הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה

אנו מדגימים שיטה לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה על בסיס מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידרופזיס הפריה כפולה באמצעות מיקרוסקופ אפיפייתי.

צמחים פורחים יש מערכת ייחודית רבייה מינית בשם ' הפריה כפולה ', שבה כל אחד מתאי הזרע מנתיכים בדיוק עם תא ביצה או תא מרכזי. לפיכך, שני אירועי הפריה עצמאיים מתרחשים כמעט בו זמנית. תא הביצית המופרית והתא המרכזי מתפתחים לזיגוטה ולאנדוזרע, בהתאמה. לכן, שליטה מדויקת של הפריה כפולה חיונית להתפתחות הזרעים שלאחר מכן. הפריה כפולה מתרחשת בתוך הנקבה המאובמת (שק העובר), אשר מוסתרים עמוקות מכוסה ברקמה עבה ורקמות שחלות. הבנייה הזאת רקמת העור עושה התבוננות וניתוח של הפריה כפולה די קשה ויצר את המצב הנוכחי שבו שאלות רבות לגבי המנגנון של הפריה כפולה נותרו ללא מענה. עבור הערכה תפקודית של מועמד פוטנציאלי לווסת הדישון, ניתוח פנוטימית של הפריה חשוב. כדי לשפוט את השלמת ההפריה ב Arabidopsis thaliana, הצורות של אותות פלואורסצנטית תיוג גרעינים זרע משמשים אינדיקטורים. תא זרע שאינו מגיע להפרות מצוין על-ידי אות מעובה מחוץ למשחק הנשי, ואילו תא זרע שמפרה בהצלחה מצוין על-ידי אות שאינו מעובד כתוצאה מקריסוגמיה בגרעין המגיים הנשי. השיטה המתוארת כאן מספקת כלי לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה תחת בתנאים vivo.

צמחים פורחים לייצר זרעים באמצעות הפריה כפולה, תהליך זה נשלט ישירות על ידי אינטראקציות בין חלבונים מקומי על ממברנה פלזמה תא רבייה^1,2. פורח מפעל גברי, זוג תאים זרע, לפתח אבקה. שפופרת אבקה הצומחת לאחר האבקה מספקת זוג תאי זרע למשחק נקבה, תא ביצה ותא מרכזי, המתפתחים לתוך שק העובר. לאחר המשחק הגברי והנשי נפגשים, חלבונים על פני משטח גמטות לקדם הכרה, החזקה, והיתוך להשלים הפריה כפולה. במחקרים קודמים, קרום המשחק הגברי חלבונים תא מסוים 1 (GCS1)/הסיס 2 (HAP2)^3,4 ו-תא רבייה ביטא 2 (GEX2)⁵ זוהו כרגולטורים הפריה מעורבים היתוך תא רבייה ו מצורף, בהתאמה. לאחרונה זיהינו מDUF679 זכר הממברנה הספציפי חלבון, תחום ממברנה חלבון 9 (DMP9), כמו וסת הפריה מעורב אינטראקציה תא רבייה. מצאנו כי ירידה של DMP9 ביטוי התוצאות עיכוב משמעותי של הפריה תא ביצה במהלך הפריה כפולה ב . thaliana⁶.

כמו הפריה כפולה מתרחשת שק העובר, אשר מוטבע בתוך ביצית כי הוא עטוף עוד עם רקמת שחלות, קשה להתבונן ולנתח את מצבי תהליכים הפריה כפולה. מסיבה זו, עדיין יש הרבה נקודות ברורות שיגבילו הבנה מלאה של המנגנון כולו של בקרת הפריה כפולה. הקמת טכניקות התבוננות כדי לעקוב אחר התנהגותו של גמטות במהלך הפריה כפולה תחת בתנאים vivo היא הכרחית לניתוח פונקציונלי של מועמדים פוטנציאליים הפריה ווסת. מחקרים שנעשו לאחרונה הניבו קווי סמן שבו מבנים subcellular המשחק מסומנים עם חלבונים פלורסנט. במאמר זה, אנו מדגימים פרוטוקול פשוט ומהיר להתבוננות הפריה כפולה שהתרחשה שק העובר נגזר מpistils מלאכותית מלאכותי. באמצעות תא זרע הגרעין סמן קו HTR10-mRFP⁷, מצב הדישון של כל מגיים נקבה יכול להיות מופלים על בסיס של זרע המבנה הגרעיני האותות. הפרוטוקול שלנו מתמקד בשינוי מורפולוגי כזה של גרעיני הזרע בהפריה יכול להשיג ביעילות כמות מספקת של נתונים עבור הוכחה סטטיסטית. קו DMP9-מיקוד עם רקע HTR10-mrfp (DMP9^{KD/HTR10-mrfp}) שימש צמחים זכרים כדי להראות דפוס הפריה יחיד. הפרוטוקול מתאים גם לניתוח פונקציונלי של מוסבי הפריה אחרים.

1. האבקה מלאכותית

הערה: לפני שמתחילים בתהליך, נדרש זוג מלקחיים של No. 5.

1. הגדל thaliana (Col-0) ב -22 ° c תחת מחזור כהה של 16-h בחדר הגידול.
   הערה: גזור ולהסיר את קנה הפרח הראשון שפותח עם מספריים כדי לקדם את הפיתוח של ניצנים השחי. צמחים הגדלים במרץ (2-3 שבועות לאחר חיתוך של הקנה הראשון; גובה הצמח כ -25 ס מ) מתאימים לניתוח.
2. כדי לסרס, להסיר עלי גביע (איור 1b), כותרת (איור 1b), ו אבקן (איור 1b) של ניצנים פרח בשלב 11⁸ (איור 1b) באמצעות מלקחיים מס ' 5. ניצן עם פיסות של עלי כותרת לראות בראש הוא הטוב ביותר.
   הערה: השתמש המתאים הנקבה סמן קו הסימון. בפרוטוקול זה, השתמשנו בצמח סוג פראי כמו ההורה הנשי.
3. 15 עד 18 שעות לאחר אה, לקחת את אבקן של DMP9^{KD/HTR10-mrfp} פרח בשלב 13⁸ על ידי צובט את חוט הלהט עם מלקחיים.
4. כדי להאביק, בעדינות ללטף את הסטיגמה של מסורס פיסטיל מספר פעמים עם ביטול הריח.

2. הכנת ביצית להשגחה

הערה: הפריטים הבאים נדרשים: זכוכית שקופית עם קלטת כפולה מחוברת, מלקחיים מס ' 5, מחט הזרקת G 27, ומיקרוסקופ מבתר.

1. 7 כדי 8 h לאחר האבקה (האפ), לאסוף את פיסטיל ולמקם אותו על קלטת כפולה, ולאחר מכן לחץ בעדינות עם מלקחיים כדי לתקן את הפיסטיל על הקלטת (איור 2a, A ').
   הערה: רוב הברגי מקבל לפחות צינור אבקה אחד 10 האפ⁹. אם שניהם או כל אחד מתאי הזרע מן הצינור אבקה הראשון להיכשל להפרות, צינור אבקה השני יימשך על ידי הביצית בשל ההפריה הפריה מערכת¹⁰. כדי לנתח את המבנה של גרעין הזרע מצינור האבקה הראשון, מומלץ להשלים את ההכנה באמצעות 10 האפ לאחרונה.
2. חותכים את הקצוות העליונים והתחתונים של השחלה באמצעות מחט הזרקה תחת מיקרוסקופ מבתר (איור 2B, B ').
3. לחתוך את חומת השחלה לאורך שני צידי השזיף (איור 2c, C) על ידי הזזת קצה המחט הזריקה.
   הערה: הכנס את המחט הזריקה שתאפשר כדי למנוע הפרדה ביצית מן המחיצה.
4. אוורט את חומת השחלה באמצעות מחט ההזרקה (איור 2D, D ').
5. צבוט את בסיס המחיצה שאליה מחוברים המחוברים, והרימו אותו בזהירות עם מלקחיים (איור 2E).
6. העבר את המכסה לתוך טיפת מים על זכוכית שקופית, ובעדינות לכסות עם זכוכית כיסוי להתבוננות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית (איור 2E, E ').

3. מיקרוסקופיה

הערה: בפרוטוקול זה, השתמשנו מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית מצויד קוביית מסנן פלואורסצנטית (ראה טבלת חומרים), מצלמה דיגיטלית, ואת התוכנה המלווה.

1. השיגו תמונות של שימוש בגרעינים המכילים גרעיני זרע עם mRFP באמצעות עדשת המטרה 20x או 40x ומצלמה דיגיטלית מצוידת.
2. אשר את מספר גרעיני הזרע המסומנים ב-mRFP בתוך שק העובר.
   הערה: ניתן לכלול בגודל האוכלוסיה שני גרעיני זרע בעלי תוויות של mRFP לניתוח סטטיסטי.
3. אשר את הצורה והמיקום של כל גרעין הזרע שכותרתו mRFP בתוך שק העובר.
   הערה: מיד לאחר ששוחרר מצינור האבקה, זוג גרעיני זרע מרוכז בעלי תוויות של mRFP מותאמים לבין הביצה לתא המרכזי. גרעין הזרע של mRFP מסומן על ידי שזיהה בצד של הצ מציין הפריה תא מרכזית, למשל. על-ידי שימוש בשורה מתאימה בצורת סמן ממברנה, כפי שמוצג באיור המשלים 1, בין אם תא הזרע עובר פלמוסוגמיה (לאחר היתוך ממברנה אבל לפני קריומיה) ניתן לפקח בבירור.

מתוך פיסטיל מואבקים עם DMP9^{KD/HTR10-mrfp} נאספו ב 7-8 האפ ו נצפתה.

רוב בעלי התפקידים הכילו שני גרעיני זרע mRFP המסומנים בתווית על תא הביצית (מיקרופיללר בצד) והתא המרכזי (צד הקצה של charazal), בהתאמה (איור 3A), המציין הפריה כפולה מוצלחת. בנוסף, המכיל את גרעין הזרע של mRFP מתויג בגרעין התא המרכזי בתוספת גרעין מרוכז mRFP בתווית הזרע מחוץ לתא ביצה (איור 3B) נצפו, המציין הפריה אחת. במקרה של הפריה כפולה כושלת, שני גרעיני הזרע צפוף mRFP המסומנים נצפו בגבול תא ביצה ואת התא המרכזי (איור 3C), כמו בתאי זרע gcs1 מוטציה (איור 3c)^3,4 .

בניתוח באמצעות אבקה DMP9^{KD/HTR10-mrfp} , המכיל את גרעין הזרע מרוכז בתווית Mrfp (איור 4a) או שלוש או יותר גרעיני זרע בעלי תווית mrfp (איור 4a) נצפו לעתים נדירות.

איור 1: ניצנים פרח מתאים לאה. (א) ניצן פרח בשלב 11, מציג פיסות של עלי הכותרת בחלק העליון. (B-D) ניצן של פרח שבו הוסר את הגביע (ב) ואת עלי הכותרת (C) וזה היה אז מסורס לחלוטין (D). . הדיניות האלה עדיין לא התרחשו סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: זרימת ההכנה לדוגמא. ההליכים מוצגים על ידי איורים (a-e) ותצלומים (a '-e '). (A, A) פיסטיל ממוקם על קלטת כפולה מחוברת לזכוכית שקופית, והקצה העליון והתחתון שלו מנותקים עם מחט הזרקה. (ב, ב) קיר השחלה מונצח לאורך שני צדי השזיף. (ג, ג) שני צדי חומות השחלה נפתחות, מאווררות ולוחצים על הקלטת לתיקון. (D, D ') המחיצה שבה מחוברים. במערכים חשופים (E, E ') קצה אחד של המחיצה הוא צבט והרים למעלה עם מלקחיים. מחיצת המחיצה בעלת החיבור מועברת לטיפת מים על זכוכית שקופית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: פנוטיפים הפריה שנשפט על ידי זרע מורפולוגיה של אותות גרעיניים . בביצית (א) הפריה כפולה מוצלחת המצוינת על ידי שני גרעיני זרע בעלי תווית mrfp (ראשי חץ). (ב) הפריה בודדת על ידי DMP9^{KD/HTR10-mrfp} בתאי זרע המסומנים באחד משני התוויות של גרעין הזרע (ראש חץ) וגרעין מרוכז של mrfp בעלי תווית (חץ). (ג) נכשל הפריה כפולה על ידי DMP9^{KD/HTR10-mrfp} תאי זרע המצוינים על ידי שני גרעיני זרע מרוכז בעלי תוויות של mrfp (חיצים). (ד) דוגמה להפריה כפולה שנכשלה על ידי תאי זרע Gcs1^HTR10-mrfp . קו סימון שבו בשימוש בגרעין תא הביצית (EN) מסומן ב-RFP. שני גרעיני זרע מרוכז בעלי תוויות (חיצים) נעצרו ללא הפריה ב 18 האפ. (ה) תרשים סכימטי של ביצית. EC = תא ביצה, CC = תא מרכזי, SC = תאים סינארגד, ES = שק העובר, MP = מיקרופייל, CHZ = מסוף החלב. קנה מידה של סרגלים = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: פוטנציאל אחר פנוטיפים לדישון. כולל מתוך פיסטיל מואבקים עם^{DMP9 KD/HTR10-mrfp} לעתים נדירות מכילים גרעין זרע דחוס מרוכז בתווית (a), או שלושה או יותר מרוכז בתוויות של גרעיני זרע (ב) (חיצים). קנה מידה של סרגלים = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: גרעיני זרע מעובה במהלך הפריה, שנשפט על ידי שילוב עם שורה של קרום פלזמה נקבה הסמן. Pfwa:: gfp-פיפ שבו קרום הפלזמה התא המרכזי הוא דמיינו שימש נקבה ההורה (gfp). בנוסף, GFP-פיפ מתייג גם את אנדו ממברנות¹². הבריר מכיל שני גרעיני זרע מרוכז בעלי תוויות של mRFP (חצים; RFP). האות RFP ב charazal בצד קצה (החץ) מוצג בתא המרכזי (מיזוג), המציין כי גרעין הזרע הוא פלמוסוגמיה (לאחר היתוך קרום המשחק, אבל לפני קריומיה). החלונית מימין היא הגדלה של האזור המוקף בקווים מקווקווים בתמונה הממוזגת. אזור ריק המסומן בכוכבית מקביל למיקום של גרעין התא המרכזי. הקו המקווקו מציין את קו המתאר של התא המרכזי הפונה לתא הביצה. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

HTR10-mRFP תוויות כרומטין אבהי (כלומר, לדמיין גרעיני תא זרע), ואת הדינמיקה הפריה כפולה דווחו⁷. מיד לאחר שחרורו מצינור אבקה, גרעיני זרע HTR10-mRFP עדיין צפוף. עם זאת, כל גרעין הזרע הוא לפרק עם מיזוג עם הגרעין הנקבי מגיים הנקבה בקאריומיה שלוש עד ארבע שעות לאחר פיוז ' ן קרום ממברנה⁷. תאי זרע לא מופרות נשארים מעובה, כפי שניתן לראות בתוך שק העובר שבו gcs1 תאי זרע נעצרו ללא הפריה (איור 3d). בדרך כלל, כאשר HTR10 פורייה-mrfp משמש ההורה אבקה, 57.9% ± 17.8% (ממוצע ± ש גויטיין; n = 16 pistils) של העבדת בתוך פיסטיל ב 7-8 האפ מכילים שני אותות גרעיני הזרע התווית mrfp, וכמעט כל האותות (97.2%) הם לפרק, המשקף הפריה כפולה מוצלחת (דפוס האות דומה מוצג באיור 3A). במקרה של DMP9^{KD/HTR10-mrfp}, המכיל שני גרעיני זרע mrfp בעלי תוויות שנצפו בתדר דומה לזה של HTR10-mrfp, אבל 17.6% מהם הראו הפריה בודדת⁶. אימצנו את הדינמיקה HTR10-mRFP להשגחה של מספר רב של בעיות בתנאים vivo באמצעות מיקרוסקופ אפיפייתי. הפרוטוקול הוא פשוט ומהיר, המאפשר איסוף מידע מספיק עבור הוכחה סטטיסטית. שימוש בפרוטוקול זה כמופע הראשון, המשמעות של הפריה יחידה של התא המרכזי על ידי תאי זרע DMP9^{KD/HTR10-mrfp} הוכח⁶.

מבוסס על הבדלים מורפולוגיים של גרעיני זרע HTR10-mRFP המופק מצינור אבקה אחד, דפוסי הדישון מסווגים לשלושה פנוטיפים: (1) הפריה כפולה מוצלחת, אשר מאופיין על ידי שני מפרק HTR10-mRFP עם התווית של גרעיני זרע (איור 3A); (2) הפריה יחידה, הכוללת אחד מרוכז HTR10-mRFP התווית הגרעין זרע ואחד לפרק HTR10-mRFP התווית הגרעין (איור 3B); ו (3) נכשל הפריה כפולה, שיש לו שני גרעיני HTR10-mRFP בעלי תווית זרע (איור 3C).

גורמים פוטנציאליים אחרים של פנוטיפים (2) ו (3) יש לשקול. דווח כי תאי זרע בהתאמה להתחיל פלסטלינה עם תא ביצה או תא מרכזי מספר דקות לאחר שוחרר לתוך שק העובר תחת התנאים החצי מבחנה התרבות¹¹. בנוסף, זמן השהיה של כמה דקות קיים בין ההפריה הראשונה והשניה, למרות שאין העדפה לסדר ההפריה של תא הביצית והתא המרכזי¹¹. לכן, זוג גרעיני זרע דחוס ומעובה ב פנוטיפ (2) עשויים להצביע על השהיה בין הדשנים במקום הפריה בודדת. כדי לאשר את התרחשות הפריה יחידה בתדר משמעותי ב-פנוטיפ (2), יש לבדוק מספר דוגמאות מספיקות לניתוח סטטיסטי. פניטיפ (3), שיש לו שני גרעיני זרע מרוכז (איור 3C), יכול לשקף תקופה של חוסר ניידות של תאי זרע לפני היתוך קרום פלזמה¹² או את התקופה בין פלמומיה וקריומיה. לכן, שני גרעיני זרע מרוכז ב 7-8 האפ לא משקפים באופן מלא ' כשל ' של הפריה כפולה, והיה צורך להתבונן בזמן מאוחר יותר לאחר האבקה כדי להעריך את ההצלחה או הכישלון של הפריה כפולה. בהקשר זה, מומלץ לראות את ההתבוננות ב-16-18, כיוון שרוב הבעלי החוליות היו משלים הפריה כפולה עם תאי זרע שנמסרו על-ידי צינור האבקה הראשון, ואותות HTR10-mRFP של גרעיני זרע לא מופרות יישארו עד הפעם הבאה יום של האבקה, כפי שמוצג באיור 3D.

תבנית של בודד דחוס HTR10-mRFP התווית הגרעין (איור 4A) זוהה לעתים נדירות, אשר היה סביר בשל היעלמות מהירה של אחר HTR10-mrfp האות של אבהי במשחק הנשי המופרית כתוצאה הפריה אחת. בניתוח זה, שלושה או יותר HTR10-mRFP בעלי תוויות זרע זוהו גם כמקרה נדיר (איור 4B), בשל קבלת שפופרת אבקת אבקה השני על ידי מערכת ההפריה הפריה¹⁰. בפרוטוקול זה, מקרים אלה לא נכללו בנתונים, כי מעקב אחר התנהגויות של שני תאי זרע הנגזרים מצינור אבקה אחד הוא קריטי להערכה מדויקת.

מאז הקוטביות עבור התנוחות של הנקבה מגיים בתוך שק העובר מוסדר היטב (כלומר, תא הביצית ואת התא המרכזי להבדיל ב micropylar ואת הצד chalazal, בהתאמה), אשר מגיים נקבה היא דשנים ניתן לשפוט על ידי הקרוב עמדות של גרעיני הזרע בעלי תווית mRFP. עם זאת, קיימת הגבלה בהבחנה בין המדינות הבלתי מופרות לבין מדינות פלסטיות, מכיוון ששתי המדינות מסומנות באות של גרעיני זרע מרוכז. כדי להעריך בדיוק אם היתוך לאחר ממברנה הפיוז התרחשה או לא כאשר גרעיני הזרע מעובה, הוא נדרש להשתמש בקווי ממברנה ממברט לסמן שורות, כפי שדווח על ידי טקהאשי et al. (2018)⁶. לדוגמה, כאשר Pfwa:: צמח GFP-פיפ ¹² שבו קרום הפלזמה של התא המרכזי היה דמיינו שימש כהורה נקבה, ברור כי תא זרע התמזגו עם התא המרכזי היה בפלמומיה (איורמשלים 1 ).

לסיכום, הפרוטוקול שלנו המתואר כאן יכול לשמש להערכת סטטיסטית של הצלחה או כישלון הפריה בכל מגיים נקבה. למרות התעסוקה של סמן ממברנה פלזמה הנשי נדרש כדי לשפוט את הפלמומיה, השיטה שלנו היא שימושית ניתוח פונקציונלי של וסת הדישון.

. למחברים אין מה לגלות

עבודה זו נתמכת על ידי החברה היפן לקידום המדע KAKENHI מענק (JP17H05832 T. I.) ועל ידי מימון של תוכנית קידום המחקר בעדיפות אסטרטגית על פיטוכימיקלים הצמח מדעי מולקולרית, אוניברסיטת צ'יבה (יפן).