סינתזה וקביעת מבנה ממוצע-Conotoxin Isomers PIIIA עם Connectivities דיסולפידי שונים

ציסטאין עתירי פפטידים מקפלים לתוך מבנים תלת מימדיים נפרדות בהתאם שלהם קישוריות דיסולפידי. יישוב סינתזה של isomers דיסולפידי הפרט נדרש כאשר מאגר חמצון לא תוביל קישוריות דיסולפידי הרצוי. הפרוטוקול עוסק הסינתזה סלקטיבי של פפטידים 3 דיסולפידי-בונדד וניתוח מבניים שלהם באמצעות מחקרים NMR ו- MS/MS.

פפטידים עם מספר גבוה של cysteines בדרך כלל מושפעים באשר למבנה התלת ממדי שלהם קישוריות דיסולפידי. זה ולכן חשוב מאוד להימנע מיצירת קשר דיסולפידי רצויה במהלך סינתזה פפטיד, כי זה עלול לגרום במבנה פפטיד שונה לחלוטין, וכתוצאה מכך משתנה bioactivity. אולם, היווצרות חוב דיסולפידי מרובים בפפטיד הנכון הוא קשה להשיג באמצעות שיטות עצמית מתקפלים סטנדרטיים כגון פרוטוקולים חימצון מאגר המקובלת, כי יכול להיווצר מספר connectivities דיסולפידי. פרוטוקול זה מייצג את אסטרטגיית מתקדם הדרושים לסינתזה יישוב של פפטידים גשר דיסולפידי מרובות אשר לא יכול להיות מסונתז באמצעות חימצון מאגר איכותי, כמותי. המחקר מדגים היישום של אסטרטגיה ברורה קבוצה שיגן על הסינתזה של כל פפטיד 3 דיסולפידי-בונדד אפשרי isomers של ממוצע-conotoxin PIIIA באופן ממוקד. פפטידים מוכנות על ידי באמצעות אסטרטגיה קבוצה מגן על היווצרות קשר דיסולפידי מוגדר סינתזה פפטיד מבוססי Fmoc מעבדתי. זוגות בהתאמה של cysteines מוגנים עם trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) טרט-בוטיל (tBu) הגנה על קבוצות כדי לוודא כי במהלך כל שלב חמצון רק הנדרשת cysteines deprotected הינם מקושרים. בנוסף הסינתזה יישוב, שילוב של מספר שיטות אנליטיות משמש כדי להבהיר את מתקפלות הנכונה ואת הדור של המבנים פפטיד הרצוי. ההשוואה של isomers שונים 3-דיסולפידי-בונדד מציין את החשיבות של נחישות מדויק והידע של קישוריות דיסולפידי עבור החישוב של מבנה תלת מימדי, פרשנות של הביולוגי פעילות של isomers פפטיד. אפיון אנליטיים כולל הבהרה קשר דיסולפידי המדויק באמצעות ספקטרומטר מסה (MS/MS) טנדם ניתוח שבו מבוצע עם נגזרות חלקית מופחתת ו alkylated של איזומר פפטיד שלם המיוצר על ידי פרוטוקול מותאם. יתר על כן, המבנים פפטיד נקבעים באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (NMR) 2D ניסויים ואת הידע המתקבל ניתוח MS/MS.

השימוש של פפטידים ביו התרופות במחקר ופיתוח מוכרת מאוד, משום שהם מייצגים תרכובת סלקטיבי מאוד חזק עבור מטרות ביולוגיות מוגדרות¹. עבור אתריים שלהם, למבנה התלת ממדי זאת, חשיבות רבה על מנת לבצע פעילות מבנה היחסים מחקרים^2,3,4. מלבד רצף חומצת אמינו העיקרי המשפיע על קונפורמציה הכוללת, חוב דיסולפידי משמעותית לייצוב המבנה של ציסטאין עתירי פפטידים⁵. פפטידים גשר דיסולפידי מרובים כוללים conotoxins כגון ממוצע-PIIIA מ פורפורסנס אשר מכיל שישה cysteines ברצף שלה. תוכן ציסטאין גבוהה זה באופן תיאורטי מאפשרת היווצרות של 15 isomers דיסולפידי. קישוריות דיסולפידי נכונה חשוב מאוד פעילות ביולוגית^6,7. עם זאת, השאלה שעולה היא האם יש אחד או יותר קונפורמציה ביו פפטידים המתרחשים באופן טבעי, אם אז, אשר של isomers האלה יש הפעילות הביולוגית הגבוהה ביותר? במקרה של ממוצע-conotoxins, מטרות ביולוגיות הן תעלות יונים ממותגת מתח נתרן, ממוצע-PIIIA בפרט הוא החזק ביותר עבור סוגי_V1.2, נה נה_V1.4 ו- Na_V1.7³.

הסינתזה של פפטידים גשר דיסולפידי יכולה להיות מושגת באמצעות שיטות שונות. השיטה הנוחה ביותר להיווצרות חוב דיסולפידי בתוך פפטיד היא הגישה כביכול על עצמי מתקפלים חמצוני. כאן, מבשר ליניארי של פפטיד מחזורית הרצוי הוא מסונתז הראשון באמצעות פפטיד מוצק-שלב הסינתזה, לאחר המחשוף מתמיכה פולימריים נתון חמצון במערכת מאגר. חמצון-חיזור-פעיל סוכני כגון גלוטתיון מופחתת ו מחמצנים (GSH/GSSG) מתווספים לעיתים קרובות כדי לקדם את היווצרות חוב דיסולפידי. החיסרון העיקרי של הנתמך על-ידי מאגר קיפול עצמית היא כי הקשרים דיסולפידי לא נוצרות באופן סלקטיבי stepwise אופנה. בהשוואה של פפטיד מקורית, אשר לעיתים קרובות איזומר אחד בלבד דיסולפידי ספציפי מתואר, זה אפשרי להשיג רבים isomers אחרים עם גישה זו⁸. ממוצע-PIIIA כבר הוכח לגרום לפחות שלושה isomers באופן שונה מקופל על עצמי מתקפל לתוך המחקר הקודם³. הפרדת תערובת איזומר כזה קשה למדי בשל פעמים השמירה דומה אם באמצעות שיטות טיהור כרומטוגרפי⁹. הסינתזה יישוב של איזומר ספציפי לכן יתרון. כדי לייצר באופן ספציפי שאיזומר עם קישוריות דיסולפידי מוגדרים, אסטרטגיה מיוחד נדרש אשר דיסולפידי איגרות החוב במרוכז סגורים. לכן, מבשר ליניארי נושאת קבוצות להגן על זוגות בודדים ציסטאין הוא מסונתז על התמיכה פולימר. לאחר חיסול, זוגות ציסטאין בנפרד ולא במרוכז deprotected הינם מקושרים ב תגובה חמצון להניב את הרצוי דיסולפידי אג ח^{10,11,12,13, 14 , 15 , 16}. לאחר הסינתזה הטיהור של המוצר התגובה, נדרש לאשר את הזהות וקישוריות דיסולפידי לפי שיטות אנליטיות מתאימים. שיטות אנליטיות רבות זמינות עבור הבהרה של הרצף חומצת אמינו העיקרי, למשל., MS/MS, בעוד הקביעה של קישוריות דיסולפידי עדיין נשאר הרבה פחות ובדוקים. מלבד למורכבות כה מרובים בונדד דיסולפידי פפטידים, זיהומים הקשור למוצר (למשל., מ דיסולפידי ערבול), עקב מדגם והכנה לעבודה יכול לסבך עוד יותר את ניתוח. בנייר זה, אנו מראים כי השימוש בשילוב של טכניקות אנליטיות שונות הכרחי להבהיר באופן חד משמעי את זהותו של הקשרים דיסולפידי ב isomers ממוצע-PIIIA. יש בשילוב שיטות כרומטוגרפיות ספקטרומטר מסה ואנו מסופקים הדגימות באותו כדי NMR ספקטרוסקופיה. ב- desorption/ionization(MALDI) לייזר בסיוע מטריקס ניתוח MS/MS, זיהינו את האיגרות דיסולפידי באמצעות הפחתה חלקית של iodoacetamide derivatization כי ניתוח מלמעלה אינה אפשרית עבור פפטיד זה. 2D NMR הניסויים בוצעו על מנת לקבל מבנה תלת ממדי של כל איזומר. לפיכך, על ידי שילוב של שיטות אנליטיות מתוחכמים ברורים, אפשרי להבהיר כראוי קישוריות דיסולפידי ואת מבנה תלת ממדי של קומפלקס פפטידים בונדד דיסולפידי מספר⁷.

הערה: כל חומצות האמינו המשמשות בתקנון היו בתצורה-L. הקיצורים של חומצות אמינו, חומצות אמיניות נגזרים שימשו על-פי ההמלצות של ועדת המינוח אוהב את, הוועדה המשותפת סיסטמטי-אוהב את המינוח הביוכימי.

1. מוצק-שלב פפטיד סינתזה (SPPS)

הערה: לבצע הסינתזה עם סינתיסייזר פפטיד מוצק-פאזי. לבצע הסינתזה של סימנים מקדימים פפטיד ליניארי של הרצף כללי ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH₂ באמצעות פרוטוקול תקשורת כימיה 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc). להחיל את חומצות אמינו המוגנים הבאים: Pyr (מפחיד (טרט-butyloxycarbonyl)), Arg (Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl)), Asn(Trt), Asp(tBu), Hyp(tBu), Lys(Boc), Ser(tBu), Gln(Trt), Glu(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), Thr(tBu) ושלו (Trt). להגן על זוגות ציסטאין Trt-, Acm-או tBu-קבוצות לפי קישוריות דיסולפידי המיועד.

1. הכנה
   1. יבש שרף Fmoc רינק-אמיד (טעינה: 0.28 mmol/g) באמצעות של איזה שהוא לופילייזר בין לילה.
   2. הזן את הרצף הרצוי פפטיד (קוד 1-מכתב) לתוכנית של סינתיסייזר. התוכנית מחשבת את הסכום הנדרש עבור כל ריאגנט בודדים ומציין את הכמויות הממס.
   3. שוקל ריאגנטים בודדים (חומצות אמינו, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) לפי הפרוטוקול, לפזר אותם ב- dimethylformamide (DMF) כדי ריכוז סופי של 2.4 מטר (חומצות אמינו) ו- (0.6 מטר HBTU), בהתאמה.
   4. להעביר את ריאגנטים שונים (חומצות אמינו, HBTU, N-methylmorpholine (NMM, 50% DMF), פיפרידין (20% ב DMF), DMF, דיכלורומתאן (DCM)) כדי כלי המתאים ומניחים המחבטים המתאים של סינתיסייזר פפטיד מוצק-פאזי.
   5. להוסיף 100 מ ג של שרף יבש העמודות התגובה ולשים אותם מן ההמולה של סינתיסייזר. התחל את הסינתזה שלב מוצק פפטיד.
2. SPPS-פרוטוקול (שסופק על-ידי סינתיסייזר)
   הערה: הפרוטוקול חלה על 100 מ ג של שרף (טעינה: 0.28 mmol/g) להוסיף תגובה אחת עמודה עבור 28 µmol סולם.
   1. הכנה של שרף
      1. יש לשטוף את השרף עם 2500 µL DMF, 1400 µL של DCM ו 1400 µL של DMF.
      2. ריקון שרף באוויר עד הממס יוסר ולשטוף השרף עם 2500 µL של DMF.
   2. . המחשוף Fmoc מגן קבוצתית
      1. להוסיף 20% פיפרידין DMF (1000 µL) שרף, וחכי במשך 6 דקות להסיר את הפתרון השרף. חזור על שלב 1.2.2.1.
      2. לשטוף פעמיים עם DMF (µL^st 4000 1, 2 µL^nd1400), לשטוף את השרף באוויר עד הממס יוסר ולשטוף פעמיים עם 2000 µL של DMF.
   3. ריאקציות מצומדות
      1. לערבב את ריאגנטים הבאים בבקבוקון נפרדים: HBTU (450 µL; 0.6 מטר ב DMF 270 µmol; 9.6 הציוד), NMM (125 µL; 50% DMF 568 µmol; 20 הציוד), חומצה אמינו Fmoc (420 µL; 2.4 מטר ב DMF 1.01 mmol; 36 הציוד). להוסיף את התערובת שרף ולחכות 13 מינימלית להסיר הפתרון של השרף. חזור על שלב כ- 1.2.3.1.
      2. לשטוף עם 3000 µL של DMF. לשטוף פעמיים עם 1400 µL של DMF. לשטוף פעמיים עם 2000 µL של DMF.
      3. חזור על שלבים 1.2.2 ו- 1.2.3 לפי מספר חומצות אמינו ברצף פפטיד.
   4. שטיפת המחשוף, שרף Fmoc הסופי
      1. להוסיף 20% פיפרידין DMF (1000 µL) שרף, וחכי במשך 6 דקות להסיר את הפתרון השרף. חזור על שלב 1.2.4.1.
      2. לשטוף פעמיים עם DMF (µL^st 4000 1, 2 µL^nd 1400) ומורידים את השרף באוויר. לשטוף פעמיים עם µL 2000 של DMF, 4 פעמים עם 1400 µL של DCM, ותורידי פעמיים עם אוויר.
3. עבודה-up
   1. Lyophilize השרף מן התגובה עמודות לילה לאחר הסינתזה הושלמה.

2. פפטיד המחשוף של השרף (איור 1א')

הערה: במהלך ההליך המחשוף, כל חומצת אמינו לצד רשתות חוץ Cys(Acm) ואת Cys (tBu) להיות deprotected. הפרוטוקול חל על 100 מ ג של שרף.

1. לשלב את השרף הליחה פנימה צינור 12 ml, תירגע עד 0 ° C על קרח.
2. להוסיף 150 µL של תערובת נבלות (להכין 0.75 g פנול, 0.5 מ ל thioanisole, ethanedithiol 0.25 mL), 1 מ"ל חומצה trifluoroacetic (95% מים (H2O), TFA) על הקרח השרף. השאר מנענע בעדינות במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר.
3. לסנן את התערובת דרך frit זכוכית ולאסוף את פילטרט של צינורות מלאים בנפרד כקרח דיאתיל אתר (1 מ"ל של פצילות תערובת לכל 8-10 מ"ל של דיאתיל אתר). פפטיד ארגונייט שוקע כמו מוצק לבן.
4. יש לשטוף את העוגה מסנן TFA נוספים (95% H₂O, כ – 1-3 מ ל).
5. סגור את הצינורות המכיל התמיסה centrifuge (3400 x g) את המתלים עבור 1 דקות, decant את תגובת שיקוע, לשטוף את כדורי עם 8-10 מ"ל של דיאתיל אתר קר כקרח. חזור על שלב זה 3 פעמים.
6. להשאיר את כדורי עומד בלי בולם כבר 5 דקות להסיר שאריות שנותרו של דיאתיל אתר. להמיס את כדורי המוצר הגולמי ב 1 מ"ל של טרט-butanol (80% H₂O). שזה יבש והקפיא את פפטידים (-80 מעלות צלזיוס).

3. טיהור למבשר ליניארי עם כרומטוגרפיה נוזלית למחצה מפוח בעל ביצועים גבוהים (HPLC)

הערה: לטהר את פפטידים גולמי על ידי שלב הפוכה למחצה מפוח (RP) HPLC מצויד עמודה סי18 (גודל החלקיקים מיקרומטר 5, 100 Å גודל הנקבוביות, 250 x 32 מ מ), לולאה הזרקת 3.6 מ ל. להשתמש במערכת • תנאי מעבר של 0.1% TFA H₂O (eluent A) ו- 0.1% TFA acetonitrile (MeCN) /H₂O (9:1, eluent B). לזהות את הפסגות-220 ננומטר.

1. להוסיף כ- 70 מ"ג של פפטיד גסה צינור 15 מ"ל, לפזר את פפטיד מוצק בהיקף של הלולאה מדגם HPLC (למשל., 3.6 מ ל). משתמשים בתערובת של 0.1% TFA MeCN/H₂O (1:1). מערבולת עד השלמת התפרקות, צנטריפוגה (3400 x g) הפתרון עבור 1 דקות.
2. לצייר את המדגם (3.6 מ"ל) במזרק 5 מ ל, להזריק את הדגימה ללא בועות אוויר לתוך הלולאה הזרקה. מזריקים לתוך מערכת HPLC. הפרד את התערובת פפטיד באמצעות שיפוע של 0-50% eluent B מעל 120 דקות בקצב הזרימה של 10 מ"ל לדקה.
3. לאסוף את השברים צינורות בודדים כפי שהם מופיעים. בתום המרוץ, להכין שברים שנבחר ספקטרומטר מסה (MS) וניתוח HPLC (שלב 6.1-6.2). שזה יבש והקפיא השברים ואחסן אותם ב-20 ° C.
4. אחרי ניתוח MS ו- HPLC, לשלב שברים טהור של פפטיד ליניארי ולהכין את הדגימות חמצון הראשון.

4. סלקטיבי היווצרות חוב דיסולפידי

1. 1 ^סנט חמצון (איור 1B)
   הערה: במהלך המחשוף פפטיד של השרף, Cys(Trt) הם deprotected, המוביל אל שני שאריות Cys לא מוגן אשר לאחר מכן ותוחלת חמצון כדי ליצור את קשר דיסולפידי הראשון. הפרוטוקול הבא חל על 15 מ ג של פפטיד מטוהרים ליניארי (גר'/מול 2864.5; 1; 5.2 µmol הציוד).
   1. להמיס את פפטיד ליניארי (15 מ ג) ב- 105 mL של אלכוהול איזופרופיל/H₂O-תערובת (1:2; מ מ 0.05 pH 8.5 מותאם עם הידרוקסיד הנתרן (NaOH)) ולהשאיר מנענע בעדינות באוויר בתנאים בסיסיים עבור 12-48 שעות.
   2. לפקח על תגובת חמצון באמצעות HPLC ו גב' אישור הקמת הגשר הראשון על-ידי iodoacetamide (רשות העתיקות) derivatization (שלב 6).
   3. שזה יבש והקפיא את פפטיד ולהשתמש בו ללא טיהור נוסף עבור חמצון 2^nd .
2. 2^nd חמצון (איור 1C)
   הערה: במהלך חמצון השני, את deprotection של cysteines המוגנים Acm, היווצרות של הגשר השני הם מזורז על ידי יוד. הפרוטוקול חל 15 מ ג של פפטיד לאחר חמצון^st 1 (גר'/מול 2862.5; 1; 5.2 µmol הציוד)
   1. להמיס את פפטיד (15 מ ג; הריכוז הסופי של 0.05 מ"מ) 105 mL של אלכוהול איזופרופיל/H₂מ' O/1 תערובת חומצת מימן כלורי (HCl) (80:12.5:7.5).
   2. להוסיף µL 158 של פתרון יוד 0.1 M מתנול (MeOH) (15.7 µmol; 3 הציוד) לפתרון. מערבבים את התגובה בטמפרטורת החדר במשך 3-52 h, כלומר., עד להשלמת החמצון.
   3. לפקח על תגובת חמצון באמצעות HPLC ו גב' אישור היווצרות קשר דיסולפידי השני על ידי iodoacetamide (רשות העתיקות) derivatization (שלב 6).
   4. לעצור את התגובה על-ידי הוספת µL 79 של פתרון חומצה אסקורבית 1 מ' H₂O (78.8 µmol; 15 הציוד). שזה יבש והקפיא את תערובת התגובה ומשתמשים את אבקת חמצון 3^rd .
3. 3 חמצון^רואד (איור 1D)
   הערה: חמצון האחרון מוביל את deprotection של cysteines המוגנים Bu t, היווצרות של גשר דיסולפידי השלישי. הפרוטוקול חל 15 מ ג של פפטיד לאחר 2^nd החמצון (גר'/מול 2718.3; 1; 5.5 µmol הציוד).
   1. להמיס את פפטיד (15 מ ג, הריכוז הסופי של 1 מ מ) מ 5.5 ל TFA. הוא מכיל תערובת נבלות המורכב 11.2 מ ג של diphenylsulfoxide (55 µmol; 10 הציוד), 60.2 µL של anisole (0.6 mmol; 100 הציוד) ו 97.2 µL של trichloromethylsilane (0.8 mmol; 150 הציוד). מערבבים את התערובת במשך 3-5 שעות בטמפרטורת החדר.
   2. לפקח על תגובת חמצון באמצעות HPLC ו גב' אישור היווצרות קשר דיסולפידי השלישי על-ידי iodoacetamide (רשות העתיקות) derivatization (שלב 6).
   3. לזרז את פפטיד את החצוצרות שלה המכיל דיאתיל קר (0 ° C, 1 מ"ל של התגובה פתרון לכל 8-10 מ"ל של דיאתיל אתר).
   4. Centrifuge את המתלים (3400 x g, 1 דקות), decant את תגובת שיקוע, לשטוף את כדורי שוב ושוב (4 פעמים) עם 8-10 מ ל קר דיאתיל אתר (0 ° C). תן את כדורי יבש על אוויר (3 דקות).
   5. להמיס את כדורי ב 1 מ"ל של 80% טרט-butanol (ב H₂O), שזה יבש והקפיא את פפטיד ואחסן אותו ב-20 ° C.

5. פפטיד טיהור

הערה: לטהר את פפטידים מחמצנים מאת preparative חלקית, RP HPLC מצויד עמודה סי18 (10 גודל החלקיקים מיקרומטר, 300 Å גודל הנקבוביות, 250 x 22 מ מ), לולאה הזרקת 3.6 מ ל. להשתמש במערכת • תנאי מעבר של 0.1% TFA H₂O (eluent A) ו- 0.1% TFA MeCN/H₂O (9:1, eluent B). לזהות את הפסגות-220 ננומטר.

1. להוסיף 15 מ ג של המוצר הגולמי שסובל משלב 4.3.5 צינור 15 מ"ל. להמיס את המוצר הגולמי בהיקף של הלולאה מדגם HPLC (למשל., 3.6 מ ל). משתמשים בתערובת של 0.1% TFA MeCN/H₂O (1:1). מערבולת עד השלמת התפרקות, צנטריפוגה (3400 x g) הפתרון עבור 1 דקות.
2. להכין לתערובת 3.6 מ במזרק 5 מ ל, להזריק את הדגימה ללא בועות אוויר לתוך הלולאה הזרקה. התחל את הזריקה לתוך מערכת HPLC. לטהר את התערובת פפטיד באמצעות שיפוע של 0-50% eluent B מעל 120 דקות בקצב הזרימה של 10 מ"ל לדקה.
3. לאסוף את השברים צינורות בודדים כפי שהם מופיעים. בתום המרוץ, להכין שברים שנבחר MS וניתוח HPLC (שלב 6.1-6.2). שזה יבש והקפיא שברים כל ואחסן אותם ב-20 ° C.
4. בתום המרוץ, להכין שברים שנבחר MS וניתוח HPLC (שלב 6.1-6.2). שזה יבש והקפיא שברים כל ואחסן אותם ב-20 ° C.

6. פפטיד Analytics

1. HPLC אנליטי
   הערה: לאשר את הטוהר של פפטיד על ידי RP HPLC אנליטיות מצויד עמודה סי18 (5 גודל החלקיקים מיקרומטר, 300 Å גודל הנקבוביות, 250 x 4.6 מ מ), לולאה הזרקת 500 µL. להשתמש במערכת • תנאי מעבר של 0.1% TFA H₂O (eluent A) ו- 0.1% TFA ב- MeCN (eluent B). לזהות את הפסגות-220 ננומטר.
   1. להעביר דגימה של שברים פפטיד או התגובה פקדים לתוך HPLC בקבוקון, להמיס בתערובת של 0.1% TFA ב MeCN/H2O (1:1, 300-500 µL). למקם את המבחנה HPLC תעשיה של RP HPLC אנליטי.
   2. מזריקים µL 250 של כל דגימה. להשתמש במערכת • תנאי מעבר של 0.1% TFA H₂O (eluent A) ו- 0.1% TFA ב- MeCN (eluent B). לטהר את פפטיד באמצעות שיפוע של 10-40% eluent B מעל 30 דקות בקצב הזרימה של 1.0 mL/min.
2. ספקטרומטר מסה MALDI TOF
   הערה: לאשר את הזהות של פפטיד באמצעות ספקטרומטר מסה TOF MALDI (שעת הטיסה) באמצעות α- cyano-4-hydroxycinnamic חומצה כמו מטריקס.
   1. העברת כמות גלוי של פפטיד לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL ו לפזר זאת בתוך 10 µL של 37 מ מ α- cyano-4-hydroxycinnamic חומצה פתרון בתערובת של 0.1% TFA H₂O/MeCN (1:1).
   2. מערבולת הפתרון עבור 10 s, חלות 2 µL של המדגם מטרה הקרקע פלדה, מילה נהדרת המדגם.
   3. השתמש במצב המשקף את המידות, כיול פפטיד של תקן שן טוחנת גושים מתחת 6000 גרם/מול.
3. Iodoacetamide derivatization
   הערה: כפי iodoacetamide מגיב עם קבוצות תיול, iodoacetamide derivatization של פפטידים מציינת קבוצות תיול חינם. לפיכך, העדר של קבוצות תיול חינם משמש פקד תגובה באמצעות MS במהלך חמצון 1^סנט .
   1. להמיס את פפטיד במאגר 10 מ מ פוספט (100 µL; מ מ 0.05 pH 7.8) צינור microcentrifuge 1.5 mL. להוסיף 100 µL של iodoacetamide במאגר פוספט (4 מ מ) של 10 מ מ הפתרון פפטיד ומנערים בעדינות את התגובה כבר שעתיים בטמפרטורת החדר בחושך. שזה יבש והקפיא את תערובת התגובה ואחסן אותו ב-20 ° C.
   2. טיפ פיפטה מסנן סי18-ריכוז ולהשתמש להתנות את הטיפ עם 10 µL של 80% (3 פעמים), 50% (3 פעמים), 30% (פי 3) ו- 0% (3 פעמים) MeCN H₂O (+ 0.1% TFA).
   3. להמיס את הדגימה של שלב µL 6.3.1 ב 1 של 0.1% TFA H₂O ולהוסיף את הפתרון לקצה פיפטה מסנן. פיפטה בזהירות למעלה ולמטה כך פפטיד נקשר החרוז. הסר את H₂O מתוך הקצה פיפטה ולשטוף את הטיפ פיפטה מסנן עם 10 µL של 0.1% TFA H₂O.
   4. להוסיף 2 µl של 0.1% TFA H₂O/MeCN (1:1) עם עוד טיפ פיפטה (ללא סינון) מעל החרוז אשר מכיל את פפטיד. להחיל את פילטרט של המטרה הקרקע פלדה, מילה נהדרת המדגם.
   5. החל µL 1 של 37 מ מ α-cyano-4-hydroxycinnamic פתרון חומצה בתערובת של 0.1% TFA H₂O/MeCN (1:1) כדי להשמיד את הקרקע היעד עם הדגימה, מילה נהדרת המדגם.
   6. השתמש במצב המשקף את המידות, כיול פפטיד של תקן שן טוחנת גושים מתחת 6000 גרם/מול.
4. חומצת אמינו ניתוח
   הערה: לנתח את הריכוז פפטיד מדויק, כמו גם הרכב חומצת אמינו פפטיד באמצעות מנתח של חומצה אמינית.
   1. להעביר צינור microcentrifuge 1.5 מ ל 100 µg של פפטיד טהור (2604 g/mol; 0.04 µmol), לפזר את האבקה בתוך 200 µL של 6 M HCl.
   2. להעביר µL 200 של הפתרון לתוך המבחנה זכוכית ולהעביר שטיפה הצינור microcentrifuge 1.5 מ ל פעמיים עם 200 µL של HCl M 6. הפתרון השטיפה לתוך האמפולה זכוכית גם כן.
   3. לסגור את האמפולה על ידי חימום צוואר המבחנה עם להבה מבער בונזן. לשים את האמפולה לתוך שפופרת זכוכית. למקם אותו בתוך גוש חימום במשך 24 שעות ביממה ב 110 ° C עבור הידרוליזה.
   4. פתח את האמפולה, להעביר את הפתרון לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל. לשטוף את האמפולה (3 x 200 µL) את הכובע (3 x 100 µL) עם מזוקק פעמיים H₂O והעבר אותו לתוך הצינור microcentrifuge.
   5. Centrifuge הפתרון עבור 6-אייץ '-60 ° C ו- g x 210 ברכז כשעוצמת ואקום. להמיס את המוצר הידרוליזה µL 192 המאגר דילול מדגם (200 מיקרומטר) ולהעביר את הפתרון לתוך מסנן מיקרו-צנטריפוגלית.
   6. Centrifuge לדוגמה עבור 1 דקות ב 2300 x µL 100 g והעברה של פילטרט של תוך צינור מדגם חומצה אמינית ניתוח. למקם את הצינור לתוך במנתח חומצת אמינו ולהתחיל את הניתוח. תקן חומצת אמינו משמש לכיול.

7. MS/MS ניתוח של קישוריות דיסולפידי

1. הפחתת ו אלקילציה חלקית¹⁷
   1. להמיס 600 µg של פפטיד טהור (2604 g/mol; 0.23 µmol) ב- 1.2 מ של מאגר ציטראט 0.05 M (pH 3.0; מ מ 0.14 פפטיד ריכוז) המכיל 7.5 מ"ג של tris(2-carboxyethyl) פוספין (TCEP; מ 0.02 נקודות mmol 0.03 נקודות).
   2. דגירה התערובת בטמפרטורת החדר, לקחת תגובה מספר דגימות הבקרה (100 µL) החל 0 דקות עד 30 דקות.
   3. מערבבים את הדגימות צינור microcentrifuge 1.5 mL עם 300 µL אלקילציה מאגר (0.5 M טריס-אצטט; pH 8.0; 2 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA); 1.1 מ' iodoacetamide) כדי לעצור את התגובה ולבצע carbamidomethylation של קבוצות תיול חינם.
   4. לעצור את התגובה לאחר 5 דקות על-ידי הוספת 100 µL של 10% TFA (ב H₂O) וחנות הדגימות בקרח יבש. להכין דגימות HPLC כפי שמתואר בשלב 6.1.2 ולהזריק 400 µL. (איור 2א)
   5. להשתמש במערכת • תנאי מעבר של 0.1% TFA H₂O (eluent A) ו- 0.1% TFA ב- MeCN (eluent B). לנתח את פפטידים באמצעות השילוב של ההפרדה איזוקראטית (10% eluent B למשך 15 דקות), ואז הדרגתי עוקבות של 10-35% eluent B מעל 25 דקות בקצב הזרימה של 10 מ"ל לדקה לזהות את הפסגות-220 ננומטר.
   6. לאסוף את השברים 1.5 mL microcentrifuge צינורות ולהקפיא את פפטידים. (איור 2B)
   7. להעביר כמות קטנה של כל שבר צינור microcentrifuge 1.5 mL לניתוח MS/MS של הצורות מחמצנים (המשך בשלב 7.1.12).
   8. להמיס את פפטיד הנותרים (10-100 µg) ב- 0.1% TFA H₂O (10-50 µL) ולהוסיף אמצעי אחסון המתאים של פתרון TCEP 100 מ מ (ב- H₂O) כדי לקבל ריכוז TCEP הסופי של 10 מ מ.
   9. דגירה התגובה עבור h 1 ° 37 C (איור 2C). שזה יבש והקפיא את תערובת התגובה ואחסן אותו ב-20 ° C.
   10. להכין דגימות MS/MS כפי שמתואר בשלב 6.3.2-6.3.5.
   11. מבצע המדידות MS/MS ספקטרומטר מסה MALDI תוף/תוף. השתמש MS/MS המכסה (קרינת לייזר המושרה) עבור פיצול של פפטיד ובחר ההמונים קודמן 2 - ו 4 פעמים carbamidomethylated מינים. תהליך ולהעריך את הנתונים MALDI כדי לוודא קישוריות דיסולפידי הרצוי.

8. NMR ניסויים וניתוח מבנה

1. להמיס כ 0.3-2 מ"ג של המוצר פפטיד טהור 500 µL של H₂O/D₂O (90:10), העברת התערובת לתוך microtube NMR.
2. הכנת המדגם למדידות-ספקטרומטר NMR
3. רשומה 2-ממדי [¹H,¹H] - DQF - נעים (כפול קוונטית מסונן המתאם ספקטרוסקופיה), [¹H,¹H] - TOCSY (ספקטרוסקופיה מתואם סה כ), [¹H,¹H] - NOESY (Overhauser הגרעינית שיפור ספקטרוסקופיה), ו [¹H,¹³C]-ספקטרה HSQC (קוהרנטיות קוונטית בודדת heteronuclear) באמצעות דיכוי מים.
4. להקצות את מגנטיים פרוטון הספקטרום מוקלטות, ליצור את המשימה אטום NOESY ספקטרה. להשוות עוצמות ב ספקטרום NOESY כדי להגדיר את האילוצים הגבול העליון המרחק בין אטומי שונה פפטיד. השתמש את עוצמת הפרוטונים נבטי לכיול שיא בעוצמה.
5. לבצע חישוב מבנה ועידון עם תוכנת מחשב להמחשת מולקולרית ועושים שימוש את connectivities דיסולפידי מזוהה של שלב 7 נוספים ריסון (איור 3).
6. בחר את המבנים עם האנרגיות הנמוך ולהשתמש בו עבור סימולציות דינמיקה מולקולרית (MD).

15 שונים גשר דיסולפידי isomers של PIIIA ממוצע-conotoxin מסונתז, מאופיין בפירוט (איור 1). חוב דיסולפידי מזוהים על ידי הפחתת חלקית ו- MS/MS לאחר מכן ניתוח (איור 2). ניתוח NMR של isomers שונים מתבצעת (איור 3) כדי לחשוף את המבנים פפטיד בודדים. ראוי לציין, שילוב של RP HPLC, פיצול MS/MS, וניתוח NMR נדרש זיהוי ברורה וחד משמעית של קישוריות דיסולפידי.

איור 1 : היווצרות קשר דיסולפידי סלקטיבי ממוצע מקורי-PIIIA דרך האסטרטגיה קבוצה מגן. (א) deprotection של cysteines המוגנים Trt במהלך המחשוף פפטיד של השרף. (B) גשר דיסולפידי הראשון היווצרות cysteines לא מוגן. (ג) Deprotection ויצירת גשר דיסולפידי של Acm מוגן cysteines. (ד) Deprotection ויצירת גשר דיסולפידי של ה- tBu מוגן cysteines. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : הפחתה חלקית של זרימת עבודה עבור ההקצאה קשר דיסולפידי על ידי ניתוח MS/MS. (א) הפחתת חלקית ו אלקילציה של פפטיד. (B) טיהור HPLC של דגימות הבקרה תגובה אחרת. (ג) הפחתה של הדגימות מטוהרים. חלקית carbamidomethylated מינים (שני פפטידים באמצע) הנמל מידע על קישוריות דיסולפידי הנקבע על-ידי ניתוח MS/MS. איור זה היה מותאם באישור לפעמים דברים, פ. et al. Isomers PIIIA ממוצע הסתגלותי-Conotoxin Revisited: ההשפעה של ציסטאין זיווג על קשר דיסולפידי הקצאה של מבנה הבהרה. כימיה אנליטית. 90 (5), 3321-3327 (2018). זכויות יוצרים (2018) האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : ההליכה רציפים ואת המבנה פתרון NMR וכתוצאה מכך נוקשה (שמאלה), של איזומר גמיש (מימין) ממוצע-PIIIa. המבנים 20 עם האנרגיות הנמוך ביותר, כמו גם קישוריות דיסולפידי של isomers שונים מוצגים. השוואת הערכים סטיית (RMSD) שורש ממוצע הריבועים מבהיר כי פפטיד נוקשה לרוב מוביל למבנה כדאי נפתרה NMR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

שיטת המתוארים בזאת לסינתזה של ציסטאין עתירי פפטידים כגון ממוצע-PIIIA מייצג אפשרות לייצר באופן סלקטיבי בונדד דיסולפידי isomers של אותו רצף חומצות אמיניות. לכן, הוקמה שיטות כמו מוצק מבוססי Fmoc שלב הסינתזה פפטיד¹⁸ , אסטרטגיה מוגדרת קבוצה שיגן על היווצרות regioselective דיסולפידי חוב היו בשימוש¹⁶. הסינתזה פפטיד מוצק-שלב יכול להפיק רצפים של חומצות אמיניות על תמיכה פולימר (שרף) באמצעות סינתזה אוטומטית. חומצות אמינו אלו מוגנים נגד ריאקציות צדדיות רצויה במהלך רצף הרכבה מיוחד שיגן על קבוצות בהשרשראות בצד שלהם, אשר הם - בהתאם לפרוטוקול להשתמש - deprotected על פפטיד המחשוף של השרף. הגנה זו חל גם על הרשתות בצד ציסטאין בתוך הרשת פפטיד, למשל., trityl הגנה. עם זאת, מגן ברורים קבוצות עבור זוגות בודדים cysteines כגון acetamidomethyl, טרט-בוטיל לא ביקע/ת שלב זה חיסול. קבוצות אלה מגן יכול להיות שהבקיע את תנאים המאפשרים חמצון הבאים על ידי יצירת חוב דיסולפידי מקבוצות תיול deprotected. בדרך זו, כל isomers דיסולפידי 15 של פפטיד המכיל שישה שאריות ציסטאין יכול להיות בנוי באופן סלקטיבי^7,16. הגורם המגביל, עם זאת, היא עם מספר גדל והולך של קבוצות שונות אורתוגונלית שיגן על עליות מאמץ. סינתטית, אשר יש השפעה גבוהה על היבול של פפטיד דיסולפידי הרצויה ניתן לגישור. לפיכך, במקרים נבחרים ובמיוחד על פחות מורכבים פפטידים בעלי חוב דיסולפידי אחד או שניים בלבד הגישה עצמית מתקפלים חמצוני אכן ייתכן המועדפת על האסטרטגיה קבוצה מגן.

במסמך זה, הקבוצות Trt בזוג אחד ציסטאין יוסרו על ידי הפעולה של TFA לאחר השלמתו של מכלול פפטיד, Fmoc-deprotection הסופי של החומצה אמינית N-מסוף. לתנאים חומציים, עם זאת, להשאיר Acm ואת tקבוצות מגן Bu-שני זוגות אחרים של ציסטאין שאריות ללא פגע. לאחר מכן, טיהור פפטיד ליניארי המכיל שני cysteines לא מוגן מתבצעת באמצעות מפוח HPLC בתנאים חומצית מעט כדי לשמר את קבוצות תיול בדמות protonated. הפרוטוקול ממשיך עם הצעד הראשון חמצון לאחר ניתוח אנליטיים HPLC ו- MS הסינתזה המוצלחת, deprotection של Trt-הזוג ציסטאין עניין. מדרגות נוספות deprotection וחמצון של השני והשלישי דיסולפידי ביצעו, אישר באופן זהה באמצעות פרוטוקול המתאים עבור Acm ו- tBu, בהתאמה. תגובות חמצון אלו הם לפיכך תגובות רטוב-כימית פשוטה שבוצעו תמיסת שאינן דורשות ריאגנטים יקר. החיסרון, לעומת זאת, הוא תגובות מסוימים, כלומר. חיבורים של שאריות ציסטאין ברורים, אין להמשיך בצורה חלקה, המוביל לחלוטין תוצרי לוואי של ביצים מקושקשות קישוריות דיסולפידי. מאז אלה לא יוסרו לאחר סיום של תגובות חמצון בודדים, תוצרי לוואי כזה יכול להצטבר התערובת המוצר הגולמי. חלק מהם אפשר בעלי מאפיינים דומים physicochemical כמו פפטיד בפועל, למשל., • תנאי HPLC, אשר מגדילה את המאמץ עבור טיהור של פפטיד מקופל כראוי. למרות סינתזה של טיהור יכול להיות קשה, כמו במקרה של ממוצע-PIIIA, שיטה זו יכול לשמש בהצלחה, עדיין דורש מיומנויות ההדרכה והתבוננות טוב. בסופו של דבר, זה צריך לקחת בחשבון כי כל רצף פפטיד הוא שונה, ולכן אולי ניתן לטפל באופן שונה על מנת להצליח ביצירת קישוריות דיסולפידי הנכון.

בנוסף הסינתזה מאתגר, זה חיוני כדי לוודא אם הבונדס דיסולפידי המיוצר נכונים, כלומר., המייצג את גירסת איזומר דיסולפידי בהתאמה המיועד. זה מתבצע במסמך זה באמצעות שילוב של ניתוח MALDI MS/MS ו- NMR מבנה הבהרה. ניתוח MS/MS מתבצעת באמצעות שונים חלקית מופחתת ו alkylated נגזרות (carbamidomethylation) של ה¹⁷-פפטיד מחמצנים באופן מלא. MALDI MS/MS המכסה תוף/תוף ספקטרה שמספר זוגי של carbamidomethylated cysteines הוא תמיד מצא, קרי, carbamidomethylated 2, 4 או 6-פעמים. זו יכולה להיות מוסברת על ידי צמצום stepwise פפטידים לחלוטין מחמצנים, מאז כל אירוע שתי פונקציות תיול לכל קשר דיסולפידי תמיד מופחתים (פתח), בחיי עיר alkylated באמצעות iodoacetamide. זה carbamidomethylation של שני cysteines אחד ניתן להבחין ב ספקטרום MALDI MS/MS ואת, בתורו, מתייחס דיסולפידי בהתאמה ש-cysteines האלה עסקו בפפטיד שלם. לדוגמה, המופע של cysteines carbamidomethylated ארבעה ברצף עם שלושה דיסולפידי חוב מסייע לזהות אחד בונד ספציפיים, כלומר זה נוצר בין שני שאינם alkylated cysteines, אשר לא נפתחו במהלך זמן תגובה של מספיק לפתוח את השניים האחרים חלקית הפחתת אג ח. לפיכך, על ידי ניתוח MALDI MS/MS של נגזרות carbamidomethylated שונים 2 - ו 4 פעמים של איזומר דיסולפידי פפטיד, connectivities דיסולפידי ניתן לחלוטין מבואר מאושרות.

עוד אפשרות להבהיר את דפוס קשר דיסולפידי הוא ניתוח MS/MS פפטידים enzymatically מעוכל, בו פפטיד צריך להיות ביקע proteolytically-חומצות אמינו שונות כדי לייצר שברים קטנים יותר. קטעים קצרים אלה עדיין יכולים להיות מקושרים באמצעות חוב דיסולפידי, וזו הסיבה כי התבנית דיסולפידי יכול להיות הובהר מניתוח MS/MS של קטעים אלה מקושרים. במקרה של ממוצע-PIIIA, עם זאת, אסטרטגיה זו לא היתה אפשרות להחיל כי כמה cysteines של הרצף הן ישירות הסמוכים אחד לשני, לכן עיכול פפטידים נפרדות לא cysteines את אחד מהשני. זיהוי של גשר דיסולפידי ספציפי ולכן קשה.

הבהרה מבנה על ידי ניתוח NMR 2D בבירור הוא הקל במקרה קישוריות דיסולפידי ידוע, כי ידע זה מאפשר את ההקצאה של האפקט Overhauser גרעיני (NOE) ספציפיים הפרוטונים, כלומר., מפנות את מרחבי מרחק בין שני אטומים מחילופי עוצמות אותות NOESY (דרך חלל-NMR הניסוי). הניתוח של, עם זאת, מתחיל עם הליכה רציף¹⁹ חלה על ספקטרום COSY, TOCSY, NOESY, בדרך זו, ניתן להקצות אות מסוימת האטום-H המתאימים חומצות אמינו (ספין מערכת) ברצף. הרצועות הנ ל מרחק של הניסוי NOESY נעשה שימוש בחישוב מבנה של פפטיד⁷. הסימנים יותר מזוהה, מדויק יותר המבנה יהיה. עם זאת, הקושי של המטלה הזו גדלה עם המספר של חומצות אמינו פפטיד ועם המופע של cysteines הסמוך, כאשר ההסתברות עולה כי אותות של מספר אטומי חופפים, ניתן כבר לא בדיוק להקצות אמורים לסגור הקרבה. יתר על כן, הגמישות של שרשרת פפטיד הוא מכריע עבור אם אותות ב NMR ניתנים לזיהוי בקלות או בקושי. גמיש יותר אזור פפטיד, מתרחשים השינויים הסתגלותי יותר, ומאפשר אותות מרובים כדי להשיג עבור אטום אותו הדבר. לפיכך, האינטנסיביות פוחתת עם המספר של הייצורים החיים, מה שגורם אותות להיעלם אל תוך רעשי רקע. משמעות הדבר היא כי המבנה התלת-ממדי הבהרה באמצעות NMR הופך להיות הרבה יותר קל. אם הרצף conformationally מוגבלת.

לבסוף, פרוטוקול זה מאפשר ליצור פפטידים גשר דיסולפידי מרובים על-ידי ניטור היווצרות קשר דיסולפידי על ידי ניתוח MALDI MS/MS ווהמצוות 2D NMR מבנה הבהרה⁷.

המחברים אין לחשוף.

אנחנו רוצים להודות Resemann א פ י מאייר, ד Suckau של ברוקר Daltonics GmbH ברמן; ד ההרחבה של טיצה, ההרחבה של טיצה א א, Schmidts ו', ג למפשעה מאוניברסיטת דרמסטאדט של טכנולוגיה; O. Ohlenschläger מ יינה כאשר שגיא, Engeser מ מ באוניברסיטת בון; ק' קרמר, Harzen א ו ה Nakagami של מכון מקס פלנק למחקר גידול הצמח, קלן; Susanne Neupert ממכון זואולוגיה, קלן; למערכות ביולוגיות תהודה מגנטית ספקטרוסקופיה במתקני באוניברסיטת פרנקפורט טכנית, תמיכה, הדרכה מודולים, וגישה מכשירים. תמיכה כספית מאת באוניברסיטת בון כדי ד הוא הודה בהכרת תודה.

An erratum was issued for: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.

Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

to:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

Step 1.2 in the Protocol section was updated from:

NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.

to:

NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.

Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:

HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).

to:

HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).

The first item in the Materials table was updated from:

to: