Method Article
מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ex-vivo סידן הדמיה של המוח דרוזופילה . בשיטה זו, תרכובות טבעי או סינתטי ניתן להחיל את המאגר כדי לבחון את היכולת שלהם להפעיל את המסוים הנוירונים במוח.
עוגב-כדי-איבר תקשורת על-ידי איתות האנדוקרינית, לדוגמה, מהפריפריה למוח חיונית על שמירה על הומאוסטזיס. כחיה דגם למחקר האנדוקרינית, דרוזופילה melanogaster, אשר מורכבת גנטי כלים ומידע הגנום, משמשת יותר ויותר. מאמר זה מתאר שיטת ההדמיה סידן של explants המוח דרוזופילה . שיטה זו מאפשרת זיהוי ישיר באיתות של הורמון במוח. זה ידוע כי רבים פפטיד ההורמונים לפעול דרך G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), הפעלת אשר גורמת לעלייה בריכוז2 +Ca תאיים. הפעלה עצבית גם מגביה תאיים Ca2 + רמות, Ca2 + זרם והן על שחרורו של Ca2 + המאוחסן תוך-פלזמית (ER). חיישן סידן, GCaMP, באפשרותך לפקח על Ca2 + שינויים אלה. בשיטה זו, GCaMP מתבטאת הנוירונים עניין, וה -המוח זחל GCaMP-לבטא ביתר תרבותי ex-vivo. מבחן פפטיד מחילה על explant המוח, שינויים פלורסנט GCaMP מזוהים באמצעות ספינינג דיסק מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד with a מצלמה CCD. באמצעות שיטה זו, ניתן לבחון את כל מולקולה מסיסים במים, הסלולר אירועים שונים הקשורים עם הפעלה עצבית יכולה לדימות באמצעות האינדיקטורים פלורסנט המתאים. יתר על כן, על-ידי שינוי התא הדמיה, ניתן בשיטה זו לשיקוף איברים דרוזופילה אחרים או האברים של בעלי חיים אחרים.
עוגב-כדי-איבר תקשורת היא אסטרטגיית אבולוציונית שנשמרת על שמירה על הומאוסטזיס להתמודד עם שינויים סביבתיים. בבני אדם, מגוון רחב של הורמונים arereleased של בלוטות אנדוקריניות למחזור. רבים של הורמונים אלה יעד ההיפותלמוס במוח, אשר מווסת תהליכים מטבוליים והתנהגויות יסוד כגון האכלה1,2. הורמונים רבים כבר גילו באמצעות מודלים בתרבית. עם זאת, מנגנוני הפעולה שלהם, במיוחד הרשתות interorgan בהם הם משתתפים, נותרו בלתי ברורים במידה רבה.
דרוזופילה melanogaster התפתחה מודל שימושי עבור לימוד אורגן-כדי-איבר תקשורת. בחרקים, תהליכים פיזיולוגיים רבים נשלטים על ידי הורמונים. לימודי התמקדות צמיחה ושינוי צורה להשתמש חרקים גדולים. במחקרים אלה, הסרה או השתלת איברים ספציפיים ניבא את קיומו של מולקולות איתות בין איברים; מאוחר יותר, הורמון נעורים (JH), הורמון Prothoracicotropic (PTTH) Ecdysone היו מבחינה ביוכימית מטוהרים3,4,5. משפחה גדולה של פפטידים איתות המערכת נחשב להיות מעורבים באירועים פיזיולוגיים שונים במהלך מחזור חיי חרק6,7. רוב פפטידים אלה פועלים על G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), למרות GPCRs ספציפי היו בתחילה קשה לזהות באמצעות גישות קונבנציונליות. הפרסום של רצף הגנום כולו דרוזופילה 8 היה פריצת הדרך שאיפשר את הזיהוי של פפטידים ביו דרוזופילה בהתבסס על שלהם הומולוגיה לאלה שנמצאו ושאר חרקים. בנוסף, קולטני עבור מספר פפטידים אותרו מ GPCRs חזה הגנום באמצעות מבחני הכריכה GPCR-ליגנד המבוססות על התא-תרבות. בשלב הבא, ביטוי ניתוח חזה המסלולים איברים-כדי-איבר שהפיק אלה פפטידים, קולטנים. ראוי לציין, רבים של קולטני פפטיד בשם באים לידי ביטוי במוח, רומז המוח הוא יעד מרכזי של פפטיד ההורמונים9. יתר על כן, כלים גנטיים מתקדמים בדרוזופילה תרמו זיהוי תפקידים פיזיולוגיים של שילובים פפטיד-GPCR. למשל, GAL4 ואת לקסה בינארי תעתיק מערכות מבוססות להפעיל גנים או ביטוי בצורה מבוקרת במרחב של חנותם. GAL4, גורם שעתוק שזוהתה שמרים, נקשר לרצף cis-רגולציה ספציפי שנקרא רצף ההפעלה נגד הזרם (UAS). במערכת GAL4/UAS, הקו מנהל התקן מספק רקמות ספציפיות או ביטוי GAL4 שלב ספציפי לבין הקו המשיב נושא UAS במעלה הזרם של הגן מעניינים או הבונה לביטוי shRNA נסיעה. לקסה/LexAop מערכת מבוססת על מנגנון דומה. ניתוחים פנוטיפי של פפטיד-נוקאאוט רקמות ספציפיות ובעלי GPCR-נוקאאוט רקמות ספציפיות יכול לחשוף מידע אודות מצב של פפטיד-GPCR באיתות האתר של פעילות. אולם, המסקנות כי ניתן להגיע אך ורק על ידי מידע גנטי מוגבלים. מצד שני, ברגע בשם היעד של הורמון מסוים הוא צימצמת לסוג הרקמה או תא, שמחוץ סידן דימות in איברים explants ניתן להבהיר את התקשורת איברים-כדי-איבר מתווכת על-ידי איתות פפטיד-GPCR. בעת ההפעלה של GPCR מצמידים Gq, הריכוז2 + Ca תאיים גדל בשל שחרורו של Ca2 + מ ה ER10. במוח, הפעלה עצבית גם מעלה רמות2 + Ca תאיים. Ca2 + עליות כאלה ניתן להבחין באמצעות חיישן סידן, GCaMP, אשר עובר שינויים הסתגלותי בנוכחות Ca2 + וכתוצאה מכך פליטת קרינה פלואורסצנטית11.
במאמר זה מתואר של סידן שיטת הדמיה באמצעות המוח דרוזופילה explants. כדי לבדוק את היכולת של פפטיד להפעלת נוירונים ספציפיים, פפטיד המבחן חל את explant המוח לבטא GCaMP, שינויים פלורסצנטיות המפוקחים על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. המעורבות של GPCR אז אושר על ידי ביצוע וזמינותו אותו באמצעות מוח מוטציה חסר את GPCR. שילוב זה של הדמיה וגנטיקה מספק מידע מדויק על איבר-כדי-איבר תקשורת על-ידי פפטידים-GPCRs. האפשר שינויים ויישומים של פרוטוקול זה נדונות גם.
1. הכנת המוח זחל Explants
2. רכישת Ca2 + זריחה תמונות
הערה: המוח explants שקוע PBS הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד 20 X עדשה המטרה טבילה במי (נ. א = 0.5). PBS אינו מפעיל תאים במוח. אם ציר z תמונות נדרשים, העדשה המטרה נטענה עם mover עדשה פיזואלקטריים מופעל. ראש ספינינג דיסק קונאפוקלית משמש כדי לשפר את הרזולוציה זמן. עבור תאורה הדמיה, אלקטרון הכפלת תשלום מצמידים מכשיר המצלמה נטענה על המיקרוסקופ. ההדמיה של זריחה GCaMP6s (עירור/פליטה: 488/509 ננומטר) דורש 488 ננומטר לייזר עבור עירור עם מפצל קרן ודיקרואיק זוהר, מסנן פליטה (למשל., 528 ± 38 nm הלהקה bandpass מסנן).
3. ניתוח נתונים
הערה: הדמיה הנתונים מנותחים במצב לא מקוון עם ImageJ. במהלך ההדמיה זמן לשגות, pipetting גורמת למוח זחל להזיז. לכן, יש לתקן סטיות לפי מיקום של תמונות טורי לפני ניתוח. התיקון יכול להתבצע באמצעות ImageJ של התוספת, TurboReg כפי שמוצג להלן.
באמצעות פרוטוקול זה, נבחן את ההפעלה של מייצרי אינסולין תאי המוח (IPCs) על ידי הורמון פפטידי, CCHa2. IPCs של המוח פראי-סוג הודבקו תוויות עם GCaMP6s באמצעות שילוב של dilp2 -GAL412 (מתנה רוליפסון ד ר), UAS-GCaMP6s13 (מתנה ד ר קים). Explants המוח זחל שטופלו פפטיד CCHa2 סינתטי, הוקלט על ידי קרינה פלואורסצנטית מ- GCaMP6s בזמן אמת. בניסוי זה, תמונות, התקבלו מוקד מטוס בודד. כל אשכול IPC מכילה תאים בסביבות 1414, אותות 3 אל 6 תאים אותרו. עוצמת האות GCaMP6s היה גדל באופן דרמטי על המינהל CCHa2 (איור 2א, סרט 1). המוח פראי-סוג לא הראה מענה ברור גרלין או Nociceptin (הסרט 2 ו- 3, בהתאמה), אשר הם יונקים פפטיד ההורמונים ללא homologue דרוזופילה . תוצאות אלה מציינים כי הפעלת שנצפה IPCs על ידי CCHa2 היא תגובה ספציפית CCHa2. כדי לברר אם CCHa2 פועלת באמצעות CCHa2-R, הניתוח באותו נערך באמצעות המוח מוטציה CCHa2-R. אין עלייה כזו בעוצמת האות נצפתה לאחר CCHa2 המינהל במוחם מוטציה (4 סרטים). ניתוח סטטיסטי הראה כי ההבדל בעוצמת האות בין פראי-סוג CCHa2-R שכל מוטציה הפכה משמעותית בתוך 2 דקות לאחר יישום CCHa2, נשמר לפחות 7 דקות (איור 2B). תוצאות אלו מצביעות על IPCs במיוחד מופעלים על-ידי CCHa2 דרך CCHa2-R. כל פפטידים השתמשו במחקר זה היו מדולל על ידי PBS להניב ריכוז סופי של 10-9 מ'.
איור 1 . הדמיה תא
(א) תרבות מאכל (35 מ"מ x 10 מ"מ) עם שקע קטן, רוד tethering. (B) בצורת טבעת קיר עשוי דבק שפכטל דמוי דבקים לשימוש חוזר. (ג) A explant המוח זחל הוכנס לחדר ההדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . סידן הדמיה של explant המוח זחל
המוח פראי-סוג (dilp2-Gal4/UAS-GCaMP6s) נחשף CCHa2 גרלין, Nociceptin. מוטציה CCHa2-R (dilp2-Gal4, CCHa2-Rטל-34/UAS-GCaMP6s, CCHa2-Rטל-34) המוח נחשף CCHa2. אותות GCaMP6s ב IPCs אותרו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית-ms 250/מסגרת. עדיין תמונות של נקודות זמן נבחר מוצגות באותיות (A). התמונות היו pseudocolored משופרת של עוצמות האות שונה. ΔF/F0 בכל נקודה בזמן הייתה להתוות ב (B). ΔF/F0 מחושב מ 5 כדי 10 תכשירים שונים. ROIs נקבעו על הגופות תא שזוהו על מטוס מוקד זהה. הקווים מוצק מציינים הממוצע של 5-10 דוגמאות, ולסמן הקווים המקווקווים הגבולות העליונים והתחתונים של שגיאת התקן של הממוצע. אזורים מוצללים מציינים את הווריאציה של האותות בניסויים. סולם בר מציין 50 מיקרומטר. הדמות היא ממאמרו של סנו. et al. 15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
סרט 1. IPCs פראי-סוג נחשפים CCHa215 אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
הסרט 2. IPCs פראי-סוג נחשפים גרלין15 אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
הסרט 3. IPCs פראי-סוג נחשפים Nociceptin15 אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
סרט 4. CCHa2-R מוטציה IPCs נחשפים CCHa2 15 אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Ca2 + הדמיה בשיטה המתוארת כאן היא מערכת שימושית לבדיקה את הפונקציה של הורמונים במוח. אין ויוו, המוח מקבל הורמונים של האורגנים האנדוקרינית. בנוסף, המוח רואה כל הזמן עולה המידע החושי, הגורמת הפעלה עצביים ספונטנית. מערכת זו שמחוץ מבטל רעש נורא ותשואות יחס אות/רעש טוב יותר מאשר ויוו הדמיה. במערכת זו, ניתן לבדוק מולקולות ביחידים או במשולב. בנוסף פפטיד ההורמונים, כל מולקולות מסיסים במים, כולל תרכובות טבעיים או סינתטיים, ניתן ליישם את explant במוח.
עבור Ca2 + הדמיה, המוח explants צריך להיות קשור. למטרה זו, מטריצה ג'ל העשוי agarose נקודת התכה נמוכה או פיברין היה בשימוש בעבר16,17. מטריצות אלה ג'ל יכול להחזיק את הדגימה stably, עם זאת, רקמות מחוממים מעל 30 ° C. את החום גורם לתגובה חום-הלם ב poikilothermic בעלי חיים כגון חרקים. כדי למנוע עומס חום, המוח יכול להיות קשור פיזית. המוח המצורפת את הקוטיקולה מהודקים עם סיכות חרקים18. השיטה שלנו באמצעות חוט טונגסטן מספק פשוטה, יציבה מחזיק המדגם. מערכת זו היא קלה להכנה ולשימוש ומאפשרת ממריצים להגיע תאי היעד בקלות רבה יותר בהשוואה הג'ל הטמעת השיטה. לכן, זה יהיה שימושי להקרנה ליגנד.
הבחירה של מחוון פלורסנט תלוי בסוג של היעד נוירונים, הסוג של קולטנים לידי ביטוי הנוירון, והשאלות ביולוגי נותרים ללא מענה. סדרה של משתנים GCaMP6 אופטימיזציה עבור זיהוי שונים טמפורלית Ca2 + דינמיקה כבר שנוצר13. בפרט, GCaMP6 גרסאות נבדלים קינטיקה התגובה שלהם: GCaMP6s (איטי), GCaMP6m (בינוני), ו- GCaMP6f (מהיר). הטיימס דעיכה עבור GCaMP6s ו- 6m איטיים יחסית (כלומר., τ1/2 אחרי 10 פוטנציאל פעולה בהכנה פרוסה בהיפוקמפוס) בזמן זה GCaMP6f הוא מהיר (τ1/2 לאחר פוטנציאל הפעולה 1). סוגים אחרים של מחוונים פלורסנט זמינים עבור פעילות עצבית כוללים במחנה EPAC (מחנה), Synapto-pHluorin (שחרור סינפטית), תאטרון ארקלייט (פוטנציאל ממברנה)19,20,21. בשעונים פלורסנט מקודדים גנטית יכול להתבטא סוגי תאים ספציפיים. לפיכך, ex-vivo מערכת הדמיה לזהות שונים התגובות בנוירונים הרצוי.
ישנם מספר שלבים קריטיים פרוטוקול זה. ראשית, שאינם שייכים לרקמות יש להסיר מן המוח כדי לקבל תמונה ברורה. השימוש מחודדים מלקחיים ומספריים כירורגי מקלה על העבודה עדין. שנית, והטרף המוח להיות קבועה למקומן. לעיתים, המדגם המוח עוברת מעט pipetting (טווח כ 5 מיקרומטר). כדי למנוע את המוח זז, הגובה של חוט טונגסטן בבית הבליעה הדימות צריך להיות מותאם בהתאם לגודל המדגם המוח. לחלופין, יכול להתקין מערכת הכבידה-feed זלוף לגירוי עדין. שלישית, התוצאות של הדמיה מוחית יש לפרש בזהירות. ליגנד חלה על המוח עלול לעורר נוירונים בלתי צפויים, אשר בתורו יכול להפעיל את הנוירונים היעד. כדי לזהות את ההשפעה הישירה של הורמון על נוירונים ספציפיים, הקולטן צריך להיות הפילו-מטה targetneurons. במקרה זה, הביטוי של מחוון פלורסנט יכול להיות משולב עם זה של הקולטן RNAi באמצעות מערכת Gal4/UAS.
מגבלה מינור של פרוטוקול זה הוא המשך של הדמיה הוא מוגבל בשל הנזק בסופו של דבר המדגם המוח. בידיים שלנו, המוח דרוזופילה יכול לדימות עבור עד כ 60 דקות שימוש בפרוטוקול זה. פתרון כמו hemolymph, כגון מלוחים HL3.122, ואת עוצמות לייזר עלול לאפשר הדמיה לטווח ארוך. בנוסף, הדמיה הכיוונון הנוכחי אינו מתאים גירוי חוזרות באותה דגימת זרע. לניסויים כאלה, אמבט זלוף יוכל לשמש.
לבסוף, פרוטוקול זה יש יישומים שונים. על-ידי שינוי התא הדמיה, המוח למבוגרים ו רקמות דרוזופילה אחרים או ברקמות של בעלי חיים אחרים יכול לדימות. אורגניזמים שאינם-דגם, העדר כלים גנטיים הפכה אותו קשה להציג מחוונים פלורסנט לתוך הגנום. עם זאת, טכניקות עריכה הגנום CRISPR/Cas9 פיתחה לאחרונה פתחת את הדלת כדי הנדסה גנטית בבעלי חיים אלה. לפיכך, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד הבין-עוגב איתות במגוון רחב של החיות.
המחברים אין לחשוף.
עבודה זו היה נתמך על ידי Grants-in-Aid למחקר מדעי (15K 07147, 17K 07419) מ- JSPS (כדי הירושי Ishimoto, סנו לובה פריז), על Inamori קרן המחקר מענק (איץ ' אי), ואת התוכנית של המרכז השימוש/מחקר משותף ללימודי רפואה התפתחותית, ב המכון אמבריולוגיה מולקולרית, גנטיקה, קאמאמוטו אוניברסיטת (HS). אנו מודים ד ר אזוסה Kamikouchi, מר דאיצ'י יאמאדה לעזרה שלהם באמצעות מערכת הדמיה.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved