הליך זה הציג את refolding של התחום מחייב ליגנד periplasmic dCACHE של קמפילובקטר jejuni chemoreceptor Tlp3 מן ההכללה וגופי הטיהור להניב כמויות מיליגרם של חלבון.

זיהוי של ליגנדים טבעית של chemoreceptors ומחקרים מבניים מכוון הבהרה של הבסיס המולקולרי של ליגנד יחודיות ניתן להקל במידה רבה על ידי הייצור של כמויות מיליגרם של ליגנד טהור, מקופל מחייב תחומים. ניסיונות heterologously אקספרס ליגנד periplasmic דומיינים איגוד של חיידקי chemoreceptors ב Escherichia coli (e. coli) לעיתים קרובות התוצאה שלהם מיקוד לתוך גופות הכללה. . הנה, שיטה מוצג להתאוששות חלבון הכללה גופות, שלה refolding, טיהור, המחשבים איגוד ליגנד periplasmic dCACHE של קמפילובקטר jejuni (ג jejuni) chemoreceptor Tlp3 כדוגמא. הגישה כרוך הביטוי של החלבון עניין עם cleavable שלו₆-תג, בידוד, בתיווך אוריאה solubilisation של גופים הכללה, חלבון refolding על ידי דלדול שתנן, טיהור באמצעות כרומטוגרפיית זיקה ואחריו כרומטוגרפיה להסרת להדרה גודל תג. ספקטרוסקופיית קיווטות משמש כדי לאשר במצב מקופל של החלבון הטהור. זה הוכח, פרוטוקול זה שימושי בדרך כלל לייצור כמויות מיליגרם של dCACHE ליגנד periplasmic מחייב תחומים של אחרים chemoreceptors חיידקי בטופס מסיסים ו crystallisable.

כימוטקסיס, תנועתיות הוכחו תפקיד חשוב בפתוגנזה קמפילובקטר jejuni באמצעות קידום colonisation חיידקי ופלישה של מארח^1,2,3. כימוטקסיס מאפשרת לחיידקים לנוע לעבר סביבה אופטימלית עבור הצמיחה, המונחית על ידי אותות כימיים. תהליך זה דורש הכרה תאיים וסביבתיים סימנים כימיים על ידי קבוצה של חלבונים כינה chemoreceptors, או חלבונים דמויי מתמר (הניתוח). רוב chemoreceptors הם חלבונים ממברנה-מוטבע עם ליגנד extracytoplasmic מחייב תחום (LBD), תחום transmembrane, תחום האיתות cytoplasmic, הצופות על אינטראקציה עם החלבונים האיתות cytosolic המעבירים את האות מנועים השוטוניים^4,5,6,7.

11 chemoreceptors שונים זוהו ב^4,הגנום ג jejuni ⁸. עד כה, רק חלק chemoreceptors האלה יש אפיינה וידוע יחודיות ליגנד של Tlp1⁹, Tlp3^10,11, Tlp4¹¹, Tlp7¹²Tlp11¹³ . זיהוי של ליגנדים טבעית של chemoreceptors הנותרים של מין זה, chemoreceptors רבים של חיידקים אחרים, ניתן להקל במידה רבה על ידי הייצור של chemoreceptor רקומביננטי, מקופל וטהור מאוד LBDs^{14, 15 , 16}. עם זאת, ניסיונות להביע heterologously את LBDs periplasmic של chemoreceptors חיידקי ב- Escherichia coli , לעיתים קרובות לגרום שלהם מיקוד לתוך גופות הכללה^17,18,19 . למרות זאת, תופעה זו יכולה להקל על קל בידוד ושחזור של החלבון ביד. כאן, שיטה מוצג שחזור חלבון מגופים הכללה, refolding, טיהור, כדוגמא את LBD periplasmic של chemoreceptor ג jejuni Tlp3. דוגמה זו נבחרה משום Tlp3-LBD שייך משפחתי dCACHE²⁰ של תחומים חישה המצויים בשפע שני היסטידין kinases ו chemoreceptors אאוקריוטים^{20,21, 22 , 23}.

בגישה זו, הביטוי הבונה, בהתבסס על וקטור pET151/D-טופו, תוכנן לשלב N-מסוף שלו₆-תג ואחריו טבק לחרוט וירוס (אס) פרוטאז המחשוף באתר, לקבלת תג עוקבות הסרת¹⁹. הפרוטוקול מתאר ביטוי חלבון ב e. coli, בידוד, בתיווך אוריאה solubilisation של הכללה, וגופי חלבון refolding על ידי דלדול אוריאה. בעקבות refolding, המדגם מטוהר באמצעות כרומטוגרפיית זיקה עם כרומטוגרפיה להסרת להדרה גודל תג אופציונלי. המדינה מקופלת של החלבון מזוכך הוא אישר באמצעות קיווטות ספקטרוסקופיה. זה גירסה שונה של השיטה פותחה בעבר כדי לשחזר ולטהר את LBD של chemoreceptor שונים, הליקובקטר פילורי TlpC¹⁹. הליך זה, המסוכם איור 1, מניב 10-20 מ"ג של Tlp3 טהור, לא מתויגות-LBD לכל 1 ליטר של התרבות חיידקי, עם חלבון טוהר > 90% כפי שנאמדו על ידי עמודים מרחביות.

1. ביטוי של שלו₆-Tlp3-LBD ב e. coli

1. לחסן 150 מ ל מרק לוריא-Bertani (LB) סטרילי המכיל אמפיצילין^-1 מ"ל µg 50 עם BL21-Codon-פלוס (DE3) - תאים RIPL הפך עם וקטור pET151/D-טופוגרפיה להבעה של שלו₆- Tlp3-LBD (חומצת אמינו שאריות 42-291), ו דגירה זה ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר (קוטר אורביט, 25 מ מ) עם סל"ד 200 בן לילה.
2. להכין 2 ל' 6 Erlenmeyer מבחנות המכילות 800 מ ל ציר סטרילי LB ו- 50 µg מ ל^-1 אמפיצילין. לחסן את הבקבוק כל 20 מ של התרבות לילה המתקבל שלב 1.1. דגירה אותם ב 37 ° C עם לרעוד רציפה ב 200 סל ד עד הצפיפות האופטית-600 nm מגיע ל 0.6.
3. קח 1 מ"ל aliquot מאחת המבחנות (שליטה uninduced לדוגמה), גלולה באמצעות צנטריפוגה benchtop (13,000 x g, 4 ° C, 10 דקות) וזורקים את תגובת שיקוע. חנות בגדר חיידקי ב-20 ° C לניתוח מרחביות-דף עוקבות.
4. זירוז ביטוי חלבונים על-ידי הוספת 1 מ מ איזופרופיל β-D-thiogalactoside (IPTG) כל הבקבוק עם התרבות. המשך המקננת המבחנות בטמפרטורה 37 ° C ב שייקר ב 200 סל ד במשך 4 שעות נוספות.
5. לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב g x 5,000 למשך 15 דקות ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע.
   הערה: בשלב זה, ההליך ניתן להשהות על-ידי הצבת בגדר תא בפריזר-80 ° C עבור אחסון.

2. בידוד, דנטורציה של הכללה גופות

1. להעביר את כל החבילות תא שהושג בשלב 1.5 כדי גביע 250 מ ל, להוסיף 100 מ של מאגר A (10 מ מ טריס-HCl, pH 8.0, 150 מ מ NaCl). לאפשר את התאים להפשיר לחלוטין (אם קפוא), resuspend בגדר. שמור את הדגימה על קרח אלא אם צוין אחרת.
2. עוברים את התאים resuspended דרך homogeniser בלחץ גבוה שלוש פעמים lyse התאים ולהבטיח הטיה מלאה של הדנ א הגנומי.
3. Centrifuge את lysate ב g x 10,000 למשך 15 דקות ב 4 º C. לאסוף דוגמה 1 מ"ל של תגובת שיקוע (שבר מסיסים) ואחסן אותו ב-20 ° C לניתוח מרחביות-דף עוקבות. למחוק את שאר תגובת שיקוע ומניחים בגדר על קרח.
   הערה: גלולה זו היא בצבע לבן (להבדיל בקלות בין תאים רצופה אשר הגוון של בראון בצבע) מכיל גופים הכללה.
4. Resuspend בגדר הכללה גופות ביסודיות ב- 20 מ של המאגר הקר B (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, פלואוריד phenylmethanesulfonyl 0.2 מ מ (PMSF), 1% טריטון X-100). זה מקל על solubilisation של הממברנה, קרום חלבונים. מערבולת למשך 1-2 דקות לסייע resuspension.
5. Centrifuge הדגימה ב g x 10,000 למשך 15 דקות ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע.
6. Resuspend בגדר ביסודיות ב- 20 מ של המאגר הקר B על ידי vortexing צינור דק 1-2. ודא כי בגדר שבור לחתיכות קטנות. Pipet המדגם למעלה ולמטה כדי לסייע resuspension גלולה.
   הערה: חשוב resuspend בגדר ביסודיות כדי להשיג הכללה גופות חינם מפני זיהומים.
7. חזור על שלב 2.5. אם תגובת שיקוע מעוננים או צבעוני, חזור על שלבים 2.6 ו 2.5 (לפי סדר זה) עד תגובת שיקוע הוא ברור חסר צבע וטעם.
8. Resuspend בגדר ב- 20 מ של המאגר הקר C (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 0.2 מ מ PMSF) על ידי vortexing ברכבת התחתית למשך 1-2 דקות.
9. חזור על שלב 2.5.
10. להוסיף 25 מ ל המאגר הקר denaturing D (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, שמונה מ' אוריאה, 10 מ מ dithiothreitol (DTT), 0.2 מ מ PMSF) להתמוסס בגדר הכללה גופות. Resuspend ביסודיות על ידי vortexing 1-2 דקות, או עד בגדר שבור לחתיכות קטנות.
11. לערבב את המתלים שסיבוב צירית עם קצב הסיבוב של סל ד 30 30-120 דקות ב 4 º C.
12. להבהיר את הפתרון שפגע בסימני חלבונים על ידי צנטריפוגה ב g 30,000 x, 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, מניחים את תגובת שיקוע על הקרח וזורקים בגדר.
13. מודדים את ריכוז חלבון באמצעות וזמינותו ברדפורד. ²⁴ . קח את aliquot לניתוח מרחביות-ג'ל ולמקם אותו ב-20 ° C.
    הערה: בשלב זה, ההליך ניתן להשהות על ידי snap-הקפאה של הדגימה aliquoted של חנקן נוזלי ולשמור אותו ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון.

3. חלבון Refolding

1. להכין 250 מ של מאגר E (3 מ' אוריאה, 100 מ מ טריס-HCl pH 8.0, monohydrochloride L-ארגנין 0.4 M, L מופחת מ מ 20-גלוטתיון, 2 מ מ מחמצנים L-גלוטתיון) בתוך 500 מ"ל. ומגניב המאגר עד 4 ° C.
2. להוסיף 60 מ"ג חלבון שפגע בסימני תערובת המכילה שלו₆-Tlp3-LBD שהושג בשלב 2.13 ל-250 מ"ל של מאגר אלקטרוני, תוך כדי ערבוב את המאגר במהירות של 500 סל ד. דגירה המיקס refolding ב 4 ° C עם ערבוב רציף ב 500 סל ד במשך 24-48 שעות. ריכוז החלבון הסופי בשלב זה היא 0.2 מ ג מ ל^-1.
3. להכין 7 לליטר מאגר A בדלי L 8-10, תירגע עד 4 ° C לקראת השלב הבא (שלב 3.4) אשר יתקיים ב- 24-48 שעות (ראה תרשים הזרימה באיור1).
4. לטבול המניח פיסת ~ 50 ס מ דיאליזה אבובים מקוטר המנופח 28 מ מ, עם משקל מולקולרי ניתוק ב 12-14 kDa לתוך 200 מ ל 10 מ מ ethylenediaminetetraacetic ניתרן חומצת מלח (EDTA-נה₂) וחום זה מעל להבה גז עד רתיחה. יש לשטוף קרום דיאליזה עם 200 מ של ddH₂O.
5. תהדק את קצה אחד של קרום דיאליזה עם סגר אבובים דיאליזה והעבר 250 מ ל refolding תערובת שהושג בשלב 3.2 לתוך הצינור דיאליזה. סגור את הקצה הפתוח עם מלקחיים. לבדוק את התקינות של קרום כדי להבטיח שישנן אין דליפות.
6. מקם את הצינור דיאליזה דיאליזה דלי עם L 7 טרום מקורר מאגר א מוכן בשלב 3.3. במקום למהומה מגנטי בר, המבטיח כי זה לא תיגע הצנרת דיאליזה תוך כדי ערבוב.
7. Dialyse הדגימה ב 4 ° C עם המשך ערבוב במהירות של 500 סל ד ולשנות את המאגר לפחות ארבע פעמים על פני תקופה של 12 שעות. לאחר השינוי מאגר האחרון, להשאיר את הדגימה כדי dialyse בין לילה.
   הערה: במהלך דיאליזה, עודף של אוריאה (~ 3 ז) בהדרגה יוסר מה הפתרון שפגע בסימני חלבון, אשר מאפשר החלבון לקפל. משקעים כבדים חלבון יכול להיות שנצפו בקצה של דיאליזה.
8. הסר את הצינור דיאליזה מהדלי, להעביר את תוכנו לתוך גביע 500 מ"ל. שמור את הפתרון חלבון על קרח, אלא אם צוין אחרת.
9. לסנן את הפתרון חלבון דרך קרום גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.43 לתוך בקבוק זכוכית 500 מ"ל כדי להסיר כל חלבון precipitated.

4. טיהור של שלו₆-מתויג חלבון באמצעות כרומטוגרפיית זיקה מקובעת יון מתכת

1. לחייב, equilibrate עמודה chelating prepacked מ.
   1. לחבר את העמודה משאבה סחרור, ולהבטיח שאין אין אוויר לכוד בתוך הצנרת המחברת.
   2. לשטוף את העמודה על ידי עובר דרך 25-50 מ ל- ddH₂O.
   3. גובה העמודה על-ידי טעינת 3 מ"ל של 0.1 M NiCl₂ , ואז עובר מ 25 ל- ddH₂O.
   4. Equilibrate את העמודה עם 25 מ של מאגר F (טעינת מאגר, 20 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 500 מ מ NaCl, imidazole 20 מ מ).
2. התאם את הדגימה חלבון refolded שהושגו בשלב 3.9 להרכב של מאגר F על-ידי הוספת 2.5 מ של 1 מ' טריס-HCl pH 8.0, 25 מ של 5 M NaCl ו- 2.5 מ של 2 מ' imidazole מלאי פתרונות.
3. לטעון את הדגימה אל העמודה שיעור של 5 מ ל/דקה או פחות, להשליך הזרימה דרך (חלבונים לא מאוגד).
4. לשטוף את העמודה עם 50-100 מ של מאגר F כדי להסיר חלבונים הלא ספציפית מאוגד ולמחוק את הזרימה דרך.
5. Elute שלו₆-Tlp3-LBD 25 מ ל מאגר G (מאגר • תנאי, 20 מ מ טריס-HCl, 500 מ מ NaCl, imidazole 500 מ מ), ביליארד שברים זרימה דרך המכיל החלבון (כפי שנקבע על-ידי שימוש הכימית ברדפורד).
6. מודדים את ריכוז חלבון במדגם במאגר באמצעות וזמינותו ברדפורד. קח קטן aliquot עבור ניתוח מרחביות-דף ומקום ב-20 ° C.

5. שלו₆-תג הסרה באמצעות אס פרוטאז (אופציונלי)

1. היכונו, מגניב עד 4 ° C, 4 L מאגר H (מאגר המחשוף אס, 10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 150 מ מ NaCl, 1% (v/v) גליצרול, 2 מ מ DTT).
2. חותכים כ 5-7 ס מ של דיאליזה אבובים (בקוטר 2-3 ס מ), לטבול אותו ב- 200 מ של ddH₂O.
3. להוסיף את₆-מתויג פרוטאז אס שלו₆-תג חלבון המבושלות צעד 4.5 יחס מולרי סופית אס 1: 8 חלבון.
4. תהדק את קצה אחד של הצנרת עם סגר אבובים דיאליזה ולמלא את זה עם התערובת פרוטאז חלבון/אס. לסגור את הקצה השני ולהבטיח שישנן אין דליפות.
5. המקום בדיאליזה צינור לתוך טרום מקורר 4 L מאגר H (מתוך שלב 5.1), דגירה זה ב 4 ° C עם רציף זע עבור 2 ח' שינוי המאגר ולהמשיך דיאליזה למשך הלילה כדי לאפשר את התגובה המחשוף בתיווך אס להשלים.
6. בינתיים, להכין, מגניב (4 ° C) 4 L מאגר אני (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 150 מ מ NaCl, 1% (v/v) גליצרול) לקראת היום הבא.
7. לאחר לילה בדיאליזה, להחליף את המאגר למאגר שהכנתי בשלב 5.6 ו dialyse עבור ה 1-2 נוספות ב 4 º C.
8. הסר את הצינור בדלי דיאליזה, להיפרם קצה אחד של הצינור ולהעביר הפתרון חלבון ל 50 מ ל בז שפופרת. לסנן את הפתרון דרך מסנן מזרק 0.43 µm גודל הנקבוביות ולשמור אותו בקרח, אלא אם צוין אחרת.
9. למדוד את עוצמת הקול של המדגם ולהתאים את הריכוז טריס, NaCl, imidazole להרכב של מאגר F (למשל עבור 25 מ של חלבון פתרון מאגר J להוסיף 0.25 mL של מ' טריס-HCl 1 pH 8.0, 1.75 מ ל 5 M NaCl, ו 0.25 mL של 2 מ' imidazole).
10. להכין עמודה HiTrap Chelating HP 5 מ"ל כפי שמתואר בשלב 4.1.
11. לטעון את הדגימה אל העמודה (קצב הזרימה: 5 mL/min) לאסוף את הזרימה דרך, אשר מכיל לא מתויגות Tlp3-LBD (שאריות 42-291). חלבון uncleaved, את cleaved שלו₆-תג ו שלו₆- אס נשמרות על-ידי העמודה.
12. לשטוף את העמודה עם מאגר מ ל F (טעינת מאגר) כדי לאפשר כל חלבון לא מתויגות זורמת דרך ולאסוף את eluate.
13. בריכת eluate שהושג בשלבים 5.11 ו- 5.12 ולמדוד את הריכוז של חלבון. קח קטן aliquot ואחסן אותו ב-20 ° C לניתוח עמוד מרחביות.

6. גודל-הדרה כרומטוגרפיה (ג'ל סינון) של Tlp3-LBD

1. להכנת 1 ליטר של מאגר A (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 150 מ מ NaCl) ולסנן אותו באמצעות מיקרומטר 0.43 קרום.
2. Equilibrate עמודת גודל-הדרה 26/60 עם מאגר A בקצב הזרימה של 4 mL/min.
3. לרכז את הדגימה חלבון שהושג בשלב 5.13 לאמצעי אחסון של 3-4 מ ל באמצעות 15 מ"ל רכז צנטריפוגלי עם ניתוק kDa 10 (4 ° C, 4,000 x g).
4. להבהיר את הפתרון חלבונים על ידי צנטריפוגה ב g x 13,000, 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להסיר כל חלבון precipitated.
5. לטעון את הדגימה אל העמודה סינון מראש equilibrated ג'ל 26/60. לבצע בדיקות במאגר A בקצב הזרימה של 4 מ ל לדקה הצג מעקב UV. Tlp3-LBD elutes בווליום השמירה של 210-220 מ. בריכת שברים שיא.
6. מודדים את ריכוז חלבון. קח קטן aliquot לניתוח עמוד מרחביות.

7. מרחביות-דף ניתוח של הדגימות שנאספו בשלבים שונים של חלבון טיהור

1. הכנת 1 ליטר מרחביות עמודים הפועלת מאגר (מאגר J), המכיל 25 מ מ טריס, 250 מ מ גליצין pH 8.3 ו- 0.1% (w/v) dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות).
2. הכנת 10 מ"ל של 5 x מרחביות-דף טעינת מאגר (מאגר K), המכיל 0.25 M טריס-HCl ה-pH 6.8, 10% (w/v) מרחביות, 50% (v/v) גליצרול, 1 מ"מ DTT, bromophenol 0.05% כחול.
3. לאפשר את aliquots שנאספו במהלך השלבים השונים של הטיהור (צעדים 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) להפשיר.
4. עבור כל דגימה, לערבב את אמצעי האחסון המתאים µg 15 הכוללת חלבונים עם 2 µL של 5 x מרחביות-טעינת מאגר, ולכוונן את העוצמה כדי µL 10 ב- ddH₂O.
5. מחממים את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות, לסובב אותם ב 10,000 g x עבור 30 s והעברת הדגימות לתוך צינור נקי.
6. הכן של ג'ל מרחביות-דף, באמצעות הפרדת ג'ל לזיהוי 15% (עבור 5 מ"ל: 2.5 מ ל 30% (w/v) bis-אקרילאמיד, 1.2 מ ל 1.5 M טריס-HCl pH 8.8, 1.2 מ"ל ddH₂O, µL 50 10% (w/v) מרחביות, 50 µL 20% (w/v) קירור (APS), µL 3 tetramethylethylenediamine (TEMED) ו- 5% לזיהוי לערום ג'ל (עבור 2 מ"ל: 340 µL 30% (w/v) bis-אקרילאמיד, 250 µL 1 מ' טריס pH 6.8, 1.37 mL ddH₂O, µL 20 10% (w/v) מרחביות, µL 20 20% (w/v) APS, 2 µL TEMED).
7. להרכיב את המנגנון אלקטרופורזה ולמלא אותו 1 x מרחביות דף הפעלת מאגר לפי ההמלצה של היצרן.
8. לטעון סימן הפרוטאין. משקל מולקולרי והדוגמאות מוכן בשלב 7.5. לבצע את אלקטרופורזה-זרם קבוע של 25 מא.
9. להעביר את הג'ל לתוך מיכל, לשטוף אותו עם ddH₂O. להוסיף 150 מ"ל של הכחול Coomassie מכתים פתרון המכיל אלכוהול איזופרופיל 25% (v/v), חומצה אצטית 10% (v/v) ו- 0.03% (w/v) R-250 כחול מבריק. הכנס את המיכל על פלטפורמה סיבוב אופקי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
10. לשטוף את הג'ל עם ddH₂O ומניחים בתוך תמיסת destaining המכילה 5% (v/v) מתנול, חומצה אצטית 7% (v/v). Destain תוך כדי ערבוב באמצעות פלטפורמה סיבוב אופקי עבור 1 h.
11. תמונה הג'ל, לנתח.

8. מעגלי Dichroism (CD) ספקטרוסקופיה ניתוח של מבנה שניוני של פרוטאין טהור refolded

1. העברת 0.5 - 1 מ ג של refolded חלבון שהושג בשלב 6.6 לתוך צינור דיאליזה ומניחים אותו בתוך דלי דיאליזה המכיל 5 L מאגר L (50 מ מ סודיום פוספט pH 7.4), precooled עד 4 ° C. Dialyse הדגימה ב 4 ° C עם ערבוב רציף ולבצע שינויים מאגר לפחות 3-4 מעל 2-4 שעות לפני שעזב את הדגימה כדי dialyse בין לילה.
2. לרכז את פתרון dialysed חלבון מ ג 0.06 מ ל^-1 באמצעות ניתוק 10 kDa רכז צנטריפוגלי.
3. להבהיר את הפתרון על ידי צנטריפוגה ב g x 13,000, 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
4. שיא הקשת CD רחוק-UV המדגם 25 ° c מעל טווח אורך הגל של 200-260 ננומטר באמצעות spectropolarimeter עם קצב סריקה של nm 20 דקות^-1. השתמש המאגר דיאליזה כפקד ריק. חזור על הקלטה שהפקידים וצור את הספקטרום בממוצע.
5. לחשב את התוכן מבנה שניוני מאת deconvoluting התקליטור ספקטרה באמצעות תוכנית CDSSTR של DichroWeb סבר²⁵ (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).

ביטוי רקומביננטי שלו₆-Tlp3-LBD ב e. coli , גרמו בעדות חלבון בגוף הכללה. התשואה ביטוי של 1 ליטר של התרבות חיידקי שחושבו בצעד 2.13 היתה כ- 100 מ ג של שלו₆-Tlp3-LBD שהופקד בגופים הכללה. ההליך בידוד חלבון, המתוארים כאן, מאויר איור 1, מורכב solubilisation של גופים הכללה, חלבון refolding, טיהור, באמצעות כרומטוגרפיית זיקה, הסרת תג ו כרומטוגרפיה גודל-הדרה , ותשואות 10-20 מ"ג של Tlp3 טהור, לא מתויגות-LBD לכל 1 ליטר של התרבות חיידקי.

החלבון eluted מן העמודה ג'ל-סינון כמו לשיא יחיד, סימטרי המתאים לאמצעי השמירה של 220 מ ל (איור 2 א). חישוב משקל מולקולרי (MW) באמצעות מגרש כיול של יומן (MW) לעומת נפח השמירה (V_שמירה (mL) = log(MW)) x 549.3-73.9 באתר ביטוי חלבון EMBL ומתקן טיהור הליבה (http://www.embl.de/ pepcore/pepcore_services/protein_purification/chromatography/hiload26-0_superdex200/index.html), הניבו את הערך של 29 kDa. ערך זה היה מאוד קרוב לזה שמחושבים על רצף חומצות אמיניות (28.7 kDa), אשר הציע את Tlp3-LBD מונומר בפתרון.

כדי להעריך את תהליך החיטוי, הדגימות שנאספו על שלבים שונים הוערכו באמצעות ניתוח מרחביות-דף. כפי שמוצג באיור 2B, הכללה גופות הכיל בעיקר שלו₆-Tlp3-LBD. כמויות קטנות של חלבון זה היו גם נוכח השבר מסיסים של התרבות מושרה (IPTG(+)), ו בתרבות uninduced (IPTG(-)) – ככל הנראה בעקבות התבטאות פולימראז T7 דולפים. שלו₆-Tlp3-LBD היגרו על הג'ל לזיהוי עם משקל מולקולרי לכאורה של kDa 28, אשר קרוב הערך שחושב מהרצף חומצת אמינו (31.8 kDa). שלו₆-תג הסרת, כרומטוגרפיית זיקה, ג'ל שלבי סינון הניב חלבון טהור מאוד (> הומוגניות electrophoretic 90%).

כדי לאשר כי החלבון מתקבל על ידי הליך זה היה מקופל, את מבנה שניוני של שלו₆-Tlp3-LBD הוערך על ידי תקליטור ספקטרוסקופיה. הערכה של סליל α והתוכן β-גיליון מהספקטרום CD (איור 3) באמצעות CDSSTR נתן ערכים של β α ו- 23% 31%. ערכים אלה היו לאלה חזה מניתוח רצף באמצעות שרת Jpred3 (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/) (37% 26% וα β), המציין כי החלבון התאוששה הגופים הכללה שפגע בסימני אוריאה היה מקופל.

איור 1: סכימטי של שיטה הציג. רקומביננטי שלו₆-Tlp3-LBD היא expressd ב e. coli על אינדוקציה עם IPTG (ראו סעיף 1). לאחר 4 שעות ביטוי, חיידקי התאים נקצרים, lysed (ראה סעיף 2). השבר לא מסיסים המכיל את הגופות הכללה (ליברות) נשטף להסרת קרום וזוהמה חלבוני ממברנה, אחרי אשר נמצאים ליברות מומס בופר המכילה אוריאה בריכוז גבוה (ראה סעיף 2). שלו₆-Tlp3-LBD הוא refolded על ידי דילול לתוך מאגר אלקטרוני ואחריו דיאליזה ממצה להסרת אוריאה הדרגתית (סעיף 3). Refolded שלו₆-Tlp3-LBD מכן מטוהרים על ידי יון מתכת קיבוע כרומטוגרפיית זיקה כמתואר בסעיף 4. שלו₆-תג מוסר באמצעות אס פרוטאז (סעיף 5). Tlp3 לא מתויגות-LBD מרוכז, מטוהרת עוד יותר על-ידי ג'ל סינון כרומטוגרפיה (סעיף 6). נקודות איסוף דוגמאות לניתוח מרחביות-דף מסומנים *. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: טיהור של Tlp3 רקומביננטי-LBD. (א) גודל-הדרה כרומטוגרפיה עקבות לא מתויגים Tlp3-LBD על עמודה סינון ג'ל Superdex 200 HiLoad 26/60. החלבון eluted עם נפח השמירה של 220 מ. (B) מופחת 15% מרחביות-דף Coomassie Blue מוכתמת ג'ל. M: סמן משקל מולקולרי חלבון; IPTG (-): שליטה uninduced דגימה שנאספו בשלב 1.3; IPTG (+): שבר מסיסים לאחר אינדוקציה IPTG (הנאסף בשלב 2.3); ליברות: הכללה בודדים גופות (שלב 2.13); Refolded שלו₆-Tlp3-LBD: חלבון refolded הדוגמה מהצעד 4.6; Tlp3-LBD לא מתויגות: חלבון לדוגמה שהושג בשלב 5.13; ג'ל סינון 1 ו- 2: 2 שברים מהשיא חלבון eluted מן העמודה ג'ל-סינון (שלב 6.6). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: קשת קיווטות מטוהר Tlp3 רקומביננטי-LBD. הספקטרום הוקלט ב 25 ° C ב- 50 מ מ סודיום פוספט pH 7.4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הליך פשוט ביטוי, refolding מגופים הכללה של LBD periplasmic של chemoreceptor חיידקי Tlp3 מוצג. הכנה של החלבון הטהור כרוך ביטוי יתר של הגן חיות מחמד פלסמיד-מקודד ב e. coli, טיהור, solubilisation של גופים הכללה, refolding של החלבון denatured, טיהור שלה על ידי בזיקה רצופים ו גודל-הדרה כרומטוגרפיה צעדים. הקלו אוריאה דנטורציה של דילול/דיאליזה-מתווכת ' refolding הם הצעדים הקריטיים בפרוטוקול, אופטימיזציה אשר נדרש לעיתים קרובות כדי להבטיח את renaturation נאות של החלבון שהופקדו הכללה גופות²⁶.

Refolding של Tlp3-LBD הושג באופן דו-שלבי, תחילה על ידי דילול הדגימה denatured לתוך מאגר המכילה אוריאה, ולאחר מכן לפי dialysing את הדגימות מאגר ללא זה. החלבון refolded תוך שימוש בפרוטוקול זה היה פונקציונלי, crystallisable^18,23. עם זאת, שיטת שהוצגו יש מספר מגבלות. ידוע היטב את carbamylation של קבוצות אמינו מתרחש לעיתים קרובות כאשר חלבון שפגע בסימני refolded בנוכחות אוריאה^27,28,29. זאת בשל העובדה כי שתנן מומס מפרקת עם הזמן ומייצרת cyanate³⁰ זה מגיב עם החלבון קבוצות אמינו כדי ליצור מוצר carbamylated יציב, במידה קטנה, עם קבוצות פונקציונליות אחרות^{31, 32}. הפירוק של שתנן מואץ בתנאים של אלקליין pH וטמפרטורה גבוהות. לכן, מומלץ לבצע אוריאה טריים פתרונות של הנדסה גנטית (> 99%) ריאגנט מוצק, ותבצע את הפעולות refolding/דיאליזה טמפרטורה נמוכה (4 ° C)^30,,³³, לצמצם את היווצרות cyanate. יתר על כן, בחירת מאגר המכיל אמינים הראשית, כגון טריס, גליצין או אמוניום ביקרבונט, עבור המיקס refolding היא חשובה לאפשר ניקוי של^29,cyanate המיוצר³³. אפשרות אחרת היא להשתמש guanidine הידרוכלוריד במקום אוריאה, כפי guanidine הידרוכלוריד לא דווחה לשינוי כימי חלבונים.

בנוסף אוריאה, סוכן צמצום (DTT או β-mercaptoethanol) נדרש לעיתים קרובות כדי solubilize הכללה הגופות, כדי למנוע שנוצרה אינטרה - דיסולפידי הבין-מולקולרי אג ח היווצרות על ידי שמירה על משקעי ציסטאין במצבם מופחת^{26 ,34}. Tlp3-LBD יש אחד התפלגות דיסולפידי, ב פרוטוקול זה, 10 מ"מ DTT סופחה המאגר דנטורציה הכללה גופים (שלב 2.10) לסייע את resuspension של החלבון לא מסיסים. ריכוז DTT צומצם ואז על ידי קיפול ~ 100 על ידי דילול המדגם לתוך החלבון refolding מאגר, ואחריו את הצעד דיאליזה בהדרגה להסיר את כל DTT. חשוב לציין כי היישום של הליך זה refolding של חלבונים עם חוב דיסולפידי מרובות עשוי להזדקק אופטימיזציה של ריכוז מחמצן וגם צמצום סוכנים (למשל מחומצן האופטימיזציות גלוטתיון (GSSH/GSH), ציסטין/ציסטאין GSSH/DTT, cystamine/cysteamineor) כדי לקדם ראוי היווצרות דיסולפידי גשרים^34,35. יתר על כן, אם החלבון של עניין יש אינטראקצית cysteines שאינם מעורבים במבנה דיסולפידי בונד, סוכן צמצום צריך להתווסף כל מאגרי טיהור. חיזוי של הגשרים דיסולפידי פוטנציאליים מהרצף חומצת אמינו של חלבון יכול להתבצע באמצעות מספר כלים סיליקו (למשל cys_rec: http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=cys_rec&group=programs& קבוצת משנה = propt).

השימוש בפרוטוקול הציג לטיהור של חלבונים שונים סביר גם לדרוש אופטימיזציה של ריכוז imidazole במהלך השלב כביסה 4.4. כפי שמוצג באיור 2B (ליין מתויג ליברות), הגופים הכללה מבודד הכיל, במקרה זה, בעיקר החלבון עניין. אם להקות משמעותיים נוספים גלויים בדף מרחביות ג'ל של המדגם ליברות, הגדלת ריכוז imidazole בשלב 4.4 יידרשו להסיר את המזהמים, אך עשויים להפחית את החלבון התשואה^36,37. אפשרות אחרת היא להחיל מעבר צבע ליניארי של ריכוז imidazole בריכה שברים eluted המכילים חלבון עניין.

השלב הסופי טיהור, גודל-הדרה כרומטוגרפיה, מספק את האמצעי בו זמנית להעריך את המסה המולקולרית של החלקיקים eluted, להפיק המדינה oligomeric של החלבון. אומדן המסה המולקולרית לפי גודל-הדרה כרומטוגרפיה זאת, רק מדויק עבור מולקולות כדורית, וזה לא המקרה עבור חלבונים רבים^38,39. ניתן לקבוע את החלבון מסה מולקולרית ומדינה oligomeric עם דיוק גבוה יותר באמצעות כרומטוגרפיה גודל-הדרה בשילוב רב זווית פיזור אור (שניה-MALS)⁴⁰ או ultracentrifugation אנליטית⁴¹. יש לנו קודם לכן אישר כי Tlp3-LBD היא monomeric בתמיסה באמצעות ניתוח שניה-MALS²³, תוצאה זו עולה בקנה אחד עם הדיווחים על אחרים dCACHE^42,LBDs⁴³.

פרוטוקול שהוצגו, בצורתו המקורית או שונה במקצת, נעשה שימוש כדי לקפל את ולטהר מספר LBDs chemoreceptor ממשפחת dCACHE עבור רנטגן מחקרים לחקר הגבישים^{17,18,19, 23 , 42 , 44}. הליך זה עשוי להיות שימושי בדרך כלל לייצור כמויות מיליגרם של LBDs periplasmic של אחרים chemoreceptors חיידקי בטופס מסיסים ו crystallisable. בכל מקרה נפרד, אופטימיזציה פרוטוקול יש צורך סביר. בנוסף נקודות שנדונו לעיל, solubilisation אופטימלי של חלבון refolding וגופי הכללה עשוי לחייב השימוש של דטרגנטים (למשל מרחביות או N-acetyl חיבור אמוניום כלוריד), תוספות (כגון L-ארגנין) ו התאמה של שלהם ריכוז וזמן הדגירה של הפרט refolding צעדים^26,34,45,46. יתר על כן, ריכוז חלבונים בשלב refolding משפיעה באופן משמעותי את התשואה refolding. טווח הריכוזים של ng 1 מ ל^-1 כ 10 מ ג מ ל^-1 צריך בדרך כלל להיבדק. Tlp3-LBD, ריכוז אופטימלי של חלבון בתערובת refolding היה 0.2 מ ג מ ל^-1.

התשואה refolding נמוך ביותר היא בדרך כלל סימן לכך התנאים refolding הניסיון גם רחוק מלהיות אופטימלי. ניתן לצפות שלתפוקה גבוהה זה עולה בקנה אחד עם חלבון מקופל, הניתנים לאימות באמצעות תקליטור ספקטרוסקופיה (כמתואר בהליך זה). יתר על כן, crystallisability של החלבון תוצאות יכול sugguest של החלבון במצב מקופל. לחלופין, assay פונקציונלי (אם זמין) יכול לשמש כדי לאשר כי החלבון הוא מקופל. במקרה של Tlp3-LBD, לדוגמה, החלבון refolded הוצגה כדי לשמור על יכולתו מחייב ליגנד, כפי שהראה calorimetry איזותרמי. ²³

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

אנו מודים ליו יו ג על עבודותיו המוקדמות ההפקה Tlp3-LBD. עורכת דין אחינעם אורבך א מצ'וקה הוא מחויב המחלקה הבינלאומית Admistrativo דה Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS עבור מלגת הדוקטורט.