטן הלבלב10. ניתן להשתמש באופני הדמיה מבוססים רבים כדי לדמיין קולגן פיברילאר כגון מיקרוסקופיה דור הרמוני שני11, כתמים או צבעים בשילוב עם מיקרוסקופיה שדה בהיר או פלואורסצנטי או מיקרוסקופ אור מקוטב12, מיקרוסקופ קיטוב מבוסס גביש נוזלי (LC-PolScope)13, ומיקרוסקופ אלקטרונים14. ככל שהחשיבות של ארגון קולגן פיברילאר הפכה ברורה יותר, והשימוש בשיטות אלה גדל, גדל גם הצורך בגישות משופרות לניתוח סיבי קולגן.

היו מאמצים רבים לפתח שיטות חישוביות למדידה אוטומטית של קולגן פיברילאר. כלי תוכנה זמינים בחופשיות מתמקדים בעיקר בחישוב יישור סיבים או אוריינטציה על ידי אימוץ טנזור נגזר או מבנה ראשון עבור פיקסלים15,16, או ניתוח ספקטרום מבוסס שינוי פורייה עבור אריחי תמונה17. כל הכלים הללו כפופים למגבלות כגון דרישה לשלבים ידניים, אי דיוק בזיהוי קצה הסיבים ברקע רועש או היעדר אפיון תכונות מקומי.

בהשוואה לכלי תוכנה חופשיים אחרים הזמינים באופן חופשי בקוד פתוח, השיטות המתוארות בפרוטוקול זה משתמשות ב- CT - שיטת ייצוג תמונה אופטימלית, רב-גוונית וכיוונית - כדי להסיר רעש מתמונות קולגן פיברילאר ולשפר או לעקוב אחר קצוות סיבים. ניתן לספק מידע על מיקום והתמצאות ישירות מסיבים ולא באמצעות המידע העקיף מבחינת פיקסלים או מבחינת חלונות כדי להסיק את המדדים של ארגון הסיבים. מסגרת מבוססת CT זו18,19,20,21 יכולה לכמת את ארגון הסיבים על בסיס גלובלי, החזר על ההשקעה או סיבים, בעיקר באמצעות שתי חבילות נפרדות, אך מקושרות, בשם "CT-FIRE"18,21 ו- "CurveAlign"19,21. בכל הנוגע ליישום התוכנה, ב- CT-FIRE, מקדמי CT על קשקשים מרובים יכולים לשמש לשחזור תמונה המשפרת קצוות ומפחיתה רעש. לאחר מכן, אלגוריתם מיצוי סיבים בודד מוחל על התמונה המשוחזרת על ידי CT כדי לעקוב אחר סיבים למציאת נקודות המרכז הייצוגיות שלהם, הרחבת ענפי סיבים מנקודות המרכז וקישור ענפי סיבים ליצירת רשת סיבים. ב- CurveAlign, מקדמי CT בקנה מידה שצוין על-ידי המשתמש יכולים לשמש למעקב אחר כיוון סיבים מקומי, שבו הכיוון והמיקומים של עקומות מופקים ומקובצים כדי להעריך את כיוון הסיבים במיקומים המתאימים. מסגרת כימות זו פותחה במשך יותר מעשר שנים והתפתחה מאוד בהיבטים רבים כגון פונקציונליות, ממשק משתמש ומודולריות. לדוגמה, כלי זה יכול לדמיין כיוון סיבים מקומי ומאפשר למשתמש למדוד עד שלושים תכונות סיבים כולל תכונות סיבים בודדים כגון אורך, זווית, רוחב וישירות, כמו גם מדידות בצובר כגון צפיפות ויישור. בנוסף, המשתמש יכול למדוד זווית סיבים יחסית באופן ידני או אוטומטי גבולות מקוטעים, אשר, למשל, ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות סמן ביולוגי מבוסס תמונה בסרטן השד22 ומחקרי סרטן הלבלב10. פלטפורמה זו מספקת מספר מודולי תכונות, כולל מודולים לניתוח החזר על ההשקעה, יצירת גבולות אוטומטית ולאחר עיבוד. ניתן להשתמש במודול ההחזר על ההשקעה כדי להוסיף ביאורים לצורות שונות של החזר ההשקעה ולבצע ניתוח החזר על ההשקעה המתאים. כדוגמה ליישום, מודול יצירת הגבולות האוטומטי יכול לשמש לרישום תמונות שדה בהירות של המטוקסילין ואאוסין (H&E) עם תמונות דור הרמוני שני (SHG) וליצור את מסכת התמונה של גבולות הגידול מתמונות H&E הרשומות. מודול שלאחר העיבוד יכול לסייע בעיבוד ואינטגרציה של קבצי נתוני פלט מתמונות בודדות לצורך ניתוח סטטיסטי אפשרי.

פלטפורמת כימות זו אינה דורשת ניסיון קודם בתכנות או בעיבוד תמונה ויכולה לטפל בערכות נתונים גדולות הכוללות מאות או אלפי תמונות, המאפשרות כימות יעיל של ארגון קולגן עבור יישומים ביולוגיים או ביו-רפואיים. זה כבר בשימוש נרחב בתחומי מחקר שונים על ידי חוקרים רבים בכל רחבי העולם, כולל את עצמנו. ישנם ארבעה פרסומים עיקריים על CT-FIRE ו CurveAlign18,19,20,21, מתוכם שלושת הראשונים צוטטו 272 פעמים (נכון ל 2020-05-04 על פי Google Scholar). סקירה של הפרסומים שציטטו פלטפורמה זו (CT-FIRE או CurveAlign) מצביעה על כך שיש כ -110 כתבי עת שהשתמשו בו ישירות לניתוח שלהם, שבו כ -35 פרסומים היו בשיתוף פעולה עם הקבוצה שלנו, והאחרים (~ 75) נכתבו על ידי קבוצות אחרות. למשל, פלטפורמה זו שימשה למחקרים הבאים: סרטן השד22,23,24, סרטןהלבלב 10,25, סרטן הכליה9,26, ריפוי פצעים3,27,28,29,30, סרטן השחלות8,31,7, רצועה הרחם32, hypophosphatemic dentin33, קרצינומה של תאי בזלת34, סרקומה היפוקסית35, רקמת סחוס36, תפקוד לקוי של הלב37, נוירונים38, גליובלסטומה39, התכווצויות לימפתיות40, cacffolds סיבי41, סרטןקיבה 42, microtubule43, ופיברוזיס שלפוחית השתן44. איור 1 מדגים את יישום ההדמיה של סרטן CurveAlign כדי למצוא את חתימות הקולגן הקשורות לגידול של סרטן השד19 מתמונת SHG. איור 2 מתאר זרימת עבודה סכמטית טיפוסית של פלטפורמה זו. למרות שכלים אלה נבדקו טכנית18,19,21, ופרוטוקול רגיל20 לניתוח יישור עם CurveAlign זמין גם, פרוטוקול חזותי המדגים את כל התכונות החיוניות יכול להיות שימושי. פרוטוקול חזותי, כפי שמוצג כאן, יקל על תהליך הלמידה של שימוש בפלטפורמה זו, כמו גם יתייחס בצורה יעילה יותר לחששות ולשאלות שעשויות להיות למשתמשים.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה מתאר את השימוש ב- CT-FIRE וב- CurveAlign לכימות קולגן. לשני כלים אלה יש מטרות עיקריות משלימות, אך שונות, והן מקושרות זו לזו במידה מסוימת. CT-FIRE יכול להיות משוגר מממשק CurveAlign לנהל את רוב הפעולות למעט ניתוח שלאחר עיבוד וההתחזור על ההשקעה מתקדמים. להפעלה מלאה של CT-FIRE, זה צריך להיות משוגר בנפרד.

1. דרישת אוסף תמונות ותמונה

הערה: הכלי יכול לעבד כל קובץ תמונה עם מבנים דמויי קו הקריאים על ידי MATLAB ללא קשר לאופן ההדמיה המשמש לאיסוףו.

  1. השתמש בגווני אפור של 8 סיביות כסוג התמונה כפרמטרים הפועלים המוגדרים כברירת מחדל מבוססים על תבנית זו.
    הערה: הדמיית SHG היא שיטת דימות קולגן פיברילאר ברזולוציה גבוהה ונטולת תוויות. תמונות SHG ממחקר סרטן השד19 ישמשו כאן לצורך הדגמה.

2. התקנת תוכנה ודרישת מערכת

הערה: הן גירסאות עצמאיות והן גירסאות קוד מקור זמינות באופן חופשי. גרסת קוד המקור דורשת התקנה מלאה של MATLAB כולל ארגזי כלים של עיבוד אותות, עיבוד תמונה, ניתוח סטטיסטיקה ומחשוב מקבילי. כדי להפעיל את גירסת קוד המקור, יש להוסיף לנתיב MATLAB את כל התיקיות הדרושות, כולל חלק מהמקורות של ספקים חיצוניים. השימוש ביישום העצמאי (APP) מומלץ עבור רוב המשתמשים, דבר הדורש התקנה של זמן ריצה של מהדר MATLAB (MCR) הזמין באופן חופשי בגירסה שצוינה. הליך ההתקנה וההפעלה של האפליקציה מתואר להלן.

  1. הורד CT-FIRE גירסה 3.0 (CTF3.0) ו CurveAlign גירסה 5.0 (CA5.0) APP חבילות מן https://eliceirilab.org/software/ctfire/ https://eliceirilab.org/software/curvealign/, בהתאמה.
    הערה: כל חבילה כוללת את היישום העצמאי, המדריך ותמונות הבדיקה.
  2. בצע את הדרישות המפורטות והוראות ההתקנה מאתרי האינטרנט לעיל כדי להתקין את MATLAB MCR 2018b.
  3. הפעל את האפליקציה.
    1. עבור מערכת של Windows 64 סיביות, לחץ פעמיים על סמל האפליקציה כדי להפעיל אותה.
    2. עבור מערכת Mac, בצע את השלבים הבאים כדי להפעיל אותה: לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על האפליקציה (הקישו ctrl) | הצג | תוכן חבילה | תוכן | MacOS השקה (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר פתח).
      הערה: פרטים נוספים ניתן לראות באתרי התוכנה המפורטים ב- 2.1.

3. מיצוי סיבים אישי עם CT-FIRE

הערה: CT-FIRE משתמש ב- CT כדי denoise את התמונה, לשפר את קצות הסיבים, ולאחר מכן משתמש באלגוריתם מיצוי סיבים כדי לעקוב אחר סיבים בודדים. אורך, זווית, רוחב וישירות מחושבים עבור סיבים בודדים.

  1. CT-FIRE על תמונה בודדת או תמונות מרובות
    1. הפעל את האפליקציה כמתואר ב- 2.3.
    2. לחץ על לחצן פתח קבצים בממשק המשתמש הגרפי הראשי (GUI, איור 3A)ולאחר מכן בחר תמונה/או ערימת תמונות אחת או יותר מחלון הבקשה. השתמש בטכניקה המתאימה למערכת ההפעלה כדי לבחור תמונות מרובות בתיבת הדו-שיח (לדוגמה, ב- Windows, החזק את מקש CTRL לחוץ בעת בחירת קבצים מרובים).
      הערה: אם נבחרו שני קבצי תמונה או יותר, כל התמונות חייבות להשתמש באותם פרמטרים פועלים לניתוח. ודא שכל התמונות נרכשות באותם תנאים או בתנאים דומים.
    3. בחר אפשרויות מחשוב מקבילי על-ידי סימון תיבת הסימון Parallel בפינה השמאלית העליונה לניתוח תמונות מרובות.
    4. לערימת התמונות, הזיזו את מחוון הפרוסה מתחת לתיבת רשימת הקבצים כדי לבחור את הפרוסה לניתוח.
    5. הגדר מאפיינים פועלים. השתמש בפרמטרי ברירת מחדל לניתוח ראשוני של תמונות מסוימות. אם אתה משתמש בפרמטרי ברירת מחדל, דלג לשלב 3.1.6. לקבץ פרמטרים שונים, לחצו על הלחצן 'עדכן' בחלונית 'פרמטרים'. בצע את המדריך כדי לכוונן כראוי את הפרמטרים.
      הערה: הפרמטרים המותאמים בתדירות הגבוהה ביותר כוללים את סף הרקע (thresh_im2) ואת רדיוס חיפוש התגרענות (s_xlinkbox). אם רמת רעשי הרקע גבוהה, הגדר thresh_im2 לערך גדול יותר; s_xlinkbox משויכת לרדיוס הממוצע של הסיבים, הגדר ערך קטן יותר לזיהוי סיבים דקים.
    6. לחץ על כפתור הפעלה.
      הערה: מידע ההתקדמות יוצג הן בחלון המידע והן בחלון הפקודה. לאחר השלמת הניתוח, תוצג טבלת הפלט (איור 3B).
    7. לחצו על פריט כלשהו בטבלת הפלט כדי לראות את ההיסטוגרמה של מידות הסיבים (איור 3C ואיור 3F)של התמונה, כולל אורך, רוחב, זווית וישירות.
      הערה: תמונות הסיבים עם סיבים מכוסים בתמונה המקורית יוצגו גם הן (איור 3E).
    8. בדוק את תיקיית המשנה בשם ctFIREout תחת תיקיית התמונה עבור קבצי הפלט, כולל קובץ ".tiff" של התמונה בשכבת-על, קובץ ".csv" וקובץ ".mat".
  2. ניתוח אזור עניין CT-FIRE (ROI)
    1. ביאור החזר על ההשקעה באמצעות מנהל ההחזר על ההשקעה
      1. לחצו על הלחצן 'פתח קבצים' ב-GUI הראשי (איור 3A)כדי לטעון תמונה אחת או יותר.
      2. בחר את התמונה שיש להוסיף לה ביאורים ברשימת הקבצים.
      3. בחרו במנהל ההחזרים על ההשקעה בתפריט הנפתח של החלונית 'אפשרויות החזר על ההשקעה'.
      4. לחצו על כפתור RUN להפעלת מודול מנהל ההחזרים על ההשקעה (איור 3A).
      5. ב- GUI של מנהל ההחזרים על ההשקעה (איור 4A), לחץ על התפריט הנפתח תחת צייר תפריטי החזר על ההשקעה(ד)כדי לצייר את ההחזרים על ההשקעה, בזה אחר זה.
        הערה: צורת ההחזר על ההשקעה יכולה להיות מלבן, ביד חופשית, אליפסה, מצולע או מלבן שצוין. בצע את ההוראות המופיעות על המסך כדי לצייר, לשמור ו לצאת ביאור החזר על ההשקעה.
      6. לאחר בחירת השיטה לציור ההחזר על ההשקעה, גרור את המלבן הצהוב המופיע בתמונה המקורית למיקום הרצוי ולאחר מכן לחץ על לחצן שמור החזר על ההשקעה או הקש על המקשים s כדי להוסיף החזר על ההשקעה לרשימת ההחזרים על ההשקעה. החזר החזר על ההשקעה זה יינתן באופן אוטומטי.
      7. צייר החזר על ההשקעה החדש על-ידי גרירת ההחזר על ההשקעה הקודם למיקום חדש ושמור אותו כפי שהוזכר ב- 3.2.1.6, או חזור על שלבים 3.2.1.5-3.2.1.6 כדי לצייר החזר החזר חדש על ההשקעה.
      8. האם להקיש x או לבחור החזר על ההשקעה החדש? בתפריט הנפתח של צורת ההחזר על ההשקעה כדי לצאת ביאור החזר על ההשקעה.
      9. סמן את תיבות הסימון הצג הכל ותוויות כדי להציג את כל ההחזרים על ההשקעה המוגדרים ברשימה ואת שמותיהם בתמונה המקורית.
      10. בחר את ההחזר על ההשקעה ברשימת ההחזרים על ההשקעה כדי לבצע פעולות בסיסיות של החזר ההשקעה, כולל שינוי שם החזר על ההשקעה, מחיקת החזר על ההשקעה, שמירת טקסט החזר על ההשקעה, טעינת החזר על ההשקעה מטקסט, שמירת מסיכת החזרעל ההשקעה , ושילוב החזרים על ההשקעה.
      11. בדוק את קובץ הפלט של מנהל ההחזר על ההשקעה שנשמר כקובץ ".mat" בתיקיית משנה בשם ROI_management תחת תיקיית התמונה המקורית.
      12. כדי להוסיף ביאורים לתמונה אחרת ברשימת הקבצים שנפתחו, חזור על שלבים 3.2.1.2–3.2.1.11.
      13. לאחר סיום הביאור, סגור את ממשק ה- GUI של מנהל ההחזר על ההשקעה ואפס את ממשק ה- GUI הראשי על-ידי לחיצה על לחצן איפוס ב- GUI הראשי.
    2. ניתוח החזר על ההשקעה עבור תמונה בודדת במנהל החזר ההשקעות
      1. אם מתבצע ניתוח CT-FIRE של תמונה מלאה והתוצאות נשמרות בספריית ברירת המחדל, לחץ על ההחזר על ההשקעה אחד או יותר ברשימת ההחזרים על ההשקעה ולאחר מכן לחץ על לחצן מנתח החזר ההשקעות של ctFIRE כדי להפעיל את מודול הניתוח שלאחר ההחזר על ההשקעה.
        הערה: התוצאות יישמרו באופן אוטומטי בתיקיית משנה הממוקמת ב- \\[תיקיית תמונות]\ CTF_ROI\בודד\ROI_post_analysis\.
      2. בחלון הנפתח, לחץ על לחצן בדוק סיבים כדי להציג סיבים בתוך ההחזרים על ההשקעה שנבחרו (איור 4B).
      3. לחץ על סטטיסטיקת התוויית נתונים כדי להציג היסטוגרמות של כל החזר על ההשקעה (איור 4C). נתוני הפלט המתאימים יוצגו.
      4. אם לא בוצע ניתוח CT-FIRE של תמונה מלאה, לחץ על ROIs אחד או יותר ברשימת ההחזרים על ההשקעה ולחץ על לחצן החל ctFIRE על החזר ההשקעה כדי להחיל ישירות ניתוח CT-FIRE על ההחזרים על ההשקעה שנבחרו.
      5. בצע את ההוראות בחלון הבקשה כדי להפעיל את הניתוח.
        הערה: הפרמטרים להפעלת ה- CT-FIRE מועברים דרך ממשק המשתמש הגרפי הראשי, והמשתמש יכול לעדכן את הפרמטרים הפועלים כמתואר בשלב 3.1.5 לפי הצורך. לאחר השלמת הניתוח, הנתונים הסטטיסטיים המסכמים של מדדי הסיבים יוצגו בטבלת הפלט. התוצאות יישמרו באופן אוטומטי בתיקיית משנה הממוקמת ב- \\[תיקיית תמונות]\ CTF_ROI\בודד\ROI_analysis\.
    3. ניתוח החזר על ההשקעה עבור תמונות מרובות באמצעות מנתח ההחזר על ההשקעה
      1. בצע את השלבים ב- 3.2.1 כדי להוסיף ביאורים להפעלה מחדש של ההחזרים על ההשקעה כדי שניתחו את התמונות.
      2. פתח תמונה אחת או יותר על-ידי לחיצה על לחצן פתח קבצים.
      3. להפעלת ניתוח פוסט החזר על ההשקעה כאשר תוצאות ניתוח התמונה המלאות זמינות, לחצו על התפריט הנפתח בחלונית 'אפשרויות הפעלה' ובחרו באפשרות מנתח CTF לאחר החזר ההשקעה.
      4. לחץ על כפתור RUN כדי להפעיל ניתוח החזר על ההשקעה עבור כל התמונות שנטענו.
      5. בדוק את מידע ההתקדמות המוצג בחלון ההודעה בתחתית ממשק משתמש הגרפי ובחלון הפקודה.
      6. לאחר השלמת הניתוח, בדוק את סטטיסטיקת הסיכום עבור כל החזר על ההשקעה המוצג בטבלת פלט.
        הערה: קבצי הפלט המפורטים נשמרים באופן אוטומטי בתיקיית משנה הממוקמת ב- \\ [תיקיית תמונות]\CTF_ROI\Batch\ROI_post_analysis\.
      7. כדי להפעיל ניתוח ישיר כאשר תוצאות ניתוח התמונה המלאות אינן זמינות, בצע את השלבים 3.2.3.1–3.2.3.6, פרט לכך שבשלב 3.2.3.3, בחר באפשרות CTF ROI לנתחr; בשלב 3.2.3.4, לפני לחיצה על לחצן RUN, עדכן את הפרמטרים הפועלים כמתואר בשלב 3.1.5. לאחר לחיצה על לחצן RUN, בחלון תיבת דו-שיח של בקשה, בחר בין החזר על ההשקעה המלבני למסכת החזר ההשקעה של צורה כלשהי.
        הערה: אם כל ההחזרים על ההשקעה המבוארים הם מלבניים, המשתמש יכול לבחור את "החזר על ההשקעה המלבני". בשלב 3.2.3.6, תוצאות ניתוח ההחזר על ההשקעה נשמרות בתיקיית משנה הממוקמת ב\ \\[תיקיית תמונות]\CTF_ROI\Batch\ROI_analysis\.
  3. לאחר העיבוד עם CT-FIRE
    הערה: לאחר ניתוח CT-FIRE הרגיל המתואר ב- 3.1, המשתמש יכול לבצע עיבוד נוסף לאחר. מבלי להפעיל שוב את מיצוי הסיבים הגוזל זמן רב, עיבוד קבוע, המתואר ב- 3.3.1, יכול לעדכן כמה תכונות של נתון פלט בסיסי, ואילו העיבוד שלאחר העיבוד המתקדם המתואר ב- 3.3.2 יכול לדמיין סיבים בודדים ואת המאפיינים שלהם, לבצע סף מורכב בין כל ארבעת מאפייני הסיבים, ליצור סטטיסטיקה מסכמת של הסיבים שנבחרו, ולהמחיש את הסיבים שנבחרו באמצעות מפת צבע מותאמת אישית.
    1. עיבוד קבוע לאחר עיבוד עם CT-FIRE
      1. הפעל את אפליקציית CT-FIRE, או לחץ על לחצן איפוס לאחר פעולות אחרות כדי לאתחל את ממשק ה- GUI הראשי של CT-FIRE (איור 3A).
      2. בדוק את תיבת הסימון .mat בחלק העליון של ממשק ה- GUI הראשי.
      3. לחץ על לחצן פתח קבצים כדי לבחור את קובץ הפלט .mat של CT-FIRE בתיקיית המשנה ctFIREout.
        הערה: אם נבחרו קבצים מרובים, תיבת הסימון אצווה תיבדק באופן אוטומטי. שם הקובץ של התמונות המתאימות יוצג ברשימת התיבות.
      4. עדכנו את האפשרויות בחלונית 'בקרת דמות פלט'.
      5. שמור את אפשרויות ברירת המחדל באפשרויות פלט, שיוודאו שכל קבצי הפלט יעודכנו בהתאם לקבוצה החדשה של הפרמטרים המוגדרת ב- 3.3.1.4.
      6. לחץ על לחצן לאחר העיבוד. בדוק את מידע ההתקדמות בחלון ההודעה בתחתית ממשק ה- GUI הראשי וכן בחלון הפקודה.
      7. לאחר השלמת הניתוח, לחץ על כל פריט בטבלת הפלט כדי לראות את ההיסטוגרמה של מידות הסיבים של התמונה כולל אורך, רוחב, זווית וישירות.
        הערה: קבצי פלט חדשים יחליפו את הקבצים הישנים בתיקיית המשנה ctFIREout.
    2. עיבוד מתקדם לאחר עיבוד של CT-FIRE
      1. הפעל את אפליקציית CT-FIRE, או לחץ על לחצן איפוס לאחר פעולות אחרות כדי לאתחל את ממשק ה- GUI הראשי של CT-FIRE (איור 3A).
      2. סמן את תיבת הסימון OUT.adv בחלק העליון של ממשק משתמש הגרפי הראשי (איור 3A).
      3. לחץ על לחצן לאחר העיבוד כדי להפעיל את ממשק המשתמש הגרפי המתקדם שלאחר העיבוד בשם "Analysis Module" (איור 5A).
      4. לחצו על הלחצן 'בחר קובץ' לבחירת תמונה.
      5. לחצו על הלחצן 'הצג סיבים חזותיים' להזנת מספר סיבים בהתבסס על התוויות באיור לשונית סיבים מקוריים.
        הערה: המידות של הסיבים שנבחרו יוצגו בטבלת פלט (איור 5B),והסיבים המתאימים יהיו מכוסים בתמונה המקורית המוצגת באיור הכרטיסייה הנקראת סיבים נמדדים (איור 5C).
      6. לחץ על לחצן אשר/עדכן כדי לעבור לפעולת הסף.
      7. סמן את תיבת הסף כדי להפוך את הגדרות הסף לזמינות.
      8. בחרו אחת מארבע אפשרויות הסף מהתפריט הנפתח.
      9. הזינו את הסף הרצוי בחלונית 'סף' למאפיינ סיב אחד או יותר.
      10. לחץ על לחצן סף עכשיו כדי להחיל את תנאי הסף לעיל.
      11. בדקו את האיור המנחה ששמו מסתיים בפריטים חזותיים של מדדים כדי לראות את הסיבים שנבחרו מכוסים בתמונות המקוריות עם מפות הצבע המותאמות אישית, כפי שמוצג באיור 5E.
      12. חזור על שלבים 3.3.2.9–3.3.2.11 כדי לקבוע את הסף הרצוי.
      13. לחצו על הלחצן 'שמור סיבים' לשמירת מידע הסיבים שנבחר.
        הערה: סיבים נבחרים תואמים יוצגו באיור הכרטיסיה שנקרא לאחר סף.
      14. לחץ על לחצן צור סטטיסטיקה ולאחר מכן לחץ על לחצן אישור בחלון המוקפץ כדי ליצור סטטיסטיקת סיכום.
        הערה: טבלת פלט (איור 5D) תציג את הערך הממוצע של הסיבים שנבחרו. נתונים סטטיסטיים אחרים של הסיבים שנבחרו יישמרו בקובץ Excel שמיקומו מוצג בחלון המצב בתחתית ממשק משתמש גרפי זה.
      15. כדי לכלול את פרטי הסיבים הבודדים שנבחרו בקובץ הפלט, סמן את התיבה צור גיליון נתונים גולמיים לפני לחיצה על לחצן אישור.
      16. כדי לשלב תוצאות מתמונות מרובות, בשלב 3.3.2.4, סמן את התיבה מצב אצווה או מצב מחסנית ובחר את התמונות או המחסניות המרובות שיש לנתח; דלג על שלבים 3.3.2.5–3.3.2.6. בשלבים 3.3.2.8-3.3.2.9, הגדר תנאי סף, אך מאחר שסף הלחצנים כעת וחיסכון בסיבים אינו זמין, דלג על שלבים 3.3.2.10–3.3.2.13; ולבסוף, בצע את ההוראות בשלב 3.3.2.14 כדי ליצור סטטיסטיקה מסכמת ומאפייני סיבים בודדים של הסיבים שנבחרו.

4. ניתוח סיבים עם יישור עקומה

הערה: CurveAlign פותחה בתחילה כדי למדוד באופן אוטומטי זוויות של סיבים ביחס לגבולות המוגדרים על-ידי המשתמש. ניתן להשתמש בגרסה הנוכחית של CurveAlign להערכת תכונות מבוססות צפיפות ויישור בצובר בנוסף למדידת הזווית היחסית על-ידי טעינת מידע הסיבים הבודד שחולץ על-ידי CT-FIRE או ישירות באמצעות הכיוון המקומי של העקומות. CurveAlign מחשבת עד שלושים תכונות הקשורות לתכונות גלובליות או מקומיות בעיקר כולל צפיפות ויישור, כמו גם תכונות סיבים בודדים כאשר CT-FIRE מאומצת כשיטת מעקב אחר סיבים.

  1. ניתוח סיבים עם עקומות
    1. הפעל את האפליקציה כמתואר ב- 2.3.
    2. לחץ על לחצן איפוס כדי לאפס את האפליקציה למצבה ההתחלתי אם בוצעו פעולות אחרות.
    3. ב- GUI הראשי (איור 6A), סמן את האפשרות שיטת ניתוח סיבים כדי לוודא שהאפשרות CT נבחרה (אפשרות ברירת המחדל).
      הערה: במצב זה, CT מבוצע בתמונה, והכיוון של כל עקומה מייצג את הכיוון של סיב במיקום המתאים.
    4. לחצו על התפריט הנפתח 'שיטת גבול' ובחרו במצב עיבוד הגבולות מתוך אפשרויות התפריט הנפתח הבאות: 'ללא גבול', 'גבול CSV' ו'גבול TIFF'.
      הערה: אם אין צורך בגבול, דלג על שלב זה. עיין ב- 4.3 כדי לחשב זוויות סיבים ביחס לגבול.
    5. לחצו על הלחצן 'קבל תמונות' ב-GUI הראשי (איור 6A),ולאחר מכן בחרו תמונה/או ערימת תמונות אחת או יותר מחלון ההנחיה. השתמש בטכניקה המתאימה למערכת ההפעלה כדי לבחור תמונות מרובות בתיבת הדו-שיח (לדוגמה, ב- Windows, החזק את מקש CTRL לחוץ בעת בחירת קבצים מרובים).
      הערה: אם נבחרו שני קבצי תמונה או יותר, כל התמונות חייבות להשתמש באותם פרמטרים פועלים לניתוח. ודא שכל התמונות נרכשות באותם תנאים או בתנאים דומים.
    6. לערימת התמונות, הזיזו את מחוון הפרוסה מתחת לתיבת רשימת הקבצים כדי לבחור את הפרוסה לניתוח.
    7. הזן את שבר הקופים לשמירה. ערך זה הוא החלק של המקדמים הגדולים ביותר של CT שישמשו בניתוח הסיבים.
      הערה: אם לתמונה יש וריאציה גדולה בעוצמת הסיבים או בניגודיות, ביאור אזורים מעניינים עם ניגודיות אחידה לניתוח הסיבים מכיוון שמצב זה מזהה רק את הסיבים הבהירים ביותר בתמונה. בנוסף, ככל שגודל התמונה גדול יותר, הגדר ערך קטן יותר עבור שבר זה.
    8. שמרו את כל הפרמטרים באפשרות 'אפשרויות פלט' ואחרים באפשרות 'מתקדם' כברירת המחדל; ייתכן שיהיה צורך בקבצי הפלט בפעולות עתידיות אחרות.
    9. לחצו על כפתור 'הפעלה' בתחתית ממשק ה-GUI הראשי (איור 6A).
      הערה: מידע ההתקדמות יוצג בחלון הודעה המסומן בצבע ירוק בתחתית. לאחר סיום התהליך, סטטיסטיקות סיכום מסוימות עבור כל תמונה יוצגו בטבלת הפלט (איור 6B),וכל קבצי הפלט יישמרו באופן אוטומטי בתיקיית משנה בשם CA_Out בספריה של התמונות המקוריות.
    10. לחצו על פריט כלשהו בטבלת הפלט (איור 6B)כדי לראות את ההיסטוגרמה (איור 6E)או את התוויית המצפן (איור 6F)של זוויות סיבים.
      הערה: תמונת הכיסוי (איור 6C) ומפת החום (איור 6D) של היישור או הזווית יוצגו גם הם.
    11. לחץ על לחצן איפוס כדי להפעיל פעולות אחרות, או סגור את ממשק ה- GUI הראשי כדי לצאת מהאפליקציה.
  2. ניתוח סיבים פרטני עם CT-FIRE
    הערה: ההליך זהה לזה המתואר בסעיף 4.1 למעט העובדה שבשלב 4.1.3, בחר במצב ניתוח סיבים הקשורים ל- CT-FIRE, ודלג על שלב 4.1.7 מכיוון שהוא אינו ישים והוא מושבת במצב CT-FIRE. באופן ספציפי, בשלב 4.1.3, בחר אחת מבין שלוש שיטות ניתוח הסיבים הבודדות הבאות המבוססות על CT-FIRE:
    1. בחר סיבי CT-FIRE כדי להשתמש בנקודת מרכז הסיבים ובזווית הסיבים כדי לייצג את הסיבים.
      הערה: אפשרות זו אינה מתחשבת בשינויים בכיוון הסיבים לאורך הסיבים.
    2. בחר נקודות קצה CT-FIRE כדי להשתמש בשתי נקודות הקצה של סיבים וזווית סיבים תואמת כדי לייצג את הסיבים.
      הערה: בהשוואה ל- 4.2.1, אפשרות זו משתמשת בשתי עמדות כדי לייצג סיבים במקום אחד (נקודת מרכז הסיבים).
    3. בחר מקטעי CT-FIRE כדי להשתמש במקטעים של סיבים כדי לייצג את הסיבים.
      הערה: לכל מקטע יש אורך שווה (מוגדר ל- 5 פיקסלים כברירת מחדל ב- CT-FIRE) כמו גם הכיוון והמיקום שלו, המשקפים את השינוי בכיוון לאורך כל הסיב. אפשרות זו תהיה גוזלת הזמן הרב ביותר, אך תהיה האפשרות הטובה ביותר מבין שלוש שיטות ניתוח הסיבים מבוססות CT-FIRE למעקב אחר שינויים בכיוון המקומי של סיב מפותל.
  3. ניתוח יישור יחסי עם גבול
    הערה: בהשוואה לניתוח הרגיל ללא תנאי גבול המתוארים בסעיפים 4.2 ו- 4.3, ניתוח יישור יחסי עם תנאי גבול דורש את הפעולות הבאות:
    1. בשלב 4.1.3, בחר את תנאי גבול ה- tiff.
      הערה: המשתמש יזדקק לקובץ גבול מתאים עבור כל תמונה או כל מחסנית. בצע את ההוראות שעל המסך כדי להוסיף ביאורים ידניים לקובץ גבול CSV (תבנית ערכים מופרדים באמצעות פסיקים המבוססת על קואורדינטות x-y) או לקובץ גבול של Tiff. קבצי הגבול שנוצרו ב- CurveAlign יישמרו באופן אוטומטי בהתאם לספריית הקבצים ולמוסכמות למתן שמות לקבצים המתוארות במדריך. אם מסופקים זוג תמונות של H&E בהיר שדה ו- SHG, השתמש במודול יצירת הגבולות האוטומטי המתואר בסעיף 4.4 כדי ליצור את קובץ הגבול.
    2. בחלונית 'פרמטרים ראשיים', הזינו את המרחק מהגבול הקרוב ביותר כדי להעריך רק את הסיבים בטווח מרחק זה.
    3. בחלונית 'אפשרויות פלט', סמן את תיבת שיוך הגבולות Bdry Assoc כדי להציג באופן חזותי את הנקודה בגבול המשויכת לסיבים, למקטע סיבים או לעקומה.
  4. יצירת גבולות אוטומטית
    1. הפעל את האפליקציה כמתואר ב- 2.3.
    2. לחץ על לחצן איפוס כדי לאפס את האפליקציה למצבה ההתחלתי אם פעולות אחרות כבר בוצעו.
    3. לחץ על כפתור יצירת BD כדי להפעיל את מודול יצירת הגבולות האוטומטי.
    4. בצע את ההוראות/רמזים שעל המסך כדי ליצור קובץ גבול עבור תמונה אחת או יותר המבוססת על זוג תמונות H&E בהירות ותמונות SHG.
    5. סגור את חלון המודול, או לחץ על לחצן איפוס ב- GUI הראשי (איור 6A) כדי לצאת מודול זה.
  5. אזור יישור עקומה של ניתוח ריבית
    1. ביאור החזר על ההשקעה באמצעות מנהל ההחזר על ההשקעה
      1. לחצו על הלחצן 'קבל תמונות' ב-GUI הראשי (איור 6A)כדי לטעון תמונה אחת או יותר.
      2. בחר את התמונה שיש להוסיף לה ביאורים ברשימת הקבצים.
      3. לחץ על מנהל ההחזר על ההשקעה כדי להפעיל את מודול מנהל ההחזר על ההשקעה (איור 7A).
      4. בצע את השלבים 3.2.1.5-3.2.1.13 בסעיף 3.2.1.
    2. ניתוח החזר על ההשקעה עבור תמונה בודדת במנהל החזר ההשקעות
      1. אם בוצע ניתוח CurveAlign של תמונה מלאה והתוצאות נשמרות בספריית ברירת המחדל, לחץ על ההחזר על ההשקעה אחד או יותר ברשימת ההחזרים על ההשקעה ולאחר מכן לחץ על לחצן מנתח החזר ההשקעה של רשות האישורים כדי להפעיל ניתוח שלאחר החזר ההשקעה.
        הערה: לאחר השלמת הניתוח, סטטיסטיקת סיכום תוצג בטבלת פלט (איור 7C) וכן באיור היסטוגרמה (איור 7D) המציג את התפלגות הזווית.
      2. לחץ על פריט כלשהו בטבלת הפלט כדי לדמיין את הסיבים בהו"ר נתון (איור 7B)כמו גם את ההיסטוגרמה של זוויות הסיבים.
      3. בדוק את קבצי הפלט שנשמרו בתיקיית משנה הממוקמת ב- \\[תיקיית תמונה]\ CA_ROI\בודד\ROI_post_analysis\.
      4. אם לא בוצע ניתוח של רשות אישורים עם תמונה מלאה, לחץ על ההחזר על ההשקעה אחד או יותר ברשימת ההחזרים על ההשקעה ולחץ על לחצן החל רשות אישורים על החזר ההשקעה כדי להחיל ישירות ניתוח של רשות אישורים על ההחזרים על ההשקעה שנבחרו. בצע את ההוראות בחלון הבקשה כדי להפעיל את הניתוח.
        הערה: הפרמטרים להפעלת ניתוח רשות האישורים מועברים דרך ממשק ה- GUI הראשי; עדכן את הפרמטרים הפועלים המתוארים בשלב 4.1.7 לפי הצורך. לאחר השלמת הניתוח, יוצגו בטבלת הפלט תוצאות סטטיסטיקת הסיכום של מדדי הסיבים. התוצאות יישמרו באופן אוטומטי בתיקיית משנה הממוקמת ב- \\[תיקיית תמונות]\ CA_ROI\בודד\ROI_analysis\.
    3. ניתוח החזר על ההשקעה עבור תמונות מרובות באמצעות מנתח ההחזר על ההשקעה
      1. בצע את השלבים ב- 4.5.1 כדי להוסיף ביאורים להפעלה מחדש של ההחזרים על ההשקעה כדי שניתחו את התמונות.
      2. פתח תמונה אחת או יותר על-ידי לחיצה על לחצן קבל תמונות.
      3. כדי להפעיל ניתוח פוסט החזר על ההשקעה כאשר תוצאות ניתוח התמונה המלאות זמינות, לחץ על לחצן ניתוח החזר על ההשקעה ובחר באפשרות החזר על ההשקעה לאחר העיבוד.
      4. בדוק את מידע ההתקדמות המוצג בחלון ההודעה בתחתית ממשק משתמש הגרפי ובחלון הפקודה.
      5. לאחר השלמת הניתוח, בדוק את סטטיסטיקת הסיכום עבור כל החזר על ההשקעה המוצג בטבלת פלט.
        הערה: קבצי הפלט המפורטים נשמרים באופן אוטומטי בתיקיית משנה הממוקמת ב- \\ [תיקיית תמונות]\CA_ROI\Batch\ROI_post_analysis\.
      6. כדי להפעיל ניתוח ישיר עם מצב CT כאשר תוצאות ניתוח התמונה המלאות אינן זמינות, בצע את שלבים 4.5.3.1–4.5.3.5, למעט השינויים הבאים: שנה את שלב 4.5.3.3 על-ידי בחירת האפשרות CA על החזר על ההשקעה המלבנית שנחתכה או CA במסיכה עם החזר על ההשקעה בכל צורה שהיא. אם כל ההחזרים על ההשקעה המבוארים הם צורה מלבנית, בחר באפשרות החזר על ההשקעה המלבני. לאחר שלב 4.5.3.2, עדכן את הפרמטרים הפועלים, כמתואר ב- 4.1.7.
        הערה: תוצאות ניתוח ההחזר על ההשקעה יישמרו בתיקיית משנה הממוקמת ב- \\ [תיקיית תמונות]\CA_ROI\Batch\ROI_analysis\.
  6. לאחר עיבוד של יישור עקומה
    1. הפעל את האפליקציה כמתואר בסעיף 2.3.
    2. לחץ על לחצן איפוס כדי לאפס את האפליקציה למצבה ההתחלתי אם פעולות אחרות כבר בוצעו.
    3. לחץ על כפתור שלאחר העיבוד כדי להפעיל את מודול לאחר העיבוד.
    4. בצע את ההוראות/רמזים שעל המסך כדי לשלב את תכונות הפלט או הערכים מתמונות שונות.
    5. סגור את חלון המודול, או לחץ על לחצן איפוס ב- GUI הראשי (איור 6A) כדי לצאת מודול זה.

5. זמן ריצה משוער

  1. המתן את זמן הריצה המשוער לעיבוד תמונה בגודל של 1024 פיקסלים x 1024 פיקסלים עם צפיפות סיבים מתונה. הזמן החישובי בפועל תלוי בדרך כלל בגורמים מרובים, כולל גודל הקובץ, מצב הניתוח, התכונות לפריסה, סוג יחידת העיבוד המרכזית (CPU) וכמות זיכרון הגישה האקראית (או RAM) הזמין. מיצוי סיבים פרטני CT-FIRE לוקח כמה דקות. עיקול מצב CT ללא גבול אורך מספר שניות. עקומהמיון סיבי CT-FIRE או מצב קצוות סיבים ללא גבול לוקח עשרות שניות. עקומהמיון מצב סיבי CT-FIRE ללא גבול לוקח מאות שניות. ניתוח יישור עקומה עם גבול אורך עשרות שניות עד מספר דקות, בהתאם למורכבות הגבולות.

תוצאות

שיטות אלה יושמו בהצלחה במחקרים רבים. כמה יישומים אופייניים כוללים: 1) Conklin et al.22 השתמשו CurveAlign כדי לחשב חתימות קולגן הקשורות לגידול, ומצא כי סיבי קולגן היו מיושרים לעתים קרובות יותר בניצב להיקף צינור קרצינומה צינורית במקום (DCIS) נגעים; 2) Drifka et al.10 השתמשו במצב CT-FIRE ב CurveAlign כדי לכמת את יישור קולגן stromal עבור אדנוקרצינומה צינורית הלבלב ורקמות דלקת לבלב נורמלית / כרונית, ומצא כי היה יישור מוגבר ברקמות סרטן לעומת זה ברקמות נורמליות / כרוניות; 3) Alkmin et al.7 השתמשו CurveAlign לכמת את ההתפלגות הזוויתית של סיבי F-actin ויישור קולגן הכולל מן התמונות SHG של קולגן סטרומה השחלות, והראה כי מורפולוגיה מטריצה ממלא תפקיד חשוב בהנעת תנועתיות התא יישור F-actin; 4) LeBert et al.3 להחיל CT-FIRE על תמונות SHG של מודל תיקון פצע זברה ומצא עלייה בעובי של סיבי קולגן לאחר פציעה חריפה; 5) Devine et al.45 השתמשו במצב CT-FIRE ב CurveAlign עבור תמונות SHG של קולגן קיפול קולי מדגמים שונים של בעלי חיים כדי למדוד תכונות סיבים בודדים יישור כללי, והראה כי קולגן קיפול ווקאלי חזירי וכלבים היה יישור גבוה יותר ישר נחות; 6) Keikhosravi et al.13 השתמשו CurveAlign לכמת יישור קולגן בדגימות היסטופתולוגיה בתמונה עם LC-PolScope, והראה כי LC-PolScope ו SHG דומים במונחים של יישור מדידת אוריינטציה עבור סוגים מסוימים של רקמה.

figure-results-1457
איור 1: שימוש ב- CurveAlign כדי למצוא חתימות קולגן הקשורות לגידול מתמונות SHG של מיקרו-סדרה של רקמת סרטן השד האנושי (TMA). (A) תמונת שכבת-על של ליבת TMA עם תמונת SHG (צהובה) מכוסה בתמונת השדה הבהיר H&E המתאימה. (B)אזור העניין של(A). (C) תמונת השדה הבהיר של (B). (D)תמונת SHG של (B). (F) המסיכה המשויכת לתמונת השדה הבהיר (C). (ה)תמונת שכבת-העל של הפלט CurveAlign המציגה את גבולות הגידול (צהוב) מ- (F), מיקומי סיבים מייצגים וכיוון (קווים ירוקים); הקווים הכחולים משמשים לשייך סיבים לגבולות הקרובים ביותר שלהם. החצים הירוקים ב- (B) ו - (E) מציגים את הסיבים המקבילים לגבול הגידול, בעוד החצים האדומים שם מראים את הסיבים בניצב לגבול. סרגל קנה המידה ב-( A) שווה ל- 200 מיקרומטר. התמונות ב-( B)–(F) מוצגות באותו קנה מידה, וסרגל קנה המידה הייצוגי ב-( D) שווה ל- 50 מיקרומטר. קיצורים: SHG = דור הרמוני שני; H&E = המטוקסילין ואאוסין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2872
איור 2: זרימת עבודה סכמטית של כימות של תמונת קולגן פיברילאר. (A) תמונת SHG שתנותח על-ידי CT-FIRE ו/או עקומהאליון. (B)שכבת-על של פלט תמונה על-ידי CT-FIRE. גבול מסיכה(A)הוא קלט אופציונלי של יישור עקומה. (D) פלט תמונת שכבת-על לפי יישור עקומה. קווי הצבע ב- (B) מייצגים את הסיבים שחולצו. ב- (D), הקווים הירוקים מציינים את מיקומם וכיווני הסיבים הנמצאים מחוץ לגבולות (קווים צהובים) והם נמצאים במרחק שצוין מגבולותיהם הקרובים ביותר, הקווים האדומים הם אלה של סיבים אחרים, והקווים הכחולים משמשים לשייך סיבים לגבולות הקרובים ביותר שלהם. תמונות ב-( A)–(D) מוצגות באותו קנה מידה, וסרגל קנה המידה הייצוגי ב- (A)שווה ל- 200מיקרומטר.

figure-results-3917
איור 3: ניתוח רגיל CT-FIRE. (A)ממשק משתמש גרפי ראשי. (B) טבלת פלט המציגה את סטטיסטיקת הסיכום. (C) ו- (F) מציגים את ההיסטוגרמות של זווית ורוחב, בהתאמה. (E) תמונת פלט המציגה את הסיבים שחולצו (קווי צבע) מכוסים בתמונת SHG המקורית (D). קיצורים: GUI = CT = המרה מעוגלת; ממשק משתמש גרפי; SHG = דור הרמוני שני. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4626
איור 4: מודול ניהול החזר על ההשקעה של CT-FIRE. (A) ממשק משתמש גרפי של מודול. (B) החזר על ההשקעה לאחר ניתוח של ארבעה ROIs עם צורות שונות המציגות את הסיבים בתוך כל החזר על ההשקעה. (C) היסטוגרמות ROI של תכונות סיבים שונים. קיצורים: CT = המרה מעוגלת; ממשק משתמש גרפי = ממשק משתמש גרפי; החזר על ההשקעה = אזור עניין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5292
איור 5: מודול מתקדם לאחר עיבוד CT-FIRE. (A) ממשק משתמש גרפי של מודול. (B)מדידות של שלושה סיבים נבחרים. (C) תצוגה חזותית של שלושת הסיבים שנבחרו ב- (B). (D) סטטיסטיקת סיכום לאחר החלת סף אורך (>60 פיקסלים). (E) תצוגה חזותית של הסיבים שנבחרו ב- (D) עם סרגל צבעים מבוסס אורך. קיצורים: CT = המרה מעוגלת; ממשק משתמש גרפי = ממשק משתמש גרפי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6048
איור 6: ניתוח רגיל של יישור עקומה. (A)ממשק משתמש גרפי ראשי. (B) טבלת פלט המציגה את סטטיסטיקת הסיכום. (C) תמונת פלט המציגה את המיקומים והכיוון של סיבים מייצגים (קווים ירוקים) וגבולות (קווים צהובים) מכוסים בתמונת SHG המקורית, הקווים הכחולים משמשים לשייך סיבים לגבולות הקרובים ביותר שלהם, קווים אדומים מציגים את המיקומים וההתמצאות של סיבים בתוך גבול או מחוץ לגבול (>מרחק שצוין על ידי המשתמש, למשל, 250 פיקסלים כאן). (D) מפת חום של הזוויות: אדום (> 60 מעלות), צהוב (45-60] מעלות, ירוק (10, 45] מעלות. (E)–(F) מציג את התפלגות הזווית באמצעות היסטוגרמה ועלילה מצפן, בהתאמה. קיצורים: ממשק משתמש גרפי = ממשק משתמש גרפי; SHG = דור הרמוני שני. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7087
איור 7: מודול ניהול החזר החזר על ההשקעה בעקומה. (A)ממשק המשתמש הגרפי של המודול. (B)ארבעה ROIs מלבניים מבוארים מכוסים בתמונה המקורית. (C) טבלת פלט לאחר ניתוח החזר על ההשקעה. (D)היסטוגרמה זוויתית של כל החזר על ההשקעה. קיצורים: החזר על ההשקעה = אזור עניין; ממשק משתמש גרפי = ממשק משתמש גרפי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את השימוש CT-FIRE ו CurveAlign עבור כימות קולגן fibrillar והוא יכול להיות מיושם על כל תמונה עם סיבי קולגן או מבנים מוארכים אחרים דמויי קו או סיבים מתאים לניתוח על ידי CT-FIRE או CurveAlign. לדוגמה, אלסטין או סיבים אלסטיים יכולים להיות מעובדים באופן דומה בפלטפורמה זו. בדקנו את שני הכלים על סיבים סינתטיים שנוצרו באופן חישובי21. בהתאם ליישום, על המשתמשים לבחור את מצב הניתוח המתאים ביותר לנתונים שלהם. מצב ניתוח סיבי CT יכול להשתמש ישירות עקומות ב- CT כדי לייצג מיקום סיבים וכיוון, והוא רגיש לשינויים במבנה הסיבים המקומי. ניתן להשתמש במצב CT לאיתור סיבים והתמצאותם בתנאים מורכבים, למשל, כאשר רמת הרעש גבוהה, הסיבים מפותלים, או שהשינוי בעובי הסיבים גבוה. עם זאת, כמו מצב CT רק מרים את החלקים הבהירים ביותר של תמונה, זה יחמיץ כמה סיבים בעוצמה נמוכה יותר כאשר יש וריאציה גדולה בעוצמת התמונה.

יתר על כן, מצב CT אינו מספק מידע על סיבים בודדים. בניגוד למצב CT- , מצב CT-FIRE מחשב תכונות סיבים בודדים ויכול לנתח את כל הסיבים שעוצמתם נמצאת מעל סף שצוין. האתגרים הקשורים למצב CT-FIRE כוללים: 1) הדיוק של מיצוי סיבים שלמים עשוי להיות מופחת או בסכנה כאשר יש וריאציה גדולה בעוצמה לאורך סיבים או עובי הסיבים על פני תמונה; ו-2) הניתוח הסטנדרטי הנוכחי תובעני מבחינה חישובית כאמור בפרוטוקול. פרטים נוספים על היתרונות והמגבלות של שיטות אלה ניתן לראות בפרסומים הקודמים שלנו20,21.

בכל הנוגע לדיוק המעקב אחר סיבים, המשתמש יכול להסתמך בעיקר על בדיקה ויזואלית כדי לבדוק את התמונה החופפת שבה הסיבים שחולצו או האוריינטציות הייצוגיות מכוסים בתמונה המקורית. בנוסף, עבור CT-FIRE, המשתמש יכול להשתמש במודול שלאחר העיבוד המתקדם כדי לזהות את המאפיינים של סיבים בודדים נבחרים, ולהשוות אותם למדידות באמצעות כלי ניתוח תמונה אחרים כגון פיג'י46. עבור CurveAlign, המשתמש יכול להשוות את תוצאות הכיוון או היישור לאלה שחושבו על ידי כלים אחרים כגון OrientationJ16 ו- CytoSpectre17.

בין התכונות הזמינות לפלט על ידי הפלטפורמה, תכונות הקשורות ליישור נמצאות בשימוש תכוף ביותר והן האמינות והחזקות ביותר. כדי להשתמש בתכונות סיבים בודדות, המשתמש צריך לאשר את החילוץ של תכונות סיבים מייצגות. יש לציין כי סיב שלם עשוי להיות מחולק למספר מקטעים קצרים יותר בנסיבות מסוימות, אשר המשתמש צריך לקחת בחשבון בעת בחירת מצב ניתוח סיבים או ביצוע ניתוח סטטיסטי נוסף. גם כאשר לא ניתן להשתמש ישירות באורך הסיבים כמאפיין דומה, הכיוון או הרוחב של מקטעי סיבים המשוקללים כנגד אורכם עשויים עדיין להצביע על מידע שימושי. בכל הנוגע להדמיית SHG, צמצם מספרי (NA) של העדשה האובייקטיבית יכול להשפיע באופן משמעותי על זיהוי הרוחב והאורך של סיב, אך יש לו פחות השפעה על מדידות הכיוון והיישור. מניסיוננו בהדמיית SHG, אנחנו בדרך כלל צריכים להשתמש בעדשה אובייקטיבית עם הגדלה של פי 40 ומעלה עם NA ≥ 1.0 כדי להשיג מדידת עובי סיבים חזקה.

"יישור" יכול להתפרש בשלוש דרכים שונות: 1) יישור ביחס לכיוון האופקי החיובי בשם "זווית", החל 0 עד 180 מעלות, שבו זוויות קרוב ל 0 יש כיוון דומה זוויות קרוב ל 180 מעלות; 2) יישור ביחס לגבול בשם "זווית יחסית", הנע בין 0 ל 90 מעלות, עם 0 מעלות המציין סיב מקביל לגבול ו 90 המציין סיבים בניצב; ו-3) יישור סיבים ביחס זה לזה בשם "מקדם יישור", הנע בין 0 ל-1, כאשר 1 מציין סיבים מיושרים בצורה מושלמת וערכים קטנים יותר המייצגים סיבים המפוזרים באופן אקראי יותר.

מלבד תכונות הסיבים המחושבות בפלטפורמה זו, הוצעו גם כמה מדדים המבוססים על ניתוח מרקם47,48,49 לכמת דפוסי ECM. תכונות אלה הקשורות למרקם יכולות לספק מתאר חלופי או נוסף של ECM ביישומים מסוימים. האתגרים להתפתחות מדדים מסוג זה טמונים בשילוב של הרלוונטיות הביולוגית האפשרית, האפיון המקומי והדיוק של איתור סיבים בודדים.

כדי למטב את הפרמטרים הפועלים ולבצע פתרון בעיות, המשתמש יכול להתייחס לפרסומים הידניים הרלוונטיים20,21 וכן לסרגלים הצדדיים של השאלות הנפוצות בדפי הוויקי של GitHub של מאגר העקומות: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki. עבור לחצנים מסוימים, רמז לפונקציה עשוי להיראות כמנחה את המשתמש לפעולה הנוכחית או הבאה כאשר המשתמש מזיז את סמל העכבר מעל לחצן. עקוב אחר המידע בחלון ה- GUI או בחלון הפקודה כדי לבצע את פתרון הבעיות.

לעיבוד ערכת נתונים גדולה, מומלץ למשתמש להשתמש באפשרויות מחשוב מקביליות, המאפשרות לכלי לעבד תמונות מרובות בו-זמנית. אפשרות אחת היא שימוש בליבות CPU מרובות אם הן זמינות במחשב המנוצל. לחלופין, גרסה חסרת ראש של שני APPs מסופקת והורכבה בהצלחה בצומת ההידור דרך השרת שנערך במרכז50 מבוסס קונדור למחשוב תפוקה גבוהה (CHTC) באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון. זרימת העבודה CHTC עבור כימות סיבים בקנה מידה גדול פותחה, נבדקה, והשתמשו בהצלחה על ערכות תמונה אמיתיות המורכבות מאלפי תמונות. המשתמש יכול להתאים את הפונקציות MATLAB חסרות הראש של CT-FIRE ו CurveAlign להפעלת כימות על מערכות מחשוב ענן אחרות כולל שירותים מסחריים כגון אלה המוצעים על ידי אמזון, גוגל, ומיקרוסופט.

כיווני הפיתוח המתמשכים והעתידיים כוללים: 1) שילוב של רשת עצבית למידה עמוקה כדי לחלץ או ליצור תמונות סיבי קולגן סינתטיים באיכות גבוהה ולשפר את החוסן והדיוק של אלגוריתם מעקב סיבים; 2) שילוב כל המודולים בפלטפורמה מקיפה תוך אופטימיזציה של הקוד והתיעוד בהתאם לשיטות העבודה המומלצות להנדסת תוכנה; 3) פריסה של כל תכונות הליבה בפלטפורמת מחשוב ענן; 4) שיפור זרימת העבודה של ניתוח סיבים באמצעות שירות CHTC; ו -5) שיפור הפונקציונליות של מחולל הסיבים הסינתטיים.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים לתורמים ומשתמשים רבים ל-CT-FIRE ו-CurveAlign לאורך השנים, כולל ד"ר רוב נובאק, ד"ר קרולין פלקה, ד"ר ג'רמי ברדפלדט, גונת מהטה, אנדרו ליכט, ד"ר אדיב קיחוסרבי, ד"ר מאט קונקלין, ד"ר ג'יין סקווירל, ד"ר פאולו פרובנזנו, ד"ר ברנדה אוגל, ד"ר פטרישיה קילי, ד"ר ג'וזף סולצ'בסקי, ד"ר סוזן פוניק ותרומות טכניות נוספות מסוואטי אנאנד וקרדיט. עבודה זו נתמכה על ידי מימון של חברת מחקר מוליכים למחצה, מכון מורגרידג' למחקר, ו NIH מענקים R01CA199996, R01CA181385 ו U54CA210190 כדי K.W.E.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CT-FIREUniverity of Wisconsin-MadisonN/Aopen source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/
CurveAlignUniversity of Wisconsin-MadisonN/Aopen source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/

References

  1. Nadiarnykh, O., et al. Second harmonic generation imaging microscopy studies of osteogenesis imperfecta. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 051805(2007).
  2. Kouris, N. A., et al. A nondenatured, noncrosslinked collagen matrix to deliver stem cells to the heart. Regenerative Medicine. 6 (5), 569-582 (2011).
  3. LeBert, D. C., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
  4. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38(2006).
  5. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 1(2008).
  6. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  7. Alkmin, S., et al. Migration dynamics of ovarian epithelial cells on micro-fabricated image-based models of normal and malignant stroma. Acta Biomaterialia. 100, 92-104 (2019).
  8. Campbell, K. R., Campagnola, P. J. Assessing local stromal alterations in human ovarian cancer subtypes via second harmonic generation microscopy and analysis. Journal of Biomedical Optics. 22 (11), 116008(2017).
  9. Best, S. L., et al. Collagen organization of renal cell carcinoma differs between low and high grade tumors. BMC Cancer. 19 (1), 490(2019).
  10. Drifka, C. R., et al. Periductal stromal collagen topology of pancreatic ductal adenocarcinoma differs from that of normal and chronic pancreatitis. Modern Pathology. 28 (11), 1470-1480 (2015).
  11. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  12. Arun Gopinathan, P., et al. Study of collagen birefringence in different grades of oral squamous cell carcinoma using picrosirius red and polarized light microscopy. Scientifica. 2015, 1-7 (2015).
  13. Keikhosravi, A., et al. Quantification of collagen organization in histopathology samples using liquid crystal based polarization microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (9), 4243-4256 (2017).
  14. Quan, B. D., Sone, E. D. Cryo-TEM analysis of collagen fibrillar structure. Methods in Enzymology. 532, 189-205 (2013).
  15. Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
  16. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 11 (3-4), 461-473 (2012).
  17. Kartasalo, K., et al. CytoSpectre: a tool for spectral analysis of oriented structures on cellular and subcellular levels. BMC Bioinformatics. 16 (1), 1(2015).
  18. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007(2014).
  19. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28(2014).
  20. Liu, Y., Keikhosravi, A., Mehta, G. S., Drifka, C. R., Eliceiri, K. W. Methods for quantifying fibrillar collagen alignment. Methods in Molecular Biology. 1627, 429-451 (2017).
  21. Liu, Y., et al. Fibrillar collagen quantification with curvelet transform based computational methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198(2020).
  22. Conklin, M. W., et al. Collagen alignment as a predictor of recurrence after ductal carcinoma in situ. Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers. 27 (2), 138-145 (2018).
  23. Jallow, F., et al. Dynamic interactions between the extracellular matrix and estrogen activity in progression of ER+ breast cancer. Oncogene. 38 (43), 6913-6925 (2019).
  24. Smirnova, T., et al. Serpin E2 promotes breast cancer metastasis by remodeling the tumor matrix and polarizing tumor associated macrophages. Oncotarget. 7 (50), 82289(2016).
  25. Fanous, M., Keikhosravi, A., Kajdacsy-Balla, A., Eliceiri, K. W., Popescu, G. Quantitative phase imaging of stromal prognostic markers in pancreatic ductal adenocarcinoma. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1354-1364 (2020).
  26. Jiménez-Torres, J. A., Virumbrales-Muñoz, M., Sung, K. E., Lee, M. H., Abel, E. J., Beebe, D. J. Patient-specific organotypic blood vessels as an in vitro model for anti-angiogenic drug response testing in renal cell carcinoma. EBioMedicine. 42, 408-419 (2019).
  27. Govindaraju, P., Todd, L., Shetye, S., Monslow, J., Puré, E. CD44-dependent inflammation, fibrogenesis, and collagenolysis regulates extracellular matrix remodeling and tensile strength during cutaneous wound healing. Matrix Biology. 75, 314-330 (2019).
  28. Henn, D., et al. Cryopreserved human skin allografts promote angiogenesis and dermal regeneration in a murine model. International Wound Journal. 17 (4), 925-936 (2020).
  29. Rico-Jimenez, J., et al. Non-invasive monitoring of pharmacodynamics during the skin wound healing process using multimodal optical microscopy. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 000974(2020).
  30. Israel, J. S., et al. Quantification of collagen organization after nerve repair. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (12), (2017).
  31. Rentchler, E. C., Gant, K. L., Drapkin, R., Patankar, M., Campagnola, P. J. Imaging collagen alterations in STICs and high grade ovarian cancers in the fallopian tubes by second harmonic generation microscopy. Cancers. 11 (11), 1805(2019).
  32. Hu, C., et al. Imaging collagen properties in the uterosacral ligaments of women with pelvic organ prolapse using spatial light interference microscopy (SLIM). Frontiers in Physics. 7, 72(2019).
  33. Guirado, E., et al. Disrupted protein expression and altered proteolytic events in hypophosphatemic dentin can be rescued by dentin matrix protein 1. Frontiers in Physiology. 11, 82(2020).
  34. Kiss, N., et al. Quantitative analysis on ex vivo nonlinear microscopy images of basal cell carcinoma samples in comparison to healthy skin. Pathology & Oncology Research. 25 (3), 1015-1021 (2019).
  35. Lewis, D. M., et al. Collagen fiber architecture regulates hypoxic sarcoma cell migration. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 400-409 (2018).
  36. Moura, C. C., Bourdakos, K. N., Tare, R. S., Oreffo, R. O., Mahajan, S. Live-imaging of Bioengineered Cartilage Tissue using Multimodal Non-linear Molecular Imaging. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  37. Murtada, S. I., et al. Paradoxical aortic stiffening and subsequent cardiac dysfunction in Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Journal of The Royal Society Interface. 17 (166), 0066(2020).
  38. Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gómez, T. M. Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons. Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).
  39. Pointer, K. B., et al. Association of collagen architecture with glioblastoma patient survival. Journal of Neurosurgery. 126 (6), 1812-1821 (2016).
  40. Razavi, M. S., Leonard-Duke, J., Hardie, B., Dixon, J. B., Gleason, R. L. Axial stretch regulates rat tail collecting lymphatic vessel contractions. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
  41. Xue, Y., et al. Valve leaflet-inspired elastomeric scaffolds with tunable and anisotropic mechanical properties. Polymers for Advanced Technologies. 31 (1), 94-106 (2020).
  42. Zhou, Z. H., et al. Reorganized collagen in the tumor microenvironment of gastric cancer and its association with prognosis. Journal of Cancer. 8 (8), 1466(2017).
  43. Zinn, A., et al. The small GTPase RhoG regulates microtubule-mediated focal adhesion disassembly. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
  44. Zwaans, B. M., et al. Radiation cystitis modeling: A comparative study of bladder fibrosis radio-sensitivity in C57BL/6, C3H, and BALB/c mice. Physiological Reports. 8 (4), (2020).
  45. Devine, E. E., Liu, Y., Keikhosravi, A., Eliceiri, K. W., Jiang, J. J. Quantitative second harmonic generation imaging of leporine, canine, and porcine vocal fold collagen. The Laryngoscope. 129 (11), 2549-2556 (2019).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. Zeitoune, A. A., et al. Epithelial ovarian cancer diagnosis of second-harmonic generation images: A semiautomatic collagen fibers quantification protocol. Cancer Informatics. 16, (2017).
  48. Wershof, E., et al. Matrix feedback enables diverse higher-order patterning of the extracellular matrix. PLoS Computational Biology. 15 (10), 1007251(2019).
  49. Mostaço-Guidolin, L. B., et al. Fractal dimension and directional analysis of elastic and collagen fiber arrangement in unsectioned arterial tissues affected by atherosclerosis and aging. Journal of Applied Physiology. 126 (3), 638-646 (2019).
  50. Thain, D., Tannenbaum, T., Livny, M. Distributed computing in practice: the Condor experience. Concurrency and Computation: Practice and Experience. 17 (2-4), 323-356 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

165

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved