שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

מאמר זה מדגים טכניקות הרומן שפותחו עבור משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA (dsRNA) דרך הרקמות וסקולריים הצמחים עבור התערבות RNA (RNAi) מהצינורות האכלה חרקים.

שיפה וצמח sap האכלה חרקים לפלוש השלמות של גידולי פירות כדי לאחזר חומרים מזינים, תוך כדי פגיעה גידולי מזון. חרקים hemipteran בחשבון מספר מזיקים מבחינה כלכלית משמעותית של צמחים לגרום נזק לצמח על ידי ניזון מהצינורות. החרק המסריח חום marmorated (BMSB), Halyomorpha האליס (פשפשים: Pentatomidae), את אסיה הדרים psyllid (ACP), Kuwayama Diaphorina קמחית (פשפשאים: Liviidae) מזיקים חרקים hemipteran הציג בצפון אמריקה, היכן הם הם של הדברה חקלאיים פולשנית מיוחדים בעלי ערך גבוה, שורה, ואת היבולים סיכות פירות הדר, כמו גם נודניק מטרד כאשר הם מצטברים בתוך הבית. עמידות חרקים מינים רבים הובילה לפיתוח שיטות חלופיות של אסטרטגיות ניהול בפשט. זוגיות-גדילי RNA (dsRNA)-RNA בתיווך הפרעה (RNAi) הוא גן להשתיק מנגנון פונקציונלי גנומית מחקרים כי יש יישומים פוטנציאליים ככלי לניהול של חרקים מזיקים. DsRNA exogenously מסונתז או RNA קטנים מפריעות (siRNA) יכולה לעורר יעילים ביותר ג'ין להחרשת דרך ההשפלה של RNA אנדוגני, אשר זה הומולוגי ל מוצג. יעיל וסביבתי השימוש RNAi בתור biopesticides המולקולרי עבור הייצור של חרקים hemipteran דורש ויוו המסירה של dsRNAs באמצעות האכלה. כאן נוכל להדגים שיטות מסירת dsRNA חרקים: טעינה של dsRNA לתוך שעועית ירוקה על ידי טבילה, וקליטת של גנים ספציפיים dsRNA עם משלוח אוראלי דרך בליעה. לנו יש גם המתוארים צמח שאינו הטרנסגניים גישות משלוח באמצעות תרסיסים בריסוס, שורש הירטבות, תא המטען זריקות וכן קליי בגרגרים, אשר עשוי להיות חיוני לשחרור מתמשכת של dsRNA. משלוח יעיל על ידי ingested dsRNA אושר כמו מינון יעיל לזירוז ירידה משמעותית בביטוי של יישוב גנים, כגון חומצה הורמון נעורים O-methyltransferase (JHAMT), vitellogenin (Vg). שיטות חדשניות אלה מייצגים אסטרטגיות עבור משלוח של dsRNA להשתמש בהגנת הצומח, להתגבר על אתגרים סביבתיים על ההדברה.

חרקים hemipteran מהווים חלק המזיקים ביותר מבחינה כלכלית משמעותית של agriculturebecause יכולתם להשיג גידול האוכלוסייה מוגברות ולהפיץ מחלות בצמחים. BMSB, ח' האליס פלדה, הוא המזיק פולשני זה הוצג בטעות עם גילויו הראשון דיווחה בשנת 1996¹בחצי הכדור המערבי ב אלנטאון פנסילבניה מאסיה (סין, טייוואן, קוריאה ויפן). מאז השקתו, BMSB זוהה 43 מדינות, עם האוכלוסיות הגבוהה ביותר באוקיינוס האטלנטי (דה, MD, הרשות הפלסטינית, NJ, אמפר, ו WV), כמו גם בקנדה ובארצות אירופה, והוא מייצג איום פוטנציאלי על החקלאות². כמו מטרד רב, BMSB יכול לעורר נזק למארחים כ 300 צמחים מוכרים, כולל ערך גבוה גידולים כגון תפוחים, ענבים, צמחי נוי, זריעה, סויה, תירס. נזק נגרם בעיקר בשל המצב של האכלה המכונה lacerate, סומק שם החיה מפלח את היבול מארח עם שלו stylet דמוי מחט כדי לקבל גישה אל החומרים המזינים רקמות וסקולריים^2,3. BMSB הוא גם המזיק מקורה כמו הם עשויים למצוא מגורים באזורי מגורים כגון בתי ספר, בתים במהלך סתיו חורף². כימיקלים, aeroallergens שפורסמו על ידי BMSB דווחו על תגובה אלרגית איליקיט עובדים חיתוך פירות. BMSB עשוי גם לתרום למחלות אלרגיות שמוביל ממגע, דלקת הלחמית דלקת אנשים רגישים^4,5. עוד חרק hemipteran, ACP, קמחית ד Kuwayama (פשפשאים: Liviidae), היא מטרד רציני של פירות הדר, ומעבירה את החיידקים שיפה מוגבל (טיריה LiberibacterCandidatus ) גורמת Huanglongbing (HLB), הידוע יותר כמו מחלת ירוק הדר^6,7. HLB דווחה לראשונה מסין הדרומית, התפשט 40 שונים אסיה אפריקה, האוקיאנית, דרום, צפון אמריקה מדינות⁷. ירוק הדר היא בעיה ברחבי העולם עם איום כלכלי הפסדים בשל אובדן פרי הדר; לפיכך, הנהלת ACP נחשב בעל חשיבות עליונה כדי למנוע ולשלוט HLB.

האמצעים לבקרה יעילה של מזיקים חרקים אלו בדרך כלל דורש היישום של הדברה כימית קצרות יחסית חי. הדברה כימית אסטרטגיות שליטה לעיתים קרובות חוסר אסטרטגיות ניהול הסביבה בטוח או פחתו הרגישות עקב עמידות לחומרי הדברה הדברה אוכלוסיות^8,9. לפיכך, הדברה ביולוגית של מזיקים עם biopesticides מולקולרית היא חלופה אפשרית, אבל השימוש בה באופן גלובלי נשאר צנוע, מינים שונים של צירעת האפידיוס (למשל, Trisolcus ג'אפוניכאס) יכול להיות גם יעיל כמו ביולוגית טבעית פקדים. RNAi הוא פוטנציאל המתעוררים טכנולוגיות לניהול פולשנית חרקים מזיקים עם biopesticides מולקולרית¹⁰. RNAi היא מנגנון רגולטורי ג'ין תיאר היטב מקלה את יעילות posttranscriptional ג'ין להחרשת של אנדוגני כמו גם פולשים dsRNAs באופן ספציפי רצף, שמוביל בסופו של דבר בקרת גנים ב mRNA רמה^11,12. בקצרה, כאשר dsRNA אקסוגני הוא הפנימו לתא שזה שהוא מעובד siRNAs על-ידי חבר superfamily RNase השלישי נוקלאז bidentate, נקרא לטעמים, אשר אבולוציונית כולו בתולעים זבובים, צמחים, פטריות, יונקים^{13, 14 , 15}. אלה דופלקסים siRNA נוקלאוטיד 21-25 ואז לשחרר ממנו, משולב בתוך המתחם שתיקה RNA-induced (RISC) כמו מדריך RNAs. מתחם RISC-RNA זה מאפשר זיווג הבסיס של ווטסון-קריק ל משלימים היעד mRNA; זה מוביל בסופו של דבר המחשוף של החלבון Argonaute, תחום רב חלבון המכיל תחום RNase H דמוי, אשר מדרדרת את ה-mRNA המתאימים ומפחית תרגום החלבון, ובכך מוביל ג'ין posttranscriptional להשתיק^{16 , 17 , 18}.

RNAi לניהול הדברה מחייבת המבוא של dsRNA ויוו להשתיק את הגן של עניין, ובכך הפעלת מסלול siRNA. שיטות שונות בהן השתמשו למסירה dsRNA חרקים, חרקים תאים לזירוז RNAi מערכתית כוללת האכלה^10,19, טבילה^20,21, microinjection²², נשאים כגון ליפוזומים ²³, טכניקות אחרות²⁴. RNAi היה הראשון הפגינו Caenorhabditis elegans להשתיק unc-22 גנים מאש מלו²⁵, ואחריו נוקאאוט ביטוי של גנים עלי דרוזופילה melanogaster²⁶. מחקרים ראשוניים פונקציונלי מנוצל microinjection כדי לספק dsRNA חרקים, כגון בומבוס^22,27, Acyrthosiphon אפון²⁸, במיוחד גרמנית²⁹, האליס ה³⁰, וחרקים lepidopteran (נבדקה על ידי. Terenius et al. ³¹). microinjection יש יתרון לספק מנה ומדויקים לאתר של עניין החרק. אמנם דקירות ספיגה כזה עשוי להפיק ביטוי של גנים הקשורים החיסון עקב טראומה³², לפיכך, שוללים את המעשיות שלה בפיתוח חקלאי biopesticides.

שיטה נוספת להעברת dsRNA ויוו היא למסמס, אשר כרוך בליעה או קליטה של dsRNA מאת השעיה של חיות או תאים בדרך כלל במדיום חוץ-תאית שמכילה dsRNA. השריית שימש לזירוז ביעילות RNAi בתאים תרביות רקמה דרוזופילה S2 לעכב במורד הנחל-של-Raf1 (DSOR1) מופעל mitogen חלבון קינאז קינאז (MAPKK)²⁰, כמו גם ב- C. elegans להשתיק את pos-1 ג'ין³³. אולם, dsRNA מועברת באמצעות השריית היא פחות יעילה לזירוז RNAi בהשוואה microinjection²⁰. RNAi בתיווך מצרי להשתיק בחרק הלעיסה הוצג לראשונה rootworm תירס המערבי (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) על ידי הלוגיסטים של dsRNA לתוך דיאטה אגר מלאכותי¹⁰. דו חות קודמים יש סיכם שיטות לאספקת dsRNA חדורים בתזונה טבעית ספיציפית פרוקי רגליים³⁴. שיטות משלוח אלה נקבעו עוד יותר יעיל וזהובה באמצעים מלאכותיים מסירה; כמו במקרה של זבובים (Glossina morsitans morsitans), שבו שווה נוקאאוט הגנים הקשורים החיסון נצפתה כאשר dsRNA נמסרה או באמצעות ארוחת דם או microinjected³⁵. באופן דומה, משלוח של dsRNA דרך טיפות תפוח חום בהיר עש (Epiphyas postvittana)³⁶, הזחלים diamondback עש (Plutella xylostella)³⁷, כמו גם דבש דבורים^38,39 המושרה RNAi יעיל. ניסויים RNAi היעילה ביותר hemipteran נעזרו הזרקה של dsRNA⁴⁰ כי משלוח אוראלי של dsRNA בחרקים hemipteran מפרך מאז שצריכים להישלח דרך רקמות וסקולריים של הצמח הפונדקאי. RNAi יעיל נצפתה גם ACP, צלף מזוגגות-כנף leafhopper (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA נמסר דרך הדרים וגפנים שקלטה dsRNA לרקמות וסקולריים דרך השורש הירטבות, בריסוס תרסיסים, תא המטען זריקות או הספיגה על ידי ייחורים^{41,42,43,44,45,46}. זה הביא גם הפטנט הראשון על dsRNA נגד ACP (2016, לנו 20170211082 A1). משלוח של siRNA ו dsRNA באמצעות נשאים כגון חלקיקים, ליפוזומים מקנה יציבות, העלאות dsRNA ונמסרו יעילות במהירות מתגלים^{23,47,48,49 ,50}. מחלקה חדשה של כלי רכב מבוססי ננו-חלקיק משלוח עבור חומצות גרעין במבחנה , ויוו היה מסוכם במיוחד עבור יישומים טיפוליים שעשוי להקנות פוטנציאל עצום כמו צורת המשלוח המומנט⁵¹. חלקיקים כרכב משלוח עבור dsRNA אולי חסרונות כולל מסיסות, hydrophobicity או bioaccumulation מוגבלת⁵², אבל משלוח עזר פולימר מתאים עשוי לפצות את החסרונות. פיתוח ושימוש עצמי להעברת נוקלאוטידים מתגלים גם בשם 'antisense oligonucleotides', אשר בודד נטושים RNA/DNA דופלקסים⁴⁶.

Vitellogenesis של פרוקי רגליים הוא מפתח תהליך השליטה רבייה ומוסדרת על ידי הורמון נעורים (JH) או ecdysone, אשר הם inducers מפתח של סינתזה Vg מאת שומן הגוף; Vg הוא נלקח בסופו של דבר על ידי oocyte לפתח דרך Vg-קולטן בתיווך מצרי-אנדוציטוזה-⁵³. Vg היא קבוצה של polypeptides מסונתז extraovarially, שהיא הכרחית להתפתחות של החלבון חלמון ביצה גדולה,^54,vitellin⁵⁵, לכן חשוב רבייה, הזדקנות⁵⁶. Vg הושתקה בהצלחה בנמטודות⁵⁷ , כמו גם בדבורת הדבש (בומבוס) איפה RNAi בתיווך מצרי דלדול של Vg נצפתה מבוגרים וביצים²². RNAi בתיווך posttranscriptional ג'ין להחרשת Vg נבדקה מכיוון שהאמינה שדלדול שלה יוביל אפקט פנוטיפי הנצפה כגון מופחתת פוריות ופריון, פוטנציאל לסייע בשליטה BMSB. הגן JHAMT מקודד את S-adenosyl-L-מתיונין (SAM)-תלוי JH חומצה O-methyltransferase, מזרז את השלב הסופי של מסלול ביוסינטזה JH⁵⁸. ב- farnesyl מסלול זה רב-תכליתי (FPP) ברצף כשהופכים מן farnesol, חומצה farnesoic, ואחריו ההמרה של מתיל farnesoate JH על-ידי JHAMT. מסלול זה כולו חרקים, פרוקי רגליים במיוחד עבור מטמורפוזה, תהליך התפתחותי מוסדר על ידי הורמונים-^59,-^60,-⁶¹. ב מורי דרב, ביטוי גנים JHAMT ואת הפעילות biosynthetic הוחלף נגזר JH allata הקורפוסים מראים כי הדיכוי תעתיק של הגן JHAMT הוא קריטי עבור הסיום של JH ביוסינטזה⁵⁸. לכן, הגנים JHAMT ו- Vg נבחרו עבור דלדול ממוקד באמצעות RNAi. RNAi נבחנה גם עצי הדר על השליטה ACP ו- GWSS. עצי הדר שטופלו dsRNA דרך השורש הירטבות, הגבעול הקשה (המטען זריקות), כמו גם בריסוס תרסיסים עם dsRNAs נגד חרקים ארגינין ספציפי קינאז (אי קאי) תעתיקים^42,44. יישום אקטואלי של dsRNA זוהה על החופה של עצי הדר, המציין משלוחים יעיל דרך הרקמות צמחים עילאיים, וכתוצאה תמותה מוגברת ACP, GWSS^{41,42, 45}.

במחקר הנוכחי, זיהינו שיטת משלוח דיאטה טבעית עבור טיפולים כגון dsRNA. טכניקה זו פיתח שימש לאחר מכן להשתיק את JHAMT ואת Vg mRNA באמצעות גנים ספציפיים dsRNAs ב BMSB נימפות כמו הפגינו קודמות⁶². פרוטוקולים אלה-משלוח חדש המודגמות כאן מחליף קונבנציונאלי מערכות אספקה RNA המשתמשות תרסיסים אקטואלי או microinjections. ירקות, פירות, גזע הקשה אדמה קפה, ופעולות חימר. סופגים ב עשוי לשמש עבור משלוח של dsRNA, אשר הינה קריטית להמשך התפתחותו של המזיק biopesticide וניהול הפתוגן.

1. BMSB לגידול

1. חרקים BMSB האחורי לפי תרגול מעבדה סטנדרטיים ו שתואר לעיל⁶³.
2. העלאת ACP (קמחית ד) חרקים הדרים מאכרופילה החממה (22 מעלות צלזיוס), אור טבעי. השתמש ACP למבוגרים, כ 5-7 ימים פוסט וגיחתו.

2. מבחר של ג'ין אזורים, ב חוץ גופית סינתזה של dsRNA

1. בחר גנים ספציפיים כדי BMSB transcriptome שפורסמו בעבר פרופילי³².
2. ודא האזורים של הריבית שנבחר משתנות בין 200 עד 500 בסיסים.
3. לבצע תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) באמצעות התנאים המתוארים להלן כדי ליצור קטעים הקשורים עם הגן שנבחר עניין מ- DNA גנומי. ראה טבלה 1 oligonucleotides הגן הספציפי.
   1. תגובת ה-PCR: בשפופרת PCR 0.25 mL, לשלב 5 µL של 10 X מאגר ה-PCR, µL 4 של dNTP תערובת (2.5 מ מ כל אחד), 2 µL של תבנית ה-DNA (50 ng/µL), 2.5 µL כל של צבעי יסוד 1 ו-2 (10 מיקרומטר), µL 0.25 של ה-DNA פולימראז (U 5/µL) , ומים DNase/RNase חינם µL עד 50.
   2. תנאי ה-PCR: מחזור התגובה PCR כדי להגביר את האזור של הריבית ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ולאחריו מחזורים של 98 ° C עבור 10 s, 55 ° C ל 30 s, 72° C עבור 1 מינימלית Incubate התגובה ב-72 מעלות עבור נוספים 10 דקות Purify באמצעות תגובת ה-PCR ערכת טיהור.
4. להגביר את השברים PCR שהושג נוסף עם גנים ספציפיים תחל תמר מוקף עם הרצף יזם T7 RNA פולימראז (5'-גה TTA אתא CGA CTC מעשה אתא GGG אגא-3') כפי שצוין קודם⁶².
5. השתמש LacZ ג'ין כפקד שלילי (מעושה) עבור RNAi.
   הערה: LacZ הוא גן מקודד β-galactosidase מוגבר מן Escherichiacoli הדנ א הגנומי (צבעי יסוד בשימוש מוצגים בטבלה1).
6. לבצע תמלול במבחנה להניב dsRNA כפי שתואר קודם⁶².
7. להמיס resuspend של dsRNA וכתוצאה מכך מים חינם DNase/RNase µL 150, מודדים את הריכוז ו לאחסן ב- 80 ° C לשימוש עתידי.

3. מסירת dsRNA שימוש שעועית ירוקה

1. בחר 4 מוקדם^th לחלל BMSB נימפות בקעו מן הדבר ביצה בנפח גדול ולהרעיב את אותם עבור 24 שעןת לפני dsRNA האכלה.
2. בחרו ודק מוסמך אורגני שעועית ירוקה (מצויה ל'), לשטוף עם 0.2% נתרן תת-כלורי פתרון עבור 5 דקות.
   הערה: שעועית ירוקה דקיקה נבחרו כך השעועית בקלות ניתן לאכלס את החצוצרות שלה microcentrifuge 2 מ"ל.
3. לשטוף 3 פעמים עם ddH₂O ויאפשר לאוויר יבש.
4. חתוך את השעועית הירוקה מהקצה גביע כדי באורך כולל של 7.5 ס מ בעזרת סכין גילוח נקי.
5. לטבול את השעועית הירוקה שטף, החתוך צינור microcentrifuge קאפ-פחות 2 מ"ל המכיל 300 µL של פתרון שליטה (1:10 לדילול צבע מאכל ירוק (מרכיבים: מים, פרופילן גליקול, Fd & C 5 צהובים, Fd & C כחול 1 ו Propylparaben כמו חומר משמר)).
6. להפוך דילולים של ה במבחנה מסונתז dsRNAs LacZ, JHAMT או Vg המדללת µg 5 או 20 µg ב 300 µL של מים חינם RNase/DNase להניב ריכוזים הסופי של 0.017 µg/µL או µg 0.067/µL, בהתאמה.
7. לטבול את השעועית הירוקה שטף, החתוך צינור microcentrifuge קאפ-פחות 2 מ"ל המכיל 300 µL של dsRNA פתרון (מתוך שלב 3.6).
8. לעטוף, לאטום את הקצוות של הצינורות microcentrifuge תוחמת את השעועית שקוע כדי למנוע אידוי של הפתרון dsRNA וכדי למנוע את החיות מלהיכנס הצינור microcentrifuge.
9. הצב הצינורות האלה בצורה זקופה בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות לאפשר את הפתרון dsRNA ייטענו ברחבי שעועית ירוקה על ידי נימיות.
10. מניחים צינורות אלה בכלי נקי תרבות (פוליפרופילן). שלוש נימפות BMSB לחלל^ה 4 בכלי תרבות ברעב
11. שלוש חיות שונים מתייחסים לכל תרבות כלי שכל אחד מהם מכיל שלושה שעועית ירוקה עם אוכל ירוק צביעה או dsRNA פתרון. לשמור על החרקים-לחות יחסית 25 ° C ו- 72%, תחת photoperiod L 16: 8D באינקובטור.
12. לאפשר את החרקים ניזונים את השעועית הירוקה (שקוע ולא נספג עם dsRNA) במשך 5 ימים אך לחדש עם דיאטות טריים של dsRNA טיפול ירוק חרוזים לאחר 3 ימים.

4. בזמן אמת כמותי (qPCR) ניתוח של ג'ין הביטוי הבא RNAi בתיווך מצרי להחרשת ב- BMSB

1. למדוד את השפעת RNAi על רמות הביטוי תורגם על ידי qPCR.
2. לבודד את הרנ א הכולל מהחיות dsRNA מטופלים ולסינתזה של cDNA⁶².
3. תוכנית ההתקנה את התגובות qPCR באמצעות מערכת ה-PCR בזמן אמת, את תחל המפורטים בטבלה1. להשתמש בתנאי רכיבה על אופניים qPCR הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ואחריו 40 מחזורי 95 ° C 15 s, 60 ° C עבור 1 דקות, ביחד עם שלב דיסוציאציה כולל 95 ° C 15 s, 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, 95 ° C 15 s , ו- 60 ° C 15 s.
4. לקבוע את הסטנדרטים qPCR: להשתמש דילול טורי cDNA שהוכנו RNA הכולל מבודד מן חיה נורמלית כתקן הפניה עבור כימות.
5. להשתמש BMSB 18s RNA כמו תקן פנימי לתיקון על ההבדלים RNA התאוששות הרקמות³².

5. בריסוס ספריי ביישום עצי הדר בעציץ גדול ושתילים

הערה: צמחים זנים הדרים citrange 'Carrizo' (הדר סיננסיס XPoncirus trifoliata, פיגמיים), היו בהשתתפות של החממה תחת אור טבעי וטמפרטורה, גדלו במיכלים 1.2 L. הצמחים היו לסילוק כל הזמן כדי לקדם את הצמיחה של נבטים בריסוס, שנקרא 'יישור'. ACP מעדיף להאכיל וגם ההטלה על גידול חדש של הדר⁶⁴.

1. בחר צמחים או שתילים, לא המים אותם במשך 2-3 ימים לפני השימוש לתת הקרקע להתייבש לחים אך לא יבש לחלוטין.
2. בעזרת בקבוק ריסוס משאבת יד להחיל 200 מ של dsRNA פתרון (0.5 mg/mL) על החופה התחתון (איור 4A).
   הערה: להכין לעיל הזכיר פתרונות dsRNA DNase/RNase מים חינם.
3. פוסט-לרסס היישום, לאפשר את הפתרון dsRNA יישומית להיקלט לחלוטין על ידי העלים.
   הערה: עצי הדר נספג dsRNA יישומית ולאחר מכן עלים או צמיחה חדש או ענפים שכוסו לקראת יישום, חולצו; dsRNA לזיהוי באמצעות qPCR, הראה תנועה מערכתית לתוך העלים החופה העליונה עץ ב- 3-4 h-^44,-^45,-⁴⁶.
4. לטעום את הצמיחה החדשה מעצי עקף בעבר לאחר 25-40 ימים על ידי איסוף כ 10 יוצא מן הקצוות של ארבעה סניפים. לחלץ את הרנ א הכולל ולנתח אותם על ידי שעתוק במהופך PCR (RT-PCR) qPCR לנוכחות של ההדק dsRNA שהוחלו באמצעות תחל את המפורטים בטבלה 1, שתואר קודם לכן בשיטות⁴⁶.
   הערה: המדגם אוסף הכולל בידוד ה-RNA, RT-PCR, qPCR בוצעו כפי שתואר לעיל⁴⁶.
5. באופן דומה, topically תרסיס 10 מ"ל dsRNA באזור התחתון של שתיל או עץ בעציץ קטן העלווה.
   הערה: חרקים Hemipteran (ACP ו GWSS) כנתינתן גישה האכלה בדרך כלל 24 שעות ביממה, פוסט טיפולים על צמיחה חדש (עלים) אשר לא מחשיפה ישירות, או שגדל שבועות מאוחר יותר, או צמחים שלמים. זה מיוצר חרקים אשר חיובית שנבדקו עבור dsRNA ב 3, 6 ו- 10 ימים, פוסט האכלה.

6. אדמה/שורש היישום הירטבות בגדולים או קטנים בעציצים שתילים ועצי הדרים

1. בחר צמחים או שתילים ומים לא אותם במשך 2-3 ימים לפני השימוש לתת הקרקע להתייבש כדי לח אך לא יבש לחלוטין (זה יוצר המרחב האווירי להחזיק את הפתרון נוזלי כדי להחיל).
2. להוסיף 1 ליטר של dsRNA פתרון (0.2 מ"ג/מ"ל) אדמת עציצים גדולים ביותר (כ- 2.5 מטר) ולהוסיף 1 ליטר של מים (מסרק) לאחר 1 h.
3. החל 100 מ של dsRNA פתרון (1.33 mg/mL) אדמת בגובה 1 מ' בעציצים עצים בקרקעות חלקית יבש.
4. עבור שתילים קטנים, להחיל 10 מ"ל של dsRNA פתרון (1 מ"ג/מ"ל) אדמות הקונוסים או על שורשי חשופות (איור 4B, C).
5. לאפשר את הצמחים מקבלים את הפתרון dsRNA מורחים על אדמת הירטבות להשרות למשך 30 דקות. לאחר מכן להחיל טיפול רק מים רגילים כדי לסייע הקליטה על-ידי שורשים (20 מ"ל צמחים במיכלים צהוב), או 100 מ ל, אם סירים צמח גדולים > 1 ליטר.
   הערה: dsRNA למריחה העלווה הביא זיהוי לכל היותר דיסטלי קצות ענפים בתוך h 3-6 טיפולים פוסט, מציג מערכתית תנועה דרך העצים. סניפים צמיחה חדשים נבחנה חיובית עבור dsRNA טיפולים פוסט 60-90 יום. ייחורים ניתנים לג'וקים (ACP ו- GWSS) dsRNA האכלה bioassay⁴⁴.

7. גזע ברז (הזרקת גזע עץ) יישום גדול עצי הדר בעציץ ושתילים

1. בחר שתילי הדר, חדש, או כ- 3.5 שנים צמחים ישנים על הזרקת dsRNA באמצעות הגזע הקש על השיטה (המטען זריקות).
2. קודחים חורים הצמחים הדרים באמצעות תרגיל ו- 10 מ"מ מקדחה, מטפל לא יעלה על 2 ס מ, או כחצי הקוטר של הגבעול.
3. לעטוף את קצה נחושת של מזרק כל 4 - 6 פעמים עם רצועה רחבה 0.6 ס"מ (¼ אינץ ') של איטום הסרט כדי למנוע דליפה ליד הקצה.
4. למלא את מזרקי גזע עץ עם 6 מ ל (1.7 מ"ג/מ"ל) של פתרון dsRNA מדולל במים חינם DNase/RNase (מסומן בתור הפתרון צבעוניות).
5. להזריק את הפתרון לתוך תא המטען של העץ ולהשאיר את מזרק בתא המטען עבור 6-10 h לאפשר קליטה של הפתרון dsRNA. לאפשר את החרקים ניזונים גזרי מעצי שטופלו ב 3, 10, ו- 30 ימים לאחר הטיפול.
   הערה: dsRNA מוזרק בשיטת הזרקת תא המטען שהתמידו בעצים לתקופה של 30-60 ימים^41,42,44. אימות עבור RNAi בוצע על ידי qPCR באמצעות תחל את המפורטים בטבלה1.

8. dsRNA אלייך בגרגרים קליי למסירה חרקים דרך האדמה

1. יוצקים את החומר סופג לתוך צינור חרוטי 50-mL לסימן 35 מ ל (כ 30 גרם של חומר סופג) ברכבת התחתית.
2. שופכים 20 מ של dsRNA הפתרון מדולל במים חינם DNase/RNase (100 µg/mL) לתוך צינור כדי להרטיב את כל כושר ספיגה. קאפ הצינור חרוט, עצה צינור כדי לסייע בהסרת אוויר, קאפ ברכבת התחתית.
3. מקם את הצינור זקוף, ומשהים 1-2 דקות על החלקיקים קליי לספוג את הפתרון.
4. הוסף מספיק קליי ספוג dsRNA לתערובת האדמה כדי למלא סיר 1 ליטר.
5. לערבב, להפוך את האדמה ביד כדי לערבב ביסודיות החימר ספוג dsRNA לתוך האדמה.
6. השתמש האדמה הזו כדי repot שתילים שנבחרו לטיפול dsRNA.
7. מים האדמה עם 200 מ של מים רגילים ללא dsRNA. לאחר 30 דקות כדי 1 h, פעל עם 100 מ של מים רגילים. לאחר 24 שעות, לשים את הצמח על לוח זמנים השקיה רגילה.
8. מבחן 4-6 עלים של הצמחים בעציץ שטופלו עם חימר. סופגים, dsRNA לטיפול בכל פוסט חודש dsRNA על ידי איסוף העלים ביותר הפסגה של צימוח חדש.
   הערה: צמחים או ייחורים מצמחים אלו שטופלו נזרקים חרקים בכל עת לאחר 24 שעות פוסט הטיפול ולא הצליחו משלוח RNAi במשך שנה חרקים (נתונים שלא פורסמו).

משלוח ירקות dsRNA מתווכת באמצעות האכלה ב BMSB 4^th לחלל נימפות נבחנה לפיתוח biopesticides מולקולרית באמצעות RNAi עבור מזיקים חרקים פולשני. BMSBs הזנה באמצעות stylets דמוי מחט שלהם על-ידי מנגנון המכונה lacerate, סומק, הגורמת להרס יבולים. שעועית ירוקה אורגנית ודק, דלקתית פ ל', שימשו כדי לבדוק אם מזינים או dsRNA יכול להישלח ויוו BMSB באמצעות האכלה³. מקטעים של שעועית ירוקה שטבלו במים חינם DNase/RNase או פתרון של מים וצבע מאכל ירוק כדי לבדוק את המשלוח ב- BMSB (איור 1 א'). מאכל ירוק שימש ציון ויזואלי לחקות dsRNA. הרקמה וסקולריים של השעועית הירוקה היו רווי צבע מאכל ירוק בשל הזרימה של פתרון בצבע ירוק באמצעות שיפה מאת נימיות⁶². נימפות BMSB נראו ניזון המקטעים של שעועית ירוקה על-ידי הוספת stylets שלהם לתוך רקמות וסקולריים השעועית הירוקה (איור 1B). הפרשות בצבע ירוק טיפות נצפו לאחר ימי 2 ו- 3 חרקים מוזנים על שעועית רווי אוכל ירוק צביעה המציין החומר ונמסרו בלע בעל פה, עברו דרך הבטן לפני הפרשה (איור 1C, D ).

לאחר מכן בדקנו אם דלדול משמעותי של ביטוי גנים יישוב הושג באמצעות מסירה שעועית ירוקה מתווכת של dsRNA ספציפי BMSB דרך בליעה ב- BMSB. שעועית ירוקה מקטעי שטבלו ולא נספג פתרון של 0.067 µg/µL (20 µg ב µL 300 DNase/RNase מים חינם) או 0.017 µg/µL (5 µg ב 300 µL של מים בחינם DNase/RNase) של dsRNA חוץ גופית בתוך מסונתז ספיציפית BMSB JHAMT ו- Vg , בהתאמה. שעועית ירוקה היו גם שקוע במים לבד, µg 0.067/µL או µg/µL 0.017 LacZ dsRNA (מעושה) כפקדים בהתאמה. התעתיק רמות הוערכו באמצעות qPCR המציין את הביטוי הזה של JHAMT והיה Vg mRNA מופחתת באופן משמעותי ויוו מאת כמעט 4.5 - ו 2.2-fold, בהתאמה (איור 2 א, ב'). כתוצאה מכך, התוצאות מצביעות על ש-dsrna הזה עשוי להיות מועברת דרך הרקמות וסקולריים של שעועית ירוקה לזירוז RNAi מוצלחת.

עוד מזיקים hemipteran, הבאג ארלקינו (HB) (Murgantia histrionica), הגורמת לפגיעה קול יבולים נבדקו גם אם מסירה מוצלחת של חומרים מזינים או טיפולים dsRNA יכולה להיות מועברת באמצעות הירק מתווכת משלוח. הנימפות HB 4^th לחלל הורשו ניזון התינוק ראמוס (כרוב הבר var. דגולה) שקוע במים או פתרון של מים עם צבע מאכל ירוק. התוצאות הצביעו על כי HB האכיל, בלע את צבע מאכל ירוק, אשר היה ברור מן הפרשות בצבע ירוק שלהם, לעומת HB זה אכל את הירקות שקוע במים, אשר היה ברור הפרשות (איור 3).

שיטות נוספות למסירה ארעית של dsRNA ריסוס או שורש/אדמה לספוג את תוצאות dsRNA ספיגת כל^65,רקמות הצמח⁶⁶. מוצרים מבוססי-RNAi מותז נמצאים בשלבי פיתוח, עשויים להיות זמינים בקרוב ממתין לאישור. משלוח של dsRNA בשדות באמצעות תרסיסים או שורש הירטבות עשויים לסייע בניהול חרקים פולשנית^42,67. בגודל מלא בעצי הדר ושתילים נחשפו dsRNA ספריי בריסוס, או באמצעות קרקע או חשוף שורש קפה, בהתאמה (איור 4). התוצאות הצביעו על כי dsRNAs מועברים על ידי או תרסיסים או אדמה/חשוף שורש הירטבות יכול להתגלות בצמחים הדרים (2.5 מ') 7 שבועות פוסט החשיפה יחיד של 2 גר' dsRNA⁴². משלוח, בליעה של psyllid dsRNA-AK (20 ng/µL) גדל התמותה psyllid 30-45% (איור 4D)⁴².

במבחנה עיבד dsRNA יכול להיות מועברת בצורה יעילה כדי רב חרקים באמצעות ברז גזע (המטען זריקות) של גנים ספציפיים dsRNA ישירות לתוך הרקמות וסקולריים של הצמח, אשר ניתן לרכוש באמצעות החרקים כאשר ובעידן צמחים כאלו⁴⁴ (איור 5). עצי הדר זה נחשפו על ידי זריקות המטען dsRNA, dsRNA יכול להתגלות בצמחים הדר גיל (כ 1 מ') במשך 7 שבועות פוסט החשיפה יחיד באמצעות 6 מ של 1.7 מ"ג/מ"ל של dsRNA בפתרון של DNase/RNase מים חינם (איור 5A B). האכלה שיפה חרקים hemipteran הורשו אז ניזונים אלה צמחים פונדקאים שטופלו dsRNA. ההנחה היא כי dsRNA בהצלחה חלוט, עברה דרך מערכת כלי הדם של הצמחים הדר עבור בליעה על ידי ACP, אשר הפגינו התמותה בעת ניזונו dsRNA-AK⁴².

Bioassays התפתח 2008 עד 2012, יש כבר הוקרן על פני מגוון רחב של עציצים, שמוצג כדי לספק משלוח dsRNA באופן שבו צמחים יכול לספוג, translocate של dsRNA עבור dsRNA מערכתית הפצתו^41,42 . שיטה אחת משתמשת רכיב סופג חימר עם dsRNA ספיחה לתוך מאטריקס חימר; זה כולל מגוון רחב של חרסיות, פולר של כדור הארץ, זאוליט, ואחרים, כמו יתר חומרי ספיגה, תאית, agars, bioplastics, וכו חימר חלקיקים הם נשאים של חומצת גרעין בחינם אבק העשויות לשמש להעברת חומרים פעילים כגון dsRNA כדי קרקעות עבור הצמח ספיגת ובסופו של דבר משלוח. חרקים (איור 6). החימר מורכבים ניתן גם מבחינה כימית להגדיר כדי לשחרר את dsRNA תחת pH ספציפי או תנאים יוניים. קליי שיטות משלוח של dsRNA לתוך צמחים הוכחו לספק dsRNA לתוך עצי הדר בעציץ, וצמחים אחרים מעל 14 חודשים (נתונים לא מוצג). מערכת משלוח זו ניתן לשנות את תכונות הצמח, כגון צבעי הפרחים, גובה הצמח (שלמרגלותיהן) או אחרים. כיום, השימוש העיקרי של שיטה זו הוא פיתוח של מזיקים חרקים יעיל של פתוגן (וירוס) שליטה או ניהול. הגישה יכול להיות חסכוני עבור משתלות, בעלי בתים, היא שיטה שאינה מהונדס.

איור 1 . מסירה של חומרים מזינים או dsRNA דרך שעועית ירוקה- (א) מקטעים של שעועית ירוקה אורגנית ודק שטבלו ולא נספג הפתרון צינור microcentrifuge 2 מ"ל המכיל 300 µL של ddH₂O לבד או ddH₂O עם צבע מאכל ירוק, עבור 3 שעות. 3 4^th לחלל BMSB נימפות היו ברעב עבור 24 שעות והניח בכלי תרבות יחד עם שעועית ירוקה 3 לכל כלי. BMSB (B) ניזונים מקטעים של שעועית ירוקה הושקע במים על ידי פירסינג דרך השעועית הירוקה כדי להגיע את החומרים המזינים עם stylets שלהם. (ג) יום 2 של BMSB האכלה bioassay, החיצים מציינות הפרשות. היום (ד') 3; הפרשות BMSB מוגברת (מסומן בחץ) נצפתה פוסט בליעה של פתרון של ddH₂O וירוק מאכל דרך שעועית ירוקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 . ניתוח RT-PCR כמותי כדי למדוד את רמת התעתיק לאחר מציאה RNAi בתיווך דלדול של JHAMT ו- Vg ב- BMSB. RNA הכולל מ- 3 נימפות לחלל BMSB 4^th בודדים ניזונו JHAMT (א) 20 µg (0.067 µg/µL), ו- Vg (B) dsRNAs 5 µg (0.017 µg/µL) ב- 300 µL של ddH₂O מועברת באמצעות מקטעים של שעועית ירוקה, הופרדה ו התעתיק רמות נמדדו על ידי qPCR. DsRNA LacZ (מעושה) שימש פקד שלילי. BMSB 18s RNA שימש תקן פנימי לתיקון הבדלים RNA התאוששות הרקמות. התוצאות שדווחו הן מן משכפל ביולוגי שלוש, קווי שגיאה מציינים ב- SEM. שונות של ניתוח בכיוון אחד (ANOVA) בוצע כדי לבדוק מובהקות סטטיסטית של הנתונים, 0.0001 < p . תוצאות לשכפל מ גוש. et al. ⁶² אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 . משלוח אוראלי של טיפול בבאג ארלקינו (M. histrionica ) באמצעות התינוק ראמוס. תינוקות אורגניים כרוב ירוק היו לשטוף 0.2% נתרן תת-כלורי, גזוז, שקוע בתוך צינור microcentrifuge קאפ-פחות מ 2 ל המכיל 300 µL של פתרון של (A) DNase/RNase ddH חינם₂O או DNase (B) / RNase ddH חינם₂ O פתרון עם צבע מאכל ירוק, לתקופה של 3 שעות. 3-4 לחלל HB נימפות היו ברעב עבור 24 שעות ואז מניחים בכלי תרבות, מותר להאכיל על אלה כרוב ירוק במשך 3 ימים. החצים הלבנים מצביעים על הפרשות מובחנים האכלה פוסט יום 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 . תרסיס בריסוס ושורש משפריצה על יישום עצי הדר ושתילים. הצמחים שנבחרו או שתילים מוקדמת לשימוש לא להשקות 2-3 ימים לתת הקרקע להתייבש לחים אך לא יבש לחלוטין. (א) העצים היו קודם עקף וחלים 200 מ של dsRNA פתרון (0.5 מ"ג/מ"ל) מים חינם היה DNase/RNase ביד בקבוק ריסוס משאבת החופה נמוכה יותר. (B) 100 מ של dsRNA פתרון (1 מ"ג/מ"ל) מים חינם DNase/RNase הוחל על האדמה של שתילי בקרקעות חלקית יבש. (ג) 100 מ של dsRNA פתרון (1 מ"ג/מ"ל) מים חינם היה מוחל על שורשי השתילים עבור 3 ח' (D) חשופות DNase/RNase ACP ניזון שתילים שקלטה dsRNA על ידי השורשים חשופות, הראו תמותה מוגברת ACP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5 . הדר שתיל עץ המטען הזרקת. שתילי הדר גבוה כ- 1 מ' הוזרקו 1.7 מ"ג/מ"ל של dsRNA. חורים לקדוח (א) בשתילי הדר באמצעות מקדחה בקוטר 10 מ מ כדי להוסיף את מזרק לתוך הגבעול של הצמח. קצה נחושת חשוף כל מזרק היה עטוף עם רצועה רחבה 0.6 ס"מ (¼ אינץ ') של איטום הסרט למניעת דליפה. מרססים (B) מלא 6 מ של הפתרון צבעוניות הוחלו על הגבעול (המטען) השתילים. מרססים נותרו במקומם כ 6-10 h עבור ספיגה מלאה של הפתרון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6 . קליי אדמה משלוח התיקון של dsRNA לתוך צמחים דרך האדמה. קו חדש של העברת חומר: קליי זה נושאת חומצת גרעין בחינם אבק לשימוש אספקת חומרים פעילים כגון dsRNA קרקעות עבור ספיגת בצמחים, ובסופו של דבר לתוך חרקים. קליי שנהגו (A) ו- (B) אפוי קליי המתארים סובלנות/החזקת מים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה 1. Oligonucleotide רצפי RNAi. המפורטים הם גנים ו oligonucleotides המשמש ליצירת PCR שברי dsRNA, תחל qPCR כדי לנתח את רמות תעתיק.

1 וידאו משלימים: Agars וג'ל כמו סופגים עבור משלוח ושחרור מתמשכת של dsRNA. Agars סינטטי או טבעי רטוב, ג'לים עם פתרון dsRNA זה עשוי לשמש בתור פיתיון או דיאטות פרוקי רגליים שונים. לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה

RNAi הוכיחה להיות כלי חשוב לחקור פונקציה ביולוגית ג'ין ורגולציה, עם פוטנציאל גדול כדי להיות מנוצל עבור ניהול של חרקים מזיקים^{19,68,69,70, 71}. מבחר gene (s) המתאימות עבור להשתיק זן חרקים נתון, שיטת מסירת dsRNA(s) התואמת החרק ועיצוב הן בעל חשיבות עליונה. השיטה אופטימלית עבור אספקת dsRNA לתוך חרק להיקבע מדעית, יחד עם הבחירה המינון היחסי עבור משלוח, כמו שיטות מסוימות עשויות להציע יתרונות ומגבלות אחרות. פיתוח biopesticide מולקולרית בסופו של דבר העלול להיות מתאימים לשחרור סביבתיים, נדרש שיטת משלוח ריאלי. יעילים, יתרון. לדוגמה, dsRNA למריחה הוכיחו להיות אפקטיבית עבור משלוח dsRNA פקד חרקים הדרים, גפנים^42,44. אסטרטגיות חדשניות כגון שימוש של פיתיונות, פתרונות סוכרוז, שמרים או חיידקי dsRNA הייצור עבור בליעה ישירה, יישום מקומי של dsRNA על גבי צמחים, או ייצור של dsRNAs ספציפית על ידי הצמחים הטרנסגניים ששונה, קידמו את התפתחות ^19,יעיל מבוסס RNAi שולטת⁷².

דוגמה טובה היא המודגמות כאן עם השימוש של שעועית ירוקה לספק dsRNA (איור 1 ו- 2 איור) שנועדו במיוחד להשפיע ולהפחית מזיקים חרקים חשיבות גלובלית. הירקות פיתח פרוטוקול מסירה dsRNA מתווכת באמצעות מקטעים של שעועית ירוקה שקוע, רווי dsRNA שימש כדי ביעילות היעד גנים ספציפיים לפיתוח זחל BMSB. שעועית ירוקה הם אחד הירקות רבים כי הם טרפו על ידי BMSB, אז אלה שימשו כאמצעי להעברת dsRNA. מדיומים אחרים של dsRNA משלוח שנבדקו (נתונים לא מוצג) אך החמיץ באספקת באמצעות תזונה BMSB כנראה עקב הבדלים מרקם לכלי הדם. לכן, השתמשנו מקטעים של שעועית ירוקה למסור במבחנה מסונתז dsRNA הנימפות BMSB. חומצות גרעין מועברת באמצעות צמח או טכניקה בתיווך ירקות פוטנציאלי יוכל לזירוז RNAi ב החרק של בחירה כפי שרואים כאן עם דלדול של גנים JHAMT ו- Vg BMSB (איור 2)⁶².

פרוטוקול מסירה זה ירקות dsRNA בתיווך שימש בהצלחה לזירוז RNAi לא רק BMSB אלא גם HB באמצעות ראמוס (איור 3), אבל משלוח אסטרטגיות, שיטות חייב להיות מותאם לכל גן ולכל חרק. לפיכך, מומלץ כי שיטות שונות להיבדק למסירה גם לגבי היעד גנים מרובים עניין אינדיבידואלי או על-ידי הערימה dsRNAs לפחות שני על מנת לקבל יותר פנוטיפי penetrance. יש כבר לסכם מספר שיטות למסירה dsRNA חרקים, חרקים התאים כולל האכלה^13,22, השריית^73,74, microinjection⁷⁵וטכניקות אחרות⁷⁶ המשמש ספיגת dsRNA לזירוז RNAi מערכתית. שיטות חדשות יותר עבור משלוח אוראלי של dsRNA לזירוז RNAi ב חרקים אחרים על ידי בליעה על צמחים שאינם הטרנסגניים התייחס גם כבר בחנו (איור 4, איור 5 ואיור 6). עצי הדר הוכחו לספוג dsRNAs גם דרך השורשים, הגבעול הקשה (המטען זריקות), או תרסיסים בריסוס^42,44. בעבר, עצי הדרים וגפנים בוגרת שטופלו עם חרקים dsRNA ספציפי התואם הגן AK ACP והן GWSS. צמחים אלה שטופלו גרם לעלייה בתמותה עבור ACP והן GWSS עבור עד אורכים שונים של זמן^41,45. יחד תוצאות אלו מדגימים ש-dsrna הזה לטרפד את הביטוי של גנים ספציפיים של החרקים למד.

אתגרים המשפיעות מוצלחת להחרשת גנים לכלול קבוצות ייחודיות של dsRNA nucleases (dsRNases) באה לידי ביטוי בעיקר בתחום הרקמה הבטן של חרקים, הפרשות הרוק, או את רמת החומציות במעיים אשר, עשוי להיות אחראי על השפלה של dsRNA^{47 77, ,78}. עם זאת, כדי להתגבר על השפלה כזאת, RNAi מערכתית עלולה להיגרם ביעילות בחרקים ניצול ריכוז גבוה של dsRNA ו/או באמצעות PEG בתזונה עבור משלוח אוראלי של dsRNA גנים ספציפיים כדי להתגבר על השפלה כזאת^{62, 79}. ספיגת של dsRNA והספקת עשוי גם להיות התייצב עם העזרה של מולקולות נושאת, כמו חלקיקי⁸⁰ כמו משקם⁴⁸, ליפוזומים כמו Lipofectamine 2000 ו- Metafectene⁷⁶, פוליאתילן גליקול⁷⁹, קליי nanosheets⁸¹, נקודה קוונטית פחמן⁵⁰. המחקר מתבצע כדי לשפר את מסירת dsRNA באמצעות פיסות אגר, ג'ל רווי גנים ספציפיים dsRNA יעיל (נתונים לא מוצג, ראה 4 וידאו משלימה). ניתן להשתמש בטכניקה זו למסירה של מנה אפקטיבית של dsRNA נמלים שיכול לשאת את dsRNA חדורים שרף או אגר אל הקן כמזון.

בנוסף, היציבות של dsRNA ההתמדה לטווח ארוך של dsRNA ברקמות הצמח הוא בעל חשיבות, במיוחד עבור גידולים חקלאיים. dsRNA המופצים וסקולריים רקמות של צמחים, פירות או ירקות עלולים להצטבר עצה, שיפה עם פעילות אנזים מופחת לפני להיות בלע על-ידי חרקים לזירוז מנגנון RNAi. ייתכן צורך בוודאות יישומים יש dsRNA להימשך לתקופה קצרה, כגון 6 ימים בשעועית ירוקה או יותר, 36 h ב-^62,אדמת⁸² כך ההצטברות של חומצות גרעין הסביבה הופכת לא סביר. עם זאת, נינה et al. הדגימו כי nanosheets יכול להגן על dsRNAs גדול מכל השפלה מוקדמת כמו גם התחלקות שחרורם מתמשכת על משטחים עלה על פני תקופה של 30 יום לפחות⁸¹.

באופן כללי האסטרטגיות משלוח dsRNA שנדונו כאן יכול לשמש להשתקת גנים ספציפיים חרקים על ההדברה. אספקה של dsRNA צמחים באמצעות המים להשקיה, שורש הירטבות או הזרקת תא המטען יכול להיות אסטרטגיית יעיל עבור חרקים מזיקים, כגון שורש מזינים, אשר אין שיטה בקרה יעיל זמין כעת. משלוח של dsRNA באמצעות נשא או ייצוב בינוני כגון חימר או אגר ניתן להוסיף ישירות על-ידי צמחים אל הקרקע עבור ספיגת. אחד הגורמים העיקריים עבור התקדמות איטית בפיתוח של biopesticides מולקולרית RNAi בתיווך מצרי לא העדר משלוח אוראלי יעיל טכניקות ליזום RNAi יעיל ויציבות תחת תנאים סביבתיים⁸³. משלוח אוראלי שמפורטות כאן בעתיד ייעשה שימוש בשיטות להעברת חומצות גרעין בתיווך גנים להשתיק טיפולים לשתול sap האכלה, כמו גם ללעוס חרקים להקטין את הנזק חרקים בייצור המזון העולמי ולפתח המזיק אקולוגי בר קיימא ניהול.

המחברים אין לחשוף.

המחברים בתודה להכיר דונלד וובר, מייגן הרליהי (USDA, ארס Beltsville, MD) מתן BMSB על בסיס חצי פנסיון ניסויים ולשמירה על המושבות; מריה גונזאלס טי סלבדור עמ' לופז, (משרד החקלאות, ארס, בפורט פירס, פלורידה), ג'קי ל' מץ (אוניברסיטת פלורידה, בפורט פירס, פלורידה) תחזוקה המושבה, הכנת הדוגמא של ניתוחים.