Evaluación del Estado de Fertilización mediante el seguimiento de la morfología nuclear de los espermatozoides en la doble fertilización de Arabidopsis

Demostramos un método para determinar la fertilización exitosa o fallida sobre la base de la morfología nuclear espermática en la fertilización doble de Arabidopsis utilizando un microscopio de epifluorescencia.

Las plantas con flores tienen un sistema de reproducción sexual único llamado "doble fertilización", en el que cada una de las células espermáticas se fusiona con precisión con una célula de óvulo o una célula central. Por lo tanto, dos eventos de fertilización independientes tienen lugar casi simultáneamente. La célula fértil del óvulo y la célula central se desarrollan en cigota y endospermo, respectivamente. Por lo tanto, el control preciso de la doble fertilización es esencial para el desarrollo de semillas subsiguientes. La doble fertilización ocurre en el gametofito femenino (sac embrionario), que está profundamente oculto y cubierto con tejidos gruesos de ovulo y ovario. Esta construcción de tejido pistilo hace que la observación y el análisis de la doble fertilización sean bastante difíciles y ha creado la situación actual en la que muchas preguntas sobre el mecanismo de doble fertilización permanecen sin respuesta. Para la evaluación funcional de un candidato potencial para el regulador de la fertilización, el análisis fenotípico de la fertilización es importante. Para juzgar la realización de la fertilización en Arabidopsis thaliana, las formas de señales de fluorescencia que etiquetan núcleos espermáticos se utilizan como indicadores. Una célula espermática que no fertiliza se indica mediante una señal de fluorescencia condensada fuera de los gametos femeninos, mientras que una célula espermática que fertiliza con éxito está indicada por una señal decondensada debido a la karyogamía con el núcleo de los gametos femeninos. El método descrito aquí proporciona una herramienta para determinar la fertilización exitosa o fallida en condiciones in vivo.

Las plantas con flores producen semillas a través de la doble fertilización, un proceso que se controla directamente mediante interacciones entre proteínas localizadas en la membrana plasmática gameto^1,2. La floración de los gametos masculinos de las plantas, un par de espermatozoides, se desarrollan en el polen. Un tubo de polen que crece después de la polinización entrega un par de espermatozoides a gametos femeninos, una célula de óvulo y una célula central, que se desarrollan en un saco embrionario. Después de que los gametos masculinos y femeninos se encuentran, las proteínas en la superficie del gameto promueven el reconocimiento, el apego y la fusión para completar la doble fertilización. En estudios anteriores, las proteínas de membrana de gameto masculino GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)^3,4 y GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)⁵ se identificaron como reguladores de fertilización involucrados en la fusión de gametos y adjunto, respectivamente. Recientemente identificamos una proteína de membrana específica del gameto masculino, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), como un regulador de fertilización involucrado en la interacción de gametos. Encontramos que una disminución de la expresión DMP9 resulta en una inhibición significativa de la fertilización de células de óvulo sin efecto durante la fertilización doble en A. thaliana⁶.

Como la fertilización doble se produce en un saco embrionario, que está incrustado en un óvulo que se envuelve aún más con tejido ovárizado, es difícil observar y analizar los estados de los procesos de fertilización doble. Por esta razón, todavía hay muchos puntos poco claros que dificultan una comprensión completa de todo el mecanismo de control de doble fertilización. El establecimiento de técnicas de observación para rastrear el comportamiento de los gametos durante la doble fertilización en condiciones in vivo es indispensable para el análisis funcional de los posibles candidatos para los reguladores de fertilización. Estudios recientes han dado lugar a líneas de marcadores donde las estructuras subcelulares gameto están etiquetadas con proteínas fluorescentes. En este artículo, demostramos un protocolo simple y rápido para observar la doble fertilización que se ha producido en un saco embrionario derivado de pistilos polinizados artificialmente. Utilizando la línea de marcador de núcleo de células espermáticas HTR10-mRFP⁷, el estado de fertilización de cada gameto femenino puede ser discriminado sobre la base de la morfología de la señal nuclear de espermatozoides. Nuestro protocolo centrado en tal cambio morfológico de los núcleos espermáticos en la fertilización puede obtener eficientemente una cantidad suficiente de datos para la prueba estadística. Se utilizó una línea de derribo DMP9con fondo HTR10-mRFP (DMP9^{KD/HTR10-mRFP}) como plantas masculinas para mostrar un único patrón de fertilización. El protocolo también es adecuado para el análisis funcional de otros reguladores de fertilización.

1. Polinización artificial

NOTA: Antes de iniciar el proceso, se requiere un par de fórceps No. 5.

1. Crecer A. thaliana (Col-0) a 22oC bajo un ciclo oscuro de 16h de luz/8-h en una cámara de crecimiento.
   NOTA: Corta y retira el primer tallo de flor desarrollado con tijeras para promover el desarrollo de cogollos axilares. Las plantas de crecimiento vigoroso (2-3 semanas después del corte del primer tallo; altura de la planta alrededor de 25 cm) son adecuadas para el análisis.
2. Para emascular, retire el sépalo (Figura1B),el pétalo (Figura1C)y el estambre (Figura1D)de los brotes de flores en la etapa 11⁸ (Figura1A)utilizando el N.o 5 fórceps. Bud con trozos de pétalos vistos en la parte superior es mejor.
   NOTA: Utilice una línea de marcador de gameto hembra adecuada. En este protocolo, usamos una planta de tipo salvaje como madre hembra.
3. Quince a dieciocho horas después de la emasculación, tomar el estambre de una flor DMP9^{KD/HTR10-mRFP} en la etapa 13⁸ pellizcando el filamento con fórceps.
4. Para polinizar, acaricie suavemente el estigma de un pistilo emasculado varias veces con una antera dehiscente.

2. Preparación de Ovule para la observación

NOTA: Se requieren los siguientes elementos: un vidrio deslizante con cinta adhesiva de doble cara, fórceps No. 5, una aguja de inyección de 27 G y un microscopio de disección.

1. 7 a 8 h después de la polinización (HAP), recoja el pistilo y colóquelo en la cinta de doble cara, luego presione suavemente con fórceps para fijar el pistilo en la cinta (Figura2A, A').
   NOTA: La mayoría de los óvulos de un pistilo reciben al menos un tubo de polen 10 HAP⁹. Si ambos o cualquiera de los espermatozoides del primer tubo de polen no se fertilizan, un segundo tubo de polen sería atraído por el óvulo debido al sistema de recuperación de fertilización¹⁰. Para analizar la morfología de los núcleos espermáticos desde el primer tubo de polen, se recomienda completar la preparación del óvulo por 10 HAP a más tardar.
2. Cortar los extremos superior e inferior del ovario con una aguja de inyección bajo un microscopio de disección (Figura2B,B').
3. Cortar la pared oválica a lo largo de ambos lados de la replum (Figura2C, C') moviendo la punta de la aguja de inyección.
   NOTA: Inserte la aguja de inyección superficialmente para evitar la separación del óvulo del tabique.
4. Evert la pared del ovario utilizando la aguja de inyección (Figura2D,D').
5. Pellizcar la base del tabique al que están conectados los óvulos, y levantarla cuidadosamente con fórceps (Figura2E).
6. Transfiera los óvulos a una gota de agua en un cristal deslizante y cubra suavemente con un vidrio de cubierta para observación bajo un microscopio de fluorescencia (Figura2E,E').

3. Microscopía

NOTA: En este protocolo, utilizamos un microscopio de epifluorescencia equipado con un cubo de filtro de fluorescencia (ver Tabla de Materiales),una cámara digital y el software que lo acompaña.

1. Adquiere imágenes de óvulos que contienen núcleos de esperma etiquetados con mRFP utilizando una lente objetivo 20x o 40x y la cámara digital equipada.
2. Confirme el número de núcleos espermáticos etiquetados con mRFP en un saco embrionario.
   NOTA: Los ovulos que contienen dos núcleos de espermatozoides etiquetados con mRFP se pueden incluir en el tamaño de la población para el análisis estadístico.
3. Confirme la forma y la posición de cada núcleo espermático etiquetado por mRFP en un saco embrionario.
   NOTA: Inmediatamente después de ser liberado de un tubo de polen, un par de núcleos de espermatozoides con etiqueta mRFP condensados se localizan entre el óvulo y la célula central. Un núcleo espermático descondensado etiquetado por mRFP detectado en el lado del extremo chalazal indica fertilización de células centrales, por ejemplo. Mediante el uso de una línea de marcador de membrana gameto hembra adecuada, como se muestra en la Figura Suplementaria 1 , si la célula espermática está experimentando plasmogamia (después de la fusión de membrana pero antes de la karyogamía) puede ser monitoreado claramente.

Los ovules de un pistilo polinizado con DMP9^{KD/HTR10-mRFP} fueron recogidos a 7-8 HAP y observados.

La mayoría de los óvulos contenían dos núcleos de espermatozoides descondensados etiquetados con mRFP en las posiciones del núcleo de la célula del óvulo (lado micropylar) y de la célula central (lado final del carácter), respectivamente (Figura3A),lo que indica una fertilización doble exitosa. Además, se observaron ovules que contienen un núcleo espermático descondensado etiquetado por mRFP en el núcleo de la célula central más un núcleo espermático con la etiqueta mRFP condensado fuera de la célula del óvulo (Figura3B),lo que indica una sola fertilización. En caso de doble fertilización fallida, se observaron dos núcleos de espermatozoides con etiqueta mRFP condensados en el límite de la célula del óvulo y la célula central (Figura3C),como en las células espermáticas mutantes gcs1 (Figura3D)^3,4 .

En el análisis utilizando polen DMP9^{KD/HTR10-mRFP,} rara vez se observaron ovules que contienen un único núcleo espermático etiquetado con mRFP condensado (Figura4A)o tres o más núcleos de espermatozoides etiquetados por mRFP (Figura4B).

Figura 1: Cogollos de flores adecuados para la emasculación. (A) Un brote de flores en la etapa 11, que muestra trozos de los pétalos en la parte superior. (B-D) Un brote de flores en el que se retiraron los sépalos (B) y pétalos (C) y que luego fue emasculado completamente (D). La dehiscencia de la antevanencia aún no ha ocurrido. Barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Flujo de preparación de muestras de óvulos. Los procedimientos se muestran mediante ilustraciones (A-E) y fotografías (A'-E'). (A, A') Un pistilo se coloca en cinta adhesiva de doble cara unida a un vidrio deslizante, y sus extremos superior e inferior se cortan con una aguja de inyección. (B, B') La pared del ovario está incisado a ambos lados del replum. (C, C') Ambos lados de las paredes del ovario se abren, se ven y se presionan sobre la cinta para su fijación. (D, D') El tabique donde los óvulos están conectados en matrices se expone. (E, E') Un extremo del tabique se pellizca y se levanta con fórceps. El tabique con los óvulos de conexión se transfiere a una gota de agua en un cristal deslizante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Fenotipos de fertilización juzgados por morfología de la señal nuclear espermática en el óvulo. (A) Fertilización doble exitosa indicada por dos núcleos de espermatozoides con etiqueta mRFP descondensados (cabezas de flecha). (B) Fertilización única por células espermáticas DMP9^{KD/HTR10-mRFP} indicadas por un núcleo espermático descondensado etiquetado por mRFP (cabeza de flecha) y un núcleo espermático con etiqueta mRFP condensado (flecha). (C) Alta fertilización doble por células espermáticas DMP9^{KD/HTR10-mRFP} indicadas por dos núcleos espermáticos (flechas) con la etiqueta mRFP condensados. (D) Un ejemplo de fertilización doble fallida por los espermatozoides gcs1^HTR10-mRFP. Se utilizó una línea marcadora donde el núcleo de células de óvulos (EN) está etiquetado con RFP. Dos núcleos espermáticos (flechas) con etiqueta mRFP condensados se detienen sin fertilización a 18 HAP. (E) Ilustración esquemática de un óvulo. EC - célula de huevo, CC - célula central, SC - células sinérgicas, ES - saco de embriones, MP - micropyle, CHZ - extremo chalazal. Barras de escala a 20 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Otro potencial fenotipos de fertilización. Los ovules de un pistilo polinizado con DMP9^{KD/HTR10-mRFP} rara vez contienen un único núcleo espermático con la etiqueta mRFP condensado (A), o tres o más núcleos espermáticos con etiqueta mRFP condensados (B) (flechas). Barras de escala a 20 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Núcleos de espermatozoides condensados en la plasmogamia durante la fertilización, juzgados por combinación con una línea de marcador de membrana plasmática femenina. pFWA::GFP-PIP donde se visualiza la membrana plasmática de la célula central se utilizó como padre femenino (GFP). GFP-PIP también etiqueta las membranas endo¹². El óvulo contiene dos núcleos espermáticos con la etiqueta mRFP condensados (flechas; RFP). La señal RFP en el lado final de los caracteres (flecha) se muestra en la célula central (Combinar), lo que indica que el núcleo espermático está en plasmogamia (después de la fusión de la membrana del gameto, pero antes de la karyogamía). El panel de la derecha es una ampliación del área rodeada de líneas discontinuas en la imagen combinada. Un área en blanco marcada con un asterisco corresponde a la posición del núcleo de la célula central. La línea discontinua indica el contorno de la célula central frente a la célula de huevo. Barra de escala a 20 m. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Etiquetas HTR10-mRFP cromatina paterna (es decir, visualiza núcleos de células espermáticas), y la dinámica en la fertilización doble se han reportado⁷. Inmediatamente después de la liberación de un tubo de polen, los núcleos de espermatozoides con etiqueta HTR10-mRFP todavía se condensan. Sin embargo, cada uno de los núcleos espermáticos se descondensa al fusionarse con un núcleo de gameto femenino fertilizado en karyogamy de tres a cuatro horas después de la fusión de la membrana del gameto⁷. Los espermatozoides no fecundados permanecen condensados, como se muestra en un saco embrionario en el que las células espermáticas gcs1 son arrestadas sin fertilización (Figura3D). Por lo general, cuando el HTR10-mRFP fértil se utiliza como el padre del polen, 57,9% a 17,8% (media s.d.; n a 16 pistilos) de los ovules en un pistilo a 7-8 HAP contienen dos señales de núcleos espermáticos etiquetados por mRFP, y casi todas las señales (97,2%) se descondensan, reflejando la doble fertilización exitosa (un patrón de señal similar se muestra en la Figura 3A). En el caso de DMP9^{KD/HTR10-mRFP}, se observaron ovules que contenían dos núcleos de espermatozoides etiquetados con mRFP a una frecuencia similar a la de HTR10-mRFP,pero el 17,6% de ellos mostraron una sola fertilización⁶. Adoptamos la dinámica HTR10-mRFP para la observación de un gran número de óvulos en condiciones in vivo utilizando un microscopio de epifluorescencia. El protocolo es simple y rápido, lo que permite la recopilación de datos suficientes para la prueba estadística. Utilizando este protocolo como primera instancia, se demostró la importancia de la fertilización única de la célula central por las células espermáticas DMP9^{KD/HTR10-mRFP 6}.

Sobre la base de las diferencias morfológicas de los núcleos de espermatozoides etiquetados con HTR10-mRFP derivados de un tubo de polen, los patrones de fertilización se clasifican en tres fenotipos: (1) fertilización doble exitosa, que se caracteriza por dos descondensados Núcleos de espermatozoides etiquetados con HTR10-mRFP (Figura3A); 2) fertilización única, que cuenta con un núcleo espermático con etiqueta HTR10-mFP condensado y un núcleo espertoso etiquetado con HTR10-mRFP descondensado (Figura3B); y (3) doble fertilización fallida, que tiene dos núcleos de espermatozoides con la etiqueta HTR10-mRFP condensados (Figura3C).

Se deben considerar otras causas potenciales de fenotipos (2) y (3). Se ha informado que las células espermáticas respectivamente comienzan la plasmogamia con una célula de óvulo o célula central varios minutos después de ser liberadas en un saco embrionario bajo condiciones de cultivo semi-in vitro¹¹. Además, existe un desenlace temporal de unos minutos entre la primera y la segunda fertilización, aunque no hay preferencia por el orden de fertilización de la célula del óvulo y la célula central^11. Por lo tanto, un par de núcleos espermáticos condensados y descondensados en fenotipo (2) podría indicar un desenlace de tiempo entre las fertilizaciones en lugar de la fertilización única. A fin de confirmar la aparición de una sola fertilización a una frecuencia significativa en el fenotipo (2), debe examinarse una serie de muestras suficientes para el análisis estadístico. El fenotipo (3), que tiene dos núcleos espermáticos condensados (Figura3C),podría reflejar un período de inmovilidad de las células espermáticas antes de la fusión de la membrana plasmática¹² o el período entre la plasmogamia miomía y la karyogamia. Por lo tanto, dos núcleos de espermatozoides condensados a 7-8 HAP no reflejan completamente el "fracaso" de la fertilización doble, y es necesario observar los óvulos en un momento posterior después de la polinización para evaluar el éxito o fracaso de la doble fertilización. En este sentido, se recomienda la observación del ovulo en 16-18 HAP, porque la mayoría de los óvulos habrían completado la fertilización doble con células espermáticas suministradas por el primer tubo de polen, y las señales HTR10-mRFP de núcleos espermáticos no fecundados permanecerían hasta el siguiente día de polinización, como se muestra en la Figura 3D.

Rara vez se detectó un patrón de núcleo espermático con etiqueta HTR10-mFP (Figura4A),lo que probablemente se debió a la rápida desaparición de otra señal paterna De Tr10-mRFP en el gameto femenino fertilizado como resultado de una sola fertilización. En este análisis, también se detectaron tres o más núcleos de espermatozoides etiquetados con HTR10-mRFP como un caso poco frecuente (Figura4B),debido a la aceptación del segundo tubo de polen por el sistema de recuperación de fertilización¹⁰. En este protocolo, estos casos fueron excluidos de los datos, porque el rastreo de los comportamientos de dos células espermáticas derivadas de un tubo de polen es crítico para una evaluación precisa.

Dado que la polaridad para las posiciones de los gametos femeninos en un saco embrionario está bien regulada (es decir, la célula de óvulo y la célula central diferencian en el micropylar y el lado chalazal, respectivamente), qué gameto femenino está fertilizando puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente puede ser juzgado por el pariente posiciones de los núcleos de espermatozoides etiquetados por mRFP. Sin embargo, hay una limitación en la distinción entre estados no fecundados y plasmogamia, porque ambos estados están indicados por la señal de núcleos espermáticos condensados. Para evaluar con precisión si la plasmogamia después de la fusión de la membrana de los gametos se ha producido o no cuando se condensan los núcleos espermáticos, es necesario utilizar líneas de marcadores de membrana de gameto femenino, según lo informado por Takahashi et al. (2018)⁶. Por ejemplo, cuando una planta pFWA::GFP-PIP ¹² en la que se visualizó la membrana plasmática de células centrales se utilizó como padre femenino, está claro que una célula espermática fusionada con la célula central estaba en plasmogamia (Figurasuplementaria 1 ).

En resumen, nuestro protocolo descrito aquí se puede utilizar para la evaluación estadística del éxito o fracaso de la fertilización en cada gameto femenino. Aunque el empleo del marcador de membrana plasmática hembra es necesario para juzgar la plasmogamia, nuestro método es útil para el análisis funcional del regulador de fertilización.

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo fue apoyado por la beca KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JP17H05832 a T. I.) y por la financiación del Programa Estratégico de Promoción de la Investigación Prioritaria sobre Ciencias Moleculares Plantas Fitoquímicas, Universidad de Chiba (Japón).