Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מאפשר לקורא לנתח מלח מרה-induced ביופילמים בתוך פתוגנים המעית באמצעות גישה רב פנים כדי ללכוד באופי הדינמי של biofilms חיידקי על-ידי הערכת הדבקות, היווצרות מטריצה חוץ-תאית חומר הפולימרים, פיזור.

Abstract

ביופילמים הוא תהליך דינמי, multistage, המתרחשת אצל חיידקים תחת תנאי סביבה קשים או בזמנים של מתח. עבור המעית פתוגנים, תגובה משמעותית מתח מושרה במהלך ההעברה במערכת העיכול ועל מרה חשיפה, מרכיב נורמלי של מערכת העיכול האנושית. כדי להתגבר על ההשפעות אחרים של מרה, פתוגנים המעית רבים יוצרים ממבנה biofilm המשוערות להתיר הישרדות כאשר הם מגיעים דרך המעי הדק. כאן אנו מציגים מתודולוגיות להגדרת ביופילמים דרך הדבקות מוצק-שלב מבחני וכן זיהוי מטריצה חוץ-תאית חומר פולימריים (EPS) ופריטים חזותיים. יתר על כן, הערכת פיזור biofilm מוצג כדי לחקות את הניתוח של אירועים מפעילה שחרור של חיידקים במהלך תהליך זיהום. קריסטל ויולט מכתים משמש כדי לזהות חיידקים חסיד assay הדבקות תפוקה גבוהה 96-ובכן צלחת. הערכת ייצור EPS נקבעת על-ידי שני מבחני, כלומר מיקרוסקופ מכתים של מטריקס EPS, ניתוח כמותי למחצה עם לקטין איגוד fluorescently מצומדת רב-סוכר. לבסוף, פיזור biofilm נמדדת דרך המושבה ספירות, ציפוי. נתונים חיוביים של מספר מבחני תמיכה אפיון biofilms and יכול להיות מנוצל כדי לזהות מלח מרה-induced ביופילמים בתוך זני חיידקים אחרים.

Introduction

ביופילמים היא אסטרטגיית חשוב הישרדות חיידקי הנגרמת במהלך בתנאי סביבה קשים. חשיפה תרכובות אחרים כמו אנטיביוטיקה או שינויים מזין או זמינות חמצן גורם לחוץ בחיידק זה ניתן להקל באמצעות ביופילמים. ממבנה biofilm מאופיין על ידי חיידקי מצורף משטח או חיידקים אחרים, והוא מלווה את הפרשת מטריקס EPS מורכב בעיקר סוכרים1,2,3. ביופילמים הוא תהליך דינמי שבו מפל של אירועים במרקחת היווצרות בוגרת הקהילה חיידקי חסיד1,2,3. החיידקים מייצרים adhesins כדי להקל על קובץ מצורף מוקדם תוך הזזת adhesin ביטוי גנים פרופילים כדי לחזק את הקובץ המצורף במהלך ההבשלה biofilm. במקביל, ייצור EPS מתרחשת את המעיל הקהילה חיידקי במטריצה כדי להגן על התאים מפני הלחץ הראשוני. חיידקים בתוך את biofilm הם לאט גדל; ככזה, יטחנו את רוב אנטיביוטיקה לא יעילה. יתר על כן, הגידול איטי חוסך אנרגיה עד שינוי המצב לטובת התפתחות חיידקים1,2,3. אחרי התנאים הקשים חלפו, חיידקים לפזר את biofilm והמשך חיים פלנקטוניים1,2,3. באופן מסורתי, biofilms הם נצפו על משטחים, מייצגים אתגר קליני מתמשך בשל זיהום המאגרים המצויים על צנתרים ו בדיור התקנים1,2,3.

ביופילמים תוארה לאחרונה מספר גורמים מחוללי המעית; חיידקים להדביק את המעי הדק או הגס4. עבור מינים שיגלה , זיהום מתרחש במעי הגס האנושי לאחר מעבר דרך רוב מערכת העיכול. במהלך המעבר דרך המעי הדק, שיגלה הוא נחשף מרה; חומר משפילים השומנים ניקוי ומופרש אל המעי כדי להקל על עיכול שומנים בזמן בו זמנית להרוג חיידקים רוב5. פתוגנים המעית יכולת ייחודית להתנגד ההשפעות אחרים של מרה6. הניתוח האחרונה שלנו מנוצל vivo-כמו שילובים של גלוקוז ושל מלחי מרה להפגין ביופילמים חזקים ב ס flexneri , כמו גם מינים אחרים של שיגלה, פתוגניים Escherichia coli, ו סלמונלה4. בעבר, סלמונלה enterica serovar Typhi הוצגה כדי ליצור ממבנה biofilm הנוצרות על-ידי המרה עקב קולוניזציה ייחודי של כיס המרה במהלך זיהום כרוני7,8,9, 10. בנוסף, מחקר קודם עם ויבריו11, קמפילובקטר12 הפגינו ביופילמים בתגובה מרה. לכן, הבדיקות מורחב התצפיות היווצרות biofilm מרה-induced פתוגנים אחרים, מסייעות לקיים הפגנה של פתוגן המעית שנשמרת תגובה מרה. בניגוד כרונית biofilms שבו שעתוק גנים חיידקיים מוגבל, הזדקנות ביולוגית התא יכול להתרחש1,2,3, אנו מציעים כי biofilm מרה-induced המעית הוא יותר ארעי בטבע. זה ארעיים, biofilm מידבק ולחתימה על ידי פירוק מהיר (כפי שניתן לראות ב וזמינותו נפיצה), משופרת ביטוי גנים התקפה אלימה נצפתה ב biofilm האוכלוסייה4,6. 

כמו ביופילמים הוא תהליך דינמי הגיוון הרב והשימוש של מלחי מרה כמו גורם ייזום היה רק תיאר לאחרונה גורמים מחוללי המעית ביותר, הכלים ואת טכניקות המשמשות הם יישומים ייחודיים ויצירתיים של שיטות מסורתיות. כך, המובאים כאן הם שלוש אסטרטגיות ללא תשלום כדי לכמת את מספר מאפיינים חשובים של מלח מרה-induced ביופילמים, כולל חיידקי הדבקות, הפקה של המטריקס EPS, פיזור של חיידקים קיימא מ biofilm. טכניקות אלה כבר נעזרו בעיקר למחקר עם שיגלה; לכן, הערכה של פתוגנים המעית אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה. יחד עם זאת, נתונים חיוביים של כל שלושת מבחני תמיכה זיהוי של biofilms ולהקים לשחזור פרוטוקולים עבור מלח מרה-induced ביופילמים.

Protocol

1. הכנת נוגדנים

  1. מלחי מרה בינוני: כדי להכין ציר סויה tryptic (TSB) המכיל מלחי מרה 0.4% (משקל/נפח), resuspend 200 מ ג של מלחי מרה ב 50 מ ל TSB בלוק. מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. הפוך בינוני טריים מדי שבוע.
    הערות: מלחי מרה בשימוש שגרתי הוא תערובת 1:1 של cholate נתרן, סודיום deoxycholate מבודד gallbladders ovine ושור. כפי שמתואר בעבר4, הנוכחות של גלוקוז היה צורך מלח מרה-induced ביופילמים. TSB הוסיפה גלוקוז ביחס מרק לוריא-Bertani (LB); לכן, היה מספיק כדי לגרום ביופילמים שיגלה , פתוגנים אחרים המעית מנותח. בהתאם לחיידקים להיות מנותח, ריכוזי גלוקוז שונים או דרישות סוכר שונים יש צורך בהזמנה.
  2. 0.5% w/v קריסטל ויולט במים: להמיס 2.5 גר' קריסטל ויולט במים מזוקקים 500 מ"ל. מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
  3. Concanavalin A (ConA) מצומדת כדי fluorescein isothiocyanate (FITC): לשקם את המניה ב- 1 x PBS. לדלל את המניה 10 mg מרוכז עם μL 400 ל- PBS 1 x כדי ריכוז סופי של 25 µg/mL, להגן מפני אור.
  4. PBS + גלוקוז: להמיס 0.2 גרם גלוקוז ב- PBS 1 x 10 מ"ל (2% w/v גלוקוז הסופי). מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. להפוך טרי ביום של שימוש.
  5. PBS + מלחי מרה: להמיס 40 מ"ג ב- PBS 1 x 10 מ"ל (0.4% w/v מלחי מרה הסופי). מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. להפוך טרי ביום של שימוש.
  6. PBS + גלוקוז, מלחי מרה: להמיס מלחי מרה 40 מ"ג ו- 0.2 גר' גלוקוז ב- PBS 1 x 10 מ"ל (מלחי מרה w/v 0.4% ו- 2% w/v גלוקוז הסופי). מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. להפוך טרי ביום של שימוש.
  7. להכין פלטות אגר ליברות.
  8. פורמלדהיד/גלוטראלדהיד תיקון: 810 להוסיף µL פורמלדהיד (37% מניות פתרון, הריכוז הסופי של 3%) ו- 125 µL גלוטראלדהיד (25% מניות פתרון, הריכוז הסופי של 0.25%) כדי PBS 1 x 14 מ ל. לערבב היטב ולאחסן ב 4 º C. התיקון צריך להיות קר לשימוש הנכון.
    התראה: התיקון הוא רעיל ואינו דורש סילוק פסולת מסוכנת.
  9. פתרון antifade mountant: להשתמש בפתרון antifade mountant המכיל 4, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כתם לעכב photobleaching דוגמאות מיקרוסקופ immunofluorescent בעת fluorescently מכתים את ה-DNA של החיידק.

2. הכנה של חיידקים

  1. לגדול תרבויות לילה של זנים חיידקי להיבדק ע י מזריקים 3 מ"ל של TSB עם מושבה בודדת, מבודד היטב בשפופרת תרבות סטרילי. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-225 rpm עבור לילה דגירה (16-24 שעות).
    הערה: זנים צריך להיות restreaked מן המקפיא מניות כל 2 כדי 4 שבועות, מתוחזק על צלחות לא ישן יותר משבועיים.

3. מוצק-שלב הדבקות Assay

הערה: זו assay מכמתת חסיד חיידקים באמצעות שיטת צלחת 96-ובכן. חיידקים גדלים באופן סטטי לוחות שטוחים. הכביסה מתבצע כדי להסיר חיידקים שאינם מחסידי, חיידקים חסיד מוכתמים קריסטל ויולט. הכתם קריסטל ויולט נקשר פפטידוגליקן בתוך הקיר תא החיידק, יכול להיות solubilized באמצעות אתנול. המספר של חיידקים חסיד נקבע בהתבסס על קריסטל ויולט השמירה.

  1. להגדיר את שני צינורות 1.5 mL. תווית עם TSB או TSB + מלחי מרה (BS).
  2. להוסיף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS הצינורות המתאימים.
  3. לחסן צינורות עם 20 µL של תרבות לילה (ב- 1:50 דילול).
  4. בצלחת 96-ובכן סטרילי, נקי, שהונעו, שטופלו תרביות רקמה, להוסיף µL 130/טוב של uninoculated בקרת מדיה משלוש בארות כדי לשמש הפקד ריק. בצע כיוונון משלוש בארות פקד עבור כל סוג מדיה (TSB ו TSB + BS) להיבדק.
  5. להוסיף µL 130/טוב של תרבות חוסנו משלוש בארות, וחזור עד כל התנאים ניסיוני הן מצופה דולר.
  6. תקופת דגירה של 4-24 h ב 37 ° C באופן סטטי.
  7. שימוש בקורא צלחת, להקליט את יתר600. הגדר הבארות שליטה כמו 'blank'. לאשר שאמצעי שליטה ברור ללא עדות של עכירות. אם כל עכירות מזוהה, למחוק את הניסוי. הערכים600 OD יכול לשמש כדי לנרמל את הנתונים אם ישנם הבדלים משמעותיים בשיעור צמיחה בין זני חיידקים.
  8. הסר את המדיום תרבות באמצעות קו ואקום על ידי הטיית בעדינות את הצלחת ואת לאט כ רפה בעברית המדיום בקצה התחתון של הבאר. יש להקפיד לאסוף את כל המדיום תרבות מבלי לשבש את פעולת האוכלוסייה חיידקי חסיד ממוקם על משטח הפלסטיק. אם EPS מטריקס הופק במהלך זמן הדגירה, המטריצה ניתן לאבחן כמו התמיסה לבן. נא לא להפריע המטריקס EPS.
  9. יש לשטוף בעדינות הבארות פעם אחת עם 200 µL PBS סטרילי. להסיר בכביסה PBS באמצעות קו ואקום.
  10. היפוך את הצלחת לייבש. הקדישו לפחות 20 דקות לייבוש.
    הערה: מאז biofilm יש לייבשם ביסודיות לפני צביעת, הפרוטוקול ניתן מושהה בשלב זה לכמה שעות או אפילו לילה. זמן ייבוש נוסף לא תשנה את ההליך מכתימים בזמן ייבוש לא שלם ישפיעו על כימות של תוצאות, הפארמצבטית.
  11. להוסיף 150 µL של 0.5% קריסטל ויולט. כל ניסיוני ושליטה טוב.
  12. תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  13. לשטוף את בארות פעם אחת עם 400 µL של מים מזוקקים. אמצעי האחסון הוסיף מסייע להסיר את הכתם שיורית קריסטל ויולט צדי הבארות. להסיר בכביסה עם הקו ואקום.
  14. לשטוף את בארות חמש פעמים עם 200 µL של מים מזוקקים. להסיר בכביסה עם הקו ואקום.
    הערה: שטיפה חשוב כמת. כאשר הבארות ריק הם ברורים מים מזוקקים אינם מכילים כל כתם שיורי קריסטל ויולט, המשך לשלב הבא.
  15. היפוך את הצלחת לייבש, מוגן מפני אור. להבטיח ייבוש מוחלט של צלחת כאמור לעיל.
  16. Destain הבארות עם 200 µL של 95% אתנול. דגירה על הלוחית אהבת בשייקר למשך 30 דקות. כדי למנוע אידוי, במיוחד בטמפרטורות גבוהות יותר, לבצע שלב זה ב 4 º C.
  17. שימוש בקורא צלחת, להקליט את יתר540.
    הערה: אורך הגל עבור ספיגת המרבי של קריסטל ויולט נמצא ליד 590 ננומטר. בספרות מדווח על טווח שבין יתר540 - OD5954,13,14,15,16 עבור ספיגת קריסטל ויולט; כך לבחור אורך גל הזמינים בהתבסס על הקורא צלחת.

4. EPS מטריצת זיהוי

הערה: מבחני חינם אלה לכמת והמחש EPS. בשני, EPS מזוהה באמצעות לקטין לאגד סוכרים. החלבון fluorescently מצומדת מאפשר כימות (שלב 4.1) או הפריט החזותי (שלב 4.2).

  1. גילוי חצי כמותית של EPS
    1. להגדיר את שני צינורות 1.5 mL. תווית עם TSB או TSB + BS.
    2. להוסיף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS הצינורות המתאימים.
    3. לחסן צינורות עם 20 µL של תרבות לילה (1:50 דילול).
    4. בצלחת 96-ובכן סטרילי, שחור, שהונעו, שטופלו תרביות רקמה, להוסיף µL 130/טוב של uninoculated בקרת מדיה משלוש בארות כדי לשמש הפקד ריק. בצע כיוונון משלוש בארות פקד עבור כל סוג בינוני להיבדק. להוסיף µL 130/טוב של תרבות חוסנו הבארות, וחזור עד כל התנאים ניסיוני הן מצופה דולר.
    5. תקופת דגירה של 4-24 h ב 37 ° C באופן סטטי.
    6. להעביר את המדיום תרבות צלחת ברור 96-ובכן עם פיפטה, באופן אידיאלי פיפטה רב-ערוצי. להיות זהירים כדי לאסוף את כל המדיום תרבות מבלי לשבש את פעולת האוכלוסייה חסיד ו/או EPS הממוקמת על משטח הפלסטיק. להפריש.
    7. לתקן את הצלחת שחור למשך 15 דקות ב RT באמצעות µL 200/טוב של הפורמלדהיד/גלוטראלדהיד ב- 1 x PBS.
    8. ואילו האוכלוסייה חסיד מתקן, להעריך את השבר supernatant מהשלב 4.1.6. שימוש בקורא צלחת, להקליט את יתר600. הגדר הבארות שליטה כמו 'blank'. לאשר שאמצעי שליטה ברור ללא עדות של עכירות. אם כל עכירות מזוהה, למחוק את הניסוי.
      1. לחלופין, ניתן לבצע וזמינותו כולו בצלחת התחתונה ברור שחור. בנסיבות אלה, ניתן לרשום את הערכים600 OD, המדיום תרבות יכול להימחק לאחר מכן לפני שתמשיך לשלב 4.1.7. הערכים600 OD יכול לשמש כדי לנרמל את הנתונים במקרה ישנם הבדלים משמעותיים בשיעור צמיחה בין זני חיידקים.
    9. הסר את התיקון והיפטרו ב פסולת מסוכנת.
    10. יש לשטוף בעדינות הבארות פעמיים עם 200 µL טוב ל- PBS סטרילי. להסיר בכביסה PBS באמצעות קו ואקום על ידי הטיית בעדינות את הצלחת לאט כ רפה בעברית לשטוף את קצה התחתון של הבאר.
    11. להוסיף 150 µL/טוב של 25 µg/mL ConA-FITC ולאחר תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT.
    12. בעדינות לשטוף פעמיים עם µL 200 ל- PBS.
    13. להוסיף 150 µL ל- PBS מכל קידוח. להקליט את זריחה-488 ננומטר.
  2. מיקרוסקופיה קונפוקלית ויזואליזציה של ייצור EPS, חישוב עובי biofilm
    1. להגדיר את שני צינורות 1.5 mL. תווית עם TSB או TSB + BS.
    2. להוסיף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS הצינורות המתאימים.
    3. לחסן צינורות עם 20 µL של תרבות לילה (ב- 1:50 דילול).
    4. להגדיר את צלחת 24-ובכן סטרילי עם 12 מ מ סטרילי סביב coverslips זכוכית דקה. להוסיף µL 400/טוב של uninoculated בקרת מדיה משלוש בארות כדי לשמש הפקד ריק. בצע כיוונון משלוש בארות פקד עבור כל סוג בינוני להיבדק.
    5. להוסיף 400 µL של תרבות חוסנו בארות כפילויות, וחזור עד כל התנאים ניסיוני הן מצופה.
    6. תקופת דגירה של 4-24 h ב 37 ° C באופן סטטי.
    7. באופן חזותי אשר הצמיחה TSB תנאי, צמיחה, EPS התמיסה (לבן) ב- TSB + מצב BS, אין צמיחה ו/או לבן התמיסה בבארות שליטה סטרילי. להסיר את supernatants.
    8. לתקן למשך 15 דקות ב RT באמצעות µL 200/טוב של פורמלדהיד/גלוטראלדהיד פתרון ב- 1 x PBS.
    9. להסיר את התיקון, להיפטר של פסולת מסוכנת.
    10. יש לשטוף בעדינות הבארות פעמיים עם 200 µL טוב ל- PBS סטרילי. להסיר בכביסה PBS באמצעות קו ואקום.
    11. להוסיף 150 µL/טוב של 25 µg/mL ConA-FITC ולאחר תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT.
    12. בעדינות לשטוף פעמיים עם 200 µL טוב ל- PBS.
    13. הר antifade mountant פתרון עם דאפי.
      הערה: הפתרון הוא פתרון הר מוכנות מראש, המבוססים על גליצרול המכיל דאפי לשמירה על התווית פלורסנט בזמן בו זמנית מכתימה את ה-DNA בתאי חיידקים להמחשת כמו counterstain. בצע את הנחיות והמלצות של ערכת עבור הדגירה פעמים לפני הדמיה דגימות. ניתן לבצע את דאפי מכתים הליך לפני החלת הפתרון antifade mountant שאינו מכיל דאפי.
    14. להעריך על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. במיקרוסקופ קונפוקלי, הגדר את הלייזר 495 ננומטר/519 nm עירור/פליטה להמחשת FITC. הגדר לייזר השני 360 nm/460 nm עירור/פליטה להמחיש דאפי. אתר את biofilm על-ידי התמקדות בערוץ דאפי. להשתמש בערוצים דאפי והן FITC כדי לקבוע את עובי מלא ולהגדיר העליון והדמיה נמוך גבולות. שיא מלא עובי Z-מחסנית תמונות על-ידי לכידת תמונות כל מיקרומטר 0.25 לאחר הגדרת ההיקפים העליון והתחתון של הערימה-z. לקבלת מידע נוסף אודות מיקרוסקופיה קונפוקלית, נא להפנות פרסומים על-ידי פדוק. et al. 17 , 18 , 19 , 20
    15. בנייה מחדש של תמונות תלת-ממד ב- ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) כדי להמחיש את מלא ביופילמים ולחשב את עובי biofilm. העובי הממוצע השיג עבור ס flexneri מלח מרה biofilms המושרה היה מיקרומטר 144.

5. פיזור Assay

הערה: ב- assay הזה, פירוק של biofilm באמצעות פיזור חיידקים מזוהה. כאן, biofilms בוגרת נקבעו, לאחר מכן (בדרך כלל ביום למחרת), התקשורת, הוחלפו PBS או שיושלם PBS. הרכיב supernatant מוערך אז כדי quantitate את המספר של חיידקים יש לזהויות biofilm.

  1. להגדיר את שני צינורות 1.5 mL. תווית עם TSB או TSB + BS.
  2. להוסיף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS הצינורות המתאימים.
  3. לחסן צינורות עם 20 µL של תרבות לילה (ב- 1:50 דילול).
  4. בצלחת 96-ובכן סטרילי, נקי, שהונעו, שטופלו תרביות רקמה, להוסיף µL 130/טוב של uninoculated בקרת מדיה משלוש בארות כדי לשמש הפקד ריק. בצע כיוונון משלוש בארות פקד עבור כל סוג מדיה להיבדק.
  5. להוסיף µL 130/טוב של תרבות חוסנו משלוש בארות, וחזור עד כל התנאים ניסיוני הן מצופה דולר.
  6. דגירה באופן סטטי את הצלחת. בשביל 4-24 h ב 37 מעלות צלזיוס.
  7. לפני שתמשיך, לחמם את PBS, PBS + גלוקוז, PBS + מלחי מרה, ואת PBS + מלחי מרה + הגלוקוז ל- 37 מעלות צלזיוס. להכין את אלה ריאגנטים טריים מדי יום.
  8. שימוש בקורא צלחת, להקליט את יתר600. הגדר הבארות שליטה כמו 'blank'. לאשר שהמדיום ברור ללא עדות של עכירות. אם כל עכירות מזוהה, למחוק את הניסוי. הערכים600 OD יכול לשמש כדי לנרמל את הנתונים אם ישנם הבדלים משמעותיים בשיעור צמיחה בין זני חיידקים.
  9. הסר את המדיום תרבות באמצעות שורת ואקום. יש להקפיד לאסוף את כל המדיום תרבות מבלי לשבש את פעולת האוכלוסייה חסיד ממוקם על משטח הפלסטיק.
  10. יש לשטוף בעדינות הבארות פעמיים עם 200 µL טוב ל- PBS סטרילי. להסיר בכביסה PBS באמצעות קו ואקום.
  11. החלף לשטוף את µL 130/טוב של הבאות לתוך שלוש בארות: PBS, PBS + גלוקוז, PBS + מלחי מרה, ו- PBS + מלחי מרה + גלוקוז. נוגדנים אלה חייב להיות מראש ומחוממת ל- 37 מעלות צלזיוס.
  12. דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  13. הסר בזהירות את הצלחת מן החממה 37 º C. להעביר את supernatants צלחת 96-ובכן טרי, סטרילי.
  14. בעזרת בלוק צלחת או דילול 96-ובכן, להכין 10-fold (1:10) דילולים טורי של תגובת שיקוע לתוך PBS סטרילי.
    הערה: הסדרה דילול צריך לנוע בין מדולל 10-6 בהתאם המתח חיידקי להיבדק. ניתן לבצע ניסויים פיילוט כדי לקבוע טווח דילול אופטימלית.
  15. צלחת 5 µL של כל דילול על גבי אגר LB באמצעות פיפטה רב-ערוצי נקודה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לספור מושבות על היום הבא, חשבון עבור הגורם דילול בקביעת המושבה שחזור ויוצרים יחידות (CFU). כדי לחשב את פיזור אחוז ביחס 1 x שליטה PBS (מוגדר ב- 100%), לחלק את התאוששות CFU כל תנאי הטיפול על ידי השחזור CFU 1 x PBS הבקרה מדגם.
    הערה: השגרה לוחות מדיה עבור חיידקים מזן עניין יכול גם לשמש. לדוגמה, יכול להיות מצופה שיגלה על צלחות קונגו אדום. ודא הצלחות יבש על טכניקות ספוט-ציפוי המתאים.

תוצאות

איור 1, ביופילמים הנגרמת ברוב של הגידול שנבדקו פתוגנים המעית שישה הבאים בתקשורת המכיל מלחי מרה. עלייה משמעותית בחיידקים חסיד לאחר חשיפה מלחי מרה הוא ציין זנים כמעט כל נבדק. החריג הוא enteroaggregative e. coli (EAEC); עם זאת, שים לב התבוננות Δaaf מוטציה4המושרה. התוצאות מצביעות על מנגנונים נוספים הדבקות הם המושרה על ידי חשיפה מלחי מרה ב EAEC בהיעדרו של הדבקות aggregative fimbriae אני (AAF / אני)21. להסיק מסקנות מבסיס הנתונים, מגרש540 יתר הערכים עבור כל סוג מדיה, זן נבדק. השוואת הערכים של כל זן של הפקד מדיה (-BS) ביחס מדיה המכיל מלחי מרה יקבע אם מלחי מרה זירוז באופן משמעותי ביופילמים. ניתן גם לבצע השוואות בין זני חיידקים ו/או מוטציות עבור ניתוחים אפיון נוסף.

להערכת ConA-FITC EPS מוצגת באיור2. איור 2A מייצג את ההערכה הכמותיים למחצה לייצור EPS שבו ConA-FITC משמש כתם biofilms. ConA נקשר סוכרים המטריצה EPS, הסכום נשמר ומתגלה על ידי קורא צלחת פלורסנט. כדי להציג את הנתונים, להתוות את יחידות קרינה פלואורסצנטית הממוצע עבור כל תנאי ולהשוות את התנאים בתדר biofilm לפקד שלילי. בנוסף, ניתן לבצע השוואות בין זני חיידקים או מוטציות. זה חיוני כדי לנתח פקד התקשורת בלבד, שלילי כדי לקבוע את כמות רקע זריחה ConA-FITC המתרחש על הצלחת. התנאי TSB לא היה שונה באופן מהותי מן הפקד מדיה, בזמן זריחה קריאות משמעותית להגדלת הבאים מלחי מרה החשיפה. הנתונים לאשר כי ייצור EPS מעידה על ביופילמים, אינה מתרחשת בהיעדר מלחי מרה flexneri ס. התמונות של מלח מרה-induced biofilms ב ס flexneri מיוצג באיור 2B. ConA-FITC משמש כתם פוליסכרידים המטריצה EPS בזמן counterstain דאפי משמש כדי להמחיש את החיידקים על ידי מכתימה את ה-DNA. על חיידקים שלא נחשפו מלחי מרה (בקרה שלילית), מזוהה רק דאפי. ראוי לציין, הצפיפות של חיידקים הוא הרבה יותר נמוך במצב מלחי מרה. רקע ברורה בערוץ FITC מתקבל כדי להצביע על חוסר ייצור EPS. כצפוי, הנתונים ממחישים כי EPS הייצור הוא מתואם עם biofilm היווצרות1,2,3 בעקבות חשיפה מלחי מרה. ConA - צביעת שליטה הדגימות שטופלו מלח מרה מסופק להפגין יחודיות של קרינה פלואורסצנטית FITC. לתמונות האלה, 1 x PBS שימש במקום ConA-FITC, counterstain דאפי ונשתמרה. ניתן לבצע הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להעריך את עובי biofilms עם דגימות EPS-חיוביות4.

פיזור חיידקים מן biofilms באיור 3 מזוהה על ידי ומוכנסות biofilms הוקמה ב- PBS או PBS שהושלם. מבחינה פיזיולוגית, מרה הוא נספג מחדש אל תוך מחזור הדם במעי הדק, רק 5% של מרה מזין את המעי הגס5. כמו שיגלה פולש האפיתל חוקן, אנו משערים כי התחדשות של מרה היא אות חשובה עבור biofilm פיזור. באיור זה פיזור מתרחשת biofilms נחשפים PBS או PBS + גלוקוז; עם זאת, פיזור מעוכבת PBS + מלחי מרה ללא קשר הנוכחות של גלוקוז. הנתונים ממחישים כי ההסרה של מלחי מרה הוא חיוני ומספיק לעודד פיזור של flexneri ס מ מלח מרה-induced biofilms4. כדי להתוות את הנתונים, גם את CFU המשוחזר של החיידקים או האחוז היחסי לפקד (כפי שמוצג כאן) יכולים להיות מותווים.

figure-results-3341
איור 1: מלחי מרה זירוז ביופילמים בתוך פתוגנים המעית. 18 h biofilms גדל על הצלחות 96-ובכן רקמות-תרבות מטופלים TSB או TSB + 0.4% מלחי מרה מדיה, מוכתם 0.5% קריסטל ויולט. ערכים כמותיים אתנול solubilization של הכתם קריסטל ויולט נקבעו על ידי ספקטרופוטומטר-OD540. מלחי מרה חשיפה גדל באופן משמעותי ביופילמים בתוך שיגלה flexneri, ס dysenteriae, enteropathogenic serovar Escherichia coli, סלמונלה enterica Typhi ו ס enterica serovar Typhimurium. מובהקות סטטיסטית נקבע על ידי מבחן T של הסטודנט לזן כל השוואה בין הטיפול מלחי מרה אל הפקד מדיה. שגיאת התקן של הממוצע (SEM) מיוצג על ידי קווי השגיאה. כל p-ערכים < 0.0001. הנתונים המוצגים הם אחד (n = 3) ניסוי נציג, עם סט מלא של נתונים הניתנים הפרסום הקודם4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4401
איור 2: מלח מרה-induced ביופילמים מאופיין על-ידי ייצור של מטריצה EPS שמזוהה עם התווית על-ידי FITC א Concanavalin (א) סטרילי, שחור, צלחת 96-ובכן היו נזרע עם flexneri S. ב- 1:50 דילול לתוך TSB או TSB + מלחי מרה והתרחבה במשך 18 ח' Biofilms תוקנו, שטף בעדינות, ויטראז'ים עם ConA-FITC. הכמות של יתרת Concanavalin-A FITC נקבע על ידי קורא צלחת פלורסנט. הערכים המותווים מדגימים כימות EPS בעקבות צמיחה של S. flexneri גדלו ב מלחי מרה TSB או המכילים TSB. משמעות נקבע על ידי חד-כיווני אנובה, ערכי p -הם < 0.01. תצורת ה-SEM מיוצג על ידי קווי השגיאה. הנתונים המוצגים הם אחד (n = 3) ניסוי נציג, עם סט מלא של נתונים הניתנים הפרסום הקודם4. מיקרוסקופ (B) תמונות מן ממבנה biofilm שיגלה מלח מרה-induced. Coverslips סטרילי היו נזרע עם flexneri S. ב- 1:50 דילול TSB או TSB + מלחי מרה והתרחבה במשך 18 h. Coverslips היו לאחר מכן קבועה מוכתם ConA-FITC ו/או counterstained עם דאפי. ConA-FITC התגלתה רק ב מלחי מרה מצבו בשל נוכחותם של המטריקס EPS. Coverslip צבעונית רק עם דאפי TSB + טיפול מלחי מרה שימש כדי להדגים קרינה פלואורסצנטית רקע מינימלי עבור ההגדרה FITC על מיקרוסקופ קונפוקלי. תמונות עבור כל אורך גל וערוץ כיסוי מורכבים ניתנים עבור כל תנאי הטיפול. סולם מציינות 10 מיקרומטר. הנתונים המוצגים הינם אחד (n = 3) ניסוי נציג, עם סט מלא של נתונים הניתנים הפרסום הקודם4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6059
איור 3: ניתוח של פיזור חיידקים מן biofilms הנוצרות על-ידי מלח מרה. 18 h מלח מרה-induced flexneri שיגלה biofilms נחשפו PBS או PBS בתוספת גלוקוז, מלחי מרה או שילוב של גלוקוז ושל מלחי מרה. תגובת שיקוע ולאחר מכן באופן סדרתי מדולל, מצופה על פלטות אגר למנות את המושבה יוצרי יחידות (CFUs) אשר פיזרו את biofilm. המספר של חיידקים התאושש הייתה להתוות ביחס הפקד PBS. חיידקים התפזרו מ biofilm PBS או PBS + גלוקוז תנאים, אבל הנוכחות של מלחי מרה היה די בכך כדי לעכב את פיזור חיידקים מן biofilm. הנתונים המוצגים הם אחד (n = 3) ניסוי נציג, עם סט מלא של נתונים הניתנים הפרסום הקודם4. לעיון, חיידקים 100-fold שנמצאו באופן שגרתי לטיפול שליטה PBS (כ 7 x 107 CFU) בהשוואה ל- PBS + טיפול מלחי מרה (כ 7 x 105 CFU). משמעות נקבע על ידי חד-כיווני אנובה, ערכי p -הם < 0.0001. תצורת ה-SEM מיוצג על ידי קווי השגיאה.

Discussion

ניתוח של ביופילמים הוא מאתגר בשל אופיו הדינמי של biofilms ולהבדלים בין זנים, חומרים, מעבדות מבחני. . הנה, מספר אסטרטגיות מוצגים כדי לקבוע ביופילמים ב פתוגנים המעית בעקבות חשיפה מלחי מרה עם תובנה ניסיוני הניתנים לקידום הפארמצבטית. ישנם שיקולים נוספים כדי להבטיח הפארמצבטית. בראש ובראשונה, אנו ממליצים על ביצוע עצמאי לפחות שלושה ניסויים כל אחד עם triplicates טכני כדי לאשר תצפיות מובהקות סטטיסטית עקב וריאציית יכול להתרחש. שנית, השימוש של פקדים חיוביות ושליליות היא חיונית כדי להבטיח הפארמצבטית של וזמינותו. מומלץ מאוד להשתמש המתח פראי סוג פקד חיובי בעת הערכת מוטציות עבור ביופילמים. יתרה מזאת, כפי הגנים החשובים של ביופילמים מזוהים (לדוגמה, ראה ויבריו22, סלמונלה7ו- e. coli23,24,25), השימוש מוטציות biofilm כפקדי שלילי יאמת את הפארמצבטית של וזמינותו. שלישית, השיטות שהוזכרו לעיל מבוססים על מחקר ממוקד עם שיגלה , ס flexneri, בפרט. התאמות לפרוטוקולים עשוי להידרש בהתאם לדרישות הצמיחה של כל פתוגן המעית מוערכים. רביעית, מבחני למדוד את תגובת הלחץ חיידקי; לכן, חשוב לעבוד עם חיידקים מתוחזקים כראוי מניות קפואים (-80 ° C) או צלחות אחסון שמרה תחת קירור (מקסימום 4 ° C) במשך לא יותר משבועיים. חשוב לציין כי חיידקים מסוימים כולל פתוגנים המעית של הסוג Yersinia הם psychrotrophs שיכולה לצמוח ב טמפרטורות 0 ° צלזיוס26. מאז האחסון בקירור בטמפרטורה ניתן לשנות את פיזיולוגיה בקטריאליות, יכול לגרום לכך genotypic או משמרות פנוטיפי27,28,29, מומלץ מאוד להכין את aliquots של תרבות מניות ב- 80 ° C עבור חיסון שגרתי starter תרבות. יתר על כן, העבודה עם מבודד קליניים מחייבת restreaks בתדירות גבוהה יותר מ-80 מעלות המלאי כפי משמרות גנטי במהירות שנצפו בעת מעבר מיגדרי זן חיידקי קלינית-derived לתוך המעבדה הגדרת30,31 . במיוחד לעבוד עם שיגלה מבודד, זנים להסתגל במהירות, משמרות פנוטיפ להתרחש לעיתים קרובות32,33. מומלץ restreak חיידקים מן המקפיא מניות לאחר חודש, ו restreak המניה צלחת אחת לשבועיים.

גורם חשוב נוסף כדי להבטיח הפארמצבטית היא הכנה טריים של מלחי מרה המדיה כדי להגביל את השתנות וזמינותו. מלחי מרה מדיה מבוגרת 1 שבוע מושפעים באופן שלילי על פנוטיפ חזקים נצפתה עם הכנה מדיה טריים. יתר על כן, בהתאם את הפתוגן בסוג של חשיפה להיות שנותחה (המעי הדק נגד קולון), מקורות שונים, תערובות של מלחי מרה עשוי להידרש. לדוגמה, מלחי מרה בודדים, מצומדת, בטל את הבחירה מצומדת מקורות, או תמציות מרה גולמי הכוללים רכיבים מרה נוספים כגון כולסטרול, בילירובין יכול להיות מנוצל5,6. ניתוחים שיגלה התמקדו עיבוד חיידקי למחשב המארח במהלך ההעברה של המעי הדק לפני זיהום במעי הגס. לכן, השימוש של תערובת cholate deoxycholate מחקה בתנאים של המעי הדק6,5,, או34. גם לגבי וזמינותו פיזור (סעיף 5), כך צוין כי ריאגנטים שיושלם PBS הם טריים מדי יום וגם מראש התחמם עד לפני 37 ° C assay. כאשר ריאגנטים שגילן עולה על מספר ימים שימשו, הפארמצבטית של וזמינותו היה נפגעו קשות. היה זה גם קריטית חם מראש אלה ריאגנטים 37 ° C, כמו פיזור לא התרחשה בקלות עם ריאגנטים בטמפרטורת החדר. לבסוף, פיזור שיטות הערכה של ספירה מלאה כייל של biofilm יכולה לשמש, אשר כוללים sonication35,36 או עיכול אנזימטי37. הגישה וזמינותו פיזור בוים לקראת הערכת ההשפעה של התחדשות מלח מרה כמו שיגלה טרנזיטים ileum מסוף, לתוך המעי הגס. ניתוח הנתונים התבסס על השערות כי ההפסד של מלחי מרה תאפשר פיזור של biofilm ארעי, שיגלה חייב לפזר את biofilm לפני גרימת זיהום אפיתל המעי הגס4,5 . מצבים כגון sonication עיכול אנזימטי לייצג שחרור מוחלט של המוני חיידקים בין biofilm ואילו האסטרטגיה המובאת כאן מדמה מעי הגס המעבר כדי ללכוד את הפנוטיפ פיזיולוגיים עבור שיגלה. בהתאם לתנאי הניסוי הרצוי, שיטות נוספות עבור ספירה ניתוח או biofilm הפיזור עשוי להידרש.

מבחני נועדו להיות במתינות תפוקה גבוהה עם השימוש של 96-ובכן צלחות כדי לאפשר בדיקה של מספר זני חיידקים ו/או תנאים. כדי להבטיח המשך הפארמצבטית של ביופילמים, שימשו לוחות שהונעו, 96-ובכן היו תרביות רקמה מטופלים. מסיבות טכניות, צלחת הקוראים לא יכול למדוד במדויק ספיגת או זריחה בלוחות עגולים. בנוסף, ללא ציפוי לוחות הציע פרופילי הדבקות משתנה שיגלה, אשר הוא שדרת החקירה הנוכחית. מבחני ניתנים לשינוי תבניות טוב גדול באופן יחסי, אך ידרוש השינויים בפרוטוקול שיכולים להפחית את יעילות ניסיוני. לדוגמה, התקשורת תרבות תצטרך להעביר וואקום להקליט את הערכים600 OD עם ספקטרופוטומטרים. בנוסף, יכול להיות שיפשף את biofilm שהוכתמו קריסטל ויולט לאחר דגירה של 30-60 דקות אתנול 95% destain שלב, ניתן להעביר את התוכן cuvette עבור קריאות ספקטרופוטומטרים-OD540. חייבים להקפיד כאשר הגריטה בתוכן biofilm כל היטב כדי למנוע מתיז, מצאנו כי הגריטה קל לאחר דגירה של 60 דקות.

ניתוח עם שיגלה, סלמונלה, פתוגניים החיידק4 הפגינו תצפית חוזרות ונשנות כי ביופילמים מתרחשת בקנה מידה זמן מואצת (תוך 24 שעות) עבור פתוגנים המעית נחשפים מלחי מרה. בניגוד חיידקים אחרים הדורשים 48 עד 72 h להתבונן ביופילמים בתנאים רגילים, מלח מרה-induced biofilm המעית מתחיל מוקדם ככל 4 שעות עם השלב הדבקות ראשונית. לאחר מכן, EPS מטריקס היווצרות מתבטא מאת 6 h, ההבשלה מתרחשת על ידי 24 שעות ביממה. בתור שכזה, פנוטיפ הדבקות ב- 24 שעות עשוי להיות חזקים מדי כדי לפענח את התפקיד של גורמים להתמדה שונים ב ביופילמים. ביצוע ניתוח מוקדם, לדוגמה מוקדם ככל 4h, מאפשר זיהוי של הגורמים החשובים של ביופילמים מוקדם כי אחרת יהיו חסרים בנקודת זמן מאוחרת יותר. בסופו של דבר, וכפי שהוזכר לעיל בשלבים פרוטוקול, מלח מרה-induced ביופילמים עבור שיגלה לא זוהה בהיעדר גלוקוז4. מאז המטריקס EPS מורכבת בעיקר סוכרים היא שלב קריטי ביופילמים עבור חיידקים רוב38, הנוכחות של גלוקוז או אחרים סוכר בכלי התקשורת חשובה סביר לצפות ביופילמים. בהתאם הפתוגן חיידקים מנותח, ניסוחים שונים מדיה הבסיס עשוי להידרש.

ביופילמים הוא תהליך מרובה שכבות המתרחשת לעיתים קרובות מערכת פתוחה היכן מזין שטף ותנועה זורמת בקלות להתרחש1,2,3. השיטות מוגבלים על ידי התרבות סגור ועל דרישות הגידול סטטי; עם זאת, השיטות לאפשר הערכה של ביופילמים בהגדרת מעבדה. על זיהוי של פנוטיפ biofilm, עוד ניסויים באמצעות תאים נוזלים או תרבות רציפה אסטרטגיות3940,,41 עשוי לספק נוספים מכניסטית תובנה פיזיולוגית או קליניים המשמעות של ביופילמים. עבור זיהוי של המטריקס EPS, הפרוטוקולים להשתמש לקטין את רב-סוכר-איגוד ConA. ConA מאגד שאריות α-D-glucosyl או sterically-הקשורים קשר הדוק42. לקטינים שונים העשויים להידרש, בהתאם לסוג EPS הופק עבור סוגים שונים או מינים. אסטרטגיית חלופית לזהות EPS הייצור היא ספקטרומטר מסה, אשר יספק אימות שני EPS מופק ולקבוע את הרכבו של EPS מטריקס43,44. בנוסף, השימוש counterstain דאפי יכול לגרום משמעותי בהירות לנוכח מספר חיידקים את biofilm או המופע של דנ א חוץ-תאית אשר נמצא לעתים קרובות מטריקס EPS45,46.

ישנן חלופות לשיטות לעיל המתוארים בספרות. לדוגמה, וזמינותו מוצק-פאזי מחייב דווח לשימוש פתוגנים אחרים (לדוגמה, הפניות4,25,47,48,49). ישנם שינויים בפרוטוקול בין הפרסומים; לכן, אסטרטגיות המובאים כאן הם תבנית קל-כדי-שכפול. חשוב לציין כי הפרוטוקולים לציין biofilms air-drying לפני צביעת (שלב 3.10) בעוד כמה קבוצות מעדיפים לתקן biofilms. שתי הגישות שונות עשויה לייצג שינוי אסטרטגיות ספציפיות הפתוגן. בנוסף, על-ידי הכנת קריסטל ויולט הכתם במים, זוהה הפנוטיפ היווצרות biofilm עקבית. קבוצות אחרות להשתמש אתנול solubilize קריסטל ויולט; אשר במשך שיגלה, הובילה destabilization של biofilms, נחשף הפארמצבטית. אנחנו כרגע חוקרים הגורמים שעשויים להיות מסיס biofilm שיגלה אתנול. דוגמה נוספת היא כימות של ההפקה EPS מאת ConA מכתים. שיטה לזיהוי פלורסנט 96-ובכן צלחת (שלב 4.1) מוצגת כדי לקבוע ערכי למחצה כמותי המשקף את כמות FITC מצומדת ConA מחייב biofilm. לידע שלנו, השיטה זו הפעם הראשונה אסטרטגיה זו דווחה. זיהוי EPS באמצעות בדיקה מיקרוסקופית מקובל בספרות ומאפשר אסטרטגיה שונה, אך ללא תשלום להמחיש EPS. זיהוי קרינה פלואורסצנטית הכמותיים למחצה בשילוב עם זיהוי מיקרוסקופי קונאפוקלית EPS בהחלט חיזק את הנתונים, במיוחד לנוכח המגבלות של ההליך counterstain דאפי בניתוח מיקרוסקופ שתוארו לעיל. בסך הכל, כוח משמעותי בקבוצת מבחני המתוארים כאן הוא כי כל טכניקה משלימה גישה אחרת כדי להצמיח הערכה דינמית של מלח מרה-induced ביופילמים בתוך המעית פתוגנים.

כמו מלחי מרה, biofilms מידבק משולבים הפרדיגמה של פתוגנזה חיידקי המעית, הוא צפוי כי שיטות אלה ישמש כדי לאמת מודלים, לזהות את התפקידים של גנים ספציפיים, לזהות את הגנים של פונקציה לא מוכרות וספק אפיון כללי של זנים קליניים. גישה רבת זו מאפשרת זיהוי גנים חשוב בהיבט אחד של ביופילמים זה עשוי לאבד פעם את biofilm בוגר הוא הוקם, לכן המאפשרת זיהוי של פונקציות מיוחדות של כל רכיב חיידקי של biofilm. יתר על כן, כפי שניתן לראות על ידי העובדה כי פתוגן הסתגלות בתוך המעי האנושית הינה תופעה המתרחשים במהירות, תפקידו של מלח מרה-induced ביופילמים הוא דוגמה של תופעה לאחרונה להערכה, שנשמרת ו קריטי המתרחשת ב- שיגלה זיהום, כמו גם פתוגנים המעית נוספים.

Disclosures

המחברים יש אין גילויים.

Acknowledgements

אנו מודים חנין B. רייצ'ל, אלחנדרו יאנוס-Chea לקבלת סיוע טכני. אנו מודים אנתוני ט Maurelli, בריאן פ הארלי, אלסיו פאסנו, ברט אי Swierczewski ו בובי Cherayil על זנים השתמשו במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה K22AI104755 גרנט מחלות זיהומיות (C.S.F.). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tryptic Soy BrothSigma-Aldrich 22092-500G
Crystal VioletSigmaC6158-50
Concanavalin-A FITCSigmaC7642-10mg
GlucoseSigmaG7021-1KG
Bile SaltsSigmaB8756-100G 
LB AgarSigmaL7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterileFisher14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPIVector LaboratoriesH-1500 
FormaldehydeSigma-Aldrich F1635-500
GluteraldehydeSigma-Aldrich G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear)TPP92696
Flat-bottomed 96-well plates (black)Greiner Bio-One 655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear)TPP92424
Glass coverslips 12mm, roundFisher08-774-383
96-well plate readerSpectramax
Flourescent plate readerBiotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent MicroscopeNikon A1 confocal microscope
37°C Shaking IncubatorNew Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate IncubatorThermolyne Series 5000

References

  1. Joo, H. -. S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
  2. O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
  3. Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
  4. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
  5. Ridlon, J. M., Kang, D. -. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  6. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
  7. Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
  8. Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
  9. Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
  10. Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. d. e. l. a. L., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
  11. Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
  12. Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
  13. Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
  14. Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
  15. Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
  16. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
  17. Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), (1999).
  18. Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
  19. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), (2008).
  20. Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
  21. Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
  22. Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
  23. Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
  24. Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
  25. Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
  26. Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
  27. Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
  28. Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
  29. Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
  30. Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror "real-world" pathogenesis?. Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
  31. Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
  32. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  33. Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
  34. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  35. Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
  36. de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
  37. Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
  38. Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
  39. Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
  40. Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
  41. McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
  42. Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
  43. Liener, I. . The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , (1986).
  44. Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
  45. Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
  46. Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
  47. Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
  48. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
  49. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135EPS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved