Method Article
כאן, אנו מציגים זרימת עבודה עבור הביטוי, טיהור וליפופי מחייב של SNX-BAR הטרודימרים ב שמרים.
החלבונים SNX-BAR הם מחלקה שימור אבולוציונית של שיפוץ הממברנה חלבונים המשחקים תפקידי מפתח במיון ובסחר של חלבונים ושומנים במהלך אנדוקציטוזה, מיון בתוך מערכת אנדוזוממית, ו האוטומטית. מרכזי לפונקציה SNX-BAR חלבון היא היכולת ליצור הומודימרס או הטרודימרים הקושרים ממברנות באמצעות שימור מאוד phox-הומולוגיה (PX) ו בר (Bin/אמפיפילפסין/מ א) תחומים. בנוסף, oligomerization של SNX-בר דימרס על ממברנות יכול לעורר את היווצרות tubules קרום ושלפוחיות ופעילות זו היא חשבה לשקף את התפקודים שלהם כמו חלבונים מעיל עבור הובלה אנדובית נגזר. החוקרים מנוצלים זמן רב במחקרים מחייב מבחנה באמצעות רקומביננטי SNX-BAR חלבונים על ליפוזומים סינתטיים או unilamellar שלפוחיות ענק (GUVs) כדי לחשוף את האיפור המדויק של שומנים הדרושים כדי לנהוג שיפוץ הממברנה, ובכך לחשוף את המנגנון שלהם של פעולה. עם זאת, בשל אתגרים טכניים עם מערכות ביטוי כפול, רעילות של ביטוי חלבון SNX-BAR בחיידקים, ואת מסיסות העניים של הפרט SNX-BAR חלבונים, רוב המחקרים עד כה נבדקו SNX-בר הומודימרס, כולל di, שאינם פיסיולוגיים הטופס במהלך הביטוי בחיידקים. לאחרונה, יש לנו אופטימיזציה פרוטוקול כדי להתגבר על החסרונות העיקריים של מערכת ביטויים טיפוסית בקטריאלי. באמצעות זרימת עבודה זו, אנו מדגימים כיצד לבטא ולטהר בהצלחה כמויות גדולות של הטרודימרים SNX-BAR וכיצד ליצור מחדש אותם על ליפוזומים סינתטיים עבור כריכה ובטלציה assays אמר.
ממברנה מאוגד אורגלים כגון קרום הפלזמה, הרשתית האנדופלזמית, מנגנון golgi, ליזוזום (שמרים בלואים), ו אנדוטיפ מהווים את מערכת endomembrane של התא איקריוטית. לרוב המארגנים יש את היכולת לתקשר ולהחליף חומר עם מנשאים אחרים באמצעות נושאות הובלה של שלפוחית לפוחית. כיצד התא מתאם את האריזה והיווצרות של נושאות הובלה שלפוחית לפוחית בתוך מערכת endomembrane אינו מובן היטב. עם זאת, החלבונים והשומנים המהווים חלק ניכר מהמערכת הendomembrane, ידועים כנובעים מהפנמה ושלפוחיות מקרום הפלזמה (PM). האנדוכמה היא הקבלה העיקרית לשלפוחיות אלה והיא מורכבת ממספר סטים של מערכות מחוברות. הפונקציה העיקרית של אנדוכמה היא להקל על רכישת מזינים, לווסת חלבון ומחזור השומנים, להגן מפני זיהום הפתוגן, ולשמש מקור החידוש העיקרי של שומנים עבור קרום הפלזמה. כמו אנדוכמה מקבל את רוב המטען של חלבונים ושומנים מקרום הפלזמה, הוא משמש תא מיון על ידי בידוד מטענים לתוך נושאות הובלה אנדוזומלית צינורי (etcs). חלבונים שאינם מחולק ל-ETCs נותרו להיות מושפל באמצעות מערכת האנדו-ליסוזומל. דיסרגולציה של מיון מטענים לתוך etcs יכול להוביל לאובדן ספיגת מזינים, מחזור החלבון או הומאוסטזיס ליפיד, וכתוצאה מכך רבים מטבולית, התפתחותית, הפרעות נוירולוגיות1,2. עם זאת, למרות התפקיד המרכזי etcs ב אנדוכמה, המנגנון הבסיסי של איך אנדוכמה יכול באופן סלקטיבי לתאם את האריזה של המון מטענים הטרוגנית לתוך נושאות צינורי אינו ידוע.
המשפחה nexin מיון (snx) הוא מחלקה שימור אבולוציונית של חלבונים שנמצאו להיות קריטי עבור תגובות הובלה שלפוחית רבים בתא3,4,5. מיון nexins מגויסים הממברנה אנדוזום וסיוע בלכידת מטענים באמצעות מאפיין phox הומולוגיה האופיינית (PX), אשר מאגד זרחן-monophosphate (2), השומנים מועשר בקרום אנדוזום. יונקים לקודד 33 SNX חלבונים, אשר ניתן לחלק עוד לתוך משפחות משנה מרובות, על פי נוכחותם של תחומים אחרים1. בעיקר, SNX-BAR משפחה היא המשפחה המשנה הגדולה ביותר המורכבת של שתים עשרה בבני אדם, בעוד שמרים להאביק, סכביסים cerevisiae ס, משפחת התת מופחת רק שבעה snx-בארים. החלבונים SNX-BAR יש גם תחום PX וגם Bin-אמפיפילוסין-מ א (בר) התחום המפעיל מאגרים שומנים לאגד ממברנות עקמומיות חיובית. אפוא, משפחת SNX-BAR יש זיקה טבעית עבור אנדוזום והוא יכול לתווך ועוד היווצרות דרך שיפוץ הממברנה שלהם יכולות. ב מבחנה, תכונות שיפוץ של SNX-ברים יכול להיגרם על ידי תוספת של מטוהרים SNX-בארים ליפוזומים סינתטיים והיווצרות בעקבות צרה, tubules מצופה יכול להיות מדמיין על ידי אלקטרון מיקרוסקופ. באמצעות שיטות אלה, החוקרים קבעו כי גם ריכוז oligomerization וכוח מכווץ להיראות להשתנות בין משפחת SNX-BAR רומז שהם יכולים לסייע הן היווצרות המספריים של ETCs.
ה-SNX-פסי יכול להיות מסווג עוד יותר על ידי מאפייני dimerization בלעדית שלהם. בעלי מבחנה מתורבת ומחקרים מבניים הוכיחו כי החלבונים SNX-BAR יכול רק ליצור הומודימרים ספציפיים או הטרודיומרס. לכן, בעיקרון, כל פוטנציאל SNX-בר dimer-oligomer יכול לספק מעיל כדורית עבור מסלול מטען ספציפי הסחר ובדומה, oligomeriטיזציה מוגבלת של אחרים SNX-BAR protomers, יכול גם להגדיר שבילים ייצוא ברורים. עם זאת, בשל המספר הגדול של SNX-ברים וגיוון בתוך משפחת SNX, מיון אחד nexin-השערת מטען אחד הוא מאוד סביר. במקום זאת מאמץ מתואם באמצעות ריבוי של גורמים כגון SNX-ברים, מטענים, ספציפיות לשומנים ויחסי תלות אחרים סביר יותר. כמו כן, מחקרים שנעשו לאחרונה של משפחת שמרים SNX4 חשף ראיות לפרטים נוספים ליפיד, מעבר ל-Dins (3) P, כדי להיות הפוטנציאל של ספקיות התחבורה6. במחקר זה, snx-BAR הומודימר Mvp1-Mvp1 היה מטוהר מן החיידקים הטרודימרים הילידים Snx4-Atg20 ו Vps5-Vps17 ביטאו ומטוהרים בתשואה גבוהה של שמרים, בעוד Snx4-Atg20 נמצא להיות מרוצה באופן מיותר מחייב פוספוליייסרין (PS) וטופסמבנים כמו צינור צר ליפוכמה מ בעוד אחרים בשדה חשפו תכונות חשובות של snx-ברים באמצעות recombinantly מטוהרים snx-בר הומודימרס מן החיידקים, רעילות הקשורים בהבעת snx-bar הטרודימרס במערכות דומות הפריע האפיון המקורי שלהם7,8,9,10. לכן, ללא מערכת אמינה כדי להשיג recombinantly טהורה ביטא הטרודימרים הילידים, החוקרים חייבים לוותר על שורות אלה של חקירה. באיור 1, אנו מציגים זרימת עבודה ארבעה חלקים ל 1) לבנות זן שמרים להביע את הביטוי snx-BAR הטרודימרים עבור טיהור האהדה הדו, 2) מהיר ומטהר מקורי snx-BAR הטרודימרס, 3) להכין ליפוזומים unilamellar סינתטיים, ו 4) להגדיר ליפוכמה בעיות או מדידים, מתן כלי חיוני עבור חוקרים לחקור את הקטלוג הגדל של מיון nexins נמצא בטבע.
1. שמרים הזנים הבנייה
2. שמרים אינדוקציה ו SNX-בר Dimer טיהור
הערה: תאים שמרים ניתן להפיץ על YPD סטנדרטי (תמצית שמרים, peptone, ו 2% גלוקוז) לוחות אגר כאשר השינויים הם כרומוסומלית משולבים.
3. ליפומין הכנה
4. SNX-בר ליפוזום קשירה
פרוטוקול זה מתאר שיטה להפקת הייצור החזק של שמרים אנדוגניים מתחמי מערכות snx-BAR שניתן להשתמש בהם עבור שיפוץ קרום המטה ממברנה בחני (איור 1). הבנייה של זן שמרים המשמש לטיהור מנצל את היעילות של שילוב מחדש של הומוולוגי ב שמרים הנצה, המאפשר שינויים בבית גנומית של המוקד SNX-בארים (איור 2). עיצוב זה יש שני יתרונות, (אני) כבחירה אינו נדרש כדי לשמור על שינויים, בינונית YP סטנדרטי ניתן להשתמש, המאפשר צמיחה צפיפות התא גבוה יותר ולכן ייצור גבוה יותר של חלבון ו (ii) רמות הביטוי של SNX-בארים ממוקדות יהיה אפילו, אופטימיזציה של ייצור של קומפלקס הטרודימר. לפני תוספת של גלקטוז, SNX-ברים ממוקדות יהיה מוצג פנוטיפ null ובכך עלול לגרום לפגם גדילה או פגמים ידועים אחרים ספציפיים המיועדים SNX-ברים. יתר על כן, צמיחה ב 2% רפפיז ו 0.1% גלוקוז איטי יותר מאשר צמיחה ב 2% גלוקוז. לפיכך, תקופת הצמיחה לפני האינדוקציה של גלקטוז עשויה לדרוש אופטימיזציה לכל מאמץ מסוים. כדי לבדוק אינדוקציה נכונה של SNX-BAR ביטוי, כתם מערבי נגד תג ברז הוא כנראה נדרש מאז רמות החלבון של SNX-ברים לא ניתן לזהות באמצעות כתם Coomassieאיור 3. עם זאת, מאחר שרק חבר אחד במתחם SNX-BAR כולל תגית, ביטוי של החלבונים שאינם מתויגים לא יכול להיות מאושר אלא אם כן כל השלבים של הטיהור הושלמו. לאחר הטיהור של SNX-BAR הטרודימר, הלהקות של שני SNX-ברים צריך להיראות להיות ביחס 1:1 stochiometric וצריך להיות מעט לא להקות מזהם (איור 4, ליין 4). אם יש עוד להקות מזהם, ואת המתח ההתחלתי שמרים הוא כבר לקוי פרוטאז, מעכב פרוטאז יותר ניתן להוסיף במהלך הליזה תא. יתר על כן, צעד טיהור שני באמצעות שרף קלמודולין עשוי להתבצע.
בעת ניהול שיפוץ קרום ממברנה (איור 5), את הכנת ליפוזומים וחלבונים מטוהרים יש להשתמש באותו ניסוי. אם מספר ההכנות לטיהור החלבונים נדרשים כדי להגיע לריכוז הרצוי, לשלב את כל החלבון מטוהרים לפני לערוך ניסוי. ליפוזומים יש לעשות ולהשתמש בתוך אותו יום (שולחן 1). כאשר מבצעים ליפוכי משקעי שיפוע אומר, זה קריטי כי החלבון מטוהר הוא מראש באמצעות אותם תנאים משקעי של 100,000 x g עבור 20 דקות מיד לפני הדגירה עם ליפוזומים כמו חלבון זירז יכול להטות את התוצאות. יתר על כן, ליפופה גלולה צריך להישאר ללא שינוי לאחר משקעי.
איור 1: שיטת האיגוד של מאגד SNX-BAR. בקצרה, בשלבים 1-2, אנו מהנדס גל היזמים לתוך שני המקום הגנומי בר של SNX-BAR, החלפת כל אחד היזמים אנדודוגני ומהנדס C-טרמינל ברז תג לתוך אחד משני SNX-בר המקום. לאחר מכן, בשלבים 3-7, אנו מזרז את התאים עם גלקטוז ומטהר את הטרודימרים מסדרה "SNX-BAR" להומוגניות. בשלבים 8-12, אנו מחשבים ולהכין ליפוזומים unilamellar. לבסוף, אנחנו יכולים לשלב את הטרודימרים SNX-BAR עם ליפוזומים unilamellar ולבצע שני שאומר; שלב 14a-16a כרוך tubulation ממברנה ו 14a-16a לערב את הסדר שאיפה משקעי. עיין בטקסט לקבלת פרטים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: האסטרטגיה של שילוב SNX-BAR. שני SNX-BAR לוקוסים היו מיועדים ביטוי גל באמצעות שילוב הומוולוגי. SNX-BAR ORF1 (Atg20) היה ממוקד בנוסף כדי לבטא תג C-מסוף ברז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אימות האינדוקציה של גלקטוז. (א-ב) כדי לאמת את האינדוקציה של גל הAtg20-הברז, מומלץ לבצע ניתוח של כתמי נייר ומגוון מערבי של תמציות תאים המושרה ב-2% גלקטוז (א, ב, ליין 2) ובלתי המושרה (A, B, ליין 1). (ג) קרום כרוב מערבי הוא גם התפשט ונחקר עם anti-pgk1 עבור בקרת טעינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: טיהור דוגמה של Atg20-Snx4 הטרודימרס. תאי שמרים הAtg20 להביע את ה-ברז ו Snx4 מונע על ידי היזמים גלקטוז המושרה עם 2% גלקטוז, לאחר וכרוך באמצעות IgG הספרד, והוסטו עם פרוטאז TEV. דגימות מכל שלב של טיהור מוצג 10% SDS-עמוד. . ליין 1: המושרה על ידי הליפוסט ליין 2: המושרה הגלולה של ליפוסט. ליין 3: מדגם של חלבונים מאוגדים כדי IgG הספרד. ליין 4: TEV להתחמק טהור Atg20-Snx4 הטרודימרס מספרד IgG. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ליפופה מייצג ומחייב שיטת הקשירה. (א) סנקס-בר הטרודימרס, Atg20-Snx4 וVps5-Vps17 משמרים, הביעו ביטוי, מטוהרים וכבולים לליזומים סינתטיים כמתואר בטקסט. שימו לב כי הMvp1 צורות הומודימרים והיא באה לידי ביטוי בחיידק. (ב) מיקרוגרפים מסוג Snx4-Atg20 ליפוטמין ומדידות כדורית (שיבוץ). (ג) snx-מאגד בר ליפופי משתנים כמה יצירות היה ככמת על ידי densi, try. גרף מציין ממוצע ושגיאה סטנדרטית של הממוצע. * * p < 0.002. (ד) כדורית בדוגמת הטקסט, כתויינו ובגרף. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. קווי שגיאה מייצגים ניתוח דו-כיוון של סטיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הרכב ליפוחלק אופייני | מיכל הג | מיכל כדורי | Ergosterol | PI3P-C16 |
MW | 786.1 | 810.0 | 396.7 | 957.0 |
מול שבר | 49% | 30 | 20 | 1 |
מלאי ממ | 32.0 | 12.0 | 25.0 | 1.0 |
מסה (מ ג) | 385.2 | 243.0 | 79.3 | 9.6 |
ריכוז (mg/mL) | 25.2 | 9.7 | 9.9 | 1.0 |
אמצעי אחסון ל-RXN (mL) | 15.3 | 25.0 | 8.0 | 10.0 |
טבלה 1: ליפומין מתכון. ליפוזומים סינתטיים הוכנו באמצעות שילוב של הדוג, DOPS, ergosterol, ו PI3P. אנו מחשבים את הריכוז הסופי. ל -1 מול השומנים ההרכב הסטנדרטי שלנו כולל 20% ergosterol, 1% PI3P, DOPS (עד 30%), וכמויות שונות של ה-דוג. הטבלה כוללת ניסוח אופייני עבור 400 μL של 30% DOPS.
כאן, אנו מדגימים זרימת עבודה ממוטבת כדי לטהר את SNX-בר דימרס ב שמרים ושני שאומר להעריך את המאפיינים הביופיסיים שלהם על ליפוזומים סינתטיים. היתרון העיקרי על הביטוי האופייני חלבון רקומביננטי ב es, coli או מערכות אחרות היא היכולת לבטא באופן שווה את החלבונים SNX-BAR במארח יליד, ובכך הימנעות רעילות ובעיות מסיסות שנמצאו בטיהור snx-ברים במערכות אחרות. זה גם בולט כי המערכת שלנו לא דורשת שיבוט מולקולרי או מחסה של וקטורים ביטויים מרובים17. כפול שלנו SNX-בר שמרים זנים מונעים על ידי היזמים גלקטוז מהונדסים, ובכך להבטיח אפילו ביטוי על אינדוקציה. שיקול חשוב הוא כי בהיעדר גלקטוז, לא יהיה מעט לביטוי של SNX-ברים ממוקדות, ובכך התוצאה היא פנוטיפ null. יתר על כן, אנו מוצאים כי SNX-ברים נוטים לסבול את התגים C-terminal היטב, המאפשר לנו להוסיף את התגית הקש על C-טרמינוס. עם זאת, בהתאם לחלבון המתויג, ייתכן שנעשה שימוש בתגית ' מסוף N 'ב-12. בנוסף, מאז SNX-בארים רק טופס 1:1 dimers, רק חלבון אחד נדרש להיות מתויג למטרות טיהור. עם זאת, כמה SNX-בארים שבדרך כלל יוצרים הטרודימרס בתא הוכחו ליצור הומומרים תחת ריכוזי שאינם פיזיולוגיים7. לכן, זה קריטי כי על טיהור של הטרודימר, את היחס סטויכולמטרי של שני snx-ברים צריך להיות 1:1, אשר ניתן לאמת על ידי הפעלת סדרת מחלקים של מורכבות מטוהרים על sds-עמוד ג'ל וביצוע כתמים coomassie. לאחר הנדסה, אלה זנים שמרים ניתן לשמור על הנצח כמו 15% (v/v) מלאי גליצרול ב-80 ° צ' ו/או בנוסף שונה כדי לבצע שאילתות שותפים מחייב נוספים. זרימת העבודה שלנו בדרך כלל לוקח 2-3 שבועות עבור הבנייה זן ו 3-4 ימים עבור ביטוי וטיהור ו 1 יום עבור ליפוכמה מחייב הכריכה. אנו מאמינים כי זרימת עבודה זו יכולה לעזור לחוקרים עוד להבין את הספציפיות לשומנים של חלבונים snx-bar באמצעות חלבונים מקומיים בר על ליפוזומים סינתטיים או unilamellar לפוחית לפוחיות ענק (guvs) ולחשוף את האיפור המדויק של ליפידים הדרושים שיפוץ הממברנה, ובכך לחשוף את מנגנון הפעולה שלהם.
צעדים קריטיים
במהלך הניסיונות הראשונים שלנו לטיהור הטרודימרים SNX-BAR מתאי שאינם פרוטאז, לעתים קרובות מצאנו תשואות מופחת ומוצרי השפלה. לכן, במהלך השלבים הראשוניים של בניית הזנים, אנו מאמינים כי הוא קריטי כדי להתחיל עם זן שמרים הורים כי הוא חסר עבור אחד או יותר של מעבר מרכזי הפרוטאינסים העיקריים. בפרט, מצאנו זן שמרים TVY614, אשר מתרוקן עבור pep4, prb1, ו prc1, כדי להיות האופטימלי ביותר. באמצעות זן TVY614, אנחנו באופן קבוע להשיג > 90% טהור Snx4-Atg20 הטרודימרס (איור 4 ואיור 5א). עם זאת, את הצורך של כל שלושת הפרוטטינוסים להיות בלתי מתחברות עשוי להיות SNX-BAR שילוב ספציפי. לדוגמה, Vps5-Vps17 הטרודימרס כבר מטוהרים בהצלחה זנים שאינם פרוטאז לקוי10 וכאשר כללנו תוספת של הPEP4 אבלציה, אנו שומרים על עליות צנועות בתשואה וטוהר (איור 5א). לכן, בהתאם ליישומי המטה של המשתמש ואת הצורך טוהר או סמנים לבחירה, ייתכנו גמישות בעת עיצוב זנים הביטוי.
הסדר של בניית גנים הוא גם חשוב. אנו ממליצים על התיוג C-סופני הקש SNX-BAR ORF 1 הראשון, כדי לאשר ביטוי על ידי הכתם המערבי ללא צורך השראה גלקטוז (איור 1). במהלך האינדוקציה גלקטוז, הוא קריטי לתנאי קדם התאים בלילה ב 2% רפפיז ו-0.1% גלוקוז. אי מראש מצב התאים התוצאות בצמיחה איטית מאוד או מוות התאים. עם זאת, זה גם קריטי עבור התאים לרוקן את הגלוקוז הנותרים במהלך הצמיחה לילה, אחרת האינדוקציה גלקטוז יכול להיות מושפע לרעה. כמו כן, מומלץ לבדוק מספר מבודד על ידי הכתם המערבי כדי להעריך ביטוי הומוגניות של הברז מתויג של חלבונים SNX-BAR. אנחנו בדרך כלל מסך 2-3 מבודד לבחור את המועמד ביותר מכבש ביטוי.
שינויים, גישות חלופיות ויישומים עתידיים
בשלב 2.8, טיהור של אהדה דו-מושביים (ברז) בדרך כלל דורש טיהור שני שלבים באמצעות igg ו קלמודולין חרוזים לאחר מחשוף tev12. עם זאת, בפרוטוקול זה, אנו מאלטים snx-BAR דימרים על ידי פרוטאז tev עם תשואה גבוהה מאוד וטוהר. אנו מוצאים טיהור אהדה לאחר מכן באמצעות חרוזי קלמודולין מייצרת תשואה לא עקבית ומופחתת, ולכן אנו ממליצים לעצור לאחר מחשוף tev. TEV להתחמק מכיל את החלבונים SNX-BAR ואת שלו (6)-מתויג TEV פרוטאז יכול להיות מטוהרים נוספת על ידי Ni-נ. ת. ע. חרוזים. עם זאת, אנחנו גם מוצאים את השלב הזה יכול להפחית את התפוקה הכוללת של החלבון SNX-BAR והוא מיותר, מאז הפרוטאז TEV אינו מפריע ליפוכמה קשירה או מחייב. לכן, אם מטוהרים SNX-בארים ישמשו עבור כל יישום אחר, אנו ממליצים למשתמש להעריך את ההשפעה של פרוטאז TEV ב assays שלהם.
עד כה, הצלחנו באמצעות פרוטוקול זה ואת השינויים המתוארים כדי לטהר Snx4-Atg20 ו Vps5-Vps17 הטרודימרס ב שמרים העריכו בהצלחה ספציפיות שומנים שלהם על ליפוזומים סינתטיים. עם זאת, אנו מאמינים כי הפרוטוקול יכול להיות מותאם בהצלחה לכל אחד SNX-ברים בשמרים. ניתן גם להשתמש במערכת כדי לייצר רקומביננטי SNX-BAR חלבונים מכל אורגניזמים אחרים. עם זאת, זה ידרוש צעד נוסף של הבנייה זן לשלב לוקוס גנים אקסוגני לתוך הגנום שמרים. אנו גם מאמינים כי ניתן להרחיב את המערכת כדי לטהר מכלולי מולטימאריק כולל חלבונים מטענים. כך, אנו מאמינים מערכת ההבעה שלנו יכול להאריך מעבר להבנת השומנים מציין של SNX-ברים. יישומים עתידיים יאפשר לחוקרים ליצור מחדש מתחמי לכידת מטענים שלמים על ליפוזומים כדי להבין כיצד הרכבות מלא יכול להשפיע על שיפוץ הממברנה.
. למחברים אין מה לגלות
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר הפרס GM060221 ובחלקו על ידי המוסד הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המוסדות הלאומיים של בריאות תחת מספר הפרס T32GM007223. מ. פ. הייתה נתמכת בחלקו על ידי תוכנית המענקים למחקר של הפקולטה UNC-שארלוט.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 μm PC Membranes | Avanti | 610006 | |
10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
27 G needle | BD Biosciences | 301629 | |
Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
BCA assay | Pierce | 23225 | |
Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
DOPC | Avanti | 850375 | |
DOPS | Avanti | 840035 | |
Ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
Extruder Set with Block 0.2 μL/1 mL | Avanti | 610000 | |
FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 °C |
Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved