Method Article
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש מבוסס טרנספורמציה מעוקל, קוד פתוח MATLAB תוכנה כלי לכימות ארגון קולגן fibrillar במטריצה חוץ תאית של רקמות נורמליות ומחלות כאחד. ניתן להחיל כלי זה על תמונות עם סיבי קולגן או סוגים אחרים של מבנים דמויי קו.
קולגנים Fibrillar הם מרכיבים בולטים מטריצה חוץ תאית (ECM), ושינויים בטופולוגיה שלהם הוכחו להיות קשורים עם התקדמות של מגוון רחב של מחלות כולל השד, השחלות, הכליות, סרטן הלבלב. כלי תוכנה לכימות סיבים הזמינים באופן חופשי מתמקדים בעיקר בחישוב יישור סיבים או אוריינטציה, והם כפופים למגבלות כגון דרישה של צעדים ידניים, אי דיוק בזיהוי קצה הסיבים ברקע רועש, או חוסר אפיון תכונות מקומי. הכלי לכמות סיבי קולגן המתואר בפרוטוקול זה מאופיין בשימוש בייצוג תמונה רב-גווני אופטימלי המופעל על-ידי המרה מעוגלת (CT). גישה אלגוריתמית זו מאפשרת הסרת רעש מתמונות קולגן פיברילאר ושיפור קצוות הסיבים כדי לספק מידע מיקום והתמצאות ישירות מסיבים, במקום להשתמש במידע העקיף מבחינת פיקסלים או מבחינת חלונות המתקבל מכלים אחרים. מסגרת מבוססת CT זו מכילה שתי חבילות נפרדות, אך מקושרות, בשם "CT-FIRE" ו- "CurveAlign" שיכולות לכמת את ארגון הסיבים על בסיס גלובלי, אזור עניין (ROI) או סיבים בודדים. מסגרת כימות זו פותחה במשך יותר מעשר שנים וכעת התפתחה לפלטפורמת כימות קולגן מקיפה ומונעת על ידי משתמשים. באמצעות פלטפורמה זו, ניתן למדוד עד כשלושים תכונות סיבים כולל תכונות סיבים בודדים כגון אורך, זווית, רוחב וישירות, כמו גם מדידות בצובר כגון צפיפות ויישור. בנוסף, המשתמש יכול למדוד זווית סיבים יחסית לגבולות מחולקים באופן ידני או אוטומטי. פלטפורמה זו מספקת גם מספר מודולים נוספים, כולל מודולים לניתוח החזר על ההשקעה, יצירת גבולות אוטומטית ולאחר עיבוד. שימוש בפלטפורמה זו אינו דורש ניסיון קודם בתכנות או בעיבוד תמונה, והוא יכול להתמודד עם ערכות נתונים גדולות כולל מאות או אלפי תמונות, המאפשר כימות יעיל של ארגון סיבי קולגן עבור יישומים ביולוגיים או ביו-רפואיים.
קולגני פיברילאר בולטים, מרכיבי ECM מבניים. הארגון שלהם משנה את תפקוד רקמת ההשפעה והם קשורים ככל הנראה עם התקדמות של מחלות רבות החל osteogenesis imperfecta1, תפקוד לקוי של הלב2, ואת הפצע ריפוי3 סוגים שונים של סרטן כולל השד4,5,6, השחלות7,8, כליות9, וסרטן הלבלב10. ניתן להשתמש באופני הדמיה מבוססים רבים כדי לדמיין קולגן פיברילאר כגון מיקרוסקופיה דור הרמוני שני11, כתמים או צבעים בשילוב עם מיקרוסקופיה שדה בהיר או פלואורסצנטי או מיקרוסקופ אור מקוטב12, מיקרוסקופ קיטוב מבוסס גביש נוזלי (LC-PolScope)13, ומיקרוסקופ אלקטרונים14. ככל שהחשיבות של ארגון קולגן פיברילאר הפכה ברורה יותר, והשימוש בשיטות אלה גדל, גדל גם הצורך בגישות משופרות לניתוח סיבי קולגן.
היו מאמצים רבים לפתח שיטות חישוביות למדידה אוטומטית של קולגן פיברילאר. כלי תוכנה זמינים בחופשיות מתמקדים בעיקר בחישוב יישור סיבים או אוריינטציה על ידי אימוץ טנזור נגזר או מבנה ראשון עבור פיקסלים15,16, או ניתוח ספקטרום מבוסס שינוי פורייה עבור אריחי תמונה17. כל הכלים הללו כפופים למגבלות כגון דרישה לשלבים ידניים, אי דיוק בזיהוי קצה הסיבים ברקע רועש או היעדר אפיון תכונות מקומי.
בהשוואה לכלי תוכנה חופשיים אחרים הזמינים באופן חופשי בקוד פתוח, השיטות המתוארות בפרוטוקול זה משתמשות ב- CT - שיטת ייצוג תמונה אופטימלית, רב-גוונית וכיוונית - כדי להסיר רעש מתמונות קולגן פיברילאר ולשפר או לעקוב אחר קצוות סיבים. ניתן לספק מידע על מיקום והתמצאות ישירות מסיבים ולא באמצעות המידע העקיף מבחינת פיקסלים או מבחינת חלונות כדי להסיק את המדדים של ארגון הסיבים. מסגרת מבוססת CT זו18,19,20,21 יכולה לכמת את ארגון הסיבים על בסיס גלובלי, החזר על ההשקעה או סיבים, בעיקר באמצעות שתי חבילות נפרדות, אך מקושרות, בשם "CT-FIRE"18,21 ו- "CurveAlign"19,21. בכל הנוגע ליישום התוכנה, ב- CT-FIRE, מקדמי CT על קשקשים מרובים יכולים לשמש לשחזור תמונה המשפרת קצוות ומפחיתה רעש. לאחר מכן, אלגוריתם מיצוי סיבים בודד מוחל על התמונה המשוחזרת על ידי CT כדי לעקוב אחר סיבים למציאת נקודות המרכז הייצוגיות שלהם, הרחבת ענפי סיבים מנקודות המרכז וקישור ענפי סיבים ליצירת רשת סיבים. ב- CurveAlign, מקדמי CT בקנה מידה שצוין על-ידי המשתמש יכולים לשמש למעקב אחר כיוון סיבים מקומי, שבו הכיוון והמיקומים של עקומות מופקים ומקובצים כדי להעריך את כיוון הסיבים במיקומים המתאימים. מסגרת כימות זו פותחה במשך יותר מעשר שנים והתפתחה מאוד בהיבטים רבים כגון פונקציונליות, ממשק משתמש ומודולריות. לדוגמה, כלי זה יכול לדמיין כיוון סיבים מקומי ומאפשר למשתמש למדוד עד שלושים תכונות סיבים כולל תכונות סיבים בודדים כגון אורך, זווית, רוחב וישירות, כמו גם מדידות בצובר כגון צפיפות ויישור. בנוסף, המשתמש יכול למדוד זווית סיבים יחסית באופן ידני או אוטומטי גבולות מקוטעים, אשר, למשל, ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות סמן ביולוגי מבוסס תמונה בסרטן השד22 ומחקרי סרטן הלבלב10. פלטפורמה זו מספקת מספר מודולי תכונות, כולל מודולים לניתוח החזר על ההשקעה, יצירת גבולות אוטומטית ולאחר עיבוד. ניתן להשתמש במודול ההחזר על ההשקעה כדי להוסיף ביאורים לצורות שונות של החזר ההשקעה ולבצע ניתוח החזר על ההשקעה המתאים. כדוגמה ליישום, מודול יצירת הגבולות האוטומטי יכול לשמש לרישום תמונות שדה בהירות של המטוקסילין ואאוסין (H&E) עם תמונות דור הרמוני שני (SHG) וליצור את מסכת התמונה של גבולות הגידול מתמונות H&E הרשומות. מודול שלאחר העיבוד יכול לסייע בעיבוד ואינטגרציה של קבצי נתוני פלט מתמונות בודדות לצורך ניתוח סטטיסטי אפשרי.
פלטפורמת כימות זו אינה דורשת ניסיון קודם בתכנות או בעיבוד תמונה ויכולה לטפל בערכות נתונים גדולות הכוללות מאות או אלפי תמונות, המאפשרות כימות יעיל של ארגון קולגן עבור יישומים ביולוגיים או ביו-רפואיים. זה כבר בשימוש נרחב בתחומי מחקר שונים על ידי חוקרים רבים בכל רחבי העולם, כולל את עצמנו. ישנם ארבעה פרסומים עיקריים על CT-FIRE ו CurveAlign18,19,20,21, מתוכם שלושת הראשונים צוטטו 272 פעמים (נכון ל 2020-05-04 על פי Google Scholar). סקירה של הפרסומים שציטטו פלטפורמה זו (CT-FIRE או CurveAlign) מצביעה על כך שיש כ -110 כתבי עת שהשתמשו בו ישירות לניתוח שלהם, שבו כ -35 פרסומים היו בשיתוף פעולה עם הקבוצה שלנו, והאחרים (~ 75) נכתבו על ידי קבוצות אחרות. למשל, פלטפורמה זו שימשה למחקרים הבאים: סרטן השד22,23,24, סרטןהלבלב 10,25, סרטן הכליה9,26, ריפוי פצעים3,27,28,29,30, סרטן השחלות8,31,7, רצועה הרחם32, hypophosphatemic dentin33, קרצינומה של תאי בזלת34, סרקומה היפוקסית35, רקמת סחוס36, תפקוד לקוי של הלב37, נוירונים38, גליובלסטומה39, התכווצויות לימפתיות40, cacffolds סיבי41, סרטןקיבה 42, microtubule43, ופיברוזיס שלפוחית השתן44. איור 1 מדגים את יישום ההדמיה של סרטן CurveAlign כדי למצוא את חתימות הקולגן הקשורות לגידול של סרטן השד19 מתמונת SHG. איור 2 מתאר זרימת עבודה סכמטית טיפוסית של פלטפורמה זו. למרות שכלים אלה נבדקו טכנית18,19,21, ופרוטוקול רגיל20 לניתוח יישור עם CurveAlign זמין גם, פרוטוקול חזותי המדגים את כל התכונות החיוניות יכול להיות שימושי. פרוטוקול חזותי, כפי שמוצג כאן, יקל על תהליך הלמידה של שימוש בפלטפורמה זו, כמו גם יתייחס בצורה יעילה יותר לחששות ולשאלות שעשויות להיות למשתמשים.
הערה: פרוטוקול זה מתאר את השימוש ב- CT-FIRE וב- CurveAlign לכימות קולגן. לשני כלים אלה יש מטרות עיקריות משלימות, אך שונות, והן מקושרות זו לזו במידה מסוימת. CT-FIRE יכול להיות משוגר מממשק CurveAlign לנהל את רוב הפעולות למעט ניתוח שלאחר עיבוד וההתחזור על ההשקעה מתקדמים. להפעלה מלאה של CT-FIRE, זה צריך להיות משוגר בנפרד.
1. דרישת אוסף תמונות ותמונה
הערה: הכלי יכול לעבד כל קובץ תמונה עם מבנים דמויי קו הקריאים על ידי MATLAB ללא קשר לאופן ההדמיה המשמש לאיסוףו.
2. התקנת תוכנה ודרישת מערכת
הערה: הן גירסאות עצמאיות והן גירסאות קוד מקור זמינות באופן חופשי. גרסת קוד המקור דורשת התקנה מלאה של MATLAB כולל ארגזי כלים של עיבוד אותות, עיבוד תמונה, ניתוח סטטיסטיקה ומחשוב מקבילי. כדי להפעיל את גירסת קוד המקור, יש להוסיף לנתיב MATLAB את כל התיקיות הדרושות, כולל חלק מהמקורות של ספקים חיצוניים. השימוש ביישום העצמאי (APP) מומלץ עבור רוב המשתמשים, דבר הדורש התקנה של זמן ריצה של מהדר MATLAB (MCR) הזמין באופן חופשי בגירסה שצוינה. הליך ההתקנה וההפעלה של האפליקציה מתואר להלן.
3. מיצוי סיבים אישי עם CT-FIRE
הערה: CT-FIRE משתמש ב- CT כדי denoise את התמונה, לשפר את קצות הסיבים, ולאחר מכן משתמש באלגוריתם מיצוי סיבים כדי לעקוב אחר סיבים בודדים. אורך, זווית, רוחב וישירות מחושבים עבור סיבים בודדים.
4. ניתוח סיבים עם יישור עקומה
הערה: CurveAlign פותחה בתחילה כדי למדוד באופן אוטומטי זוויות של סיבים ביחס לגבולות המוגדרים על-ידי המשתמש. ניתן להשתמש בגרסה הנוכחית של CurveAlign להערכת תכונות מבוססות צפיפות ויישור בצובר בנוסף למדידת הזווית היחסית על-ידי טעינת מידע הסיבים הבודד שחולץ על-ידי CT-FIRE או ישירות באמצעות הכיוון המקומי של העקומות. CurveAlign מחשבת עד שלושים תכונות הקשורות לתכונות גלובליות או מקומיות בעיקר כולל צפיפות ויישור, כמו גם תכונות סיבים בודדים כאשר CT-FIRE מאומצת כשיטת מעקב אחר סיבים.
5. זמן ריצה משוער
שיטות אלה יושמו בהצלחה במחקרים רבים. כמה יישומים אופייניים כוללים: 1) Conklin et al.22 השתמשו CurveAlign כדי לחשב חתימות קולגן הקשורות לגידול, ומצא כי סיבי קולגן היו מיושרים לעתים קרובות יותר בניצב להיקף צינור קרצינומה צינורית במקום (DCIS) נגעים; 2) Drifka et al.10 השתמשו במצב CT-FIRE ב CurveAlign כדי לכמת את יישור קולגן stromal עבור אדנוקרצינומה צינורית הלבלב ורקמות דלקת לבלב נורמלית / כרונית, ומצא כי היה יישור מוגבר ברקמות סרטן לעומת זה ברקמות נורמליות / כרוניות; 3) Alkmin et al.7 השתמשו CurveAlign לכמת את ההתפלגות הזוויתית של סיבי F-actin ויישור קולגן הכולל מן התמונות SHG של קולגן סטרומה השחלות, והראה כי מורפולוגיה מטריצה ממלא תפקיד חשוב בהנעת תנועתיות התא יישור F-actin; 4) LeBert et al.3 להחיל CT-FIRE על תמונות SHG של מודל תיקון פצע זברה ומצא עלייה בעובי של סיבי קולגן לאחר פציעה חריפה; 5) Devine et al.45 השתמשו במצב CT-FIRE ב CurveAlign עבור תמונות SHG של קולגן קיפול קולי מדגמים שונים של בעלי חיים כדי למדוד תכונות סיבים בודדים יישור כללי, והראה כי קולגן קיפול ווקאלי חזירי וכלבים היה יישור גבוה יותר ישר נחות; 6) Keikhosravi et al.13 השתמשו CurveAlign לכמת יישור קולגן בדגימות היסטופתולוגיה בתמונה עם LC-PolScope, והראה כי LC-PolScope ו SHG דומים במונחים של יישור מדידת אוריינטציה עבור סוגים מסוימים של רקמה.
איור 1: שימוש ב- CurveAlign כדי למצוא חתימות קולגן הקשורות לגידול מתמונות SHG של מיקרו-סדרה של רקמת סרטן השד האנושי (TMA). (A) תמונת שכבת-על של ליבת TMA עם תמונת SHG (צהובה) מכוסה בתמונת השדה הבהיר H&E המתאימה. (B)אזור העניין של(A). (C) תמונת השדה הבהיר של (B). (D)תמונת SHG של (B). (F) המסיכה המשויכת לתמונת השדה הבהיר (C). (ה)תמונת שכבת-העל של הפלט CurveAlign המציגה את גבולות הגידול (צהוב) מ- (F), מיקומי סיבים מייצגים וכיוון (קווים ירוקים); הקווים הכחולים משמשים לשייך סיבים לגבולות הקרובים ביותר שלהם. החצים הירוקים ב- (B) ו - (E) מציגים את הסיבים המקבילים לגבול הגידול, בעוד החצים האדומים שם מראים את הסיבים בניצב לגבול. סרגל קנה המידה ב-( A) שווה ל- 200 מיקרומטר. התמונות ב-( B)–(F) מוצגות באותו קנה מידה, וסרגל קנה המידה הייצוגי ב-( D) שווה ל- 50 מיקרומטר. קיצורים: SHG = דור הרמוני שני; H&E = המטוקסילין ואאוסין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זרימת עבודה סכמטית של כימות של תמונת קולגן פיברילאר. (A) תמונת SHG שתנותח על-ידי CT-FIRE ו/או עקומהאליון. (B)שכבת-על של פלט תמונה על-ידי CT-FIRE. גבול מסיכה(A)הוא קלט אופציונלי של יישור עקומה. (D) פלט תמונת שכבת-על לפי יישור עקומה. קווי הצבע ב- (B) מייצגים את הסיבים שחולצו. ב- (D), הקווים הירוקים מציינים את מיקומם וכיווני הסיבים הנמצאים מחוץ לגבולות (קווים צהובים) והם נמצאים במרחק שצוין מגבולותיהם הקרובים ביותר, הקווים האדומים הם אלה של סיבים אחרים, והקווים הכחולים משמשים לשייך סיבים לגבולות הקרובים ביותר שלהם. תמונות ב-( A)–(D) מוצגות באותו קנה מידה, וסרגל קנה המידה הייצוגי ב- (A)שווה ל- 200מיקרומטר.
איור 3: ניתוח רגיל CT-FIRE. (A)ממשק משתמש גרפי ראשי. (B) טבלת פלט המציגה את סטטיסטיקת הסיכום. (C) ו- (F) מציגים את ההיסטוגרמות של זווית ורוחב, בהתאמה. (E) תמונת פלט המציגה את הסיבים שחולצו (קווי צבע) מכוסים בתמונת SHG המקורית (D). קיצורים: GUI = CT = המרה מעוגלת; ממשק משתמש גרפי; SHG = דור הרמוני שני. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מודול ניהול החזר על ההשקעה של CT-FIRE. (A) ממשק משתמש גרפי של מודול. (B) החזר על ההשקעה לאחר ניתוח של ארבעה ROIs עם צורות שונות המציגות את הסיבים בתוך כל החזר על ההשקעה. (C) היסטוגרמות ROI של תכונות סיבים שונים. קיצורים: CT = המרה מעוגלת; ממשק משתמש גרפי = ממשק משתמש גרפי; החזר על ההשקעה = אזור עניין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מודול מתקדם לאחר עיבוד CT-FIRE. (A) ממשק משתמש גרפי של מודול. (B)מדידות של שלושה סיבים נבחרים. (C) תצוגה חזותית של שלושת הסיבים שנבחרו ב- (B). (D) סטטיסטיקת סיכום לאחר החלת סף אורך (>60 פיקסלים). (E) תצוגה חזותית של הסיבים שנבחרו ב- (D) עם סרגל צבעים מבוסס אורך. קיצורים: CT = המרה מעוגלת; ממשק משתמש גרפי = ממשק משתמש גרפי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ניתוח רגיל של יישור עקומה. (A)ממשק משתמש גרפי ראשי. (B) טבלת פלט המציגה את סטטיסטיקת הסיכום. (C) תמונת פלט המציגה את המיקומים והכיוון של סיבים מייצגים (קווים ירוקים) וגבולות (קווים צהובים) מכוסים בתמונת SHG המקורית, הקווים הכחולים משמשים לשייך סיבים לגבולות הקרובים ביותר שלהם, קווים אדומים מציגים את המיקומים וההתמצאות של סיבים בתוך גבול או מחוץ לגבול (>מרחק שצוין על ידי המשתמש, למשל, 250 פיקסלים כאן). (D) מפת חום של הזוויות: אדום (> 60 מעלות), צהוב (45-60] מעלות, ירוק (10, 45] מעלות. (E)–(F) מציג את התפלגות הזווית באמצעות היסטוגרמה ועלילה מצפן, בהתאמה. קיצורים: ממשק משתמש גרפי = ממשק משתמש גרפי; SHG = דור הרמוני שני. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: מודול ניהול החזר החזר על ההשקעה בעקומה. (A)ממשק המשתמש הגרפי של המודול. (B)ארבעה ROIs מלבניים מבוארים מכוסים בתמונה המקורית. (C) טבלת פלט לאחר ניתוח החזר על ההשקעה. (D)היסטוגרמה זוויתית של כל החזר על ההשקעה. קיצורים: החזר על ההשקעה = אזור עניין; ממשק משתמש גרפי = ממשק משתמש גרפי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
פרוטוקול זה מתאר את השימוש CT-FIRE ו CurveAlign עבור כימות קולגן fibrillar והוא יכול להיות מיושם על כל תמונה עם סיבי קולגן או מבנים מוארכים אחרים דמויי קו או סיבים מתאים לניתוח על ידי CT-FIRE או CurveAlign. לדוגמה, אלסטין או סיבים אלסטיים יכולים להיות מעובדים באופן דומה בפלטפורמה זו. בדקנו את שני הכלים על סיבים סינתטיים שנוצרו באופן חישובי21. בהתאם ליישום, על המשתמשים לבחור את מצב הניתוח המתאים ביותר לנתונים שלהם. מצב ניתוח סיבי CT יכול להשתמש ישירות עקומות ב- CT כדי לייצג מיקום סיבים וכיוון, והוא רגיש לשינויים במבנה הסיבים המקומי. ניתן להשתמש במצב CT לאיתור סיבים והתמצאותם בתנאים מורכבים, למשל, כאשר רמת הרעש גבוהה, הסיבים מפותלים, או שהשינוי בעובי הסיבים גבוה. עם זאת, כמו מצב CT רק מרים את החלקים הבהירים ביותר של תמונה, זה יחמיץ כמה סיבים בעוצמה נמוכה יותר כאשר יש וריאציה גדולה בעוצמת התמונה.
יתר על כן, מצב CT אינו מספק מידע על סיבים בודדים. בניגוד למצב CT- , מצב CT-FIRE מחשב תכונות סיבים בודדים ויכול לנתח את כל הסיבים שעוצמתם נמצאת מעל סף שצוין. האתגרים הקשורים למצב CT-FIRE כוללים: 1) הדיוק של מיצוי סיבים שלמים עשוי להיות מופחת או בסכנה כאשר יש וריאציה גדולה בעוצמה לאורך סיבים או עובי הסיבים על פני תמונה; ו-2) הניתוח הסטנדרטי הנוכחי תובעני מבחינה חישובית כאמור בפרוטוקול. פרטים נוספים על היתרונות והמגבלות של שיטות אלה ניתן לראות בפרסומים הקודמים שלנו20,21.
בכל הנוגע לדיוק המעקב אחר סיבים, המשתמש יכול להסתמך בעיקר על בדיקה ויזואלית כדי לבדוק את התמונה החופפת שבה הסיבים שחולצו או האוריינטציות הייצוגיות מכוסים בתמונה המקורית. בנוסף, עבור CT-FIRE, המשתמש יכול להשתמש במודול שלאחר העיבוד המתקדם כדי לזהות את המאפיינים של סיבים בודדים נבחרים, ולהשוות אותם למדידות באמצעות כלי ניתוח תמונה אחרים כגון פיג'י46. עבור CurveAlign, המשתמש יכול להשוות את תוצאות הכיוון או היישור לאלה שחושבו על ידי כלים אחרים כגון OrientationJ16 ו- CytoSpectre17.
בין התכונות הזמינות לפלט על ידי הפלטפורמה, תכונות הקשורות ליישור נמצאות בשימוש תכוף ביותר והן האמינות והחזקות ביותר. כדי להשתמש בתכונות סיבים בודדות, המשתמש צריך לאשר את החילוץ של תכונות סיבים מייצגות. יש לציין כי סיב שלם עשוי להיות מחולק למספר מקטעים קצרים יותר בנסיבות מסוימות, אשר המשתמש צריך לקחת בחשבון בעת בחירת מצב ניתוח סיבים או ביצוע ניתוח סטטיסטי נוסף. גם כאשר לא ניתן להשתמש ישירות באורך הסיבים כמאפיין דומה, הכיוון או הרוחב של מקטעי סיבים המשוקללים כנגד אורכם עשויים עדיין להצביע על מידע שימושי. בכל הנוגע להדמיית SHG, צמצם מספרי (NA) של העדשה האובייקטיבית יכול להשפיע באופן משמעותי על זיהוי הרוחב והאורך של סיב, אך יש לו פחות השפעה על מדידות הכיוון והיישור. מניסיוננו בהדמיית SHG, אנחנו בדרך כלל צריכים להשתמש בעדשה אובייקטיבית עם הגדלה של פי 40 ומעלה עם NA ≥ 1.0 כדי להשיג מדידת עובי סיבים חזקה.
"יישור" יכול להתפרש בשלוש דרכים שונות: 1) יישור ביחס לכיוון האופקי החיובי בשם "זווית", החל 0 עד 180 מעלות, שבו זוויות קרוב ל 0 יש כיוון דומה זוויות קרוב ל 180 מעלות; 2) יישור ביחס לגבול בשם "זווית יחסית", הנע בין 0 ל 90 מעלות, עם 0 מעלות המציין סיב מקביל לגבול ו 90 המציין סיבים בניצב; ו-3) יישור סיבים ביחס זה לזה בשם "מקדם יישור", הנע בין 0 ל-1, כאשר 1 מציין סיבים מיושרים בצורה מושלמת וערכים קטנים יותר המייצגים סיבים המפוזרים באופן אקראי יותר.
מלבד תכונות הסיבים המחושבות בפלטפורמה זו, הוצעו גם כמה מדדים המבוססים על ניתוח מרקם47,48,49 לכמת דפוסי ECM. תכונות אלה הקשורות למרקם יכולות לספק מתאר חלופי או נוסף של ECM ביישומים מסוימים. האתגרים להתפתחות מדדים מסוג זה טמונים בשילוב של הרלוונטיות הביולוגית האפשרית, האפיון המקומי והדיוק של איתור סיבים בודדים.
כדי למטב את הפרמטרים הפועלים ולבצע פתרון בעיות, המשתמש יכול להתייחס לפרסומים הידניים הרלוונטיים20,21 וכן לסרגלים הצדדיים של השאלות הנפוצות בדפי הוויקי של GitHub של מאגר העקומות: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki. עבור לחצנים מסוימים, רמז לפונקציה עשוי להיראות כמנחה את המשתמש לפעולה הנוכחית או הבאה כאשר המשתמש מזיז את סמל העכבר מעל לחצן. עקוב אחר המידע בחלון ה- GUI או בחלון הפקודה כדי לבצע את פתרון הבעיות.
לעיבוד ערכת נתונים גדולה, מומלץ למשתמש להשתמש באפשרויות מחשוב מקביליות, המאפשרות לכלי לעבד תמונות מרובות בו-זמנית. אפשרות אחת היא שימוש בליבות CPU מרובות אם הן זמינות במחשב המנוצל. לחלופין, גרסה חסרת ראש של שני APPs מסופקת והורכבה בהצלחה בצומת ההידור דרך השרת שנערך במרכז50 מבוסס קונדור למחשוב תפוקה גבוהה (CHTC) באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון. זרימת העבודה CHTC עבור כימות סיבים בקנה מידה גדול פותחה, נבדקה, והשתמשו בהצלחה על ערכות תמונה אמיתיות המורכבות מאלפי תמונות. המשתמש יכול להתאים את הפונקציות MATLAB חסרות הראש של CT-FIRE ו CurveAlign להפעלת כימות על מערכות מחשוב ענן אחרות כולל שירותים מסחריים כגון אלה המוצעים על ידי אמזון, גוגל, ומיקרוסופט.
כיווני הפיתוח המתמשכים והעתידיים כוללים: 1) שילוב של רשת עצבית למידה עמוקה כדי לחלץ או ליצור תמונות סיבי קולגן סינתטיים באיכות גבוהה ולשפר את החוסן והדיוק של אלגוריתם מעקב סיבים; 2) שילוב כל המודולים בפלטפורמה מקיפה תוך אופטימיזציה של הקוד והתיעוד בהתאם לשיטות העבודה המומלצות להנדסת תוכנה; 3) פריסה של כל תכונות הליבה בפלטפורמת מחשוב ענן; 4) שיפור זרימת העבודה של ניתוח סיבים באמצעות שירות CHTC; ו -5) שיפור הפונקציונליות של מחולל הסיבים הסינתטיים.
למחברים אין מה לחשוף.
אנו מודים לתורמים ומשתמשים רבים ל-CT-FIRE ו-CurveAlign לאורך השנים, כולל ד"ר רוב נובאק, ד"ר קרולין פלקה, ד"ר ג'רמי ברדפלדט, גונת מהטה, אנדרו ליכט, ד"ר אדיב קיחוסרבי, ד"ר מאט קונקלין, ד"ר ג'יין סקווירל, ד"ר פאולו פרובנזנו, ד"ר ברנדה אוגל, ד"ר פטרישיה קילי, ד"ר ג'וזף סולצ'בסקי, ד"ר סוזן פוניק ותרומות טכניות נוספות מסוואטי אנאנד וקרדיט. עבודה זו נתמכה על ידי מימון של חברת מחקר מוליכים למחצה, מכון מורגרידג' למחקר, ו NIH מענקים R01CA199996, R01CA181385 ו U54CA210190 כדי K.W.E.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CT-FIRE | Univerity of Wisconsin-Madison | N/A | open source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/ |
CurveAlign | University of Wisconsin-Madison | N/A | open source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/ |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved