עכברוש עורק הראש מבוקר לחץ על פגיעה בבלון מגזרי עם יישום טיפולי Periadventitial

הפציעה בבלון עורק התרדמה של החולדה מחקה את הליך האנגיופלסטיקה הקליני המבוצע כדי לשחזר את זרימת הדם בכלי טרשת עורקים. מודל זה גורם לתגובת פגיעה עורקית על ידי התנפצות דופן העורקים, ו denuding את השכבה האינטימית של תאי אנדותל, בסופו של דבר גורם שיפוץ ותגובה היפרפלסטית מולדת.

מחלות לב וכלי דם נשאר הגורם המוביל למוות ונכות ברחבי העולם, בין השאר עקב טרשת עורקים. לוחית טרשת עורקים מצמצמת את שטח הפנים הזוהר בעורקים ובכך מפחיתה זרימת דם נאותה לאיברים ולרקמות דיסטליות. קלינית, נהלי revascularization כגון אנגיופלסטיקה בלון עם או בלי מיקום סטנט שואפים לשחזר את זרימת הדם. למרות הליכים אלה מחדש את זרימת הדם על ידי הפחתת נטל פלאק, הם פוגעים בקיר כלי הדם, אשר יוזם את תגובת ריפוי העורקים. תגובת הריפוי הממושכת גורמת לרסטנוזיס עורקי, או להצטמצם מחדש, ובסופו של דבר מגבילה את ההצלחה ארוכת הטווח של הליכי revascularization אלה. לכן, מודלים פרה-קוליניים של בעלי חיים הם חלק בלתי נפרד מניתוח המנגנונים הפתופיזיולוגיים המניעים את restenosis, ומספקים את ההזדמנות לבחון אסטרטגיות טיפוליות חדשניות. דגמי מורין זולים וקלים יותר לתפעול מאשר מודלים גדולים של בעלי חיים. בלון או פגיעה תיל הם שני אופני פציעה מקובלים בשימוש במודלים מורין. מודלים של פגיעת בלון במיוחד מחקים את הליך האנגיופלסטיקה הקלינית וגורמים נזק הולם לעורק להתפתחות restenosis. בזאת אנו מתארים את הפרטים הכירורגיים לביצוע וניתוח היסטולוגי של מודל הפגיעה בבלון עורק הראש של עכברושים שעבר שינוי, הנשלט בלחץ. בנוסף, פרוטוקול זה מדגיש כיצד יישום periadventitial המקומי של טיפולים יכול לשמש כדי לעכב היפרפלזיה ניאוינטימיאלית. לבסוף, אנו מציגים מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של יריעות אור כגישה חדשנית להדמיה ותדמיינות של הפגיעה העורקית בשלושה ממדים.

מחלות לב וכלי דם (CVD) נשאר הגורם המוביל למוות ברחבי העולם¹. טרשת עורקים היא הגורם הבסיסי לרוב התחלואה והתמותה הקשורות ל- CVD. טרשת עורקים היא הצטברות של פלאק בתוך העורקים שתוצאתו לומן צר, מעכב זלוף דם תקין לאיברים ורקמות דיסטליות². התערבויות קליניות לטיפול טרשת עורקים חמורה כוללים אנגיופלסטיקה בלון עם או בלי מיקום סטנט. התערבות זו כרוכה בקידום קטטר בלון לאתר של פלאק, וניפוח הבלון כדי לדחוס את השלט לקיר העורקים, הרחבת האזור הזוהר. הליך זה פוגע בעורק, עם זאת, ייזום תגובת פגיעה עורקית³. הפעלה ממושכת של תגובת פציעה זו מובילה לרסטנוזיס עורקי, או להצטמצמות מחדש, משנית להיפרפלזיה ניאו-ינטילית ולשיפוץ כלי שיט. במהלך אנגיופלסטיקה השכבה האינטימית היא denuded של תאי אנדותל המוביל גיוס טסיות מיידית דלקת מקומית. איתות מקומי גורם לשינויים פנוטיפיים בתאי שריר חלקים בכלי הדם (VSMC) ופיברובלסטים הרפתקניים. זה מוביל הגירה והתפשטות של VSMC ו fibroblasts פנימה אל הלומן, המוביל היפרפלזיה ניאוינטימל^4,5. במחזור תאים אב ותאי החיסון גם לתרום את הנפח הכולל של restenosis⁶. במידת הצורך, סטנטים מעוררי סמים (DES) הם התקן הנוכחי לעיכוב restenosis⁷. DES לעכב אנדותל עורקי מחדש, עם זאת, ובכך ליצור סביבה פרו טרומבוטית שיכולה לגרום פקקת מאוחרת סטנט⁸. לכן, מודלים של בעלי חיים הם חלק בלתי נפרד הן להבנת הפתופיזיולוגיה של restenosis, והן לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות טובות יותר כדי להאריך את היעילות של הליכי revascularization.

מספר מודלים גדולים וקטנים של בעלי^{חיים 9} מנוצלים לחקר פתולוגיה זו. אלה כוללים פגיעה בבלון^3,10 או פציעה^{תיל 11} של הצד הזוהר של העורק, כמו גם קשירה חלקית¹² או מיקום חפתים¹³ סביב העורק. פגיעת הבלון והחוט הן מנודה את שכבת האנדותל של העורק, מחקה את מה שקורה קלינית לאחר אנגיופלסטיקה. בפרט, מודלים של פגיעה בבלונים משתמשים בכלים דומים כמו בסביבה הקלינית (כלומר, קטטר בלון). הפגיעה בבלון מבוצעת בצורה הטובה ביותר בדגמי עכברושים, שכן עורקי חולדה הם בגודל מתאים לקטטרים בלון זמינים מסחרית. בזאת אנו מתארים פגיעה עורקית מגזרית מבוקרת לחץ, גרסה מבוססת ומותנית היטב של פגיעת בלון עורק הראש של החולדה. גישה זו מבוקרת לחץ מחקה מקרוב את הליך האנגיופלסטיקה הקלינית, ומאפשרת היווצרות היפרפלזיה ניאוינטילית הניתנת לשחזור שבועיים לאחר פציעה^14,15. בנוסף, זה פגיעה עורקית מבוקרת לחץ תוצאות שיקום שכבת אנדותל מלאה על ידי 2 שבועות לאחר הניתוח¹⁶. זה מנוגד ישירות לדגם פגיעת הבלון המקורי, המתואר על ידי Clowes, שבו שכבת האנדותל לעולם לא חוזרת לכיסוי מלא³.

לאחר הניתוח, ניתן להחיל טיפולי או להפנות לכיוון העורק הפצוע באמצעות מספר גישות. השיטה המתוארת בזאת משתמשת ביישום periadventitial של מולקולה קטנה מוטבע בתמיסת ג'ל פלורונית. באופן ספציפי, אנו מיישמים פתרון של 100 μM אלדהיד סיננמי ב 25% פלורוניק-F127 ג'ל לעורק מיד לאחר פציעה כדי לעכב היווצרות היפרפלזיה ניאוינטילית¹⁵. Pluronic-F127 הוא ג'ל לא רעיל, תרמו הפיך מסוגל לספק תרופות באופן מקומי באופן מבוקר¹⁷. בינתיים, פגיעה עורקית היא מקומית, ולכן הממשל המקומי מאפשר לבדוק עיקרון פעיל תוך מזעור השפעות מחוץ ליעד. עם זאת, אספקה יעילה של טיפול בשיטה זו תהיה תלויה בכימיה של המולקולה הקטנה או הביולוגית המשמשת.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.

1. הליכים טרום ניתוחיים

1. לעקר מכשירים כירורגיים. אוטוקלאב כל המכשירים הכירורגיים לפני הניתוח. אם אתם מבצעים מספר ניתוחים באותו יום, יש לעקר מכשירים בין ניתוחים באמצעות מעקר חרוזים יבש.
2. הכן טיפולית 25% פלורוניק-127 ג'ל (מדולל במים מזוקקים סטריליים).
3. הגדר קטטר בלון פוגרטי 2F כדי insufflator ומניחים את קצה הבלון של הקטטר במזרק 1 מ"ל מלא תמיסת מלח.
4. לגרום להרדמה על ידי הצבת החולדה בתא עם 5% isoflurane.
   1. תוציא את החולדה מהתא ותקליט את משקל החולדה. השתמש קוצץ שיער כדי לגלח פרווה על אזור הצוואר הגחוני.
   2. מניחים את החולדה בחזרה לתוך התא עם 5% isoflurane כדי להבטיח אינדוקציה של הרדמה.
5. מניחים את הסופרן החולדה על פלטפורמה כירורגית, מכניסים את הפנים לתוך חרוט האף, כך פני החולדה הוא לכיוון המנתח.
   1. להפחית הרדמה בשאיפה ל 1.5% isoflurane. לאמת את עומק ההרדמה על ידי רפלקס צביטה בוהן על כל ארבעת הרגליים.
   2. תדביק את כל ארבע הרגליים לפלטפורמה הכירורגית.
6. תדליק את מנורת החום.
7. להזריק אטרופין (0.01 מ"ג/ק"ג) תת עורית כדי להפחית את הפרשות דרכי הנשימה.
8. הזרק Carprofen (5 מ"ג/ק"ג) תת עורית לטיפול בכאב מניעתי. אם תרופות אנטי דלקתיות אינן מקובלות על הניסוי מתייחסים לשלבים 3.2.2 ו 3.2.3.
9. החל משחת עיניים סיכה על שתי העיניים באמצעות ספוגית כותנה סטרילית כדי למנוע קרניות ייבוש במהלך הניתוח.
10. לנגב את הצוואר שלוש פעמים בתנועה מעגלית לסירוגין בין 70% אלכוהול אתיל ואחריו Betadine ממרכז האזור מגולח כלפי חוץ כדי לעקר את אתר החתך.
11. לחדור את קו החתך s.c. עם 0.25% bupivacaine.
12. ללבוש כפפות כירורגיות סטריליות לפני טיפול מכשירים כירורגיים סטריליים ואספקה.
13. פורסים את כל המכשירים הכירורגיים האוטומטיים על גיליון כירורגי סטרילי.
14. חותכים שלושה גדילים עצמאיים 1 אינץ ' של תפר סטרילי 7-0 Prolene.
15. מניחים ספוגיות כותנה וגזה על סדין כירורגי.
16. לעטוף את החולדה עם סדין כירורגי סטרילי שרק חושף את אזור הצוואר מעוקר.
17. חותכים פתח קטן נוסף בסדין החושף חלק מתוך חרוט האף. זה יהיה האתר להדבקת קטטר הבלון במהלך פציעה.

2. נהלים אופרטיביים

1. במהלך כל ההליך הכירורגי, להעריך את עומק ההרדמה על ידי ניטור קצב הנשימה (שיעור צריך להיות עקבי ונחשב נורמלי) כמו גם על ידי צביטה בוהן כל 15 דקות. אם קצב הנשימה עולה או שיש תגובה לצביטת בוהן, אז להשהות מניפולציה כירורגית ולהגדיל isoflurane עד 2.5%.
2. לחשוף את העורק הראשי המשותף (CCA).
   1. לעשות חתך שטחי, ישר, צוואר אורך בין עצמות הלסת של החולדה. אורך החתך יהיה כ-1.5-2 ס"מ.
   2. בצע חתך דרך רקמת החיבור מתחת לעור עד שכבת השריר נחשפת. לעקור את בלוטות הרוק מתחת לעור כדי לגשת לרקמת השריר.
   3. מפרידים בבוטות את רקמת החיבור מהשריר על ידי החדרת מספריים סגורים בין שכבת השריר לרקמת החיבור ופותחים בעדינות את המספריים תוך משיכת העור כלפי מעלה.
3. לנתח את שני השרירים הנראים לעין (עצם החזה ו sternomastoid) לאורך הצד השמאלי של קנה הנשימה עד שריר שלישי (omohyoid) כי פועל בניצב לשני השרירים השטחיים הוא ציין.
4. השתמש מלקחיים כדי ליצור חלון המפריד שריר ניצב זה (omohyoid) משריר האורך (עצם החזה) פועל על גבי קנה הנשימה. בצעו בעדינות הפרדה זו כדי למנוע טראומה קהה לקנה הנשימה.
5. להגיע מלקחיים מתחת לשריר הניצב לחתוך להפריד את שני שרירי האורך ולחשוף את CCA.
6. לנתח את CCA.
   1. לנתח את CCA ליד bifurcation עד העורק הראשי הפנימי (ICA) ועורק עורק ראשי חיצוני (ECA) נחשפים.
   2. לנתח את עורק בלוטת התריס מעולה (STA), אשר מסתעף מן ECA.
   3. באמצעות תפרים Prolene לחתוך מראש, ligate STA ו ECA ליד bifurcation בהתאמה שלהם. השאירו את רוב התפירה לצד אחד של הקשר ותפסו כל תפר עם המוסטט מעוקל.
   4. לסיים לנתח סביב ICA, להגיע מלקחיים מתחת ומסביב ICA, ולהשתמש מהדק כלי דם שאינו מוחץ כדי להשיג שליטה דיסטלית. מהדקים את העורק העורפי יחד עם ה- ICA.
   5. לנתח את CCA proximal כדי bifurcation, הבטחת להפריד את עצב הוואגוס מן CCA.
   6. להגיע מלקחיים מתחת ומסביב CCA ולהשתמש מהדק כלי דם שאינו מוחץ כדי להשיג שליטה פרוקסימלית. מניחים מהדק לפחות 5 מ"מ מהתנורציה.
7. בצע פגיעה בבלון.
   1. לתמרן את hemostats מעוקל מחזיק כל ענף עורק רצועות לחשוף את bifurcation בין ECA לבין ענף מעולה.
   2. לנתח בעדינות רקמה בביפורציה ולאחר מכן לבצע חתך arteriotomy בין ECA לבין ענף מעולה באמצעות מספריים microdissection.
   3. השתמש ספוגית כותנה כדי לדחוף את כל הדם מתוך CCA ולנקות את האתר arteriotomy.
   4. הכנס את קטטר בלון מנופח דרך העורקים ולהתקדם לתוך CCA עד הקצה הפרוקסימלי של הבלון הוא עבר bifurcation.
   5. קטטר סרט אל חרוט האף כך הבלון לא להחליק מתוך העורק במהלך האינפלציה.
   6. לאט לנפח את הבלון ל 5 אטמוספרות של לחץ ולהשאיר CCA במשך 5 דקות כדי לגרום לפגיעה בעורקים. ודא כי הלחץ נשאר קבוע במשך כל 5 דקות.
   7. לאחר 5 דקות, לנפח בלון בעדינות להסיר מן CCA דרך העורקים.
   8. לשטוף את CCA על ידי בעדינות לסחוט על המהדק ב CCA. אל תסיר את ההידוק.
   9. Ligate ECA proximal לעורקים ולאחר מכן להסיר את המהדקים מן CCA ו ICA כדי לשחזר את זרימת הדם דרך CCA כדי ICA. ודא שאין דימום גלוי סביב העורקים וכי CCA הוא פועם.
8. יש למרוח 100 μL של רכב ג'ל טיפולי או פלוריוני לבדו לאורך CCA הפצוע. עשה זאת על ידי החלת 50 μL בצד שמאל של CCA ולאחר מכן 50 μL בצד ימין של CCA כדי להבטיח אפילו ציפוי של העורק הפצוע.
9. סגור את אתר הפצע.
   1. חותכים תפרים פרולין עודף.
   2. סגור את הפצע באמצעות מופרע 4-0 או 6-0 שכבות vicryl לאורך רקמת החיבור.
   3. סיים לסגור את הפצע באמצעות ריצה 4-0 תפר ניילון לאורך העור.

3. הליכים לאחר הניתוח

1. מניחים את החולדה לבד בכלוב נקי עם חצי מהכלוב תחת מנורת חימום ומפקחים עד שהחולדה חוזרת להכרה מספקת כדי לשמור על שיקום עצם החזה. שמור את החולדה בכלוב נפרד עד החיה היא ערנית לחלוטין נייד לפני העברה חזרה לכלוב המקורי שלהם.
2. לפקח על החולדה מדי יום במשך שלושת הימים הבאים ולאחר מכן שלוש פעמים בשבוע עד המתת חסד. המתת חסד באמצעות מנת יתר isoflurane ואחריו כריתת חזה דו-צדדית כמתואר להלן.
   1. השתמש במרכז הלאומי לעידון חלופי & הפחתת בעלי חיים במחקר (NC3Rs) סולם עוויתות כדי לזהות רמות כאב לאחר הניתוח. אם נראה כי בעל חיים כלשהו חווה כאב או מפתח פשרה נוירולוגית כלשהי, הקרב מיד.
   2. עבור בעלי חיים שאינם מקבלים carprofen, לנהל פרצטמול 6 מ"ג / מ"ל במי השתייה שלהם 24 שעות לפני הניתוח דרך 48 שעות לאחר הניתוח. פרצטמול מספק משככי כאבים עם השפעות אנטי דלקתיות מינימליות.
   3. לחלופין, אסטרטגיות משככי כאבים אחרים עם השפעות אנטי דלקתיות מינימליות ניתן להשתמש, כגון buprenorphine או buprenorphine שחרור מורחב. התייעץ עם הצוות הווטרינרי במוסד שלך.

4. קציר רקמות והדמיה

1. שבועיים לאחר הניתוח, המתת לחות החולדה על ידי מנת יתר של הרדמה (5% isoflurane). לחלופין, המתת חסד חולדות בנקודת זמן מוקדמת יותר כדי לנתח את ההיבטים השונים של תגובת הפגיעה בעורקים.
   1. ברגע שהנשימה מפסיקה לבצע כריתת חזה דו-צדדית כשיטה משנית של המתת חסד.
2. בצע חתך לרוחב דרך הבטן, ולאחר מכן לחתוך כלפי מעלה, דרך הסרעפת והצלעות, חושף את חלל בית החזה.
3. לעיין ולתקן את העורקים.
   1. הכנס קנולה 18 G מחובר למערכת קיבוע זלוף כבידתי דרך החדר השמאלי. לשמור על לחץ שווה בין חולדות על ידי סימון הגובה של מערכת זלוף יחסית הספסל (גובה 120 ס"מ, שווה ערך 91 ± 3 מ"מ היג).
   2. מהדקים את הצינורית יחד עם החדר באמצעות המוסטט מעוקל.
   3. בצע חתך באטריום הימני, פתיחת מעגל כלי הדם, ולהתחיל זלוף עם PBS ואחריו 2-4% paraformaldehyde (כ 250 מ"ל כל אחד).
   4. הכן paraformaldehyde מדולל PBS יום ההקרבה, או לפחות בלילה שלפני ההקרבה. אם מתכוננים ביום ההקרבה, ודאו שפרפורמלדהיד התקרר לטמפרטורת החדר לפני תחילת הזלוף. חנות paraformaldehyde ב 4 °C (69 °F).
4. לאחר הקיבעון, לחלץ את העורקים הראשיים שמאלה וימינה ולאחסן ב 4 °C (70 °F) עבור 2 שעות ב 2-4% paraformaldehyde.
5. מעבירים את העורקים ל-30% סוכרוז ומאחסנים לילה ב-4 מעלות צלזיוס.
6. לאחר 16-24 שעות, להטמיע את העורקים בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) ולהקפיא בלוקים עורק משובץ OCT.
   1. תנאי העורקים ב OCT בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. מניחים את העורק במקביל למישור של cryomold מלא OCT, מסמן את הצד של cryomold שאליו bifurcation העורקים פונה. הצמד להקפיא בחנקן נוזלי.
   2. לאחסן בלוקים קפואים לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס.
7. סעיף בלוקים קפואים באמצעות cryostat.
   1. לאסוף שישה חתכי עורקים בעובי 5 מיקרומטר לכל שקופית, עם שקופית 1 החל bifurcation.
   2. מקטע בלוקים קפואים עד היפרפלזיה כבר לא גלוי (סביב 100 שקופיות).
8. שקופיות כתם המטוקסילין ואאוסין (H&E)¹⁸
   1. מצא את אזור הפציעה על-ידי הכתמת אחת מכל עשר שקופיות לאורך כל העורק החל מהביפרציה (למשל, שקופיות 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ו- 100).
   2. כתמים שקופיות נוספות סביב האתר של פגיעה כדי למצוא את השקופית עם חסימת שיא (למשל, שקופיות 20, 30, ו 40 היו היפרפלזיה גלויה, ובכך כתמים שקופיות 15, 25, 35, ו 45).
   3. הכתם וכמת את השקופית עם שיא חסימה ושקופיות שווה ערך לפני ואחרי שקופית חסימת השיא (למשל, חסימת שיא שנמצאה בשקופית 35, ולאחר מכן הכתים וכמת שקופיות 25, 45 וכו ') עבור סך של 3-10 שקופיות לכל חולדה.
9. להדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית גיליון אור, לאחסן את העורקים לילה ב 4 מעלות צלזיוס לאחר קיבעון בשלב 4.4.
   1. בדיקה עורק עם 1:500 דילול של ארנב אנטי CD31 נוגדן ראשוני ב diluent (pH 7.4) במשך 3 ימים. ואז נגד העורק עם 1:500 דילול של נוגדן אנטי ארנב אלקסה פלואור 647 משני במשך 2 ימים¹⁹.
   2. נקה את העורק באמצעות iDISCO+²⁰.
   3. תמונה העורק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור²¹. רינדור תמונות באמצעות תוכנה (למשל, Imaris)¹⁹.
10. לכמת היפרפלזיה ניאוינטימית. בצע כימות באופן עיוור במידת האפשר.
    1. השתמש בתוכנת ImageJ כדי לעקוב אחר ההיקף של האינטימה, הלאמינה האלסטית הפנימית (IEL) ולאמינה אלסטית חיצונית (EEL) של עורק בכל אחת מ- 3-10 השקופיות שנקבעו לעיל (שלב 4.8.3).
    2. כימתו את האזור של כל אזור שעקבו אחריו ב-ImageJ וייצאו ערכים אלה. עקבות האינטימה מניבות את אזור לומן, עקבות IEL מניבות את אזור IEL, ועקבות EEL מניבות את אזור EEL.
    3. ממוצע הערכים המתקבלים מ 3-10 שקופיות כדי לקבל את הפציעה הממוצעת (% חסימה, intima:media (I:M) יחס, היפרפלזיה ניאוינטילית) לכל עורק התרגז עכברוש.
       היפרפלזיה ניאוינטימית = אזור IEL - אזור לומן
       
       

איור 1 מציג את כל החומרים והכלים הכירורגיים המשמשים לביצוע ניתוח זה. המטוקסילין & אאוסין (H&E) הכתמת חתכים עורקיים פצועים של שבועיים מאפשרת הדמיה ברורה של היפרפלזיה ניאוינטילית. איור 2 מציג תמונות מייצגות של חתכי עורקים מוכתמים ב-H&E של עורק בריא, פצוע ומטופל. איור 2 מתאר גם כיצד לכמת את רמת ההיפרפלזיה הניאו-ינטילית בעורק פצוע באמצעות ImageJ, תוכנה נפוצה לעיבוד תמונה. באמצעות גישה זו, ההיקף של הניאוינטימה, כמו גם הלאמינה האלסטית הפנימית והחיצונית נמצאים במעקב כדי לכמת את האזורים המתאימים. שיטת הפציעה הסגמנטלית הנשלטת על ידי לחץ אנו מתארים תוצאות ביחס אינטימה למדיה של 0.80 עם סטיית תקן של 0.29 (2 מנתחים שונים ו- n = 11 חולדות). טיפול עם יישום periadventitial של CA בתוצאות פלורוניק עיכוב של היפרפלזיה ניאוינטימיאלית, כפי שהראינו בעבר (61% ירידה באחוז החסימה)¹⁵.

איור 3 מספק איור ליצירת עורקים אופטימלי בביפורציה של ECA ו- STA. לבסוף, איור 4 מראה כיצד מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של יריעות אור יכולה לשמש כדי לדמיין את כל אזור הפגיעה לאורך העורק. כתמי CD31 כדי לדמיין את תאי האנדותל המצפים את השכבה האינטימלית יכולים להתבצע על עורקים קבועים. לאחר מכן ניתן להטמיע עורקים ב- 1% agarose ולנקה באמצעות שיטת iDISCO+ כדי הומוגניזציה של אינדקס השבירה של המדגם²⁰. אז העורקים יכולים להיות בתמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור ואת התמונות ניתן לעבד באמצעות תוכנה לכימות יחס I:M. באמצעות גישה זו, השגנו יחס I:M של 0.86, אשר בהסכמה עם תוצאות H&E.

שולחן 1. מספר נפוץ של חתכים עורקיים לניתוח היפרפלזיה.

איור 1. כלים וכלים כירורגיים. בסדר בכיוון השעון החל בפינה השמאלית העליונה של התמונה: (A) צמר גפן; (ב)פתרון בטדין; (C)גזה; (D)70% פתרון אלכוהול אתיל; (E)1cc מזרקים עם מחט; (נ)אטרופין; (ז)רקטורים; מהדקי נייר מכופפים המשמשים כאן; רימאדיל; (I)מלחצי מיקרו-סרפין החלת מלקחיים; (J)מחזיק מחט; (K) 4-0 תפר ניילון; (L)4-0 תפר ויקריל; (ז)וילונות סטריליים; מספרימאיו; (O)מלקחיים סטנדרטיים; (P) מלקחיים מעוגלים עדינים; (Q) מספריים מיקרו-דיסקטיים; (R) מלחציים מיקרו סרפין; מספרייםמשובחים; (T)T-סיכות; (U)המוסטטים מעוגלים; (V)שלושה תפרים פרולין 7-0 לחתוך כ 1 אינץ '; (W)100 μL של 25% פלורוניק-127 ג'ל; (X) משחת עיניים סיכה; (Y)2 קטטר כריתת תסחיף בלון צרפתי בתמיסת מלח סטרילית; (Z)אינזלטור. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2. המטוקסילין & אאוסין (H&E) כתמים וניתוח של חתכים עורק עורק ראשי חולדה. (A)חתך רוחב של עורק ראש ימני בריא, לא נפגע. IEL = אלסטי פנימי למינה, EEL = חיצוני אלסטי למינה. (B)חתך רוחב של עורק התרם השמאלי הפצוע במשך שבועיים טופל ברכב פלורוניק-F127. (ג)חתך רוחב של עורק ראשי שמאלי פצוע של שבועיים שטופלו ב-100 מיקרומטר סינאמי אלדהיד. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (D) תוחם סכמטי של עורקים קפואים לכימות פציעה. שקופית 1 מתחילה ב bifurcation ושישה מקטעים עורקיים 5 מיקרומטר רוחב נלקחים לכל שקופית. מקטע בדרך כלל ממשיך להחליק 70 כמו הפציעה מתרחשת בדרך כלל לפני שקופית זו. (ה)חתך רוחב של עורק התרזה השמאלי הפצוע שטופל ברכב פלורוניק(B). הקו השחור הפנימי ביותר עוקב אחר הניאוינטימה ומתווה את האזור הזוהר. הקו הצהוב האמצעי מציין את האזור של הלאמינה האלסטית הפנימית, או אינטימה טוניקה. הקו הכחול החיצוני מציין את האזור של הלאמינה האלסטית החיצונית, או אדוונטיטיה טוניקה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (F) חישובים המשמשים למדידת אחוז חסימת כלי אינטימה:מדיה (I:M) יחס בהתבסס על מדידות שהתקבלו (E). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3. יצירת עורקים. איור של השלבים ליצירת עורקים נאותים, והימנעות ממערכת דמה. CCA = עורק הראש המשותף, ECA = עורק עורק הראש החיצוני, ICA = עורק הראש הפנימי, OA = עורק העורקים העורפיים, STA = עורק בלוטת התריס מעולה. לבודד את bifurcation בין ענפי ECA ו STA. לנתח bifurcation זה עד האזור משתנה לצבע בהיר יותר, המציין דילול של דופן העורקים, ולאחר מכן ליצור arteriotomy באמצעות מספריים microdissection. הרם את העורקים באמצעות מלקחיים עדינים כדי לסייע בהחדרת בלון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4. מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעת אור כדי לדמיין פגיעה עורקית. חתכי רוחב אורך לאורך עורק העורק הראשי המשותף מעכברוש ספראג דולי בן 14 שבועות עם קטע רוחבי מייצג למטה. העורקים מוכתמים ב-CD31 ומוכתמים ב-AF647. (A)חתכים של עורק עורק ראשי ימני בריא, לא נפגע. לבן = CD31, ירוק = אלסטי למינה, L = לומן, סרגל סולם = 200-500 מיקרומטר. (B) חתכים של פצועים, עורק התרם השמאלי מטופלים עם רכב Pluronic-F127. ראשי חץ מציינים אזורים של היפרפלזיה ניאו-ינטימית. (ג)אינטימה למדיה (I:M) יחס של עורק עורק ראשי לא פצוע ופצוע, עם ערך מדויק שצוין עבור כל קבוצה (n = 1). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הפציעה בבלון עורק הראש של החולדה היא אחד המודלים הנפוצים ביותר שנחקרו בבעלי חיים. הן מודל פגיעת הבלון המקורי³ והן וריאציית הפציעה הסגמנטית הנשלטת על ידי לחץ^{שונה 10} הודיעו היבטים רבים של תגובת הפגיעה בעורקים המתרחשת גם בבני אדם, כאשר המגבלות המעטות הן כי פקקת עשירה בפיברין מתפתחת לעתים רחוקות ודלקת מקומית היא מינימלית בהשוואה לדגמי פציעה אחרים כגון ארנב היפרכולסטרולמי או מודלים חזיריים^9,22. החולדות יכולות גם להיות מוקרבות בנקודות זמן שונות כדי לכמת ולנתח את ההיבטים השונים של תגובת הפגיעה בעורקים. לדוגמה, נקודות זמן מוקדמות יותר יכולות לשמש לחקר היבטים של תגובה מוקדמת לפציעה כגון התפשטות תאים, מתג פנוטיפי של תאי שריר חלקים בכלי הדם, והתגובה החיסונית המוקדמת. הראינו בעבר כי חדירת לויקוציטים והתפשטות תאים הם מקסימליים בין 3 ימים ל 1 שבוע¹⁶. נקודות זמן ביניים ניתן להשתמש כדי להעריך את קצב אנדותל מחדש. נקודת הזמן של שבועיים היא נקודת הזמן המוצעת המוקדמת ביותר למדידת היפרפלזיה ניאוינטילית כמו העורק הוא בעיקר מחדש אנדותל בשלב זה¹⁶. מגבלה עיקרית לתרגום מודל זה היא שהפציעה מבוצעת בעורק בריא, ואילו הליך זה מתרחש בחולים עם מחלה טרשת עורקים. מגבלה זו קיימת בין השאר בשל המחסור הקודם של מודלים טרשת עורקים החולדה זמין^23,24. עם זאת, ההתקדמות בטכנולוגיות לעריכת גנים אפשרה פיתוח של מודלים אמינים של חולדות טרשת עורקים²⁴, אשר עשוי להניב תובנות חדשניות בחקר הפתופיזיולוגיה של restenosis.

באופן יחסי, חולדות זכר להניב פציעה חזקה יותר מאשר חולדות נקבה, אשר בדרך כלל לפתח היפרפלזיה ניאוינטימיאלית פחות אולי בשל אפקט מגן של^{אסטרוגן 25}. עם זאת, המודל המתואר עדיין מתאים ללמוד ריפוי עורקי אצל נקבות. חולדות זכר מזדקנות 12-16 שבועות, בין 300-400 גרם מניבות את המבנה הניאו-ינטימיאלי החזק ביותר. חולדות מתחת לגיל 12 שבועות ניתן להשתמש; עם זאת, העורקים של חולדות צעירות אלה עשויים להיות קטנים מדי עבור בלון 2F להיכנס בקלות לעורק בהתאם לזן החולדה. חולדות במשקל של פחות מ 200 גרם לא צריך להיות מופעל על עם מודל זה כמו הבלון אינו מתאים בקלות דרך העורקים והוא יכול למעשה לקרוע את העורק אם נאלץ. בנוסף, שימוש בחולדות מעל גיל 16 שבועות עשוי להניב תגובה משתנה בהיווצרות ניאו-אינטמילית. זנים שונים של חולדות יכולים לשמש לביצוע מודל פציעה זה, עם חולדות Sprague Dawley להיות הנפוץ ביותר בשימוש לאורך הספרות²⁶. כדי להתחיל את הניתוח, תחילה לקבל את היישור הנכון ואת האוריינטציה של אתר החתך בצוואר על ידי תחושה של עצמות הלסת ושימוש באף החולדה כדי למצוא את קו האמצע. לאחר החתך הראשוני, לנתח את הרקמה עד שני שרירי האורך (עצם החזה ו sternomastoid) פועל במקביל זה לזה הם דמיינו. השתמש בשריר הצוואר (masseter) כגבול התחתון של חלון הניתוח, לכיוון הראש. הפרד את השרירים המקבילים, אשר רצים לכיוון הגוף, אחד מהשני עד שריר פועל בניצב לשני אלה הוא דמיין. חיתוך השריר הניצב יאפשר נסיגה קלה של שני השרירים המקבילים, חשיפת העורק הראשי. כמו האנטומיה עשויה להשתנות מעט מכל בעל חיים, יחד עם המיקום שלהם, ייתכן שיש ענף עורקי קטין שנשען על גבי ICA. ענף מינורי זה יכול להיות מהודק יחד עם ICA; עם זאת, כאשר ענף קטן זה אינו מהודק לא אמורות להיות בעיות בביצוע ההליך. בנוסף, הקפד לנתח את עצב הוואגוס הן מה- ICA והן מ- CCA לפני כל הידוק ותפירה מתרחשים. חשוב להיות עדינים ולמנוע נזק עצבי בשלב זה. אם החיה מתעוותת לאחר לשים על מהדק שעשוי להיות תגובה של עצב הוואגוס בא במגע עם מהדק מתכת; שקול להתאים מחדש את המהדק.

ניתן לטעון שהצעד המסובך ביותר של ההליך כולו הוא ביצוע העורקים. הסיבה לכך היא שניתן לעשות arteriotomy 'כוזב', והכנסת בלון דרך העורקים 'הכוזבים' האלה תגרום לבלון לרוץ למעשה מעל העורק, ולא בתוך העורק. אם זה קורה, אז מה שהופך arteriotomy חדש קרוב יותר bifurcation ב CCA הוא פתרון אפשרי, אבל אם הבלון נאלץ לתוך העורק, אז הניתוח לא יכול להיות הצלה. כדי למנוע עורקים 'כוזבים' (איור 3), לנתח את השכבה ההרפתקנית בביפורציה ECA ו- STA באמצעות מלקחיים עד שהמראה אדום משמעותית מהאזורים הסמוכים, ונראה שחלק זה של העורק בולט החוצה. לאחר מכן, השתמש במיקרו-מספריים כדי ליצור את העורקים על ידי החדרה מהירה של שיניים אחד של המספריים לאזור המטוהר בביפורציה ולאחר מכן חיתוך. לאחר ביצוע arteriotomy, להשתמש במלקחיים בסדר כדי להרים את פתיחת העורק ולדחוף את הבלון לתוך לומן. הבלון צריך להחליק בקלות דרך העורקים לתוך CCA. בהתאם מיקום החולדה זה עשוי להיות מועיל כדי להנחות את הבלון לתוך CCA באמצעות מלקחיים עדינים למשוך בעדינות כלפי מעלה בצד החיצוני של CCA תוך הנחיית קטטר בלון לתוך CCA. לאחר הבלון מוכנס לתוך CCA, קלטת קטטר למטה כך הבלון לא לצאת העורק כפי שהוא מנופח.

יישום Periadventitial של הטיפול מאפשר משלוח תרופות מקומי ומכוון רק באתר של פציעה. גישה זו מגבילה השפעות פוטנציאליות מחוץ ליעד, כמו גם מגבלות מינון בהשוואה למשהו שנמסר באופן שיטתי על ידי ממשלים אוראליים, תוך-אישיים או תוך ורידי. Pluronic-F127 הוא תרמו הפיך, כלומר הוא נוזלי בטמפרטורה קרה וג'לים בטמפרטורת החדר. זה מאפשר טיפולית להיות מוכן בקלות בתמיסה נוזלית לפני ג'לים פלורוני, בעוד הג'ל יכול להיות מיושם באופן שווה על העורק מיד לאחר פציעה. בעוד החלק העליון של CCA נגיש בקלות כדי לכסות ביעילות את כל אזור הפציעה CCA צריך להיות הרים בעדינות כדי לצפות את החלק התחתון של CCA. עם זאת, החוקרים צריכים להבטיח כוח המחקר כראוי כדי להסביר את השונות הפוטנציאלית בין בעלי חיים שטופלו. חשוב לקבל הערכה של גודל האפקט הצפוי ואת סטיית התקן של התוצאה כדי להפעיל את המחקר כראוי. המגבלה של שיטת הלידה periadventitial היא כי זה לא גישה רלוונטית קלינית מאז העורק של המטופל אינו חשוף במהלך אנגיופלסטיקה, אשר מבוצע כהליך מלעורי. עם זאת, יישום periadventitial מאפשר בדיקה ראשונית של מולקולות וביולוגיה מועברים באופן מקומי לאתר של פציעה^{15,27,28,29,30}.

השיטה הסטנדרטית הנוכחית לכימות היפרפלזיה ניאו-אינטמילית מבוססת על ניתוח מורפומטרי של שקופיות מוכתמות H&E. עורק העורק הראשי הפצוע נחתך פיזית על מגלשות בפרוסות של 5 מיקרומטר. שקופיות אלה מוכתמות לאחר מכן באמצעות H&E ותמונות נלקחות באמצעות מיקרוסקופ קל. תוכנת ImageJ משמשת לאחר מכן למדידת האזורים וההיקפים המופרדים על-ידי האינטימה, הלאמינה הפנימית ולמינה החיצונית. למרות שדיווחנו על דיוק מוגבר באמצעות 10 שקופיות לכמת היפרפלזיה¹⁹, אין קונצנזוס קיים בספרות על כמה שקופיות למדוד, עם מתודולוגיה דיווח נע בין 3 ל 10 חלקים במרווחים שווים (טבלה 1)^{31,32,33,34,35,36}. ניתן לצפות ליחס I:M של 0.8 עם סטיית תקן של 0.29 (n=11) באמצעות מתודולוגיה זו (טווח: 0.54-1.51). אנחנו ואחרים דיווחנו בעבר על מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות יריעות אור (LSFM) מספק גישה חדשנית להדמיית פגיעה עורקית^19,37. LSFM מאפשר הדמיה של העורק הראשי כולו במישור x, y ו- z. LSFM מאפשר חתך אופטי כדי ליצור חתכים עורקיים לניתוח, מניב הערכות מדויקות יותר של היפרפלזיה (מקדם וריאציה: 28% על ידי LSFM לעומת 41% על ידי היסטולוגיה) מאשר גישות היסטולוגיות מסורתיות^19,37. כפי שניתן לראות באיור 4, יחס ה-I:M המתקבל על ידי LSFM (0.86, n=1) דומה לתוצאות שהשגנו באמצעות ניתוח היסטולוגי קלאסי (0.8 ± 0.29).

לסיכום, הפגיעה הסגמנטלית הנשלטת על ידי לחץ מסכמת מחדש את תגובת הפגיעה בעורקים המתרחשת לאחר הליכי revascularization קליניים, מה שהופך אותו למודל אידיאלי לחקר הפתופיזיולוגיה של restenosis. יישום תרופה Periadventitial היא שיטת מסירה הוכחת הרעיון שימושי עבור assaying את היעילות הטיפולית של אספקת תרופות מקומית, והוא יכול ליידע את הפיתוח של גישות משלוח תרופות מערכתיות ממוקדות.

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים בנוגע לפרסום כתב יד זה.

N.E.B נתמכה על ידי מענק הכשרה מהמכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה (5T32ES007126-35, 2018), ומלגת קדם דוקטורט של איגוד הלב האמריקאי (20PRE35120321). E.S.M.B. היה חוקר KL2 נתמך חלקית על ידי UNC קליני ותרגום מדע פרס-K12 חוקרים תוכנית (KL2TR002490, 2018), ואת הלב הלאומי, ריאות, מכון הדם (K01HL145354). המחברים מודים לד"ר פבלו אריאל מהמעבדה לשירותי מיקרוסקופיה של UNC על הסיוע ב-LSFM. מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של יריעות אור בוצעה במעבדה לשירותי מיקרוסקופיה. המעבדה לשירותי מיקרוסקופיה, המחלקה לפתולוגיה ורפואת מעבדה, נתמכת בחלקה על ידי P30 CA016086 מרכז סרטן מרכז הליבה תמיכה מענק למרכז הסרטן מקיף UNC Lineberger.