Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ב פרוטוקול זה, נתאר את הסינתזה של התרמילים, phenyoxadiazolyl מתיל מבוססי sulfone ריאגנט של הקובץ המצורף באתר סלקטיבית של מטענים תיולים של מולקולות, במיוחד נוגדנים. בנוסף, נתאר את סינתזה ואפיון של chelator bifunctional של תרמילי מניבי, ההטיה שלה נוגדן מודל.

Abstract

הגששים bifunctional Maleimide מניבי יש כבר מועסקים במשך עשרות שנים על השינוי באתר סלקטיבית של תיולים במולקולות, במיוחד נוגדנים. עדיין מבוסס maleimide conjugates להציג ויוו מוגבל יציבות כי ניגודים thioether succinimidyl ניתן לעבור ריאקציה רטרו-מיכאל. זה, כמובן, יכול להוביל לשחרור המטען רדיואקטיבי או exchange שלו עם מולקולות תיול מניבי במחזור. שני התהליכים הללו יכולים לייצר פעילות מוגברות ריכוזים באיברים בריאים, כמו גם ירד ריכוז פעילות ברקמות היעד, וכתוצאה מכך ניגודיות הדמיה מופחתת יחסי טיפולית נמוכה יותר. ב-2018, דיווחנו הבריאה של קרונות, יציב ו- phenyloxadiazolyl נגיש בקלות מתיל sulfone ריאגנט – שכונתה "תרמילים" — כפלטפורמה מבוססי תיול bioconjugations. הראו בבירור כי מבוססי תרמילי bioconjugations האתר סלקטיבית reproducibly ו- robustly ליצור radioimmunoconjugates הומוגנית, מוגדרים היטב, immunoreactive מאוד, יציבה מאוד. יתר על כן, ניסויים פרה במודלים מאתר של סרטן המעי הגס הראו כי אלה באתר באופן סלקטיבי מתויג radioimmunoconjugates התערוכה ביצועים ויוו בהרבה בהשוואה radiolabeled נוגדנים מסונתז via מבוסס-maleimide ההטיות. ב פרוטוקול זה, נתאר את הסינתזה ארבעה שלבים של התרמילים, היצירה של variant תרמילי מניבי bifunctional של chelator נמצא בכל מקום דוטה (תרמילים-דוטה), הבניין של תרמילי-DOTA הרצפטין נוגדן פילוח HER2.

Introduction

כימאים radiopharmaceutical זמן לנצל את סלקטיביות וספציפיות של נוגדנים עבור סמנים ביולוגיים של המחלה עבור שניהם הדמיה גרעינית, ממוקד הקרנות1. הגישה הנפוצה רחוק ביותר radiolabeling של נוגדנים המרקסיסטי מבוסס על הקובץ המצורף ללא הבחנה של קבוצות prosthetic radiolabeled או radiometal chelators כדי חומצות אמינו – לרוב lysines — בתוך המבנה של אימונוגלובולינים ( איור 1A)2. אסטרטגיה זו הוא יעיל בהחלט, טבעה אקראיות, לא אתר-ספציפית ניתן ליצור בעיות. באופן ספציפי, גישות מסורתיות bioconjugation מייצרים מוגדרת היטב, immunoconjugates הטרוגנית המורכבת תערובות של אלפי regioisomers שונים, כל אחד עם ערכה ייחודית של תכונות ביולוגיות תרופתי3. יתר על כן, bioconjugation אקראיים לטרפד את immunoreactivity של נוגדנים אם המטען מצורף לתחומים של נוגדן-אנטיגן מחייב.

במהלך השנים פותחו מגוון רחב של אסטרטגיות ספציפיות-לאתר, האתר-סלקטיבי bioconjugation כדי לטפל אלה בעיות4,5. הנפוצה ביותר של גישות אלה מסתמך על מצדו של הגששים maleimide מניבי לקבוצות sulfhydryl של cysteines (איור 1B). IgG1 נוגדנים באופן טבעי מכיל 4 דיסולפידי בין שרשרת גשרים, קישורים כי ניתן להפחית באופן סלקטיבי להניב מסוגל שעברו מייקל תגובות תוספת עם maleimides כדי ליצור קשרים thioether succinimidyl חינם תיולים. השימוש תיולים maleimides הוא בהחלט שיפור לעומת שיטות מסורתיות, מגוון רחב של נושאי maleimide synthons, bifunctional chelators זמינים כעת. עם זאת, חשוב לציין כי מתודולוגיה זו יש מגבלות רציניות גם כן. Immunoconjugates מבוססי Maleimide שהפגינו ויוו מוגבל יציבות כי הצמדה thioether יכולות לעבור. מייקל רטרו התגובה (איור 2)6,7,8,9, 10. זה, כמובן, יכול להוביל לשחרור המטען רדיואקטיבי או exchange שלו עם מולקולות תיול מניבי במחזור (למשל, גלוטתיון או אלבומין). שני התהליכים הללו יכולים להגדיל את ריכוז פעילות באיברים בריאים וכן להקטין ריכוז פעילות ברקמות היעד, וכתוצאה מכך ניגודיות הדמיה מופחתת יחסי טיפולית נמוכה יותר. מספר חלופי ריאגנטים תיול-תגובתי פותחו במטרה לעקוף סוגיות אלה, כולל tosylates, ברומו - ו iodo-acetyls, ויניל sulfones11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. עם זאת, כל הגישות האלה יש מגבלות יש הקשו את היישום הנרחב שלהם.

לפני כחמש שנים במעבדה של המנוח קרלוס השלישי Barbas במכון המחקר סקריפס חלוץ השימוש phenyloxadiazolyl מתיל sulfones כמו ריאגנטים עבור היווצרות סלקטיבי של קישורים יציב מאוד עם תיולים (1C איור, איור 3) 18 , 19. המחברים המועסקים וריאציה sulfone מניבי מתיל phenyloxadiazolyl של fluorescein כדי לשנות את מספר נוגדנים מתוכנן להכיל שאריות ציסטאין חינם, בסופו של דבר לייצר immunoconjugates עם יציבות גבוהה יותר מאשר מקביל בונה שנוצרו באמצעות הגששים מבוסס maleimide. רואה את זה מבטיח, היינו מופתעת כי טכנולוגיה זו היה בשימוש רק בקושי ב radiochemistry, היה לא עדיין בשימוש בכלל בסינתזה של bifunctional chelators או20,radioimmunoconjugates21 . זה מחסור של יישומים, אולם עד מהרה החלו הגיוני יותר: מספר נסיונות ברכישת הכימית של סיגמה-אולדריץ הביא הקבלה של תערובות מורכבים של השפלה מוצרים עם < 15% משטח המתחם הרצוי. בנוסף, סינתזה הכימית דווח על עצמנו לא היה אופציה ריאלית, כפי המסלול סינתטי שפורסם הוא קצת מסורבל ודורש ציוד מתוחכם כימיה אורגנית זה רוב radiochemistry והדמיה מולקולרית מעבדות — לרבות שלנו – פשוט לא ניחנת.

בתגובה מכשולים אלה, יצאנו כדי ליצור נגישה בקלות ויציבה מאוד ריאגנט sulfone מתיל phenyloxadiazolyl שניתן להשיג באמצעות מסלול סינטטי למדי נתיישב ועמיד. מוקדם יותר השנה, דיווחנו הבריאה של קרונות, יציב ו- phenyloxadiazolyl נגיש בקלות מתיל sulfone ריאגנט – המכונה "תרמילים" — כפלטפורמה מבוססי תיול bioconjugations (1C איור, איור 3)22. ההבדל העיקרי בין התרמילים הכימית שדווחו על-ידי Barbas, et al. הוא לשעבר מעסיקה טבעת אנילין המצורפת את moiety sulfone מתיל phenyloxadiazolyl, בזמן האחרון כולל של פנול באותה תנוחה (איור 4). שינוי זה מקלה על מסלול סינטטי פשוטה ונגישה יותר וכן — אם הניסיון שלנו עם המתחם זמינים מסחרית הוא סמלי – ריאגנט הסופי יותר יציב. בעבודה זו, אנחנו גם מסונתז זוג תרמילי מניבי chelators bifunctional — תרמילי-DFO ואת התרמילים-CHX-A '-DTPA — כדי להקל על היצירה של 89Zr - 177התווית על-ידי Lu radioimmunoconjugates, בהתאמה. כפי שנדון, הראו כי מבוססי תרמילי bioconjugations האתר סלקטיבית reproducibly ו- robustly ליצור radioimmunoconjugates הומוגנית, מוגדרים היטב, immunoreactive מאוד, יציבה מאוד. יתר על כן, ניסויים פרה במודלים מאתר של סרטן המעי הגס הראו כי אלה באתר באופן סלקטיבי הנקרא radioimmunoconjugates התערוכה ביצועים מעולים ויוו בהשוואה radiolabeled נוגדנים מסונתז via מבוסס maleimide ההטיות.

מטרת עבודה זו מתקשת יתר היא להקל על יצירת immunoconjugates מוגדרים היטב, הומוגנית, יציבה מאוד, immunoreactive מאוד ליישומים במבחנה ויוו. הגישה סינתטית היא פשוט מספיק כדי לבצע כמעט כל במעבדה, הכימית תרמילי האב יכול להיות שונה עם שפע של chelators שונים, fluorophores או מטענים. פרוטוקול זה, הסרטון הנלווה, נתאר את הסינתזה פשוט בן ארבעה שלבים של תרמילי (איור 5); היצירה של variant תרמילי מניבי של DOTA, chelator בשימוש נרחב עבור תיאום של 64Cu, 68Ga, 111ב, 177Lu, 225Ac (איור 6); את bioconjugation של תרמילי-DOTA נוגדן מודל, הרצפטין IgG1 פילוח HER2 (איור 7).

Protocol

1. הסינתזה של 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)

הערה: בשל האור-הרגישות של המתחם, שמור כל התגובות בכלי מכוסה בנייר כסף.

  1. בסיבוב 10 מ"ל בתחתית הבקבוק, להמיס 100 מ ג (mmol 0.517, 1 שוות ערך) של 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol ב 3 מ"ל של מתנול.
  2. כדי פתרון זה, להוסיף μL 360 של diisopropylethylamine (DIPEA; 2.07 mmol; 4 מקבילות; נטול מים), בר קטן מערבבים מגנטי. לכסות את הבקבוק עם פקק גומי ומערבבים את הפתרון ל-10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. באמצעות מזרק זכוכית 1 מ"ל, לתקוע חור פקק הגומי ולהוסיף במהירות μL 32 (mmol 0.517, 1 שוות ערך) של iodomethane תערובת זו. לאפשר את התערובת להגיב במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: בשל ההשפעות המזיקות פוטנציאלי של iodomethane, התגובה הזו צריך להיעשות בשכונה fume כימי.
  4. מוגדר האמבט במים המאדה 40 ° C , לאט להפחית את הלחץ כדי להסיר הממס לממן מוצק לבן.
  5. ממיסים המוצק ב- 3 מ"ל של אתיל אצטט ושוטפים לפחות שלוש פעמים עם פתרון מ של 0.1 M נתרן פחמתי באמצעות משפך מפריד.
    הערה: מעת לעת לקחת נקודה-בדיקות של שלב מימית תחת מנורת UV; לאחר דבר הוא ראה תחת המנורה, אתה יכול לעצור את שוטף.
  6. לאסוף את השלב אורגני ב משפך, לשטוף אותה עם מים עד ה-pH של שלב מימית מגיע 6.8-7.0 (באמצעות נייר pH).
  7. לאסוף את שלב אורגני, להוסיף מגנזיום גופרתי כדי להסיר את עקבות של מים.
    הערה: יש להוסיף את מגנזיום גופרתי עם מרית קטנה, אחרי אשר צריך להיות התרוצצו הפתרון. אם עדיין נראים חלקיקים זעירים של סוכן ייבוש, הפתרון הוא יבש. אם לא, מוסיפים כמויות קטנות של מגנזיום גופרתי, עד שניתן לראות חלקיקים.
  8. לסנן את התערובת באמצעות זכוכית בינוני frit או נייר סינון.
  9. להתנדף שיכללו חומרים נדיפים באמצעות המאדה, תהליך שאמור ליצור את המוצר הרצוי כמו מחטים לבן.

2. הסינתזה של tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbamate (2)

הערה: בשל האור-הרגישות של המתחם, שמור כל התגובות בכלי מכוסה בנייר כסף.

  1. בסיבוב mL 25 בתחתית הבקבוק, להמיס 387 מ ג (0.92 mmol, המקבילה 1.0) של NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine ב- 10 מ"ל של דיכלורומתאן.
  2. כדי פתרון זה, להוסיף 480 μL (2.76 mmol, ושווי 3) של DIPEA, 264 מ"ג (mmol 1.38 אינץ; מקבילות 1.5) של N-אתיל - N′-[3-(דלמטלמינו) propyl] carbodiimide הידרוכלוריד (EDCI), ו- 200 מ ג (0.97 mmol, ושווי 1.1) 1. לאטום את הכלי עם פקק זכוכית ולתת את התגובה מערבבים במשך 5 ימים בטמפרטורת החדר.
    הערה: להיות קשובים אידוי דיכלורומתאן. אם יש צורך, להוסיף יותר במהלך השבוע.
  3. לשטוף את התערובת בתוך משפך עם פתרון של חומצת מלח 1 מ' (3 x 5 מ"ל).
  4. לאסוף את שלב אורגני וממשיכים לשטוף את זה ב משפך, תחילה עם פתרון של 1 מ ' נה2CO3 (2 x 5 מ"ל) ולאחר מכן עם מים (3 x 5 מ"ל).
  5. לאסוף את שלב אורגני והוספת מגנזיום גופרתי כדי להסיר את עקבות של מים (ראה צעד 1.7). לסנן את התערובת באמצעות זכוכית בינוני frit או נייר סינון.
  6. באמצעות את המאדה, להסיר את ממסים נדיפים בלחץ מופחת לממן מוצק תפר חוט רקמה אופווייט.
  7. לפזר מחדש זה מוצק ב 10 מ"ל של אתיל אצטט, לזרז את המוצר באמצעות התוספת של 30 מ של ציקלוהקסאן הדרגתי (למשל, בכל פעם 2 מ"ל).
  8. לסנן את הפתרון עם נייר סינון או של זכוכית בינוני frit כדי לקבל את המוצר כמו אבקה לבנה.

3. הסינתזה של tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] carbamate (3)

הערה: בשל האור-הרגישות של המתחם, שמור כל התגובות בכלי מכוסה בנייר כסף.

  1. בבקבוקון סיבוב המדרגה 10 מ"ל, לפזר 30 מ"ג (0.05 mmol; המקבילה 1) של 2 4 מיליליטר דיכלורומתאן.
  2. לאט לאט להוסיף במ ג 49 (0.2 mmol; מקבילות 4) של 70% m-chloroperbenzoic חומצה תערובת זו ולכסות את מיכל התגובה עם פקק זכוכית. מערבבים את הפתרון ללילה בטמפרטורת החדר, בסופו של דבר מניב תערובת צהוב.
  3. לשטוף את התערובת צהוב ב משפך, תחילה עם פתרון 0.1 M של NaOH (3 x 5 מ"ל) ולאחר מכן עם מים (3 x 5 מ"ל).
  4. יבש את שלב אורגני עם מגנזיום גופרתי, לסנן את התערובת באמצעות זכוכית בינוני frit או נייר סינון.
  5. באמצעות את המאדה, להסיר את ממיסים תחת לחץ מופחת כדי לקבל את המוצר כמו מוצק חיוור.

4. הסינתזה של N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4- succinamide {phenyl 4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]} (סיר)

  1. בסיבוב mL 25 בתחתית הבקבוק, לפזר 30 מ"ג של 3 ב מ 2.0 ל דיכלורומתאן.
  2. להוסיף 400 μL של חומצה trifluoroacetic, לאטום את הבקבוק עם פקק זכוכית.
  3. מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות.
  4. באמצעות את המאדה, להסיר את שיכללו חומרים נדיפים בלחץ מופחת בטמפרטורת החדר, עוזב של משקע שמנוני.
  5. להמיס את השאריות שמנוני ב 7 מ ל מים, שימוש משפך, לשטוף עם אתיל אצטט (3 x 4 מ"ל). להשאיר את השכבה המימית.
  6. Lyophilize את השכבה המימית לממן תרמילי כאבקה לבנה.
    הערה: מקדמי קליטה טוחנת עבור התרמילים ב nm 280, 298 הם 9,900 ו- 12,400 ס מ-1מ'-1, בהתאמה.

5. הסינתזה של תרמילי-דוטה

  1. צינור microcentrifuge 1.5 mL, להמיס 10 מ ג של התרמילים, ב- 300 μL של דימתיל סולפוקסיד (0.018 mmol; המקבילה 1) ולהוסיף μL 26 של N, N-diisopropylethylamine (0.15 mmol; 8 מקבילות).
  2. להמיס 15.2 מ"ג של DOTA-בסון-רכיבי NC (0.02 נקודות mmol; מקבילות 1.2) בμl 100 של dimethylsulfoxide ולשלב פתרון זה עם הפתרון של שלב 5.1. חותם את הצינור microcentrifuge.
  3. לאפשר התגובה דגירה ללילה בטמפרטורת החדר.
  4. לטהר את המוצר באמצעות הפוכה-שלב ג18 hplc, קורס כרומטוגרפיה כדי להסיר את כל unreacted דוטה-בסון-רכיבי NC.
    הערה: שמירה פעמים הם מאוד תלויים בציוד HPLC של כל מעבדה (משאבות, עמודות, אבובים, וכו '), הפקדים המתאימים צריכה לפעול לפני טיהור. עם זאת, להציג דוגמה, אם שיפוע של 5:95 MeCN/H2O (שניהם עם 0.1% TFA) כדי 70:30 MeCN/H2O (שניהם עם 0.1% TFA) מעל 30 דקות, עמודה18 למחצה מפוח 19 x 250 מ מ ג, קצב זרימה של 6 מ לדקה משמשים , תרמילים, p-SCN-בסון-דוטה, DOTA תרמילי יהיו פעמים השמירה של סביב 14.4, 18.8 ו- 19.6 דקות, בהתאמה. ניתן לנטר כל התרכובות שלוש-254 ננומטר.

6. bioconjugation של תרמילי-DOTA כדי הרצפטין

הערה: בשלב זה, התחלנו עם פתרון מניות 16.4 מ"ג/מ"ל של הרצפטין.

  1. נקז microcentrifuge 1.5 mL מחייב חלבון נמוכה, לדלל μL 61 של הפתרון מניות הרצפטין (1 מ ג; nmol 6.67, 1 שוות ערך) עם μL 859 תמיסת פוספט buffered (pH 7.4).
  2. כדי תערובת זו, להוסיף μL 6.7 של טרי 10 מ מ פתרון של TCEP H2O (66.7 nmol, ושווי 10).
  3. להכין פתרון 1 מ"ג/מ"ל של תרמילי-דוטה, דימתיל סולפוקסיד ולהוסיף μL 73 של פתרון זה תרמילים-DOTA תערובת התגובה (66.67 nmol, ושווי 10).
  4. לאטום את הצינור microcentrifuge, תקופת דגירה הפתרון של 2 שעות בטמפרטורת החדר.
  5. לאחר שעתיים, לטהר את immunoconjugate באמצעות עמודה desalting של הדרה מראש ארז גודל חד פעמיות.
    1. ראשית, equilibrate את גודל אי-הכללה של העמודה כפי שתואר על ידי הספק כדי להסיר כל מוצר קיים בעמודה במהלך האחסון. הליך טיפוסי כולל שטיפת העמודה 5 פעמים עם נפח של PBS המתאים לנפח של העמודה: 5 x 2.5 מ של PBS.
    2. לאחר מכן, להוסיף את תערובת התגובה העמודה אי-הכללה של גודל וציין את עוצמת הקול של תערובת התגובה.
    3. לאחר תערובת התגובה נכנס העמודה, להוסיף כמות מספקת של PBS להביא את הנפח הכולל של פתרון להוסיף את העמודה עד 2.5 מ ל. לדוגמה, אם התגובה ההטיה, גרמו הנפח הכולל של 1.3 מ ל, 1.2 מ של PBS נוספים יהיה צורך להוסיף את העמודה.
    4. לבסוף, לאסוף את המוצר באמצעות 2 מ של PBS כמו eluent.
  6. לרכז את immunoconjugate הסופית עם יחידות צנטריפוגליות סינון עם ניתוק משקל מולקולרי kDa 50.

תוצאות

תחילה ארבעת השלבים של פרוטוקול זה — הסינתזה של תרמילי — עוצבו כדי להיות עמיד ואמין. דה-פרוטונציה של החלפה של 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol כדי ליצור את המוצר הרצוי thioether מעניקה את thioether ב > 99% תשואה לאחר 45 דקות בלבד. בשלב הבא, מצדו בין 1 לבין N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine הושגה באמצעות פפטיד סטנדרטי צימוד הליך, וכתוצאה מכך האוסף של המוצר (2) ב- 55% תשואה. לאחר מכן, החמצון של 2 בוצעה באמצעות m-chloroperoxybenzoic חומצה, חמצון בשימוש נרחב. בעקבות הצעדים כביסה, 3 היה מתקבל בתור מוצק חיוור ב ~ 90% תשואה. בסופו של דבר, הסרת הקבוצה מגן טרט-butyloxycarbonyl מ 3 נעשתה על פי נהלי, באמצעות יחס של 4:1 של חומצה dichloromethane:trifluoroacetic. לאחר lyophilization השלב מימית, המוצר שלנו — תרמילי — היה מתקבל בתור אבקה לבנה ב- 98% תשואה. ההתקדמות של התגובה היה מלווה דרך שכבה דקה כרומטוגרפיה, הזהות של כל מוצר אושר באמצעות 1H-NMR, 13C-NMR ו- HRMS-ESI (טבלה 1).

אחד היתרונות העיקריים של תרמילי הכימית הוא המודולריות שלו. ניתן לצרף מגוון chelators, fluorophores, רעלנים או מטענים אחרים כדי amine תליון של המתחם. בפרוטוקול בהישג יד, אנו משתמשים את chelator בכל מקום דוטה (חומצה 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic) כמו תוכן מנה של נציג. דוטה, כמובן, שימש במגוון רחב של הבימולקולרי radiopharmaceuticals chelator עבור radiometals כולל 68Ga, 64Cu, 111ב, 90Y, 177Lu, ו- 225Ac. למטרה זו, וריאנט isothiocyanate מניבי של DOTA (p-SCN-בסון-דוטה) היה מועסק, מצמידים את אמין תליון של התרמילים באמצעות צימוד ישיר תנאים. Chelator bifunctional הנובעת היה לאחר מכן מטוהרים באמצעות היפוך פאזה C18 HPLC, בבידוד ~ 75% תשואה. כמו עם מבשרי אחרים, ההתקדמות של התגובה היה מלווה דרך שכבה דקה כרומטוגרפיה, הזהות של המוצר אושר באמצעות 1H-NMR, 13C-NMR ו- HRMS-ESI (טבלה 1).

בשלב הסופי של הפרוטוקול, נדון את bioconjugation האתר סלקטיבית של תרמילי-DOTA נוגדנים מודל הרצפטין נוגדן פילוח HER2. לשם כך, קישורים דיסולפידי באזור ציר של הנוגדן מופחתים באופן סלקטיבי עם הסוכן צמצום TCEP [tris(2-carboxyethyl) פוספין]. בעקבות צעד זה צמצום, הנוגדן מודגרות עם תרמילי-DOTA עבור 2 h בטמפרטורת החדר, לאחר מכן מטוהרים באמצעות גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה. במקרה זה, immunoconjugate מטוהרים, דוטה מניבי הושג ב ~ 80% תשואה, ניתוח MALDI-ToF גילה מידה מסוימת של תיוג (בארבי כוכ) של ~1.8 דוטה/mAb. באופן כללי, מצאנו כי מקבילות 10 TCEP, המקבילים 10 תרמילי הכימית, של דגירה 2 h מספיקים תשואה של immunoconjugate עם עוד לא יודעיםעליהם כלום של תרמילי 2/mAb (טבלה 2). תוצאה זו נשאר קבוע לאורך מגוון של נוגדנים IgG1 אנושי, humanized ו chimeric; עם זאת, באותם התנאים לייצר immunoconjugates עם עוד לא יודעיםעליהם כלום של ~1.5 רק כאשר עובדים עם נוגדנים IgG1 מאתר. כל זה אמר, חוקרים צריך לייעל את אלה תנאים תגובת נוגדנים חדשים, תרמילי מניבי מטענים. לבסוף, וחשוב, לגבי התוצר הסופי, שוב ושוב, reproducibly מצאנו immunoconjugates מבוססי תרמילי התערוכה immunoreactivities שווה או יותר מקבילה בונה שנוצרו באמצעות אקראית או מבוסס-maleimide אסטרטגיות ההטיה.

figure-results-3346
איור 1: איור סכמטי של bioconjugations באמצעות (A), אמין תגובתי (B) maleimide-מיסב ו- (ג) תרמילי מניבי מטענים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3816
איור 2: מייקל תוספת של biomolecule תיול מניבי (ירוק), maleimide מניבי רדיונוקלידים (צהוב) כדי ליצור bioconjugate radiolabeled, כמו גם את תגובות נוספות radiolabeled הבונה יכול עוברים בנוכחות אנדוגני תיול מניבי מולקולות (ורוד). RT = טמפרטורת החדר. איור הודפס מחדש באישור מ. דווידובה, Adumeau, עמ', לאישה, מ., Zeglis, נולד ב- מ' תיול-תגובתי Bifunctional Chelators עבור היצירה של האתר באופן סלקטיבי שונה Radioimmunoconjugates עם יציבות משופרת. Bioconjugate כימיה. 29, 1364-1372 (2018). זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4673
איור 3: תיאור סכמטי של התגובה בין התרמילים תיול. איור הודפס מחדש באישור מ. דווידובה, Adumeau, עמ', לאישה, מ., Zeglis, נולד ב- מ' תיול-תגובתי Bifunctional Chelators עבור היצירה של האתר באופן סלקטיבי שונה Radioimmunoconjugates עם יציבות משופרת. Bioconjugate כימיה. 29, 1364-1372 (2018). זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5333
איור 4: המבנה של תרמילי (א) , כמו גם (B) הכימית שדווחו על-ידי Barbas, et al.18,19אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5816
איור 5: ערכה של הסינתזה ארבעה שלבים של התרמילים. איור הודפס מחדש באישור מ. דווידובה, Adumeau, עמ', לאישה, מ., Zeglis, נולד ב- מ' תיול-תגובתי Bifunctional Chelators עבור היצירה של האתר באופן סלקטיבי שונה Radioimmunoconjugates עם יציבות משופרת. Bioconjugate כימיה. 29, 1364-1372 (2018). זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6476
איור 6: ערכה של הסינתזה של תרמילי-דוטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6825
איור 7: בסכמה bioconjugation של הרצפטין עם תרמילי-דוטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-7190
איור 8: השוואה של ההתנהגות ויוו של 89התווית על-ידי Zr radioimmunoconjugates של huA33 שנוצרו באמצעות מבוססי תרמילי (89Zr-DFO-תרמילים-huA33) ואסטרטגיות bioconjugation מבוסס maleimide (89Zr-DFO-מאל-huA33). מישורי (משמאל) ותמונות העוצמה המקסימלית הקרנה (מימין) חיית המחמד של עכברים עירום athymic הנושאת A33 לבטא אנטיגן SW1222 סרטן המעי הגס xenografts (חץ לבן) לאחר ההזרקה של 89Zr-DFO-תרמילים-huA33 ו- 89 Zr-DFO-מאל-huA33 (140 µCi, µg 60-65). הפרוסות הילתית מצטלבות המרכז של הגידולים. איור הודפס מחדש באישור מ. דווידובה, Adumeau, עמ', לאישה, מ., Zeglis, נולד ב- מ' תיול-תגובתי Bifunctional Chelators עבור היצירה של האתר באופן סלקטיבי שונה Radioimmunoconjugates עם יציבות משופרת. Bioconjugate כימיה. 29, 1364-1372 (2018). זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-8336
איור 9: השוואה של ההתנהגות ויוו של 89התווית על-ידי Zr radioimmunoconjugates של huA33 שנוצרו באמצעות מבוססי תרמילי (89Zr-DFO-תרמילים-huA33) ואסטרטגיות bioconjugation מבוסס maleimide (89Zr-DFO-מאל-huA33). Biodistribution נתונים לאחר הממשל של 89Zr-DFO-תרמילים-huA33 ו- 89Zr-DFO-מאל-huA33 (30 µCi, µg 15-18) athymic לעכברים עירום הנושאת A33 לבטא אנטיגן תת עורית SW1222 סרטן המעי הגס האנושי xenografts. הערכים עבור הקיבה, המעי הדק, המעי הגס לכלול תוכן. איור הודפס מחדש באישור מ. דווידובה, Adumeau, עמ', לאישה, מ., Zeglis, נולד ב- מ' תיול-תגובתי Bifunctional Chelators עבור היצירה של האתר באופן סלקטיבי שונה Radioimmunoconjugates עם יציבות משופרת. Bioconjugate כימיה. 29, 1364-1372 (2018). זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תרכובת 1 H-NMR משמרות 13 C-NMR משמרות HRMS
1(500 MHz, CDCl3) 7.79 (2 H, d, J = 8.5 הרץ), 6.72 (2 H, d, J = 8.5 הרץ), 4.04 (2 H, br s), 2.75 (3 H, s)(125 מגה-הרץ, CDCl3) 166.3, 163.7, 149.7, 128.5, 114.8, 113.5, 14.8ז/ז Calcd עבור [ג9H9N3OS + H]+: 208.0539; נמצאו: 208.0539; Δ: 0.0 ppm
2(500 MHz, CDCl3) 9.68 (1H, s), 7.91 (2H, d, J = הרץ 9.0), 7.71 (2H, d, J = 8.5 הרץ), 6.82 (1H, s), 4.99 (1H, s), 3.70-3.45 (12H, m), 3.41 (2H, q, J = הרץ 6.0), 3.20 (2H, q, J = 6.5 הרץ), 2.76 (3H, s), 2.71 (2H, m), 2.63 (2h ז), 1.80-1.70 (4 H, m), 1.42 (9 H, s)(125 מגה-הרץ, CDCl3) 172.6, 171.3, 165.8, 164.6, 156.2, 141.8, 127.7, 119.6, 118.6, 79.2, 70.6, 70.5, 70.3, 70.1, 69.6, 38.8, 38.5, 33.5, 31.6, 29.9, 28.6, 14.8מ/z Calcd עבור [ג28H43N5O8S + Na]+: 632.2725; נמצאו: 632.2722; Δ:-0.47 ppm
3(500 MHz, CDCl3) 9.99 (1 H, s), 7.98 (2 H, d, J = הרץ 9.0), 7.75 (2 H, d, J = 8.5 הרץ), 6.88 (1 H, s), 4.99 (1 H, s), 3.66-3.50 (15 H, m), 3.41 (2 H, q, J = הרץ 6.0), 3.20 (2 H, q, J = 6.5 הרץ), 2.71 (2 H, m), 2.65 (2 H, m) , 1.80-1.70 (4H, m) 1.43 (9H, s)(125 מגה-הרץ, CDCl3) 172.6, 171.5, 166.5, 161.6, 156.1, 143.4, 128.7, 119.6, 116.4, 79.1, 70.5, 70.4, תנשב 70.2, 70.0, 69.4, 43.0, 38.8, 38.4, 33.2, 31.3, 29.7, 28.4 מ/z  Calcd [ג28H43N5או10S + H]+: 642.2803; נמצאו: 642.2797; Δ:-0.93 ppm
התרמילים(500 MHz, D2O) 7.85 (2 H, d, J = הרץ 9.0), 7.55 (2 H, d, J = 8.5 הרץ), 3.60-3.45 (15 H, m), 3.45 (2 H, t, J = 6.5 הרץ), 3.20 (2 H, t, J = 6.5 הרץ), 3.04 (2 H, t, J = 7.0 הרץ), 2.67 (2 H, t, J = 6.5 הרץ), 2.54 (2h t, J = 6.5 הרץ), 1.87 (2 H, qt, J = 6.5 הרץ), 1.70 (2 H, qt, J = 6.5 הרץ)(125 MHz, D2O) 174.5, 173.2, 166.8, 161.4, 142.2, 128.6, 120.3, 116.6, 69.4, 69.4, 69.3, 69.2, 68.2, 68.2, 42.5, 37.6, 36.2, 31.9, 30.7, 28.2, 26.4 מ/z  Calcd [ג23H35N5O8S + H]+: 542.2279; נמצאו: 542.2281; Δ: 0.37 ppm
תרמילי-דוטה(600 MHz, דימתיל סולפוקסיד-d6) 10.46 (1 H, s), 9.74 (1 H, bs), 8.04 (2 H, d, J = הרץ 8.6), 7.99 (1 H, s), 7.90 (1 H, t, J = 5.0 הרץ), 7.86 (2 H, d, J = 6.5 הרץ), 7.44 (2 H, d, J = הרץ 7.9), 7.24 (2 H, d, J = הרץ 7.1), 4.35-2.41 (45 H, m) , 3.70 (3H, s), 1.76 (2H, q, J = 6.3 הרץ), 1.61 (2H, q, J = 6.5 הרץ)(125 MHz, דימתיל סולפוקסיד-d6) 171.8, 171.4, 166.1, 162.2, 158.8, 158.6, 129.8, 129.0, 127.6, 123.3, 119.5, 118.5, 116.5, 116.4, תנשב 70.2, 70.1, 70.0, 68.7, 68.5, 43.4, 41.8, 36.3, 32.2, 30.4, 29.8, 29.1 מ/z  Calcd [C47H68N10O16S2+ H]+: 1093.4334; נמצאו: 1093.4327; Δ:-0.64 ppm

טבלה 1- אפיון נתוני ביניים סינתטי תיאר תרמילי ואת התרמילים-דוטה.

נוגדןסוגאזור קבועיחס של תרמילי: mAb
לפלסמה אנושית איגאנושיהאדם אג2.1 ± 0.1
הרצפטיןHumanizedIgG1 אנושי2.0 ± 0.1
huA33HumanizedIgG1 אנושי2.1 ± 0.1
ארביטוקסChimericIgG1 אנושי2.2 ± 0.1
AR 9.6מאתרIgG1 מאתר1.4 ± 0.1
העכבר פלזמה איגמאתראג מאתר1.5 ± 0.1

בטבלה 2. מידת תיוג של נוגדנים שונים בעקבות ההטיה עם fluorophore תרמילי מניבי. הערכים מוצגים סטיות תקן. טבלה הודפס מחדש באישור מ. דווידובה, Adumeau, עמ', לאישה, מ., Zeglis, נולד ב- מ' תיול-תגובתי Bifunctional Chelators עבור היצירה של האתר באופן סלקטיבי שונה Radioimmunoconjugates עם יציבות משופרת. Bioconjugate כימיה. 29, 1364-1372 (2018). זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה.

Discussion

בדו ח זה, בחרנו לא לכלול כל פרוטוקולים לניסויים radiolabeling או ויוו. הסיבות שלנו הם פשוטה. ביחס לשעבר, radiolabeling של immunoconjugate המבוסס על תרמילי אינו שונה כלל מזו של immunoconjugate מסונתז באמצעות אסטרטגיות bioconjugation אחרים, נהלים אלה היו באופן מקיף שנסקרו במקום אחר2 . לגבי האחרון, הפרטים של ניסויים ויוו פרה (קרי, העכבר מודלים, מינונים, וכו ') יכול להשתנות בהרחבה על פי היישום ובמערכת נוגדן/אנטיגן.

החקירות הקודמות שלנו עם 89התווית על-ידי Zr משתנים של huA33 מספקים דוגמה מרתקת היתרונות של bioconjugations המבוסס על התרמילים. HuA33 הוא IgG1 מואנשים שמכוונת אנטיגן A33, גליקופרוטאין transmembrane לידי ביטוי > 95% של סרטן המעי הגס23,24. שלנו הקודם כתב היד22, מדווחים הסינתזה של 89Zr-DFO-huA33 radioimmunoconjugate באמצעות שתי אסטרטגיות bioconjugation תרמילי maleimide מבוססות. השניים radiolabeled נוגדנים – 89Zr-DFO-תרמילים-huA33 ו- 89Zr-DFO-מאל-huA33 — הופקו ב תשואה כמעט זהות, טוהר, ירידה לפרטים פעילות ו- immunoreactivity. אנושות, עם זאת, radioimmunoconjugates שני הציג stabilities שונה באופן דרמטי בנסיוב אדם: לאחר דגירה במשך שבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 89Zr-DFO-תרמילים-huA33 נשארה 86 ± 1%, בעוד דוד שלה מבוסס על maleimide היה רק 61 ± 5% ללא פגע. דימות PET in vivo ו- biodistribution ניסויים בעכברים עירום athymic הנושאת A33 לבטא אנטיגן SW1222 סרטן המעי הגס האנושי xenografts חשף סטארק ההבדלים בהתנהגות ויוו של radioimmunoconjugates שני (איור 8 ו איור 9). 89Zr-DFO-תרמילים-huA33 והן 89Zr-DFO-מאל-huA33 לייצר פעילות גבוהה ריכוזים ברקמת הגידול: 56.4 ± 6.9%ID/g, 49.6 ± 9.3%ID/g, בהתאמה, 48 שעות לאחר ניהול. עם זאת, radioimmunoconjugate מבוססי maleimide המיוצר ריכוז גבוה באופן משמעותי פעילות ברקמות בריאות מאשר הסוכן מבוסס תרמילי. לדוגמה, 89Zr-DFO-מאל-huA33 המיוצר פעילות ריכוזים של 3.1 ± 0.5, 2.7 ± 0.4 ו- 12.2 ± 0.4% מזהה/g הכליות, הכבד, וכן עצם, בהתאמה, ב- 120 h שלאחר ההזרקה, ערכים אשר באופן דרמטי יעלה על ריכוז פעילות מיוצר על ידי 89Zr-DFO-תרמילים-huA33 ברקמות זהה (1.4 ± 0.1, ± 1.2 0.3 ו 4.3 ± 0.6% מזהה/g). אכן, 89Zr-DFO-תרמילים-huA33 המיוצר ריכוז נמוך יותר של פעילות ברקמות המטרה ללא כל (למעט המעי הגס)-120 h שלאחר ההזרקה לעומת 89Zr-DFO-מאל-huA33. כתוצאה מכך, יחס ריכוז פעילות גידול-כדי-איברים עבור 89Zr-DFO-תרמילים-huA33 עדיפים בדרך כלל לאלה של 89Zr-DFO-מאל-huA33; בפרט, הגידול-כדי-הכבד, הגידול-כדי-, הגידול-כדי-כליות בטחול ריכוז פעילות גידול-עד-עצם יחסי הן כמעט כפול על immunoconjugate מבוססי תרמילי בהשוואה לבת דודה שלה נגזר maleimide. בהתחשב בכך ההבדל העיקרי בין radioimmunoconjugates שני היתה ידית bioconjugation chelator, יציבות מוגברת של ניגודים תרמילי-תיול אחראי כמעט בוודאות זה ויוו ביצועים משופרים.

לוקח מבט רחב יותר, bioconjugation שאינו האתר-סלקטיבית של הבדיקות כדי lysines בתוך נוגדנים היא אמנם בגישה ישירה, נתיישב השינוי של נוגדנים. עם זאת, הנוכחות של מספר lysines מופצים ברחבי המבנה של immunoglobulins אומר שזה בלתי אפשרי לשלוט באתר מדויק או מידת bioconjugation2. כתוצאה מכך, אסטרטגיה אקראית זו לעיתים קרובות מייצרת גרוע מוגדרת על-ידי וירידה immunoconjugates הטרוגנית מאוד שיכול immunoreactivity אם ligations מתרחשות בתוך התחומים אנטיגן מחייב3. היתרונות של גישות באתר סלקטיבית bioconjugation כבר מאויר שוב ושוב על שתי radioimmunoconjugates, נוגדן תרופתיים conjugates8,14,25,26, 27,28,29,30. בקיצור, לא רק bioconjugation האתר סלקטיבית אסטרטגיות מייצרים יותר מוגדרים היטב, immunoconjugates הומוגנית מאשר מתודולוגיות מסורתיים, הם גם ליצור הדמיה סוכנים, radioimmunotherapeutics ו- ADCs עם ביצועים משופרים ויוו. עדיין איפה מבוססי תרמילי ligations עומדים לשם השוואה כדי אחרים אסטרטגיות שינוי אתר סלקטיבית? באופן כללי, ניתן לסווג את הגישות השינוי באתר סלקטיבית של נוגדנים לארבע קטגוריות: (1) ligations שאריות ציסטאין, (2) המניפולציה של glycans שרשרת כבדה את המרות (3) chemoenzymatic, (4) שימוש הנדסה גנטית4,5. כמובן, מערכת הסיווג אינו מושלם, גישות מסוימות (למשל, השינוי של glycans שרשרת כבדה עם אנזימים) באופן בלתי נמנע להעפיל לשתי קטגוריות. כל אסטרטגיה יש יתרונות וחסרונות משלה. גישות מבוססות-הנדסה גנטית לספק שליטה מעולה על האתר של נטיה, אך עם זאת הם מורכבים ויקרים31,32,33. חמצוני כדי glycans שרשרת כבדה התפסים פשוטה וזולה, אך הם מסתכנים נזק חמצוני השלמות. המבנית של אימונוגלובולינים34,35,36,37 ,38.

היתרון הראשי של bioconjugations מבוססי תיול — תרמילי כללו — הוא הפשטות שלהם ואת מודולריות. הגבלה העיקרי שלהם, מצד שני, נובעת הנוכחות של תיולים מרובות בתוך נוגדן, תכונה אשר מפחית את מידת שליטה גם האתר של ההטיה ואת מספר שינויים לכל נוגדן. במובן זה, השילוב של ligations מבוססי תיול נוגדנים יש מהונדס גנטית להחזיק שאריות ציסטאין חינם היא גישה אטרקטיביים במיוחד. כפי שציינו, הגבלה נוספת של תיול מבוססי maleimide ligations היא הרגישות ההדבקה thioether succinimidyl רטרו-מיכאל תוספות ויוו. עדיין אנושות, השימוש של תרמילי abrogates בעיה זו.

לפני שאנחנו מסכמים, חשוב לציין כי הטבע מתהווה של טכנולוגיה התרמילים יכולים ליצור מערך של מכשולים. לדוגמה, chelators bifunctional אין תרמילים מניבי (כרגע) זמינים מסחרית, אין נתונים פונה את פרמקולוגיה קלינית, טוקסיקולוגיה, או immunogenicity של immunoconjugates המבוסס על התרמילים. עם זאת, אנו מאמינים מבוססי תרמילי bioconjugations יש פוטנציאל לשנות מן היסוד את הדרך immunoconjugates הם מסונתז הן במעבדה והן במרפאה. בזמן הנוכחי, אנו יש להחיל רק הטכנלוגיה כימי לפיתוחה של radioimmunoconjugates אטומי, radioimmunotherapy, למרות חקירות השירות של גישה זו לבנייה של נוגדן תרופתיים conjugates ו תרופות למערכות ביולוגיות אחרות נמצאים כעת בעיצומו. בסופו של דבר, אנחנו מקווה שנהפוך את זה פרוטוקול זה — במיוחד את פשוטה ופשוט כימיה זה פיתחנו — יסייע לקדם את השימוש phenyloxadiazolyl מתיל sulfones על ההטיות מבוססי sulfhydryl, לדרבן שינוי בשטח של maleimides לחלופות יותר יציבה ואמינה יותר.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים ד ר סאי קיראן שארמה על שיחות מועיל.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiolSigma-Aldrich675024
1.5 mL LoBind Microcentrifugal TubeEppendorf925000090
1.5 mL Microcentrifugal TubeFisherbrand05-408-129
AcetonitrileFisher ScientificA998-4
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter UnitEMD MilliporeEN300000141G
CyclohexaneFisher ScientificC556-4
DichloromethaneFisher ScientificAC383780010
DiisopropylethylamineMP Biomedicals, LLC150915
DimethylsulfoxideFisher Scientific31-727-5100ML
Ethyl AcetateFisher ScientificE145 4
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144-500
IodomethaneSigma-Aldrich289566-100G
Magnesium SulfateAcros Organics413485000
m-chloroperbenzoic acidSigma-Aldrich273031
MethanolFisher ScientificA412 1
NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamineSigma-Aldrich671401Store at -80 °C
N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochlorideSigma-Aldrich3450
Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichP549310× Concentration
p-SCN-Bn-DOTAMacrocyclicsB-205Store at -80 °C
Sephadex G-25 in PD-10 Desalting ColumnsGE Healthcare17085101
Sodium CarbonateSigma-AldrichS7795
Sodium HydroxideFisher ScientificS318-1
TCEPThermoFischer Scientific20490
TriethylamineFisher ScientificAC157911000
Trifluoroacetic AcidFisher ScientificA116-50

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
  2. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
  3. Agarwal, P., Bertozzi, C. R. Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).
  4. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).
  5. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).
  6. Alley, S. C., et al. Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).
  7. Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
  8. Shen, B. -. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).
  9. Jackson, D., et al. In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates. Plos One. 9 (1), (2014).
  10. Ponte, J. F., et al. Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates. Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).
  11. Stimmel, J. B., et al. Site-specific conjugation on serine -> cysteine variant monoclonal antibodies. Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).
  12. Li, L., et al. Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody. Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).
  13. Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment. Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).
  14. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
  15. Li, L., et al. Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).
  16. Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -. w., Lever, R., Brocchini, S. Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).
  17. Koniev, O., Wagner, A. Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation. Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).
  18. Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers. Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).
  19. Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation. Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).
  20. Zhang, Q., et al. Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers. Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).
  21. Chiotellis, A., et al. Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions. Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).
  22. Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability. Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).
  23. Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).
  24. Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).
  25. Junutula, J. R., et al. Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
  26. Pillow, T. H., et al. Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).
  27. Boswell, C. A., et al. Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).
  28. Boswell, C. A., et al. Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).
  29. Alvarez, V. L., et al. Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy. Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).
  30. Strop, P., et al. Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates. Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).
  31. Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody conjugates with unnatural amino acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
  32. Axup, J. Y., et al. Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).
  33. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  34. Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. Periodate oxidation of methionine in proteines. Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).
  35. Wang, W., et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).
  36. O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties. Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).
  37. Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).
  38. Hu, M. D., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145bioconjugationbioconjugationmaleimidesulfhydrylradioimmunoconjugateimmunoconjugate

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved